WO2015194524A1 - Ｂ前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病新規キメラ遺伝子 - Google Patents

Ｂ前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病新規キメラ遺伝子 Download PDF

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WO2015194524A1
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gene
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信敬 清河
松本　健治
仁 市川
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国立研究開発法人 国立成育医療研究センター
国立研究開発法人 国立がん研究センター
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting gene fusion that is a responsible mutation for cancer, a method for determining the prognosis of cancer based on the presence of the gene fusion, and the like.
  • Cancer is the leading cause of death in Japan. Cancer cells are known to become malignant due to genetic changes. Identification of genetic changes characteristic of cancer type is expected to contribute not only to the elucidation of carcinogenic mechanisms, but also to the diagnosis and prognosis of cancer, the development and selection of cancer treatments, etc. Has been.
  • a chimeric gene (also referred to as a fusion gene in the present specification) is formed by fusing two genes encoding proteins originally functioning as completely separate molecules with abnormalities such as chromosomal translocation, As a result, a fusion protein having an abnormal function is produced.
  • Chimeric genes are known to cause leukemia and other cancers, and are used as indicators in diagnosis and targets for drug discovery. In particular, in recent years, successful cases of molecular targeted therapy have increased for cancers having chimeric genes related to components (for example, kinases) of signal transduction pathways involved in canceration.
  • tyrosine kinase inhibitors that target ALK protein are effective in treating lung cancer patients with EML4-ALK fusion gene, and tyrosine that targets protein encoded by BCR-ABL fusion gene It has been shown that a kinase inhibitor (for example, imatinib) is effective in treating leukemia patients having the fusion gene.
  • Acute lymphoblastic leukemia is a type of cancer in which lymphocytes become malignant at an early stage and increase abnormally. ALL occurs in any age group, from children to adults, but is known as the most common cancer in children. Many chimeric genes have been reported as genetic changes for ALL. For example, B-progenitor acute lymphoblastic leukemia (also called B-ALL or BCP-ALL), which accounts for about 80% of childhood ALL, has a known chimeric gene in about half. The most common is ETV6-RUNX1, which is detected in about 1/4 of cases.
  • chimeric genes containing MLL genes such as MLL-AF4, TCF3-PBX1, and BCR-ABL1 are each detected at about 5%, and TCF3-HLF is detected at less than 1%. Both are presumed to be involved in the development of leukemia, but their role is unexplained except for BCR-ABL1, whose functional action has been clarified. However, these chimeric genes correlate well with the treatment response, and the prognosis is good in ETV6-RUNX1-positive cases, but other than these, the prognosis is poor. The test results are used to determine the treatment intensity. In addition to the above, various chimeric genes are detected at a very low frequency.
  • Non-patent document 1 describes the inheritance in ALL (Ph-like ALL), which has an IKZF1 mutation, is negative for BCR-ABL1, and has a poor prognosis.
  • ALL Ph-like ALL
  • RNA sequencing and whole-genome sequencing of BCP-ALL cases identified as Ph-like ALL were performed, and NUP214-ABL1, EBF1-PDGFRB, BCR-JAK2, STRN3-JAK2, PAX5 -It has been described that the in-frame fusion of JAK2, ETV6-ABL1, RANBP2-ABL1, and RCSD1-ABL1 has been identified.
  • EBF1-PDGFRB, BCR-JAK2, and NUP214-ABL1 have also been shown to be potential targets for treatment with tyrosine kinase inhibitors.
  • BCP-ALL in addition to the above chimeric genes, chromosomal aberrations have been revealed in about 1/4 of cases. However, in the remaining about 1/4 of cases, abnormalities that can cause onset have not been clarified.
  • EP300 / E1A binding protein p300 binds to transcription factors and regulates the transcriptional activity of many genes as a transcription coactivator, and is thought to be involved in cell proliferation, cell division, cell maturation, differentiation, etc. . EP300 is also considered to be one of the factors related to B cell differentiation.
  • MLL-EP300 Non-patent Document 2
  • t (8) produced by chromosomal translocation t (11; 22) (q23; q13) in relation to acute myeloid leukemia MYST3 (MOZ) -EP300 (Non-patent Document 3) generated by; 22) (p11; q13) has been reported so far.
  • ZNF384 is a C2H2-type zinc finger protein, functions as a transcriptional regulator, and is thought to regulate the promoter activity of genes encoding extracellular matrix such as MMP1, MMP3, MMP7, COL1A1.
  • TAF15-ZNF384 produced by t (12; 17) (p13; q11) has been found in ALL patients, and the switch from ALL to acute myeloid leukemia (AML), It has been reported to be involved in the transformation of mouse fibroblasts (Non-Patent Documents 4 to 8).
  • EWSR1-ZNF384 (Non-patent Documents 4 and 5) caused by t (12; 22) (p13; q12), t (12; 19) (p13.3; p13.3) E2A-ZNF384 (Non-Patent Document 9) has been reported.
  • an object of the present invention is to identify a mutation that can be an index for determining a prognosis in cancer such as leukemia including ALL, and to provide a means for detecting the mutation.
  • the present inventors have identified the EP300-ZNF384 gene as a novel fusion gene expressed in B precursor cell acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL). .
  • BCP-ALL B precursor cell acute lymphoblastic leukemia
  • the frequency of EP300-ZNF384 gene fusion was estimated to be about 1% of BCP-ALL.
  • a fusion gene with another gene was reported, but the presence of the EP300-ZNF384 fusion gene was completely unexpected even if any prior art was considered.
  • the present invention is as follows. [1] A method for detecting gene fusion, wherein in an isolated sample derived from a subject, an EP300-ZNF384 fusion polypeptide comprising a TAZ-type zinc finger domain on the N-terminal side of EP300 and a TAZ-type zinc finger domain of ZNF384, Or detecting a fusion polynucleotide encoding it.
  • the fusion polypeptide is any one of the following (i) to (iii): (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (Ii) a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, or (iii) represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence.
  • the fusion polynucleotide is any of the following (i) to (iii): (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (Ii) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (Iii) a polynucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more nucleotides are deleted, substituted or added, or (iv) a polynucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a polynucleotide having a sequence identity of 80% or more with a polynucleotide comprising a base sequence [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the gene fusion is a cancer responsible mutation (driver mutation). [5] The method according to [4], wherein the cancer is B precursor cell acute lymphoblastic leukemia.
  • a method for determining the prognosis of cancer comprising the following steps: (1) In an isolated sample derived from a subject, an EP300-ZNF384 fusion polypeptide comprising a TAZ-type zinc finger domain on the N-terminal side of EP300 and a TAZ-type zinc finger domain of ZNF384, or a fusion polynucleotide encoding the same And (2) a step of determining that the prognosis of cancer is good in the subject when the fusion polypeptide or the fusion polynucleotide encoding the fusion polypeptide is detected.
  • a kit for detecting gene fusion comprising any of the following (A) to (C) or a combination thereof: (A) a polynucleotide that is a probe designed to specifically recognize an EP300-ZNF384 fusion polynucleotide; (B) a polynucleotide that is a pair of primers designed to specifically amplify an EP300-ZNF384 fusion polynucleotide; or (C) an antibody that specifically recognizes an EP300-ZNF384 fusion polypeptide. [8] The kit according to [7], wherein the gene fusion is a responsible cancer mutation (driver mutation).
  • fusion polypeptide or fragment thereof comprising a TAZ-type zinc finger domain on the N-terminal side of EP300 and a TAZ-type zinc finger domain of ZNF384.
  • the present invention it becomes possible to detect an unknown responsible mutation of a specific cancer that has been revealed for the first time by the present invention, and it is possible to determine the prognosis of cancer based on the presence of the responsible mutation. .
  • the presence and type of genetic abnormality is closely related to the treatment responsiveness, and treatment is stratified by the detection. If it is denied by detecting the EP300-ZNF384 chimeric gene of the present invention that the patient has another chimeric gene with a poor prognosis, it can be determined that there is no need to increase the treatment risk.
  • the EP300-ZNF384 chimeric gene of the present invention which is a non-kinase related chimeric gene, is detected, it can be determined that the tyrosine kinase inhibitor is basically not applicable, and it is possible to treat ALL patients. Therefore, it becomes possible to determine a more appropriate treatment policy.
  • the appearance frequency of the EP300-ZNF384 chimeric gene in BCP-ALL is 1%, which is very high compared to that of other chimeric genes. As a routine test item, its clinical significance is extremely large.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the domain structure of the EP300-ZNF384 fusion protein.
  • the downward arrows indicate the breakpoints in the EP300 and ZNF384 proteins and the fusion point in the EP300-ZNF384 fusion protein.
  • FIG. 2 is an electrophoresis photograph showing the results of detecting EP300-ZNF384 gene fusion by RT-PCR. From the left side, the first lane shows a molecular weight marker (Phi-X174 / HaeIII), and the second to fourth lanes show a gene fragment containing a fusion portion amplified from leukemia cell-derived cDNA of the gene fusion positive 3 cases.
  • FIG. 3 shows the results of nucleotide sequence determination of the amplified gene fragment.
  • FIG. 4 shows the results of FISH analysis using a probe for EP300 (short arrow) and a probe for ZNF384 (long arrow). The overlap of two signals indicating the presence of gene fusion is indicated by an arrowhead.
  • the present inventors have found the EP300-ZNF384 gene fusion for the first time as a responsible cancer mutation (driver mutation) in cancer tissues. Based on this finding, the present invention provides a method for detecting the gene fusion, a method for determining the prognosis of cancer based on the presence of the responsible mutation, and the like.
  • “responsible mutation of cancer” is a term used interchangeably with driver mutation, and refers to a mutation that exists in cancer tissue and has a cancer-causing ability for cells.
  • driver mutation refers to a mutation that exists in cancer tissue and has a cancer-causing ability for cells.
  • the mutation is responsible for cancer.
  • the “fusion point” in the fusion polynucleotide means a boundary where the 5 ′ gene portion and the 3 ′ gene portion are connected, and this is a boundary between two nucleotide residues. It is a boundary.
  • the “fusion point” in the fusion polypeptide means a boundary where the N-terminal polypeptide and the C-terminal polypeptide are connected, and is this a boundary between two amino acid residues, Or, if the gene fusion occurs within one codon, it is the single amino acid residue itself encoded by that codon.
  • EP300-ZNF384 gene fusion is a mutation that causes the expression of a fusion protein of EP300 protein and ZNF384 protein (hereinafter also referred to as EP300-ZNF384 fusion polypeptide), and within the region of 22q13.2 and 12p13.31 in the human chromosome It is a mutation caused by a translocation with a breakpoint (t (12; 22)).
  • EP300 (E1A binding protein p300) protein is a protein encoded by a gene present in 22q13.2 in humans, and typically an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (NCBI accession number NM_001429.3 ( 20-Apr-2014)). EP300 protein is considered to be one of the factors related to B cell differentiation.
  • the EP300 protein is characterized by having two TAZ-type zinc finger domains, a CREB-binding site, a bromo domain, a ZZ-type zinc finger domain, and a nuclear receptor coactivator domain (FIG. 1).
  • the N-terminal side TAZ-type zinc finger domain corresponds to the amino acid sequence at positions 347 to 416 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 for humans, for example.
  • ZNF384 protein is a protein encoded by a gene present at 12p13.31 in humans, and typically an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (NCBI accession number NP_597733.2 (26-Feb-2014) ) Protein.
  • ZNF384 protein is characterized by having a TAZ-type zinc finger domain (FIG. 1).
  • the TAZ-type zinc finger domain corresponds to the amino acid sequence at positions 208 to 394 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 for humans, for example.
  • the EP300-ZNF384 fusion polypeptide is a polypeptide containing a TAZ-type zinc finger domain on the N-terminal side of the EP300 protein and a TAZ-type zinc finger domain of the ZNF384 protein.
  • the EP300-ZNF384 fusion polypeptide may contain all or part of the TAZ-type zinc finger domain on the N-terminal side of the EP300 protein.
  • the EP300-ZNF384 fusion polypeptide may contain all or part of the TAZ-type zinc finger domain of the ZNF384 protein.
  • a polynucleotide encoding an EP300-ZNF384 fusion polypeptide (hereinafter also referred to as an EP300-ZNF384 fusion polynucleotide) is a TAZ-type zinc finger domain on the N-terminal side of the EP300 protein and a TAZ-type zinc finger domain of the ZNF384 protein.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide comprising The EP300-ZNF384 fusion polynucleotide may be any of mRNA, cDNA and genomic DNA.
  • the EP300-ZNF384 fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, an EP300-ZNF384 fusion polynucleotide encoding the following polypeptide: (I) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (Ii) a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, or (iii) represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence encoded by an EP300-ZNF384 fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in Examples described later.
  • the “one or more amino acids” is usually 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to several (for example, 1 ⁇ 5, 1-4, 1-3, 1 or 2, or 1) amino acids.
  • sequence identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, even more preferably 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • Amino acid sequence identity is called BLASTX or BLASTP based on the algorithm BLAST (Proc. ⁇ ⁇ ⁇ Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) by Carlin and Arthur It can be determined using the program (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990).
  • the EP300-ZNF384 fusion polynucleotide in the present invention can be, for example, any of the following polynucleotides: (I) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (Ii) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (Iii) a polynucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more nucleotides are deleted, substituted or added, or (iv) a polynucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the base sequence of the EP300-ZNF384 fusion polynucleotide found in a sample derived from human cancer tissue, as shown in the Examples described later.
  • stringent conditions refers to moderately or highly stringent conditions unless otherwise specified.
  • the moderately stringent conditions can be easily designed by those skilled in the art based on, for example, the length of the target polynucleotide.
  • the basic conditions are shown in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Chapters 6-7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
  • moderately stringent conditions for nitrocellulose filters are 5 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0) prewash conditions; about 50-50 ° C. at about 50-50 ° C.
  • the moderately stringent conditions preferably include hybridization conditions of about 50 ° C. and 6 ⁇ SSC, and may include the aforementioned washing conditions and / or washing conditions.
  • High stringent conditions can also be easily designed by those skilled in the art based on, for example, the length of the target polynucleotide.
  • High stringency conditions include higher temperatures and / or lower salt concentrations than moderately stringent conditions.
  • hybridization conditions of about 65 ° C., 0.2-6 ⁇ SSC, preferably 6 ⁇ SSC, more preferably 2 ⁇ SSC, and even more preferably 0.2 ⁇ SSC are included.
  • cleaning conditions of about 65 to 68 ° C., 0.2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • SSPE (1 ⁇ SSPE is 0.15 in place of SSC (1 ⁇ SSC is 0.15 ⁇ M NaCl and 15 ⁇ mM sodium citrate)) as a buffer for hybridization, pre-washing and washing.
  • washing can be performed for about 15 minutes after hybridization is complete.
  • the “one or more nucleotides” usually means 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to several (for example, 1 ⁇ 5, 1-4, 1-3, 1 or 2, or 1) nucleotides.
  • sequence identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, even more preferably 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • the present invention provides a method for detecting EP300-ZNF384 gene fusion (hereinafter also referred to as the detection method of the present invention).
  • the gene fusion preferably causes a responsible cancer mutation (driver mutation).
  • the detection method of the present invention comprises the step of detecting an EP300-ZNF384 fusion polynucleotide or a polypeptide encoded thereby in an isolated sample from a subject.
  • the subject is not particularly limited as long as the subject is a mammal.
  • mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, chipmunk, guinea pigs, rabbits, pigs, cows, goats, horses, sheep, minks, dogs, cats, humans, monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, marmosets, Primates such as orangutans and chimpanzees can be mentioned, and humans are preferred.
  • the subject may be not only a subject suffering from cancer, but also a subject suspected of suffering from cancer, or a subject having a risk of developing cancer in the future.
  • the “cancer” to which the detection method of the present invention is applied is not particularly limited as long as EP300-ZNF384 gene fusion can be detected, but is preferably leukemia, more preferably acute lymphoblastic.
  • An “isolated sample” derived from a subject is a biological sample (eg, cell, tissue, organ (eg, small intestine, spleen, kidney, liver, stomach, lung, adrenal gland, heart, brain, pancreas, aorta, etc.), body fluid) (For example, blood, lymph, bone marrow, etc.), digestive juice, sputum, alveolar / bronchial lavage fluid, urine, stool) as well as nucleic acid extracts (genomic DNA extract, mRNA extract) obtained from these biological samples , CDNA preparations prepared from mRNA extracts, cRNA preparations, etc.) and protein extracts.
  • a biological sample eg, cell, tissue, organ (eg, small intestine, spleen, kidney, liver, stomach, lung, adrenal gland, heart, brain, pancreas, aorta, etc.), body fluid) (For example, blood, lymph, bone marrow, etc.), digestive juice, sputum, al
  • genomic DNA mRNA, cDNA or protein by selecting a known method suitable for the sample in consideration of the type and condition of the sample.
  • the sample may be subjected to formalin fixing treatment, alcohol fixing treatment, freezing treatment, or paraffin embedding treatment.
  • the “isolated sample” is preferably derived from a tissue, organ, or body fluid in which the cancer is present or suspected of being present, and more preferably the cancer is present or suspected to be present. It is derived from blood or bone marrow fluid.
  • Such an “isolated sample” includes, for example, cells derived from blood or bone marrow fluid of a leukemia (preferably ALL, more preferably BCP-ALL) patient or a subject suspected of suffering from leukemia, Examples include total RNA extracted from cells.
  • the detection of the fusion polynucleotide or the polypeptide encoded thereby can be performed using a technique known per se.
  • transcripts from genomic DNA for example, using RT-PCR, sequencing, TaqMan probe, Northern blotting, dot blotting, cDNA microarray analysis, etc. Fusion polynucleotides that are mRNA or cDNA can be detected.
  • genomic DNA is targeted, for example, detection of fusion polynucleotides that are genomic DNA using in situ hybridization (ISH), genomic PCR, sequencing, TaqMan probe, Southern blotting, genomic microarray analysis, etc. can do.
  • ISH in situ hybridization
  • EP300-ZNF384 gene fusion is thought to contribute to canceration by expressing a fusion polypeptide
  • when detecting a fusion polynucleotide that is genomic DNA for example, by in situ hybridization
  • it is also preferable to further confirm that a transcript or protein is produced for example, by RT-PCR, immunostaining, etc.
  • the fusion polynucleotide is specific.
  • Polynucleotides that are probes designed to recognize can be used.
  • “specifically recognize a fusion polynucleotide” includes a wild-type gene derived from the fusion point of the fusion polynucleotide from the 5 ′ terminal side and the 3 ′ terminal part under stringent conditions. This refers to identifying and recognizing the fusion polynucleotide from a polynucleotide other than the fusion polynucleotide.
  • the genomic DNA to be detected is stable even under formalin fixation. From the viewpoint of high detection sensitivity, it is preferable to use in situ hybridization.
  • the biological sample described in the following (a) or (b) having a chain length of at least 15 bases as a polynucleotide that is a probe designed to specifically recognize a fusion polynucleotide By hybridizing these polynucleotides, genomic DNA (fusion polynucleotide) encoding the fusion polypeptide can be detected.
  • A At least one selected from the group consisting of a probe that hybridizes to the base sequence of the 5 ′ side fusion partner gene (EP300 gene) and a probe that hybridizes to the base sequence of the 3 ′ side fusion partner gene (ZNF384 gene) Polynucleotide which is a probe (b) A polynucleotide which is a probe that hybridizes to a base sequence including a fusion point between a 5 ′ fusion partner gene and a 3 ′ fusion partner gene.
  • the EP300 gene according to the present invention is typically a gene consisting of DNA sequences 41092302 to 41180083 in the genome sequence specified by Genbank accession number NC — 000022.11.
  • ZNF384 gene according to the present invention is derived from a human, typically, the 6664477-6689572 DNA sequence (encoded by the complementary strand) of the genomic sequence specified by Genbank accession number NC_000012.12. ).
  • DNA sequence of a gene can change in nature (ie, non-artificially) due to its mutation or the like. Therefore, such natural mutants can also be the subject of the present invention (hereinafter the same).
  • the polynucleotide described in (a) of the present invention is the nucleotide sequence of the 5 ′ fusion partner gene (EP300 gene) and / or the 3 ′ fusion partner gene (ZNF384 gene), which is the target nucleotide sequence of the polynucleotide.
  • Any polynucleotide can be used as long as it can detect the presence of genomic DNA encoding the fusion polypeptide in the biological sample by hybridizing to the base sequence.
  • the polynucleotide described in (a1) to (a3) below is used.
  • the base sequence in the upstream region 5 ′ from the cleavage point of the 5′-side fusion partner gene typically contains the TAZ-type zinc finger domain of the N-terminal side of the EP300 protein. All or part of the code region is included.
  • the base sequence of the downstream region 3 ′ from the cleavage point of the 3 ′ fusion partner gene typically contains all or part of the TAZ type zinc finger domain of ZNF384. Contains a code region.
  • Examples of the polynucleotide described in (a1) include the following combinations of polynucleotides (a1-1): (a1-1) A polynucleotide that hybridizes to all or part of the coding region of the TAZ-type zinc finger domain on the N-terminal side of EP300, and hybridizes to all or part of the coding region of the TAZ-type zinc finger domain of ZNF384 A combination of polynucleotides.
  • the region (target base sequence) to which the polynucleotide described in (a) used for in situ hybridization hybridizes is the 5 ′ side from the viewpoint of specificity to the target base sequence and sensitivity of detection.
  • a region within 1 million bases from the fusion point between the fusion partner gene (EP300 gene) and the 3 ′ fusion partner gene (ZNF384 gene) is preferred.
  • the polynucleotide described in (b) used in in situ hybridization is a fusion of a 5 ′ fusion partner gene and a 3 ′ fusion partner gene, which is a target base sequence of the polynucleotide.
  • Any nucleic acid may be used as long as it can detect the presence of genomic DNA encoding the fusion polypeptide in the biological sample by hybridizing to a base sequence containing a point.
  • the polynucleotide described in (a) or (b) used for in-situ hybridization covers the entire target base sequence from the viewpoint of specificity to the target base sequence and sensitivity of detection.
  • a group consisting of a plurality of types of polynucleotides is preferable.
  • the length of the polynucleotide constituting the population is at least 15 bases, preferably 100 to 1000 bases.
  • the polynucleotide described in (a) or (b) used for in situ hybridization is preferably labeled with a fluorescent dye or the like for detection.
  • fluorescent dyes include, but are not limited to, DEAC, FITC, R6G, TexRed, and Cy5.
  • radioisotopes eg, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, 33 P, 32 P, etc.
  • enzymes eg, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase
  • the polynucleotide may be labeled with a malate dehydrogenase, etc.
  • a luminescent substance eg, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin, 3,3′-diaminobenzidine (DAB), etc.
  • in situ hybridization when 5 ′ fusion partner gene probe 1 and 3 ′ fusion partner gene probe 1 are used, when 5 ′ fusion partner gene probe 1 and 5 ′ fusion partner gene probe 2 are used, Alternatively, when 3 ′ fusion partner gene probe 2 and 3 ′ fusion partner gene probe 1 are used, these probes are preferably labeled with different dyes.
  • the signal for example, fluorescence
  • the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected when an overlap with the signal emitted by the label of the gene probe 1 is observed.
  • the signal emitted from the label of the 5 ′ fusion partner gene probe 1 is separated from the signal emitted from the label of the 5 ′ fusion partner gene probe 2, the signal emitted from the label of the 3 ′ fusion partner gene probe 2 and the signal 3 ′ from the signal emitted from the label of the 3 ′ fusion partner gene probe 2.
  • separation from the signal emitted by the label of the fusion partner gene probe 1 is observed, it can be determined that the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected.
  • labeling of the polynucleotide can be performed by a known technique.
  • the polynucleotide can be labeled by incorporating a substrate base labeled with a fluorescent dye or the like into the polynucleotide by a nick translation method or a random prime method.
  • conditions for hybridizing the polynucleotide according to (a) or (b) and the biological sample may vary depending on various factors such as the length of the polynucleotide.
  • conditions for stringency hybridization include 0.2 ⁇ SSC and 65 ° C.
  • conditions for low stringency hybridization include 2.0 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • a person skilled in the art appropriately selects various conditions such as the concentration of surfactant (NP-40, etc.), the concentration of formamide, pH, etc. in addition to the salt concentration (SSC dilution ratio, etc.) and temperature.
  • SSC dilution ratio etc.
  • Examples of the method for detecting genomic DNA encoding a fusion polypeptide using the polynucleotide described in (a) or (b) include Southern blotting, Northern blotting, and dot blotting in addition to the in-situ hybridization. It is done.
  • the fusion gene is detected by hybridizing the polynucleotide described in (a) or (b) to a membrane to which a nucleic acid extract obtained from the biological sample is transferred.
  • the polynucleotide (a) When the polynucleotide (a) is used, the polynucleotide that hybridizes to the base sequence of the 5 ′ fusion partner gene and the polynucleotide that hybridizes to the base sequence of the 3 ′ fusion partner gene are developed on the membrane. When the same band is recognized, it can be determined that the genomic DNA encoding the fusion polypeptide has been detected.
  • Examples of the method for detecting genomic DNA encoding a fusion polypeptide using the polynucleotide (b) include genomic microarray analysis and DNA microarray analysis.
  • an array in which the polynucleotide (b) is immobilized on a substrate is prepared, and the genomic DNA is detected by bringing the biological sample into contact with the polynucleotide on the array.
  • the substrate is not particularly limited as long as it can immobilize oligo or polynucleotide, and examples thereof include glass plates, nylon membranes, micro beads, silicon chips, capillaries and the like.
  • the detection method of the present invention it is also preferable to detect the fusion polynucleotide using PCR.
  • a polynucleotide that is a pair of primers designed to specifically amplify a fusion polynucleotide using DNA (genomic DNA, cDNA) or RNA prepared from the biological sample as a template can be used.
  • the fusion polynucleotide can be specifically amplified means that the fusion polynucleotide is not amplified without amplifying the wild-type gene from which the 5′-end and 3′-end portions are derived from the fusion point of the fusion polynucleotide. It means that only nucleotides can be amplified, and all of the fusion polynucleotide may be amplified, or a part of the fusion polynucleotide including the fusion point may be amplified.
  • Polynucleotide which is a pair of primers” used in PCR, etc. consists of a sense primer (forward primer) and an antisense primer (reverse primer) that specifically amplify the target fusion polynucleotide.
  • the base sequence on the 5 ′ end side from the fusion point of the fusion polynucleotide is designed, and the antisense primer is designed from the base sequence on the 3 ′ end side from the fusion point of the fusion polynucleotide.
  • These primers are usually designed so that the PCR product is 5 kb or less from the viewpoint of accuracy and sensitivity of detection by PCR.
  • the design of the primer can be appropriately performed by a known method, and for example, Primer Express (registered trademark) software (Applied Biosystems) can be used.
  • the length of these polynucleotides is usually 15 bases or more (preferably 16, 17, 18, 19 or 20 bases or more, more preferably 21 bases or more), and 100 bases or less (preferably 90, 80, 70, 60, 50 or 40 bases or less, more preferably 30 bases or less).
  • polynucleotide as a pair of primers include a primer set comprising a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 and a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 9. It is done.
  • sequencing is performed on the PCR product, and the base sequence including the fusion point is determined. It can be confirmed that they are linked in-frame and / or contain a predetermined domain in the fusion polynucleotide. Sequencing can be performed by a known method, and can be easily performed by using a sequencer (for example, ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.)) according to the instruction manual.
  • a sequencer for example, ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.)
  • the TaqMan probe method is used to confirm that the 5 ′ gene portion and the 3 ′ gene portion are linked in-frame and / or in the fusion polynucleotide. It can be confirmed that a predetermined domain is included.
  • Examples of the probe used in the TaqMan probe method include the polynucleotides described in the above (a) or (b).
  • the probe is labeled with a reporter dye (eg, FAM, FITC, VIC, etc.) and a quencher (eg, TAMRA, Eclipse, DABCYL, MGB, etc.).
  • the primer and probe may be DNA, RNA, or DNA / RNA chimera, but is preferably DNA.
  • PNA polyamide nucleic acid, peptide nucleic acid
  • LNA registered trademark, locked nucleic acid, Bridged Nucleic acid, cross-linked nucleic acid
  • ENA registered trademark, 2'-O, 4'-C Nucleotides
  • the primers and probes may be double-stranded or single-stranded, but are preferably single-stranded.
  • the primers and probes may contain one or a plurality of nucleotide mismatches as long as they can specifically hybridize to the target sequence, and are usually 80% or more, preferably 90, relative to the complementary sequence of the target sequence. 91, 92, 93, 94% or more, more preferably 95, 96, 97, 98, 99% or more identity, most preferably 100% identity.
  • primers and probes can be synthesized according to a conventional method using a DNA / RNA automatic synthesizer based on, for example, information on the base sequence described in the present specification.
  • the fusion polynucleotide may be detected by whole transcriptome sequencing (RNA sequencing) or genome sequencing.
  • RNA sequencing whole transcriptome sequencing
  • next-generation sequencers for example, Genome Analyzer IIx (Illumina), HiSeq Sequencer (HiSeq2000, Illumina), Genome Sequencer FLX System (Roche), etc.
  • a cDNA library is prepared from total RNA using a commercially available kit (eg, mRNA-Seq sample preparation kit (Illumina) etc.) according to the manufacturer's instructions, and this is used as a next-generation sequencer. This can be done by subjecting it to the sequencing used.
  • a translation product ie, fusion polypeptide
  • a fusion polypeptide a translation product of a fusion polynucleotide
  • an antibody that specifically recognizes the fusion polypeptide is used.
  • “specifically recognize a fusion polypeptide” means a protein other than the fusion polypeptide, including wild-type proteins derived from the N-terminal side and the C-terminal side from the fusion point of the fusion polypeptide. Recognizing only the fusion polypeptide without recognizing.
  • the antibody “specifically recognizes the fusion polypeptide” used in the detection method of the present invention may be one antibody or a combination of two or more antibodies.
  • the “antibody specifically recognizing the fusion polypeptide” examples include an antibody specific to the polypeptide containing the fusion point of the fusion polypeptide (hereinafter also referred to as “fusion point-specific antibody”).
  • fusion point-specific antibody means an antibody that specifically binds to a polypeptide containing the fusion point but does not bind to a wild-type protein from which the N-terminal and C-terminal portions are derived. To do.
  • the “antibody specifically recognizing the fusion polypeptide” refers to an antibody that binds to a polypeptide consisting of the N-terminal region from the fusion point of the fusion polypeptide and a C-terminal region from the fusion point of the fusion polypeptide. Also included are combinations of antibodies that bind to the polypeptide.
  • the fusion polypeptide can be detected by performing sandwich ELISA, immunostaining, immunoprecipitation, Western blotting, etc. using these two antibodies.
  • antibodies include natural antibodies such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies (mAbs), chimeric antibodies that can be produced using gene recombination techniques, humanized antibodies, single chain antibodies, and binding fragments thereof. Is included, but is not limited thereto.
  • the binding fragment means a partial region of the antibody having specific binding activity, and specific examples include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, and a single chain antibody.
  • the class of the antibody is not particularly limited, and may be an antibody having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE, but IgG is more preferable in consideration of ease of purification.
  • “An antibody that specifically recognizes the fusion polypeptide” can be prepared by a person skilled in the art by appropriately selecting a known method.
  • a known technique includes a polypeptide comprising a fusion point of the fusion polypeptide, a polypeptide comprising a region N-terminal from the fusion point of the fusion polypeptide, or a C-terminal side of the fusion polypeptide.
  • the animal's serum (polyclonal antibody) is recovered, the hybridoma method, the recombinant DNA method, the phage display method, etc. And a method for producing a monoclonal antibody.
  • the target protein can be directly detected by detecting the label.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can bind to an antibody and can be detected.
  • peroxidase ⁇ -D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein isotope
  • HRP horseradish peroxidase
  • fluorescein isotope examples include thiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin, and radioactive substances.
  • a method for indirectly detecting the target protein using a secondary antibody, protein G or protein A to which a labeling substance is bound can also be used.
  • the present invention includes a kit for detecting a gene fusion (preferably a gene fusion that is a responsible mutation (driver mutation) of cancer) including any of the following or a combination thereof (hereinafter also referred to as a kit of the present invention).
  • )I will provide a: (A) a polynucleotide that is a probe designed to specifically recognize an EP300-ZNF384 fusion polynucleotide; (B) a polynucleotide that is a pair of primers designed to specifically amplify an EP300-ZNF384 fusion polynucleotide; or (C) an antibody that specifically recognizes an EP300-ZNF384 fusion polypeptide.
  • the kit of the present invention includes, in addition to the polynucleotide and antibody, a substrate necessary for detection of a label added to the polynucleotide or antibody, a positive control (for example, EP300-ZNF384 fusion polynucleotide, EP300-ZNF384 fusion polypeptide, or Cells that hold these), negative controls, PCR reagents, counterstaining reagents used in in situ hybridization (DAPI, etc.), and molecules necessary for antibody detection (eg, secondary antibodies, protein G, protein A), buffer solutions used for sample dilution and washing, and the like can be included in appropriate combinations. Instructions for use can also be included in the kit of the present invention. By using the kit of the present invention, the detection method of the present invention can be easily carried out.
  • a positive control for example, EP300-ZNF384 fusion polynucleotide, EP300-ZNF384 fusion polypeptide, or Cells that hold these
  • negative controls for example, EP300
  • the detection method and the detection kit of the present invention enable detection of a newly discovered gene fusion as a responsible mutation of cancer, identify a positive example of the gene fusion as described later, and This is extremely useful in determining prognosis and applying personalized medicine.
  • the present invention provides a method for determining the prognosis of cancer based on the presence of the EP300-ZNF384 gene fusion (hereinafter also referred to as the determination method of the present invention).
  • the determination method of the present invention includes the following steps: (1) In an isolated sample derived from a subject, an EP300-ZNF384 fusion polypeptide comprising a TAZ-type zinc finger domain on the N-terminal side of EP300 and a TAZ-type zinc finger domain of ZNF384, or a polypeptide encoded thereby And (2) a step of determining that the prognosis of cancer is good in the subject when the fusion polynucleotide or the polypeptide encoded thereby is detected.
  • the “subject” is a mammal, preferably a human, who has cancer or is suspected of having cancer.
  • the “cancer” to which the identification method of the present invention is applied is not particularly limited as long as EP300-ZNF384 gene fusion can be detected, but is preferably leukemia, more preferably acute lymphoblastic.
  • Step (1) in the determination method of the present invention can be performed in the same manner as the step included in the detection method of the present invention.
  • the favorable prognosis of cancer is 1 year or more (preferably 2 years or more, 3 years or more, or 4 years or more, more preferably 5 years after the initial remission. That the cancer does not recur for over a year).
  • the determination method of the present invention it becomes possible to determine the prognosis of cancer for a cancer patient or a subject suspected of having cancer, and appropriate treatment is performed for the cancer patient. This is useful in that it becomes possible.
  • the present invention relates to an isolated EP300-ZNF384 fusion polypeptide (hereinafter also referred to as the fusion polypeptide of the present invention) comprising a TAZ-type zinc finger domain on the N-terminal side of EP300 and a TAZ-type zinc finger domain of ZNF384, or a Provide a fragment.
  • an “isolated” substance refers to another substance (preferably a biological agent) (eg, a nucleic acid) in the environment in which the substance exists in nature (eg, within the organism's cells).
  • a nucleic acid containing a non-nucleic acid factor and a nucleic acid sequence other than the target nucleic acid in the case of a protein, such as a protein containing a non-protein factor and an amino acid sequence other than the target protein). It means what was done.
  • isolated preferably refers to 75% or more, more preferably 85% or more, even more preferably 95% or more, and most preferably 96% or more, 97% or more.
  • isolated polynucleotides and polypeptides include polynucleotides and polypeptides purified by standard purification methods, as well as chemically synthesized polynucleotides and polypeptides.
  • “Fragment” refers to a fragment of the fusion polypeptide of the present invention, comprising a continuous partial sequence including sequences upstream and downstream of the fusion point.
  • the sequence upstream of the fusion point contained in the partial sequence is one or more amino acid residues from the fusion point (for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 , 100 amino acid residues or more) and may include up to the N-terminus of the fusion polypeptide of the present invention.
  • the sequence downstream of the fusion point contained in the partial sequence is one or more amino acid residues from the fusion point (for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 , 100 amino acid residues or more) and may include up to the C-terminus of the fusion polypeptide of the present invention.
  • the length of the fragment is not particularly limited, but is usually 8 amino acid residues or more (for example, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 50, 100 amino acid residues or more).
  • the fusion polypeptide of the present invention can be, for example, the following isolated fusion polypeptide.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added
  • iii represented by SEQ ID NO: 2
  • the present invention provides an isolated polynucleotide encoding the above-mentioned fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof (hereinafter also referred to as the polynucleotide of the present invention).
  • the polynucleotide of the present invention may be any of mRNA, cDNA and genomic DNA. It may be double-stranded or single-stranded.
  • a typical example of the cDNA encoding the EP300-ZNF384 fusion polypeptide is a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced by a method known per se. For example, it can be extracted from a cDNA library or a genomic library prepared from a cancer tissue or the like holding an EP300-ZNF384 fusion polynucleotide using a known hybridization technique. Moreover, it can also prepare by amplifying using mRNA, cDNA, or genomic DNA prepared from the said cancer tissue etc. using a well-known gene amplification technique (PCR) as a template.
  • PCR gene amplification technique
  • PCR restriction enzyme treatment
  • site-directed mutagenesis site-directed mutagenesis method using wild-type gene cDNA derived from the 5 'end and 3' end of EP300-ZNF384 fusion polynucleotide (Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.) and the like can also be used for the preparation.
  • the fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof can also be produced by a method known per se. For example, by inserting the polynucleotide prepared as described above into an appropriate expression vector, introducing the vector into a cell-free protein synthesis system (for example, reticulocyte extract, wheat germ extract), and incubation, Further, the fusion polypeptide of the present invention can be prepared by introducing the vector into an appropriate cell (for example, E. coli, yeast, insect cell, animal cell) and culturing the obtained transformant.
  • a cell-free protein synthesis system for example, reticulocyte extract, wheat germ extract
  • the fusion polypeptide of the present invention can be prepared by introducing the vector into an appropriate cell (for example, E. coli, yeast, insect cell, animal cell) and culturing the obtained transformant.
  • the fusion polypeptide of the present invention or a fragment thereof can be used as a marker in the detection method of the present invention, and can also be used for production of an antibody against the fusion polypeptide of the present invention.
  • RNA sequencing> A cDNA library for RNA sequencing was prepared using TruSeq RNA sample preparation kit v2 Set B (Illumina) according to the manufacturer's standard protocol. The analysis of the total RNA sequence was performed by a paired end method using a next-generation sequencer (HiSeq1000 Illumina).
  • CDNA was synthesized from total RNA extracted from leukemia cells of a subject using ReverTra Ace (registered trademark) qPCR RT Master Mix (Toyobo). The obtained cDNA was subjected to PCR amplification using rTaq DNA Polymerase (Toyobo). Amplification of the desired size gene fragment was confirmed by agarose gel electrophoresis. The amplified gene fragment was TA cloned into a pGEM-T easy vector (PROMEGA).
  • FISH Fluorescence in situ hybridization
  • Example This example describes the identification of novel fusion transcripts in leukemia cells.
  • transcriptome analysis of leukemia cells obtained from 106 children with leukemia was performed.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 was detected in one case.
  • the region on the 5 ′ end side coincided with the sequence encoding EP300 (chromosome 22q13.2), and the region on the 3 ′ end side was a sequence encoding ZNF384 (chromosome 12p13.31).
  • An example of the accession number of the matched sequence is shown below.
  • Homo sapiens zinc finger protein 384 (ZNF384), transcript variant X6, mRNA Select seq ref
  • FIG. 1 shows the domain structure of the EP300-ZNF384 fusion protein encoded by the nucleotide sequence.
  • EP300-ZNF384 gene a novel fusion gene, is present in leukemia cells of BCP-ALL patients.
  • This first EP300-ZNF384-positive case was characterized by a weak expression of CD10 (common-ALL antigen) and a positive myelocytic antigen with respect to cell markers. Therefore, 32 CD10 (common-ALL antigen) negative to weakly positive BCP out of a group of 344 consecutive ALL registered cases (including 41 T-ALL etc. in addition to 293 BCP-ALL) RT-PCR was performed on -ALL (including the above 1 example) using the following primers. As a result, a 441 bp fragment indicating the presence of the EP300-ZNF384 gene was amplified in 3 cases of CD10 weakly positive BCP-ALL including the above 1 case (FIG. 2).
  • RT-PCR was performed in the same manner for all cases except for cases in which known chimeric genes were detected and cases in which samples for analysis were not preserved. There were no positive cases other than the above 3 cases.
  • Forward primer agctctctaggggtgggtca (SEQ ID NO: 8)
  • Reverse primer cagctggtctgacttggact (SEQ ID NO: 9)
  • two-color FISH analysis was performed using two probes that hybridize to the EP300 gene and the ZNF384 gene, respectively (FIG. 4).
  • Overlapping signals (arrowheads in Fig. 4) were detected in 954 cells out of 1,000 cells examined, and the presence of the EP300-ZNF384 fusion gene was confirmed.
  • the EP300-ZNF384 fusion gene was considered to be specific for BCP-ALL, and the frequency of its occurrence was estimated to be about 1% of BCP-ALL (3/293 cases).
  • the EP300-ZNF384 gene fusion is a cryptic trans for the normal karyotype by the chromosome G-band method (the remaining 1 case cannot be examined because a metaphase plate cannot be obtained). Probably caused by location.
  • the present invention it is possible to detect the EP300-ZNF384 gene fusion newly found as a responsible mutation for cancer, to determine the prognosis of cancer based on the presence of the gene fusion, It is possible to perform treatment (individualized medicine) suitable for patients.
  • SEQ ID NO: 1 EP300-ZNF384 fusion polynucleotide
  • SEQ ID NO: 2 EP300-ZNF384 fusion polypeptide
  • SEQ ID NO: 3 EP300 cDNA
  • SEQ ID NO: 4 EP300 polypeptide
  • SEQ ID NO: 5 ZNF384 cDNA
  • SEQ ID NO: 6 ZNF384 polypeptide
  • SEQ ID NO: 7 EP300-ZNF384 fusion polynucleotide partial sequence
  • SEQ ID NO: 9 Reverse primer

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Abstract

[課題]白血病などのがんにおいて予後を判定する指標となりうる変異を同定すること、当該変異を検出する手段を提供することなど。 [解決手段]遺伝子融合の検出方法であって、被験者由来の単離された試料におけるEP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む、方法。

Description

Ｂ前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病新規キメラ遺伝子
　本発明は、がんの責任変異である遺伝子融合の検出方法、当該遺伝子融合の存在に基づきがんの予後を判定する方法などに関する。
　がんは日本における死因の第一位を占める疾病である。がん細胞は、遺伝的変化により悪性化することが知られている。がんのタイプに特徴的な遺伝的変化を特定することは、発がん機構の解明のみならず、がんの診断および予後予測、がんの治療法の開発および選択などにも貢献することが期待されている。
　キメラ遺伝子（本明細書中、融合遺伝子とも称する）は、本来は全く別個の分子として機能しているタンパク質をコードする２つの遺伝子が染色体転座等の異常にともなって融合することにより形成され、その結果として異常な機能を有する融合タンパク質を産生する。キメラ遺伝子は、白血病やその他のがんの発生の原因となることが知られており、診断における指標および創薬の標的として利用されている。特に近年、がん化に関与するシグナル伝達経路の構成因子（例えば、キナーゼ）に関連するキメラ遺伝子を有するがんに対して、分子標的療法の成功例が増加している。例えば、ALKタンパク質を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、クリゾチニブ）がEML4-ALK融合遺伝子を有する肺がん患者の治療に有効であること、BCR-ABL融合遺伝子によってコードされるタンパク質を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ）が当該融合遺伝子を有する白血病患者の治療に有効であることなどが示されている。
　急性リンパ芽球性白血病（ALL）は、リンパ球が幼若な段階で悪性化して、異常に増加するがんの一種である。ALLは、小児から成人までのどの年齢層にも発生するが、小児においては最も一般的ながんとして知られている。ALLについても遺伝的変化として多数のキメラ遺伝子が報告されている。例えば、小児ALLの約8割を占めるB前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病（B-ALLまたはBCP-ALLともいう）では、その約半数に既知のキメラ遺伝子を認める。最も頻度が高いのはETV6-RUNX1で約1/4の症例に検出される。この他、MLL-AF4を始めとするMLL遺伝子を含んだキメラ遺伝子、TCF3-PBX1、BCR-ABL1がそれぞれ5%程度、TCF3-HLFが1%未満に検出される。いずれも、白血病発症に関与すると推測されるが、機能的な作用が明らかにされているBCR-ABL1を除いては、その役割については未解明である。しかし、これらのキメラ遺伝子は、治療反応性と良く相関し、ETV6-RUNX1陽性症例は予後良好であるが、それ以外は予後不良であることから、現在は初期診断に必須の項目となっており、その検査結果は治療強度の決定に用いられている。また、上記以外にも様々なキメラ遺伝子が非常に低い頻度で検出され、非特許文献１には、IKZF1変異を有しBCR-ABL1陰性であり予後不良であるALL（Ph-like ALL）における遺伝的変化を特定するために、Ph-like ALLとして特定されたBCP-ALLの症例についてRNAシーケンシングおよび全ゲノムシーケンシングを行い、NUP214-ABL1、EBF1-PDGFRB、BCR-JAK2、STRN3-JAK2、PAX5-JAK2、ETV6-ABL1、RANBP2-ABL1、およびRCSD1-ABL1のインフレーム融合を特定したことが記載されている。またEBF1-PDGFRB、BCR-JAK2、およびNUP214-ABL1が、チロシンキナーゼ阻害剤による治療における標的となる可能性があることも示されている。BCP-ALLでは、上記キメラ遺伝子に加えて、約1/4の症例に染色体の数的異常が明らかにされている。しかし、残りの約1/4の症例では、発症の原因となり得る異常は明らかにされていない。
　EP300/E1A binding protein p300は、転写因子と結合し、転写コアクチベーターとして多くの遺伝子の転写活性を調節しており、細胞増殖、細胞分裂、細胞の成熟、分化などに関与すると考えられている。またEP300は、B細胞分化に関連する因子の一つであると考えられている。EP300と他の遺伝子とのキメラ遺伝子としては、急性骨髄性白血病に関連して、染色体転座t(11;22)(q23;q13)によって生じるMLL-EP300（非特許文献２）、t(8;22)(p11;q13)によって生じるMYST3(MOZ)-EP300（非特許文献３）などがこれまでに報告されている。
　ZNF384は、C2H2-型のジンクフィンガータンパク質であり、転写調節因子として機能し、MMP1、MMP3、MMP7、COL1A1等の細胞外マトリックスをコードする遺伝子のプロモーター活性を調節していると考えられている。ZNF384と他の遺伝子とのキメラ遺伝子としては、t(12;17)(p13;q11)によって生じるTAF15-ZNF384がALL患者において見つかっており、またALLから急性骨髄性白血病（AML）へのスイッチ、マウス線維芽細胞のトランスフォームなどに関与することが報告されている（非特許文献４～８）。また急性白血病に関連して、t(12;22)(p13;q12)によって生じるEWSR1-ZNF384（非特許文献４および５）、t(12;19)(p13.3; p13.3)によって生じるE2A-ZNF384（非特許文献９）などが報告されている。
Roberts KG et al., Cancer Cell, 2012, 22(2), 153-66. Ida K et al., Blood, 1997, 90(12), 4699-704. Kitabayashi I et al., Leukemia, 2001, 15(1), 89-94. Martini A et al., Cancer Res, 2002, 62(19), 5408-12. Janssen H and Marynen P, Exp Cell Res, 2006, 312(7), 1194-204. Grammatico S et al., Leuk Lymphoma, 2013, 54(8), 1802-5. Thorsen J et al., Cancer Genet, 2011, 204(8), 458-61. Nyquist KB et al., Cancer Genet, 2011, 204(3), 147-52. Zhong CH et al., Leukemia, 2008, 22(4), 723-9.
　ALLを含む白血病などのがんにおける変異の同定はいまだ十分になされているとはいえず、がんの予後を判定する指標となりうる変異などのさらなる同定が望まれているのが現状である。
　したがって本発明は、ALLを含む白血病などのがんにおいて予後を判定する指標となりうる変異を同定すること、当該変異を検出する手段を提供することなどを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、B前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病（BCP-ALL）において発現している新規融合遺伝子としてEP300-ZNF384遺伝子を同定した。EP300-ZNF384遺伝子融合の出現頻度は、BCP-ALLの約1%と推定された。EP300遺伝子およびZNF384遺伝子のそれぞれについて、他の遺伝子との融合遺伝子が報告されていたものの、EP300-ZNF384融合遺伝子の存在についてはいずれの先行技術を考慮しても全く予想外であった。
　またEP300-ZNF384遺伝子融合が検出されたALL患者は、観察期間5年以上にわたり初回寛解を維持しており、当該遺伝子融合は予後良好因子である可能性が高い。
　本発明者らは、これら知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］遺伝子融合の検出方法であって、被験者由来の単離された試料において、EP300のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインおよびZNF384のTAZ型ジンクフィンガードメインを含むEP300-ZNF384融合ポリペプチド、またはそれをコードする融合ポリヌクレオチドを検出する工程を含む、方法。
［２］融合ポリペプチドが、下記（i）～（iii）のいずれかである、［１］に記載の方法：
（i）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
（iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［３］融合ポリヌクレオチドが下記（i）～（iii）のいずれかである、［１］または［２］に記載の方法：
（i）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
［４］遺伝子融合が、がんの責任変異（ドライバー変異）である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］がんがB前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病である、［４］に記載の方法。
［６］がんの予後を判定する方法であって、下記の工程を含む、方法：
（1）被験者由来の単離された試料において、EP300のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインおよびZNF384のTAZ型ジンクフィンガードメインを含むEP300-ZNF384融合ポリペプチド、またはそれをコードする融合ポリヌクレオチドを検出する工程；ならびに
（2）前記融合ポリペプチド、またはそれをコードする融合ポリヌクレオチドが検出された場合に、前記被験者においてがんの予後が良好であると判定する工程。
［７］遺伝子融合の検出用キットであって、下記（A）～（C）のいずれかまたはそれらの組合せを含む、キット：
（A）EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド；
（B）EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
（C）EP300-ZNF384融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
［８］遺伝子融合が、がんの責任変異（ドライバー変異）である、［７］に記載のキット。
［９］EP300のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインおよびZNF384のTAZ型ジンクフィンガードメインを含む、単離されたEP300-ZNF384融合ポリペプチドまたはその断片。
［１０］融合ポリペプチドが、下記（i）～（iii）のいずれかである、［９］に記載の融合ポリペプチドまたはその断片：
（i）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
（iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［１１］［９］または［１０］に記載の融合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
　本発明によれば、本願発明によりはじめて明らかとなった特定のがんの未知の責任変異を検出することが可能となり、当該責任変異の存在に基づきがんの予後を判定することが可能となる。
　また成人も含めて急性リンパ芽球性白血病の場合には、遺伝子異常の有無と種類が治療反応性と密接に関係しており、その検出によって治療の層別化が行なわれている。本発明のEP300-ZNF384キメラ遺伝子を検出することによって患者が他の予後不良なキメラ遺伝子を有する可能性が否定されれば、治療リスクを上げる必要性はないという判断が可能になる。また例えば、非キナーゼ関連キメラ遺伝子である本発明のEP300-ZNF384キメラ遺伝子が検出された場合には、基本的にチロシンキナーゼ阻害剤の適応にはならないと判断することが可能になり、ALL患者に対してより適切な治療方針を決定することが可能となる。
　さらに、BCP-ALLの中でEP300-ZNF384キメラ遺伝子の出現頻度は1%と、他のキメラ遺伝子のものと比較しても非常に高いことから、EP300-ZNF384キメラ遺伝子の検出は、初期診断のルーチンな検査項目などとして、その臨床的意義は極めて大きいものである。
図１は、EP300-ZNF384融合タンパク質のドメイン構造の一例を示す概略図である。下向き矢印はEP300タンパク質およびZNF384タンパク質における切断点、ならびにEP300-ZNF384融合タンパク質における融合点を示す。 図２は、EP300-ZNF384遺伝子融合をRT-PCRにより検出した結果を示す電気泳動の写真である。左側から、1レーン目は分子量マーカー（Phi-X174/Hae III）を、2-4レーン目は、当該遺伝子融合陽性3症例の白血病細胞由来cDNAから増幅された融合部分を含む遺伝子断片を示す。 図３は、増幅した遺伝子断片の塩基配列決定の結果を示す。融合点を垂直の線で示す。 図４は、EP300に対するプローブ（短い矢印）およびZNF384に対するプローブ（長い矢印）を用いたFISH解析の結果を示す。遺伝子融合の存在を示す2つのシグナルの重なりを矢頭で示す。
　後述の実施例において示す通り、本発明者らは、がん組織において、がんの責任変異（ドライバー変異）としてEP300-ZNF384遺伝子融合を初めて見出した。本発明はかかる知見に基づき、当該遺伝子融合の検出方法、当該責任変異の存在に基づくがんの予後を判定する方法等を提供する。
　本発明において「がんの責任変異」とは、ドライバー変異と互換的に使用される用語であるが、がん組織に存在する変異であって、細胞に対するがん化能を有する変異をいう。典型的には、ある変異が見出されたがん組織において、既知のがん遺伝子変異がいずれも存在しない場合（すなわち、当該変異が前記既知のがん遺伝子変異と相互排他的に存在する場合）、当該変異はがんの責任変異であるということができる。
＜具体的ながんの責任変異＞
　以下、具体的な遺伝子融合について説明する。なお本明細書中、融合ポリヌクレオチドにおける「融合点」とは、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とが接続される境界を意味し、これは2つのヌクレオチド残基の間の境界である。また融合ポリペプチドにおける「融合点」とは、N末端側のポリペプチドとC末端側のポリペプチドとが接続される境界を意味し、これは2つのアミノ酸残基の間の境界であるか、または遺伝子融合が1つのコドン内で生じた場合には当該コドンによりコードされる1つのアミノ酸残基自体である。
　EP300-ZNF384遺伝子融合は、EP300タンパク質とZNF384タンパク質の融合タンパク質（以下、EP300-ZNF384融合ポリペプチドとも称する）の発現を生じる変異であり、ヒト染色体においては22q13.2および12p13.31の領域内に切断点を有する転座（t(12;22)）により生じる変異である。
　EP300（E1A binding protein p300）タンパク質は、ヒトにおいては22q13.2に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号4で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NM_001429.3（20-Apr-2014））からなるタンパク質である。EP300タンパク質は、B細胞分化に関連する因子の一つであると考えられている。EP300タンパク質は、2つのTAZ型ジンクフィンガードメイン、CREB-binding site、ブロモドメイン、ZZ型ジンクフィンガードメイン、および核内受容体コアクチベータードメインを有することを特徴としている（図１）。N末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインは、例えば、ヒトであれば配列番号4で表されるアミノ酸配列の347～416位のアミノ酸配列に該当する。
　ZNF384タンパク質は、ヒトにおいては12p13.31に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、典型的には配列番号6で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号NP_597733.2（26-Feb-2014））からなるタンパク質である。ZNF384タンパク質は、TAZ型ジンクフィンガードメインを有することを特徴としている（図１）。TAZ型ジンクフィンガードメインは、例えば、ヒトであれば配列番号6で表されるアミノ酸配列の208～394位のアミノ酸配列に該当する。
　EP300-ZNF384融合ポリペプチドは、EP300タンパク質のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインおよびZNF384タンパク質のTAZ型ジンクフィンガードメインを含むポリペプチドである。EP300-ZNF384融合ポリペプチドには、EP300タンパク質のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインの全部が含まれてもよいし、その一部が含まれてもよい。EP300-ZNF384融合ポリペプチドには、ZNF384タンパク質のTAZ型ジンクフィンガードメインの全部が含まれてもよいし、その一部が含まれてもよい。
　本発明において、EP300-ZNF384融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドとも称する）は、EP300タンパク質のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインおよびZNF384タンパク質のTAZ型ジンクフィンガードメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。
　本発明におけるEP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のポリペプチドをコードするEP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
（iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　配列番号2で表されるアミノ酸配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたEP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列である。
　上記(ii)において、「1若しくは複数のアミノ酸」とは、通常、1～50個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個、さらにより好ましくは1～数個（例えば、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個）のアミノ酸を意味する。
　上記(iii)において、「80％以上の配列同一性」とは、好ましくは８５%以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、さらにより好ましくは９７%以上、９８％以上、９９%以上の配列同一性を意味する。アミノ酸配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）に基づくBLASTXまたはBLASTPと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は当業者にはよく知られている（例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
　また本発明におけるEP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドは、例えば、下記のいずれかのポリヌクレオチドであり得る：
（i）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（iii）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、または
（iv）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
　配列番号１で表される塩基配列は、後述の実施例において示すように、ヒトがん組織由来のサンプル中に見出されたEP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドの塩基配列である。
　上記(ii)において、「ストリンジェントな条件下」とは、特に記載した場合を除き、中程度または高程度にストリンジェントな条件をいう。
　中程度にストリンジェントな条件は、例えば、対象となるポリヌクレオチドの長さに基づき、当業者であれば容易に設計することができる。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、第6～7章、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示されている。典型的には、中程度にストリンジェントな条件は、ニトロセルロースフィルターに関し、5×SSC、0.5％SDS、1.0 mM EDTA（pH8.0）の前洗浄条件；約40～50℃での、約50％ホルムアミド、2～6×SSC（または、約42℃での、約50％ホルムアミド中のStark's solutionなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件；および約40℃～60℃、0.5～6×SSC、0.1％ SDSの洗浄条件を含む。中程度にストリンジェントな条件は、好ましくは、約50℃、6×SSCのハイブリダイゼーション条件を含み、前述の洗浄条件および／または洗浄条件を含んでいてもよい。
　高程度にストリンジェントな条件（高ストリンジェントな条件）もまた、例えば、対象となるポリヌクレオチドの長さに基づき、当業者であれば容易に設計することができる。高ストリンジェントな条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度が含まれる。典型的には、約65℃、0.2～6×SSC、好ましくは6×SSC、より好ましくは2×SSC、さらに好ましくは0.2×SSCのハイブリダイゼーション条件を含む。いずれの場合も、約65～68℃、0.2×SSC、0.1％ SDSの洗浄条件を含むことが好ましい。
　いずれの場合も、ハイブリダイゼーション、前洗浄および洗浄のための緩衝液として、SSC（1×SSCは、0.15 M NaClおよび15 mM クエン酸ナトリウムである。）の代わりにSSPE（1×SSPEは、0.15 M NaCl、10 mM NaH2PO4、および1.25 mM EDTA、pH7.4である。）を代用することができる。いずれの場合も、洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、約15分間行うことができる。
　上記(iii)において、「1若しくは複数のヌクレオチド」とは、通常、1～50個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～10個、さらにより好ましくは1～数個（例えば、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個）のヌクレオチドを意味する。
　上記(iv)において、「80％以上の配列同一性」とは、好ましくは８５%以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、さらにより好ましくは９７%以上、９８％以上、９９%以上の配列同一性を意味する。塩基配列の同一性は、前記アルゴリズムBLASTに基づくBLASTNと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。
＜遺伝子融合の検出方法＞
　本発明は、EP300-ZNF384遺伝子融合の検出方法（以下、本発明の検出方法とも称する）を提供する。当該遺伝子融合は、好ましくはがんの責任変異（ドライバー変異）を生じる。本発明の検出方法は、被験者由来の単離された試料におけるEP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程を含む。
　本発明の検出方法において、被験者は、哺乳動物であれば特に限定されない。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、シマリス、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク、イヌ、ネコ、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができるが、ヒトが好ましい。
　被験者は、がんに罹患している被験者のみならず、がんに罹患している疑いのある被験者、又は将来がんになるリスクを有する被験者であってもよい。本発明の検出方法を適用する対象となる「がん」としては、EP300-ZNF384遺伝子融合が検出され得るがんであれば特に限定されないが、好ましくは白血病であり、さらに好ましくは急性リンパ芽球性白血病（ALL）であり、特に好ましくはB前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病（BCP-ALL）である。
　被験者由来の「単離された試料」は、生体試料（例えば、細胞、組織、臓器（例えば、小腸、脾臓、腎臓、肝臓、胃、肺、副腎、心臓、脳、膵臓、大動脈等）、体液（例えば、血液、リンパ液、骨髄液等）、消化液、喀痰、肺胞・気管支洗浄液、尿、便）のみならず、これらの生体試料から得られる核酸抽出物（ゲノムDNA抽出物、mRNA抽出物、mRNA抽出物から調製されたcDNA調製物やcRNA調製物等）やタンパク質抽出物も含む。ゲノムDNA、mRNA、cDNA又はタンパク質は、当業者であれば、前記試料の種類及び状態等を考慮し、それに適した公知の手法を選択して調製することが可能である。また、前記試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。
　また「単離された試料」は、前記がんが存在するか又は存在すると疑われる組織、臓器、または体液由来であることが好ましく、より好ましくは前記がんが存在するかまたは存在すると疑われる血液または骨髄液由来である。そのような「単離された試料」としては、例えば、白血病（好ましくはALL、より好ましくはBCP-ALL）患者または白血病に罹患している疑いのある被験者の血液または骨髄液由来の細胞、当該細胞から抽出した全RNAなどが挙げられる。
　本発明の検出方法において、融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドの検出は、自体公知の手法を用いて行なうことができる。
　ゲノムDNAからの転写産物（mRNAまたはmRNAから調製したcDNA）を対象とする場合、例えば、RT-PCR法、シークエンシング、TaqManプローブ法、ノーザンブロッティング、ドットブロット法、cDNAマイクロアレイ解析等を利用してmRNA又はcDNAである融合ポリヌクレオチドを検出することができる。
　またゲノムDNAを対象とする場合、例えば、in situハイブリダイゼーション（ISH）、ゲノムPCR法、シークエンシング、TaqManプローブ法、サザンブロッティング、ゲノムマイクロアレイ解析等を利用してゲノムDNAである融合ポリヌクレオチドを検出することができる。
　これらの手法はそれぞれ単独で利用することができるが、組み合わせて利用してもよい。例えば、EP300-ZNF384遺伝子融合は、融合ポリペプチドを発現することによりがん化に寄与すると考えられることから、ゲノムDNAである融合ポリヌクレオチドを検出する場合（例えばin situハイブリダイゼーション等による）には、転写産物またはタンパク質が生成することをさらに確認すること（例えばRT-PCR、免疫染色法等による）も好ましい。
　ハイブリダイゼーション技術（例えば、TaqManプローブ法、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、ドットブロット法、マイクロアレイ解析、in situハイブリダイゼーション（ISH）など）により融合ポリヌクレオチドを検出する場合には、前記融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチドを使用することができる。ここで「融合ポリヌクレオチドを特異的に認識する」とは、ストリンジェントな条件で、当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子を含めて当該融合ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドから、当該融合ポリヌクレオチドを識別して認識することをいう。
　本発明の検出方法においては、治療又は診断の過程で得られる生体試料（生検サンプル等）は、ホルマリン固定されていることが多いため、検出対象であるゲノムＤＮＡがホルマリン固定下においても安定しており、検出感度が高いという観点から、in situハイブリダイゼーションを用いることが好適である。
　in situハイブリダイゼーションにおいては、前記生体試料に、融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチドとして少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ（融合ポリヌクレオチド）を検出することができる。
（ａ）5’側融合パートナー遺伝子（EP300遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズするプローブ及び3’側融合パートナー遺伝子（ZNF384遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）5’側融合パートナー遺伝子と3’側融合パートナー遺伝子との融合点を含む塩基配列にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
　本発明にかかるEP300遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000022.11で特定されるゲノムの配列のうち41092302から41180083番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
　本発明にかかるZNF384遺伝子は、ヒト由来のものであれば、典型的にはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号　NC_000012.12で特定されるゲノムの配列のうち6666477から6689572番目のＤＮＡ配列（相補鎖にコードされる）からなる遺伝子である。
　しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変化しうる。従って、このような天然の変異体も本発明の対象になりうる（以下、同様）。
　本発明の（ａ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、5’側融合パートナー遺伝子（EP300遺伝子）の塩基配列および／または3’側融合パートナー遺伝子（ZNF384遺伝子）の塩基配列にハイブリダイズすることにより、前記生体試料における融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、好ましくは、下記（ａ１）～（ａ３）に記載のポリヌクレオチドである：
（ａ１）　5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）と、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）との組み合わせ；
（ａ２）　5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）と、5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「5’融合パートナー遺伝子プローブ２」とも称する）との組み合わせ；
（ａ３）　3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ２」とも称する）と、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「3’融合パートナー遺伝子プローブ１」とも称する）との組み合わせ。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、5’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも5’側の上流領域の塩基配列には、典型的にはEP300タンパク質のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　上記（ａ１）～（ａ３）において、3’側融合パートナー遺伝子の切断点よりも3’側の下流領域の塩基配列には、典型的にはZNF384のTAZ型ジンクフィンガードメインの全部または一部のコード領域が含まれる。
　前記（ａ１）に記載のポリヌクレオチドとしては、例えば、以下の(a1-1)のポリヌクレオチドの組み合わせが挙げられる：
(a1-1)EP300のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、ZNF384のTAZ型ジンクフィンガードメインの全部または一部のコード領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドの組み合わせ。
　本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域（標的塩基配列）としては、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、5’側融合パートナー遺伝子（EP300遺伝子）と3’側融合パートナー遺伝子（ZNF384遺伝子）との融合点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましい。
　また、本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、5’側融合パートナー遺伝子と3’側融合パートナー遺伝子との融合点を含む塩基配列にハイブリダイズすることにより、前記生体試料における融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、典型例としては、配列番号1に記載の塩基配列中の融合点を含む塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
　また、本発明において、in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、前記標的塩基配列全体をカバーすることのできる、複数種のポリヌクレオチドからなる集団であることが好ましい。かかる場合、該集団を構成するポリヌクレオチドの長さは少なくとも１５塩基であるが、１００～１０００塩基であることが好ましい。
　in situハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、検出のため、蛍光色素等によって標識されていることが好ましい。かかる蛍光色素としては、例えば、ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに制限されない。また、蛍光色素以外に放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、33Ｐ、32Ｐ等）、酵素（例：β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）等）、によって、前記ポリヌクレオチドを標識してもよい。
　in situハイブリダイゼーションにおいて、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１と3’側融合パートナー遺伝子プローブ１とを用いる場合、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１と5’側融合パートナー遺伝子プローブ２とを用いる場合、または3’融合パートナー遺伝子プローブ２と3’融合パートナー遺伝子プローブ１とを用いる場合、これらプローブは互いに異なる色素にて標識されていることが好ましい。そして、このように異なる色素にて標識したプローブの組み合わせを用いてin situハイブリダイゼーションを行った場合、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナル（例えば、蛍光）と3’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルとの重なりが観察された際に融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。一方、5’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルと5’側融合パートナー遺伝子プローブ２の標識が発するシグナルとの分離、3’側融合パートナー遺伝子プローブ２の標識が発するシグナルと3’側融合パートナー遺伝子プローブ１の標識が発するシグナルとの分離が観察された際に融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。
　なお、ポリヌクレオチドの標識は、公知の手法により行うことができる。例えば、ニックトランスレーション法やランダムプライム法により、蛍光色素等によって標識された基質塩基をポリヌクレオチドに取り込ませ、該ポリヌクレオチドを標識することができる。
　in situハイブリダイゼーションにおいて、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドと前記生体試料とをハイブリダイズさせる際の条件は、当該ポリヌクレオチドの長さ等の諸要因により変動し得るが、高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。なお、当業者であれば、塩濃度（ＳＳＣの希釈率等）と温度の他、例えば、界面活性剤（ＮＰ－４０等）の濃度、ホルムアミドの濃度、ｐＨ等の諸条件を適宜選択することで、前記条件と同様のストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件を実現することができる。
　前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを用いて、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、前記in situハイブリダイゼーション以外に、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング及びドットブロッティングが挙げられる。これら方法においては、前記生体試料から得られる核酸抽出物を転写したメンブレンに、前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、前記融合遺伝子を検出する。前記（ａ）のポリヌクレオチドを用いた場合、5’側融合パートナー遺伝子の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドと3’側融合パートナー遺伝子の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドとが、メンブレンにおいて展開された同一のバンドを認識した場合に、融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができたと判定することができる。
　前記（ｂ）のポリヌクレオチドを用いて融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、さらに、ゲノムマイクロアレイ解析やＤＮＡマイクロアレイ解析が挙げられる。これら方法においては、前記（ｂ）のポリヌクレオチドを基板に固定したアレイを作製し、当該アレイ上のポリヌクレオチドに前記生体試料を接触させることにより、当該ゲノムＤＮＡを検出する。基板としては、オリゴまたはポリヌクレオチドを固相化できるものであれば特に限定されず、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーなどを挙げることができる。
　本発明の検出方法においては、PCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出することも好ましい。
　PCRにおいては、前記生体試料から調製したDNA（ゲノムDNA、cDNA）やRNAを鋳型として融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチドを使用することができる。ここで「融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できる」とは、当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子を増幅することなく、当該融合ポリヌクレオチドのみを増幅できることをいい、当該融合ポリヌクレオチドの全部が増幅されてもよいし、融合点を含む当該融合ポリヌクレオチドの一部が増幅されてもよい。
　PCR等で利用する「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となる融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅するセンスプライマー（フォワードプライマー）とアンチセンスプライマー（リバースプライマー）とからなり、センスプライマーは当該融合ポリヌクレオチドの融合点から5’末端側の塩基配列から設計し、アンチセンスプライマーは当該融合ポリヌクレオチドの融合点から3’末端側の塩基配列から設計する。またこれらのプライマーは、PCR法による検出の精度や感度の観点から、通常PCR産物が5 kb以下になるよう設計される。プライマーの設計は、公知の手法により適宜行なうことができ、例えば、Primer Express（登録商標）ソフトウェア（Applied Biosystems）を利用することができる。これらのポリヌクレオチドの長さは、通常15塩基以上（好ましくは16、17、18、19または20塩基以上、より好ましくは21塩基以上）であり、100塩基以下（好ましくは90、80、70、60、50または40塩基以下、より好ましくは30塩基以下）である。
　「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」の好適な例としては、配列番号8で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列番号９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるプライマーセットが挙げられる。
　PCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出する場合、PCR産物を対象としてシークエンシングを行い、融合点を含む塩基配列を決定することで、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とがインフレームで連結されていることおよび／または融合ポリヌクレオチド中に所定のドメインが含まれていることを確認することができる。シークエンシングは公知の手法により行うことができ、シークエンサー（例えば、ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems Inc.）などを）を取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。
　またPCRを利用して融合ポリヌクレオチドを検出する場合、TaqManプローブ法により、5’側の遺伝子部分と3’側の遺伝子部分とがインフレームで連結されていることおよび／または融合ポリヌクレオチド中に所定のドメインが含まれていることを確認することができる。TaqManプローブ法において使用するプローブとしては、例えば前記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドが挙げられる。プローブは、レポーター色素（例えば、FAM、FITC、VIC等）とクエンチャー（例えば、TAMRA、Eclipse、DABCYL、MGBなど）で標識される。
　上記プライマー及びプローブは、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。またその一部又は全部において、PNA（polyamide nucleic acid、ペプチド核酸）、LNA（登録商標、locked nucleic acid、Bridged Nucleic Acid、架橋化核酸）、ENA（登録商標、2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）、GNA（Glycerol nucleic acid、グリセロール核酸）、TNA（Threose nucleic acid、トレオース核酸）等の人工核酸によって、ヌクレオチドが置換されているものであってもよい。また上記プライマー及びプローブは、二本鎖であっても一本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖である。
　また上記プライマーおよびプローブは、標的配列に特異的にハイブリダイズし得る限り、1又は複数のヌクレオチドのミスマッチを含んでいてもよく、標的配列の相補配列に対して通常80％以上、好ましくは90、91、92、93、94％以上、より好ましくは95、96、97、98、99％以上の同一性を有し、最も好ましくは100％の同一性を有する。
　上記プライマー及びプローブは、例えば、本明細書に記載された塩基配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
　本発明の検出方法においては、全トランスクリプトームシークエンシング（RNAシークエンシング）またはゲノムシークエンシングにより融合ポリヌクレオチドを検出してもよい。これらの手法は、例えば、次世代シークエンサー（例えば、ゲノムアナライザーIIx（Illumina社）、ハイセックシークエンサー(HiSeq2000、イルミナ社）、ゲノムシークエンサー FLX System（Roche社）など）を使用して製造者の説明書に従って行なうことができる。RNAシークエンシングは、例えば、市販のキット（例えば、mRNA-Seqサンプル調製キット（Illumina社）など）を用いて製造者の説明書に従ってトータルRNAからcDNAライブラリーを調製し、これを次世代シークエンサーを使用するシークエンシングに供することにより行なうことができる。
　本発明の検出方法において、融合ポリヌクレオチドの翻訳産物（すなわち、融合ポリペプチド）を対象とする場合、例えば、免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、RIA法、ELISA法、フローサイトメトリー法、免疫沈降法、抗体アレイ解析などを利用して当該翻訳産物を検出することができる。これらの方法においては、融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体が用いられる。ここで「融合ポリペプチドを特異的に認識する」とは、当該融合ポリペプチドの融合点からN末端側及びC末端側の部分が由来する野生型タンパク質を含めて当該融合ポリペプチド以外のタンパク質を認識することなく、当該融合ポリペプチドのみを認識することをいう。本発明の検出方法において使用される「融合ポリペプチドを特異的に認識する」抗体は、1つの抗体であってもよいし、2つ以上の抗体の組み合わせであってもよい。
　「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」としては、融合ポリペプチドの融合点を含むポリペプチドに特異的な抗体（以下、「融合点特異的抗体」とも称する）が挙げられる。ここで、「融合点特異的抗体」とは、前記融合点を含むポリペプチドに特異的に結合するが、N末端側及びC末端側の部分が由来する野生型タンパク質には結合しない抗体を意味する。
　また「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」としては、融合ポリペプチドの融合点からN末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体と融合ポリペプチドの融合点からC末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体の組み合わせも挙げられる。これら2つの抗体を用いてサンドイッチELISA、免疫染色法、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法などを行なうことにより、融合ポリペプチドを検出することができる。
　本発明において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前記抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fv、及び単鎖抗体などが挙げられる。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgEなどのいずれのアイソタイプを有する抗体であってもよいが、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。
　「融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体」は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して調製することができる。かかる公知の手法としては、前記融合ポリペプチドの融合点を含むポリペプチド、前記融合ポリペプチドの融合点からN末端側の領域からなるポリペプチド、または前記融合ポリペプチドの融合点からC末端側の領域からなるポリペプチドを免疫動物に接種し、該動物の免疫系を活性化させた後、該動物の血清（ポリクローナル抗体）を回収する方法や、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法等のモノクローナル抗体の作製方法が挙げられる。市販の抗体を利用してもよい。また標識物質を結合させた抗体を用いれば、当該標識を検出することにより、標的蛋白質を直接検出することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、検出可能なものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミンイソチオシアネート（RITC）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、及び放射性物質などが挙げられる。さらに、標識物質を結合させた抗体を用いて標的タンパク質を直接検出する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体、プロテインGまたはプロテインA等を用いて標的タンパク質を間接的に検出する方法を利用することもできる。
＜遺伝子融合の検出用キット＞
　以上のように、EP300-ZNF384遺伝子融合により生じる融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドを、前記プライマー、プローブ、または抗体、あるいはそれらの組み合わせを用いて検出することができ、それにより当該遺伝子融合を検出することができる。したがって、本発明は、下記のいずれかまたはそれらの組み合わせを含む、遺伝子融合（好ましくは、がんの責任変異（ドライバー変異）である遺伝子融合）の検出用キット（以下、本発明のキットとも称する）を提供する：
（A）EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド；
（B）EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
（C）EP300-ZNF384融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
　本発明のキットには、ポリヌクレオチドや抗体に加えて、ポリヌクレオチドや抗体に付加した標識の検出に必要な基質、陽性対照（例えば、EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチド、EP300-ZNF384融合ポリペプチド、またはこれらを保持する細胞等）や陰性対照、PCR用試薬、in situハイブリダイゼーション等において用いられる対比染色用試薬（DAPI等）、抗体の検出に必要な分子（例えば、二次抗体、プロテインG、プロテインA）、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を適宜組み合わせて含めることができる。本発明のキットには、使用説明書を含めることもできる。本発明のキットを使用することにより、上記本発明の検出方法を容易に実施することが可能である。
　本発明の検出方法及び検出用キットは、がんの責任変異として新たに見出した遺伝子融合の検出を可能にするものであり、後述のように当該遺伝子融合の陽性例を同定し、がんの予後の判定、個別化医療の適用などを行う上で極めて有用である。
＜がんの予後を判定する方法＞
　EP300-ZNF384遺伝子融合が検出された3名のALL患者は、いずれも観察期間5年以上にわたり初回寛解を維持しており、当該遺伝子融合は予後良好因子である可能性が高い。したがって、本発明は、EP300-ZNF384遺伝子融合の存在に基づく、がんの予後を判定する方法を提供する（以下、本発明の判定方法とも称する）。
　本発明の判定方法は、下記の工程を含む：
（1）被験者由来の単離された試料において、EP300のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインおよびZNF384のTAZ型ジンクフィンガードメインを含むEP300-ZNF384融合ポリペプチド、またはそれによりコードされるポリペプチドを検出する工程ならびに
（2）前記融合ポリヌクレオチドまたはそれによりコードされるポリペプチドが検出された場合に、前記被験者においてがんの予後が良好であると判定する工程。
　本発明の判定方法において、「被験者」は、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している疑いのある哺乳動物、好ましくはヒトである。本発明の同定方法を適用する対象となる「がん」としては、EP300-ZNF384遺伝子融合が検出され得るがんであれば特に限定されないが、好ましくは白血病であり、さらに好ましくは急性リンパ芽球性白血病（ALL）であり、特に好ましくはB前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病（BCP-ALL）である。
　本発明の判定方法における工程(1)は、前記本発明の検出方法に含まれる工程と同様に実施することができる。
　本発明の判定方法における工程(2)において、がんの予後が良好であるとは、初回寛解後、1年以上（好ましくは2年以上、3年以上、または4年以上、より好ましくは5年以上）にわたって当該がんが再発しないことをいう。
　本発明の判定方法によれば、がんの患者またはがんに罹患している疑いのある被験者についてがんの予後を判定することが可能となり、がん患者に対して適切な治療を行うことが可能になる点で有用である。
＜単離された融合ポリペプチドまたはその断片、およびそれらをコードするポリヌクレオチド＞
　本発明は、EP300のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインおよびZNF384のTAZ型ジンクフィンガードメインを含む、単離されたEP300-ZNF384融合ポリペプチド（以下、本発明の融合ポリペプチドとも称する）またはその断片を提供する。
　本明細書中、「単離された」物質とは、ある物質が天然に存在する環境（例えば、生物体の細胞内）の他の物質（好ましくは、生物学的因子）（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。本明細書において「単離された」とは、好ましくは７５重量％以上、より好ましくは８５重量％以上、よりさらに好ましくは９５重量％以上、そして最も好ましくは９６重量％以上、９７重量％以上、９８重量％以上、９９重量％以上、又は１００％の純度を有することを意味する。「単離された」ポリヌクレオチドおよびポリペプチドには、標準的な精製方法によって精製されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、また化学的に合成したポリヌクレオチドおよびポリペプチドも含まれる。
　「断片」とは、本発明の融合ポリペプチドの断片であって、融合点の上流および下流の配列を含む連続した部分配列からなるものをいう。当該部分配列に含まれる融合点の上流の配列は、融合点から1アミノ酸残基以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100アミノ酸残基以上）を含み、本発明の融合ポリペプチドのN末端までを含みうる。当該部分配列に含まれる融合点の下流の配列は、融合点から1アミノ酸残基以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100アミノ酸残基以上）を含み、本発明の融合ポリペプチドのC末端までを含みうる。断片の長さは、特に限定されないが、通常8アミノ酸残基以上（例えば、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、100アミノ酸残基以上）である。
　また本発明の融合ポリペプチドは、例えば下記の単離された融合ポリペプチドであり得る。
（i）配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは
（iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　本発明の融合ポリペプチドに関する各用語の意味については、上記＜具体的ながんの責任変異＞において記載した通りである。
　さらに本発明は、上記本発明の融合ポリペプチドまたはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチド（以下、本発明のポリヌクレオチドとも称する）を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、mRNA、cDNAおよびゲノムDNAのいずれであってもよい。また二本鎖であっても一本鎖であってもよい。
　EP300-ZNF384融合ポリペプチドをコードするcDNAの典型例は、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　本発明のポリヌクレオチドは、自体公知の方法により作製することができる。例えば、EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドを保持するがん組織等から調製したcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーから公知のハイブリダイゼーション技術を利用して抽出することができる。また、前記がん組織等から調製したmRNA、cDNAまたはゲノムDNAを鋳型として公知の遺伝子増幅技術（PCR）を用いて増幅することにより調製することもできる。さらに、EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドの5’末端側及び3’末端側の部分が由来する野生型遺伝子のcDNAを材料とし、PCR、制限酵素処理、部位特異的変異誘発（site-directed mutagenesis）法（Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350．）等の公知の遺伝子増幅技術や組換え技術を利用して調製することもできる。
　本発明の融合ポリペプチドまたはその断片も、自体公知の方法により作製することができる。例えば、上記のようにして調製したポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入してインキュベーションすることにより、また該ベクターを適当な細胞（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞）に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、本発明の融合ポリペプチドを調製することができる。
　本発明の融合ポリペプチドまたはその断片は、本発明の検出方法等におけるマーカーとして使用することができ、また本発明の融合ポリペプチドに対する抗体の作製等にも使用することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　＜サンプル＞
　急性リンパ芽球性白血病（B前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病（BCP-ALL）、T細胞性急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）などを含む）の患児より得た白血病細胞から、miRNeasy mini kit（QIAGEN社）を使用して全RNAを抽出した。なお、この研究は、本研究に係る組織の倫理審査員会の承認を得て進められた。
　＜RNAシークエンシング＞
　RNAシークエンシングのためのcDNAライブラリーは、製造者の標準プロトコールに従い、TruSeq RNA sample preparation kit v2 Set B（Illumina社）を使用して作製した。全RNA配列の解析は、次世代シーケンサー（HiSeq1000 Illumina）によりペアエンド法で行なった。
　＜融合転写産物の検出＞
　融合転写産物の検出は、がん細胞における融合遺伝子検出専用のアルゴリズムであるDeFuse （http://sourceforge.net/apps/mediawiki/defuse/index.php?title=DeFuse）を用いて行った。
　＜RT-PCR、サンガーシークエンシング＞
　被験者の白血病細胞から抽出した全RNAから、ReverTra Ace(登録商標) qPCR RT Master Mix（東洋紡社）を使用してcDNAを合成した。得られたcDNAをrTaq DNA Polymerase（東洋紡社）を用いたPCR増幅に供した。目的とするサイズの遺伝子断片の増幅をアガロースゲル電気泳動で確認した。増幅された遺伝子断片をpGEM-T easyベクター（PROMEGA社）にTAクローニングした。このベクター上のマルチクローニングサイトの5’側のT7配列および3’側のSP6配列をプライマーとして用いて、BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社）とABI 3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）を用いて塩基配列を決定した。
　＜蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）解析＞
　それぞれEP300遺伝子およびZNF384遺伝子を含む、バクテリア人工染色体（BAC）クローンRP11-958C6（Green-dUTPで標識、Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA）およびRP11-1137P19（Orange-dUTPで標識、Abbott）（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）を使用して、患児から取得した骨髄試料について、二色FISH解析を行った。標準的な技術（アジレントFISH General Purpose Reagentsプロトコル Version E0, May 2014参照）を用いて、プローブのハイブリダイゼーションおよび細胞の観察を行った。ハイブリダイゼーション処理後の試料上に適量の蛍光観察用の封入剤を滴下し、ただちにカバーガラスをかぶせ、気泡が残らないように液を均一に広げた。スライドを15分ほど冷暗所に静置したのち、適合するフィルターを搭載した蛍光顕微鏡で観察し、1,000個の細胞を調べた。
　（実施例）
　本実施例は、白血病細胞における新規融合転写産物の同定について記載する。
　ALLにおける新規融合転写産物を同定するため、106例の小児白血病（急性リンパ芽球性白血病）の患児より得た白血病細胞のトランスクリプトーム解析を行った。
　RNAシークエンシングで得られたペアエンドリードを解析した結果、1例において、配列番号7で表される塩基配列が検出された。この塩基配列についてBLASTサーチを行った結果、5'末端側の領域はEP300をコードする配列（染色体22q13.2）と一致し、3'末端側の領域はZNF384をコードする配列（染色体12p13.31）と一致した。一致した配列のアクセッション番号の例を以下に示す。
Homo sapiens zinc finger protein 384 (ZNF384), transcript variant X6, mRNA
Select seq ref|XM_006718968.1|
Homo sapiens zinc finger protein 384 (ZNF384), transcript variant X5, mRNA
Select seq ref|XM_006718967.1|
Homo sapiens zinc finger protein 384 (ZNF384), transcript variant X4, mRNA
Select seq ref|XM_006718966.1|
Homo sapiens zinc finger protein 384 (ZNF384), transcript variant X3, mRNA
Select seq ref|XM_006718965.1|
Homo sapiens zinc finger protein 384 (ZNF384), transcript variant X2, mRNA
Select seq ref|XM_006718964.1|
Homo sapiens zinc finger protein 384 (ZNF384), transcript variant X1, mRNA Sequence ID: ref|XM_006718963.1|またはref|XM_005253671.1|
Homo sapiens zinc finger protein 384 (ZNF384), transcript variant 2, mRNA Sequence ID: ref|NM_133476.4|（配列番号5）
Homo sapiens zinc finger protein 384 (ZNF384), transcript variant 6, mRNA Sequence ID: ref|NM_001039920.2|
Homo sapiens zinc finger protein 384 (ZNF384), transcript variant 7, mRNA Sequence ID: ref|NM_001135734.2|
Homo sapiens E1A binding protein p300 (EP300), transcript variant X1, mRNA Select seq ref|XM_006724165.1|
Homo sapiens E1A binding protein p300 (EP300), mRNA Sequence ID: ref|NM_001429.3|（配列番号3）
　配列番号7で表される塩基配列では、EP300のエクソン6からZNF384のエクソン3に融合していた。なお、ZNF384のコード領域はエクソン3の6塩基目から開始するため、検出された当該塩基配列には、野生型ZNF384遺伝子では本来は翻訳されない5塩基が含まれるが、当該塩基配列ではEP300をコードする配列は、当該5塩基を挟んで、ZNF384をコードする配列とインフレームで融合されていた。当該塩基配列にコードされるEP300-ZNF384融合タンパク質のドメイン構造を図１に示す。
　以上の結果から、BCP-ALL患者の白血病細胞に、新規融合遺伝子であるEP300-ZNF384遺伝子が存在することが明らかとなった。
　この最初に見出されたEP300-ZNF384陽性症例は、細胞マーカーに関して、CD10（common-ALL抗原）の発現が弱く、骨髄球系抗原陽性という特徴を有していた。そこで、344例の連続したALL登録症例の集団（293例のBCP-ALL以外に41例のT-ALL等も含む）のうち、32例のCD10（common-ALL抗原）陰性～弱陽性のBCP-ALL（上記1例を含む）について、下記プライマーを用いてRT-PCRを行った。その結果、上記1例を含めて3例のCD10弱陽性のBCP-ALLで、EP300-ZNF384遺伝子の存在を示す441 bpの断片が増幅された（図２）。さらに、既知のキメラ遺伝子が検出された症例および解析用の試料が保存されていなかった症例を除く、全例について同様にRT-PCRにより確認を行なったが、最終的に344例の中で、上記3例以外には陽性症例は認められなかった。
フォワードプライマー：agctctctaggggtgggtca（配列番号8）
リバースプライマー：cagctggtctgacttggact（配列番号9）
　上記PCR産物の塩基配列をサンガー法により解析した結果、融合部位の塩基配列は上記3例において完全に一致することが確認された（図３）。さらに、上記3例のうちの1例において、EP300-ZNF384融合遺伝子のコード領域の全配列を決定した（配列番号1）。
　さらに、1例において、EP300遺伝子およびZNF384遺伝子にそれぞれハイブリダイズする2つのプローブを使用して二色FISH解析を行った（図４）。調べた1,000個の細胞のうち954個の細胞で2つのシグナルの重なり（図４中、矢頭）が検出され、EP300-ZNF384融合遺伝子の存在が確認された。
　以上の結果から、EP300-ZNF384融合遺伝子は、BCP-ALLに特異的であると考えられ、またその出現頻度は、BCP-ALLの約1%（293例中3例）と推定された。なお、3例中2例で染色体G-バンド法では正常核型（残りの1例は核盤（metaphase plate）が得られず検査不能）であることから、EP300-ZNF384遺伝子融合はクリプティックトランスロケーションにより生じたと考えられる。
　また、EP300-ZNF384遺伝子融合が検出された3例は、CD10弱陽性の症例であった。CD10陰性を特徴とする亜群としては、MLL関連のキメラ陽性群が良く知られている。EP300-ZNF384陽性群は、そのようなMLL関連のキメラ陽性群とは別の、MLL関連キメラ陰性かつCD10弱陽性の１亜群を形成すると考えられる。EP300-ZNF384遺伝子融合が検出された3例は、いずれも中間危険群に分類されたが、観察期間5年以上にわたり初回寛解を維持しており、当該遺伝子融合は予後良好因子である可能性が高い。したがって、EP300-ZNF384遺伝子を検出することにより、これまでに知られていなかったALLの予後良好亜群を特定できる可能性が示された。
　本発明によれば、がんの責任変異として新たに見出したEP300-ZNF384遺伝子融合を検出すること、当該遺伝子融合の存在に基づきがんの予後を判定すること、さらには当該遺伝子融合陽性のがんの患者に適した治療（個別化医療）を行うことが可能となる。
配列番号１：EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチド
配列番号2：EP300-ZNF384融合ポリペプチド
配列番号3：EP300 cDNA
配列番号4：EP300ポリペプチド
配列番号5：ZNF384 cDNA
配列番号6：ZNF384ポリペプチド
配列番号7：EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチド部分配列
配列番号8：フォワードプライマー
配列番号9：リバースプライマー

Claims (11)

  1. 　遺伝子融合の検出方法であって、被験者由来の単離された試料において、EP300のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインおよびZNF384のTAZ型ジンクフィンガードメインを含むEP300-ZNF384融合ポリペプチド、またはそれをコードする融合ポリヌクレオチドを検出する工程を含む、方法。
  2. 　融合ポリペプチドが、下記（i）～（iii）のいずれかである、請求項１に記載の方法：
    （i）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
    （iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  3. 　融合ポリヌクレオチドが下記（i）～（iii）のいずれかである、請求項１または２に記載の方法：
    （i）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （ii）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
    （iii）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、または
    （iv）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと80％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
  4. 　遺伝子融合が、がんの責任変異（ドライバー変異）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　がんがB前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病である、請求項４に記載の方法。
  6. 　がんの予後を判定する方法であって、下記の工程を含む、方法：
    （1）被験者由来の単離された試料において、EP300のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインおよびZNF384のTAZ型ジンクフィンガードメインを含むEP300-ZNF384融合ポリペプチド、またはそれをコードする融合ポリヌクレオチドを検出する工程；ならびに
    （2）前記融合ポリペプチド、またはそれをコードする融合ポリヌクレオチドが検出された場合に、前記被験者においてがんの予後が良好であると判定する工程。
  7. 　遺伝子融合の検出用キットであって、下記（A）～（C）のいずれかまたはそれらの組合せを含む、キット：
    （A）EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドを特異的に認識するように設計されたプローブであるポリヌクレオチド；
    （B）EP300-ZNF384融合ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド；あるいは
    （C）EP300-ZNF384融合ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
  8. 　遺伝子融合が、がんの責任変異（ドライバー変異）である、請求項７に記載のキット。
  9. 　EP300のN末端側のTAZ型ジンクフィンガードメインおよびZNF384のTAZ型ジンクフィンガードメインを含む、単離されたEP300-ZNF384融合ポリペプチドまたはその断片。
  10. 　融合ポリペプチドが、下記（i）～（iii）のいずれかである、請求項９に記載の融合ポリペプチドまたはその断片：
    （i）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ii）配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
    （iii）配列番号2で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  11. 　請求項９または１０に記載の融合ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
     
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