JP5861244B2 - 新規ros1融合体の検出法 - Google Patents
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Description
ロス1(ROS 1)キナーゼはUR2(University of Rochester 2)鳥肉腫ウイルスのオンコジーンであるv−rosのヒトオーソログとして同定された(非特許文献1)。ROS1遺伝子転座はグリオブラストーマでの発見が最初であり、融合パートナーはエフアイジー(FIG:Fused in glioblastoma)であった(非特許文献2)。野生型全長のROS1の発現は広範な組織の上皮細胞で観察されており、癌との関連性も示唆されている。ROS1とFIGの融合により、ROS1キナーゼ活性は恒常的となり、発現した細胞を癌化することやそのトランスジェニックマウスにおいて癌が発生することが知られている(非特許文献3)。
非小細胞肺癌におけるROS1とCD74またはSLC34A2との融合遺伝子の存在が報告された(非特許文献4;なお、非特許文献4では、「ROS1」の代わりに「ROS」の名称を使用している)。CD74−ROS1は患者検体150例中1例、SLC34A2−ROS1は41細胞株中1例でのみ同定されていることから、実際の患者での頻度や患者の臨床的特徴は不明である。報告されたCD74−ROS1遺伝子の融合部位はCD74遺伝子のエクソン6とROS1遺伝子のエクソン34であり、他のエクソンでの融合については見出されておらず、腫瘍形成能についても示されていない。本発明で見出したCD74ex6−ROS1ex32の融合部位はCD74遺伝子のエクソン6とROS1遺伝子のエクソン32である。また、報告されたSLC34A2−ROS1遺伝子の融合部位はSLC34A2遺伝子のエクソン4とROS1遺伝子のエクソン32または34であり、他のエクソンでの融合については示されていない。本発明で見出したSLC34A2ex13−ROS1ex32の融合部位はSLC34A2遺伝子のエクソン13とROS1遺伝子のエクソン32である。
[1]下記工程を含むことを特徴とするROS1キナーゼ領域を含む融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法:
被験者から得た試料中の、SDC4、EZR、LRIG3、又はTPM3とROS1との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程、
[2]被験者から得た試料中の、以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ROS1キナーゼ領域を含む融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
[3]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、[2]の方法、
[4]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、[2]の方法、
[5]被験者から得た試料中の、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、[1]〜[4]のいずれかの融合遺伝子の検出方法、
[6]SDC4、EZR、LRIG3、又はTPM3とROS1との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ROS1遺伝子キナーゼ領域を含む融合遺伝子の検出用キット、
[7]以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ROS1遺伝子キナーゼ領域を含む融合遺伝子の検出用キット:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
[8]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、[7]のキット、
[9]前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、[7]のキット、
[10]SDC4、CD74、EZR、SLC34A2、LRIG3、又はTPM3をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びROS1をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、SDC4、CD74、EZR、SLC34A2、LRIG3、又はTPM3遺伝子とROS1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは[1]〜[4]のいずれかのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなり、センスプライマーは[1]〜[4]のいずれかのポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるプライマーセット、
[11]SDC4、CD74、EZR、SLC34A2、LRIG3、又はTPM3遺伝子とROS1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記a)〜h)からなる群より選択されるプライマーセット:
a)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
b)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
c)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
d)配列番号7に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
e)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
f)配列番号11に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
g)配列番号13に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、及び
h)配列番号15に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
[12]配列番号1の塩基番号1から199間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号200から1995間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[13]配列番号3の塩基番号1から445間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号3の塩基番号446から2241間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[14]配列番号5の塩基番号1から445間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号5の塩基番号446から1932間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[15]配列番号7の塩基番号1から625間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号7の塩基番号626から2421間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[16]配列番号9の塩基番号1から1090間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号9の塩基番号1091から2577間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[17]配列番号11の塩基番号1から2026間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号11の塩基番号2027から3822間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[18]配列番号13の塩基番号1から2695間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号13の塩基番号2696から4098間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
[19]配列番号15の塩基番号1から775間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号15の塩基番号776から2178間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
に関する。
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするROS1キナーゼ領域を含む融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌)の存在の検出方法;
被験者から得た試料中の、下記(1)乃至(3)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
(1)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
(3)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするROS1キナーゼ領域を含む融合遺伝子陽性の癌(特には肺癌)の診断方法;
被験者から得た試料中の、下記(1)乃至(3)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
(1)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
(3)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌(特には肺癌)の存在の検出方法;
被験者から得た試料を鋳型とし、請求項6乃至請求項13に記載された前記プライマーセットを用いてPCRを行う工程、
PCR産物の存在を検出する工程、
に関する。
また、本発明は、
以下工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成(genomic rearrangement)を検出する方法;
被験者から得た試料中の、下記(1)乃至(3)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
(1)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
(3)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
さらに、本発明は、
以下工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成(genomic rearrangement)を検出する方法;
i)被験者から得た試料並びにii)SDC4、CD74、EZR、SLC34A2、LRIG3、又はTPM3をコードする5’側ゲノム領域を含む標識プローブ及びiii)ROS1をコードする3’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブを用い、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、
前記標識のシグナルの重なりを検出する工程
に関する。
本発明の検出方法には、融合遺伝子の検出方法と、前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法とが含まれる。以下、融合遺伝子の検出方法について説明し、その後、融合タンパク質の検出方法について説明する。
のことをいう。
(i)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド(以下、機能的等価改変体と称する)、
(ii)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド(以下、相同ポリペプチドと称する)、並びに、
(iii)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
Gap penalty = 10
Extend penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
本発明の融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドの存在を遺伝子増幅反応により検出する工程に加え、さらに目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。
インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、公知のFISH法(fusion assay)に従って実施することができる。または、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション(CISH)法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション(SISH)法を組み合わせたヒュージョンアッセイで実施することができる。好適には、実施例6に記載のFISH法(fusion assay)で検出することができる。
本発明の検出用キットには、少なくとも、本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチド増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
「SDC4遺伝子とROS1遺伝子との融合遺伝子」とは、SDC4遺伝子の一部とROS1遺伝子の一部とが融合した遺伝子(SDC4−ROS1と称する)(好ましくは、SDC4遺伝子の開始コドンATGからエクソン2までとROS1遺伝子のエクソン32からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、SDC4遺伝子の開始コドンATGからエクソン4までとROS1遺伝子のエクソン32からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び、SDC4遺伝子の開始コドンATGからエクソン4までとROS1遺伝子のエクソン34からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド)、「EZR遺伝子とROS1遺伝子との融合遺伝子」とは、EZR遺伝子の一部とROS1遺伝子の一部とが融合した遺伝子(EZR−ROS1と称する)(好ましくは、EZR遺伝子の開始コドンATGからエクソン10までとROS1遺伝子のエクソン34からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド)、「LRIG3遺伝子とROS1遺伝子との融合遺伝子」とは、LRIG3遺伝子の一部とROS1遺伝子の一部とが融合した遺伝子(LRIG3−ROS1と称する)(好ましくは、LRIG3遺伝子の開始コドンATGからエクソン16までとROS1遺伝子のエクソン35からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド)、「TPM3遺伝子とROS1遺伝子との融合遺伝子」とは、TPM3遺伝子の一部とROS1遺伝子の一部とが融合した遺伝子(TPM3−ROS1と称する)(好ましくは、TPM3遺伝子の開始コドンATGからエクソン8までとROS1遺伝子のエクソン35からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド)のことをいう。CD74遺伝子の一部とROS1遺伝子の一部とが融合した遺伝子(CD74−ROS1と称する)とは、CD74遺伝子の開始コドンATGからエクソン6までとROS1遺伝子のエクソン32からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチドのことをいう。SLC34A2遺伝子の一部とROS1遺伝子の一部とが融合した遺伝子(SLC34A2−ROS1と称する)とは、SLC34A2遺伝子の開始コドンATGからエクソン13までとROS1遺伝子のエクソン32からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチドのことをいう。SDC4−ROS1、CD74−ROS1、EZR−ROS1、SLC34A2−ROS1、LRIG3−ROS1、又はTPM3−ROS1によってコードされる融合タンパク質を、それぞれ、SDC4とROS1との融合タンパク質、CD74とROS1との融合タンパク質、EZRとROS1との融合タンパク質、SLC34A2とROS1との融合タンパク質、LRIG3とROS1との融合タンパク質、TPM3とROS1との融合タンパク質という。
(1)SDC4、CD74、EZR、SLC34A2、LRIG3、又はTPM3をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びROS1をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、SDC4、CD74、EZR、SLC34A2、LRIG3、又はTPM3遺伝子とROS1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下(好ましくは、よりストリンジェントな条件下)でハイブリダイズする核酸分子(好ましくは、少なくとも16塩基の核酸分子)からなり、センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件(好ましくは、よりストリンジェントな条件下)でハイブリダイズする核酸分子(好ましくは、少なくとも16塩基の核酸分子)からなるプライマーセット
が含まれる。
(3)配列番号3(SDC4ex4−ROS1ex32)の塩基番号1から445間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー(好ましくは配列番号34)及び配列番号3の塩基番号446から2241間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー(好ましくは配列番号31)のプライマーセット。
(4)配列番号5(SDC4ex4−ROS1ex34)の塩基番号1から445間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー(好ましくは配列番号34)及び配列番号5の塩基番号446から1932間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー(好ましくは配列番号31)のプライマーセット。
(5)配列番号7(CD74ex6−ROS1ex32)の塩基番号1から625間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー(好ましくは配列番号35)及び配列番号7の塩基番号626から2421間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー(好ましくは配列番号31)のプライマーセット。
(6)配列番号9(EZRex10−ROS1ex34)の塩基番号1から1090間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー(好ましくは配列番号36)及び配列番号9の塩基番号1091から2577間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー(好ましくは配列番号33)のプライマーセット。
(7)配列番号11(SLC34A2ex13−ROS1ex32)の塩基番号1から2026間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー(好ましくは配列番号37)及び配列番号11の塩基番号2027から3822間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー(好ましくは配列番号31)のプライマーセット。
(8)配列番号13(LRIG3ex16−ROS1ex35)の塩基番号1から2695間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー(好ましくは配列番号38)及び配列番号13の塩基番号2696から4098間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー(好ましくは配列番号32)のプライマーセット。
(9)配列番号15(TPM3ex8−ROS1ex35)の塩基番号1から775間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー(好ましくは配列番号39)及び配列番号15の塩基番号776から2178間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー(好ましくは配列番号31)のプライマーセット。
また、本発明のプライマーは、通常、15〜40塩基、好ましくは16〜24塩基、更に好ましくは18〜24塩基、特に好ましくは20〜24塩基の鎖長を有する。
目的遺伝子の5’領域および3’領域を異なる色素で染め、遺伝子の転座を観察する方法が知られている。FISH法の一種であるこの方法はスプリットアッセイ(split assay)と呼ばれている。スプリットアッセイでは、染色体転座を調べたい目的遺伝子の5’領域および3’領域のそれぞれを異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、テキサスレッド(TexasRed)(赤)標識およびFITC(緑)標識した2種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合は2つの黄色のシグナル(緑色と赤色のシグナルが近傍に存在している状態)として検出され、転座または逆位が起きている場合は、離れた緑色と赤色のシグナルとして検出される。
FISH法解析によりROS1ゲノム構造異常が示唆された組織12例由来のRNAをテンプレートに5’−RACEキット(SMAT(TM) RACE cDNA Amplification Kit; Clonetech社)のプロトコールに従い、ROS1遺伝子キナーゼ領域の5’側に存在する遺伝子を調べた。具体的には、ファーストストランドcDNA(1st strand cDNA)合成は、臨床検体由来のRNA0.5μgとROS1遺伝子キナーゼコード領域に設計したリバースプライマー(配列番号17)を用いて行った。5’−RACE(rapid amplification of cDNA ends)PCRは、キットに含まれるUPMプライマーおよびリバースプライマー(配列番号17)を用いてDNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold(R);ライフテクノロジーズジャパン株式会社)によるPCR反応(94℃30秒、72℃3分を5サイクル、94℃30秒、70℃30秒、72℃3分を5サイクル、94℃30秒、68℃30秒、72℃3分を25サイクル)を行った。
12例中1例(#20130由来RNA)ではRACE反応で増幅が得られなかったが、配列番号31のプライマーのみで増幅が観察され、配列確認の結果、ROS1遺伝子の5’側にLRIG3遺伝子の一部が融合していることが認められた。#20130検体ではLRIG3−ROS1融合遺伝子の存在があると仮定し、実施例3および4において他の融合遺伝子の確認に平行して存在を見極めた。
FISH法解析によりROS1ゲノム構造異常が示唆され、融合する遺伝子が同定された肺癌臨床検体由来のcDNA(#7130、#26356、#6534、#11994、#10286、#20130)を鋳型として、DNAポリメラーゼ(PrimeStar HS DNAポリメラーゼ)を用いてPCR(98℃10秒、68℃4〜4.5分を25〜37サイクル)を行い、増幅産物をpT7Blue−2にクローニングした。プライマーセットとしては、
1)#7130及び#26356に対して、配列番号20及び配列番号18の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド;
2)#6534に対して、配列番号21及び配列番号19の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド;
3)#11994に対して、配列番号22及び配列番号18の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド;
4)#10286に対して、配列番号23及び配列番号18の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド;及び
5)#20130に対して、配列番号24及び配列番号18の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
をそれぞれ用いた。
#7130から、SDC4遺伝子の開始コドンATGからエクソン2までとROS1遺伝子のエクソン32からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド(SDC4ex2−ROS1ex32)(配列番号1);
#26356から、SDC4遺伝子の開始コドンATGからエクソン4までとROS1遺伝子のエクソン32からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド(SDC4ex4−ROS1ex32)(配列番号3)及びSDC4遺伝子の開始コドンATGからエクソン4までとROS1遺伝子のエクソン34からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド(SDC4ex4−ROS1ex34)(配列番号5);
#6534から、CD74遺伝子の開始コドンATGからエクソン6までとROS1遺伝子のエクソン32からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド(CD74ex6−ROS1ex32)(配列番号7);
#11994から、EZR遺伝子の開始コドンATGからエクソン10までとROS1遺伝子のエクソン34からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド(EZRex10−ROS1ex34)(配列番号9);
#10286から、SLC34A2遺伝子の開始コドンATGからエクソン13までとROS1遺伝子のエクソン32からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド(SLC34A2ex13−ROS1ex32)(配列番号11);
#20130から、LRIG3遺伝子の開始コドンATGからエクソン16までとROS1遺伝子のエクソン35からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド(LRIG3ex16−ROS1ex35)(配列番号13)
がそれぞれ取得できた。
実施例3で作製した各プラスミドを制限酵素EcoRI及びSalIで消化することによりインサートを取り出し、発現ベクターpMXS(JBC 275,24945-24952,2000)のEcoRI−SalIサイトにサブクローニングした。実施例3に記したようにTPM3−ROS1はEcoRI−NotIサイトに挿入した。これら各融合ポリペプチドを発現するプラスミド又はcDNAを挿入しない空ベクター(pMXS)をリン酸カルシウム法で3T3繊維芽細胞に導入し14日間培養したところ、図1〜図8(ROS1融合ポリペプチド発現)および図9(空ベクター)に示すように、各融合ポリペプチドを発現するベクターを導入した場合に限り形質転換フォーカスが観察された。
融合部を含む領域を直接増幅するRT−PCRで各融合遺伝子の検出を行い、各融合遺伝子cDNAが癌組織に存在していることを示した。以下に示す各検体由来RNAテンプレートに対して、フォワードプライマー(今回同定したROS1遺伝子に融合していた遺伝子上に設計)とROS1遺伝子上に設計したリバースプライマーを使用し、PCRは94℃、10分の前処理後に、以下に示す条件で増幅反応を行い、最後に72℃、10分間の延長反応を行った。
#7130、#8701、#26356(SDC4−ROS1)については、配列番号34のフォワードプライマーと配列番号31のリバースプライマーを使用し、94℃1分、70℃1分、72℃30秒を30サイクルの増幅反応;
#6534、#148、#10855(CD74−ROS1)については、配列番号35のフォワードプライマーと配列番号31のリバースプライマーを使用し、94℃1分、70℃1分、72℃30秒を30サイクルの増幅反応;
#11994、#9604(EZR−ROS1)については、配列番号36のフォワードプライマーと配列番号33のリバースプライマーを使用し、94℃1分、70℃1分、72℃30秒を30サイクルの増幅反応;
#10286(SLC34A2−ROS1)については、配列番号37のフォワードプライマーと配列番号31のリバースプライマーを使用し、94℃1分、68℃1分、72℃60秒を35サイクルの増幅反応;
#20130(LRIG3−ROS1)については、配列番号38のフォワードプライマーと配列番号32のリバースプライマーを使用し、94℃1分、68℃1分、72℃10秒を35サイクルの増幅反応;
#17970、#8405(TPM3−ROS1)については、配列番号39のフォワードプライマーと配列番号31のリバースプライマーを使用し、94℃1分、70℃1分、72℃30秒を30サイクルの増幅反応
をそれぞれ行った。増幅産物を電気泳動したところ、プライマー設定位置から予想されるサイズのバンドが各遺伝子ともに観察され、臨床検体を用いて融合遺伝子の検出がそれぞれの遺伝子上にプライマーを設計することによって可能であることが示された。
各融合遺伝子がゲノム上で融合していることを確認するため、
ROS1遺伝子についてはBACクローン(RP1-179P9);
SDC4遺伝子についてはBACクローン(RP3-453C12);
CD74遺伝子についてはBACクローン(RP11-1120I24);
EZR遺伝子についてはBACクローン(RP11-507C10);
SLC34A2遺伝子についてはBACクローン(RP11-752I1);
LRIG3遺伝子についてはBACクローン(RP11-557F20);
TPM3遺伝子についてはBACクローン(RP11-205-M9)
を用いて、実施例1に従いFISH法にてFusion assayを行った。なお、ROS1遺伝子についてはFITC(緑)で、それ以外の遺伝子についてはテキサスレッド(赤)で、それぞれ、プローブを標識した。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (17)
- 被験者から得た試料中の、SDC4、EZR、LRIG3、又はTPM3とROS1との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とするROS1キナーゼ領域を含む融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法であって、前記融合タンパク質が、
SDC4遺伝子の開始コドンATGからエクソン2までとROS1遺伝子のエクソン32からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
SDC4遺伝子の開始コドンATGからエクソン4までとROS1遺伝子のエクソン32からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
SDC4遺伝子の開始コドンATGからエクソン4までとROS1遺伝子のエクソン34からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
EZR遺伝子の開始コドンATGからエクソン10までとROS1遺伝子のエクソン34からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
LRIG3遺伝子の開始コドンATGからエクソン16までとROS1遺伝子のエクソン35からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、
TPM3遺伝子の開始コドンATGからエクソン8までとROS1遺伝子のエクソン35からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド
がコードする融合タンパク質である、前記検出方法。 - 被験者から得た試料中の、以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ROS1キナーゼ領域を含む融合遺伝子又は該融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号10、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号10、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号10、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項2に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号10、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項2に記載の方法。
- 被験者から得た試料中の、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の融合遺伝子の検出方法。
- SDC4、EZR、LRIG3、又はTPM3とROS1との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ROS1遺伝子キナーゼ領域を含む融合遺伝子の検出用キットであって、
前記融合タンパク質が、
SDC4遺伝子の開始コドンATGからエクソン2までとROS1遺伝子のエクソン32からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
SDC4遺伝子の開始コドンATGからエクソン4までとROS1遺伝子のエクソン32からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
SDC4遺伝子の開始コドンATGからエクソン4までとROS1遺伝子のエクソン34からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
EZR遺伝子の開始コドンATGからエクソン10までとROS1遺伝子のエクソン34からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、
LRIG3遺伝子の開始コドンATGからエクソン16までとROS1遺伝子のエクソン35からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、
TPM3遺伝子の開始コドンATGからエクソン8までとROS1遺伝子のエクソン35からエクソン43の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド
がコードする融合タンパク質である、前記キット。 - 以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ROS1遺伝子キナーゼ領域を含む融合遺伝子の検出用キット:
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号10、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号10、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号10、配列番号14、若しくは配列番号16で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項7に記載のキット。
- 前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号10、配列番号14、又は配列番号16で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項7に記載のキット。
- SDC4、EZR、LRIG3、又はTPM3をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びROS1をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、SDC4、EZR、LRIG3、又はTPM3遺伝子とROS1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなり、センスプライマーは請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子からなるプライマーセット。
- SDC4、EZR、LRIG3、又はTPM3をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びROS1をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、SDC4、EZR、LRIG3、又はTPM3遺伝子とROS1遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記a)〜f)からなる群より選択されるプライマーセット:
a)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
b)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
c)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
d)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、
e)配列番号13に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、及び
f)配列番号15に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。 - 配列番号1の塩基番号1から199間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号200から1995間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
- 配列番号3の塩基番号1から445間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号3の塩基番号446から2241間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
- 配列番号5の塩基番号1から445間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号5の塩基番号446から1932間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
- 配列番号9の塩基番号1から1090間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号9の塩基番号1091から2577間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
- 配列番号13の塩基番号1から2695間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号13の塩基番号2696から4098間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
- 配列番号15の塩基番号1から775間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号15の塩基番号776から2178間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
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