JP5769968B2 - ヒト非小細胞肺癌における転座および変異rosキナーゼ - Google Patents
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Description
Cancer Societyを参照されたい。NSCLCには3種類の異なるサブタイプが含まれるが、NSCLCはその転移後に初めて検出されることが多く、したがって、その死亡率は、診断の2年以内で75%である。
In Enzymology, 201:264-283(1991);Merrifield、J. Am. Chem. Soc. 85:21-49(1962))を参照されたい。また、単鎖抗体、ラクダ科動物抗体およびその類似物ならびに重鎖または軽鎖を含むその抗体の構成要素を含む、4鎖より少ない抗体分子も本発明の範囲内にある。いくつかの実施形態において、免疫グロブリン鎖は、5’側から3’側の順序で可変領域および定常領域を含有していてもよい。この可変領域は、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4の構造をとるために、分散型のフレームワーク(FR)領域と共に、3つの相補性決定領域(CDR)を含有していてもよい。また、重鎖または軽鎖の可変領域、フレームワーク領域、およびCDRも本発明の範囲内にある。本発明の抗体は、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域の一部もしくは全部を含む重鎖定常領域を含有していてもよい。本発明の抗体は、1×10−7Mまたはそれより小さい結合親和性(KD)を有していてもよい。他の実施形態では、該抗体は、1×10−8M、1×10−9M、1×10−10M、1×10−11M、1×10−12M、またはそれより小さいKDで結合する。特定の実施形態において、このKDは、1pM〜500pM、500pM〜1μMの間、1μM〜100nMの間、または100mM〜10nMの間である。本発明の抗体は、任意の種の動物、好ましくは哺乳動物から得ることができる。非限定的な自然抗体の例には、ヒト、ニワトリ、ヤギ、および齧歯動物(例えば、ラット、マウス、ハムスター、およびウサギ)に由来する抗体が含まれ、この齧歯動物には、ヒト抗体を産生させるために遺伝的に改変した遺伝子導入齧歯動物が含まれる(例えば、Lonbergら、WO第93/12227号;米国特許第5,545,806号;およびKucherlapatiら、WO第91/10741号;米国特許第6,150,584号を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。自然抗体は宿主動物によって産生される抗体であるが、本発明は、そのアミノ酸配列を天然の抗体のアミノ酸配列から変化させた遺伝子改変抗体も意図する。本出願に対する組換えDNA技術の適合性から、自然抗体に見られるアミノ酸の配列に限定する必要はなく、望ましい特性を得るために抗体を再設計することができる。可能な変形態様は多数あり、ただ1つのまたは少数のアミノ酸を変更することから、例えば可変領域または定常領域の、完全な再設計までに及ぶ。定常領域における変更は、一般に、補体固定、膜との相互作用、および他のエフェクター機能のような特性を改良または変化させるためになされるであろう。可変領域における変更は、抗原結合特性を改良するためになされるであろう。「ヒト化抗体」という用語は、本明細書中で用いているように、本来の結合能力を依然として維持させたまま、より厳密にヒト抗体に類似させるために、非抗原結合領域中でアミノ酸を置換した抗体分子のことをいう。特定的に意図される他の抗体は、オリゴクローナル抗体である。本明細書中で用いているように、「オリゴクローナル抗体」という句は、異なるモノクローナル抗体の所定の混合物のことをいう。例えば、PCT公開WO第95/20401号;米国特許第5,789,208号および第6,335,163号を参照されたい。一実施形態では、1つまたは複数のエピトープに対する抗体の所定の混合物からなるオリゴクローナル抗体は、単一の細胞内で産生される。他の実施形態では、オリゴクローナル抗体は、多様な特異性を有する抗体を産生するために、一般的な軽鎖と対形成できる複数の重鎖を含有する(例えば、PCT公開WO第04/009618号)。オリゴクローナル抗体は、単一の標的分子上の複数のエピトープを標的とすることが望まれる場合に特に有用である。本明細書に開示のアッセイおよびエピトープに鑑みて、当業者は、意図する目的および所望の必要性のために適用可能な抗体または抗体の混合物を作製または選択することができる。本発明において特定したリン酸化部位に対する組換え抗体も本出願中に含まれる。これらの組換え抗体は、その自然抗体と同じアミノ酸配列を有する、あるいは本出願においてその自然抗体の変更したアミノ酸配列を有する。これらは、原核生物および真核生物の両方の発現系を含む任意の発現系において、あるいはファージディスプレイ法を用いて作製することができる(例えば、Dowerら、WO第91/17271号、およびMcCaffertyら、WO第92/01047号;米国特許第5,969,108号を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。抗体を、多数の方法によって改変することができる。これらは、(小モジュール免疫薬剤、すなわちSMIP(商標)を含む)単鎖抗体、Fab断片、およびF(ab’)2断片などとして作製することができる。抗体を、ヒト化、キメラ化、脱免疫化する、あるいは、完全なヒト抗体とすることができる。多数の刊行物に、多種類の抗体およびそのような抗体の改変方法が記載されている。例えば、米国特許第6,355,245号;第6,180,370号;第5,693,762号;第6,407,213号;第6,548,640号;第5,565,332号;第5,225,539号;第6,103,889号;および第5,260,203号を参照されたい。これらの遺伝子改変抗体は、上記の自然抗体と機能的に同等であるべきである。特定の実施形態において、改変抗体は、改良された安定性または/および治療有効性をもたらす。改変抗体の例には、アミノ酸残基の保存的置換、および抗原結合の有用性をそれほど悪化させることのない1つまたは複数のアミノ酸の欠失または付加を有するものが含まれる。置換は、その治療的な有用性が維持される限り、1つまたは複数のアミノ酸残基を変更または修飾することから領域を完全に再設計することまでに及んでもよい。本出願の抗体を、翻訳後に修飾(例えば、アセチル化、および/またはリン酸化)することができ、あるいは合成的に修飾(例えば、標識基を付加)することができる。改変したまたはバリアントの定常領域またはFc領域を有する抗体は、例えば抗原依存性細胞傷害作用(ADCC)および補体依存性細胞傷害作用(CDC)などの、エフェクター機能を調節するのに有用となり得る。改変したまたはバリアントの定常領域またはFc領域を有するそのような抗体は、親シグナル伝達タンパク質(表1)が正常な組織内で発現している場合に有用となり得る;これらの場合、エフェクター機能のないバリアント抗体は、正常組織を損傷せずに所望の治療反応性を引き出し得る。したがって、本開示の特定の態様および方法は、1つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を含有し、エフェクター機能が変化している抗体に関する。「生物学的に活性な」という用語は、天然に存在する分子の構造的、調節的、または生化学的な機能を有するタンパク質のことをいう。同様に、「免疫学的に活性な」とは、自然の、組換えの、あるいは合成のCD74−ROS融合ポリペプチドまたは切断型ROSポリペプチド、またはこれらの任意のオリゴペプチドが、適切な動物内または細胞内で特定の免疫応答を誘導できること、および特定の抗体と結合できることをいう。
of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine, CRC Press, Boca Raton(1995);McPherson(編)、Directed
Mutagenesis:A Practical Approach, IRL Press, Oxford(1991)が含まれる。薬理学の一般的な原理を記載している標準的な参考資料には、GoodmanおよびGilmanのThe Pharmacological Basis of
Therapeutics, 第11版, McGraw Hill
Companies社, New York(2006)が含まれる。
Multistage Mass Spectrometry」(Gygiら)に記載のように、タンパク質の絶対的な定量化または検出に好適である。このようなAQUAペプチドに関して、「特異的に検出する」という用語は、このペプチドがAQUAペプチド配列を含むポリペプチドおよびタンパク質のみを検出および定量化し、AQUAペプチド配列を含まないポリペプチドおよびタンパク質を実質上検出しないであろうことを意味する。
NaCl、75mMクエン酸3ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート液、10%デキストラン硫酸、および20マイクログラム/mLの変性、切断したサケ精子DNAを含む溶液中、42℃で一晩インキュベートした後、0.1×SSC中、約65℃でフィルターを洗浄する。当業者に理解されるであろうように、同一または類似のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを変えることもできる。
Peptides from Complex Mixtures」(「IAP」技術)を参照されたい。リン酸化チロシン特異的抗体(CELL SIGNALING TECHNOLOGY社, Beverly, MA,
2003/04 カタログ#9411)を使用したIAP技術の適用により、1名のNSCLC患者が、(そうでない大部分の他のNSCLC患者とは対照的に)ROSキナーゼを発現することを特定した。このスクリーニングにより、ROSを含む、この患者における多数の他の活性化したキナーゼが同定された。次いで、5’RACE法による、ROSの5’の配列の解析によって、このキナーゼがCD74のN末端に融合されていることを確認した(図5を参照されたい)。
NaCl、75mMクエン酸3ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート液、10%デキストラン硫酸、および20マイクログラム/mLの変性、剪断したサケ精子DNAを含む溶液中、42℃で一晩インキュベートした後、0.1×SSC中、約65℃でこのフィルターを洗浄することを意図する。
T.(編)、Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(1989)に記載されているように、従来のDNAハイブリダイゼーション技術によるプローブとして、もしくはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による標的配列の増幅用のプライマーとして、診断的に有用である。当然、(図2に示すCD74−ROS配列(配列番号:2の3’末端ポリ(A)領域のような)ポリA配列またはT(もしくはU)残基の相補的なストレッチにのみハイブリッド形成するポリヌクレオチドは、ポリ(A)ストレッチまたはその相補鎖を含む任意の核酸分子(例えば、実際的には任意の二本鎖cDNAクローン)とハイブリッド形成するため、本発明の核酸の一部とハイブリッド形成させるために用いる本発明のポリヌクレオチドには含まれないであろう。
Sons, New York(1985)を参照されたい。天然に存在しないバリアントは、当技術分野で公知の変異生成技術を用いて作製することができる。
Package, バージョン8 Unix(登録商標)用,
Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison,
Wis. 53711のような既知のコンピュータプログラムを用いて、従来通り決定することができる。Bestfitは、SmithおよびWaterman、Advances
in Applied Mathematics 2:482-489(1981)の局所的相同性アルゴリズムを用いて、2つの配列間の相同性が最も高いセグメントを見つけ出す。Bestfitまたは任意の他の配列アライメントプログラムを用いて、特定の配列が、例えば本発明の基準CD74−ROS融合ポリヌクレオチド配列と95%同一であるかどうかを決定する場合には、パラメータは、当然、同一性の百分率がその基準ヌクレオチド配列の全長にわたって算出され、基準配列中のヌクレオチドの総数の最高5%までの相同性におけるギャップが許されるように設定する。
Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions」, Science 247:1306-1310(1990)に提供されている。このような技術に精通している当業者は、どのアミノ酸の変化がそのタンパク質のある部位で許容的となる可能性が高いかも理解している。例えば、埋没しているアミノ酸残基の大部分は非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は一般的にほとんど保存されていない。他のそのような表現型的にサイレントな置換は、前掲、Bowieら、およびその中の引用文献に記載されている。
Cleveland, Ohio)、Taqポリメラーゼ(Perkin
Elmer)、耐熱性T7ポリメラーゼ(Amersham, Chicago, I11.)、またはGibco BRL(Gaithersburg, Md.)により市販されるELONGASE増幅系のような組換え型ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼの組合せなどの酵素を利用することもできる。このプロセスは、Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton, Reno, Nev.)、Peltierサーマルサイクラー(PTC200;MJ Research, Watertown,
Mass.)、およびABI 377 DNAシークエンサー(Perkin
Elmer)などの機械により自動化されることが好ましい。
Alto, Calif.)を使用して、ゲノムDNA歩行を行なうこともできる。このプロセスは、ライブラリーをスクリーニングする必要性を回避し、イントロン/エクソン接合部を見つける際に有用である。
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y、およびGrantら、Methods Enzymol. 153:516-544(1997)を参照されたい。
Interscienceを参照されたい。
また、本発明は、部分的には、単離CD74−ROS融合ポリペプチドおよびそれらの断片も提供する。一実施形態では、本発明は、以下からなる群から選択される配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含有する単離ポリペプチドを提供する:(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有するCD74−ROS融合ポリペプチドをコードしているアミノ酸配列;(b)CD74のN末端アミノ酸配列(配列番号:3の残基1〜208)およびROSのキナーゼドメイン(配列番号:5の残基1945〜2222)を含有するCD74−ROS融合ポリペプチドをコードしているアミノ酸配列;ならびに(c)CD74−ROS融合ポリペプチドの融合ジャンクション(配列番号:1の残基208〜209または配列番号:3の残基208〜209)を含む少なくとも6つの連続したアミノ酸を含有するポリペプチドをコードしているアミノ酸配列。
67:31-40(1988)に記載のワンステップ法によって実質上精製することができる。
Package, バージョン8 Unix(登録商標)用,
Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison,
Wis. 53711)および類似性を決定するための初期設定を用いて、2種類のポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって得られる類似性スコアを意図する。Bestfitは、SmithおよびWaterman(Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981))の局所的相同性アルゴリズムを用いて、2つの配列間の類似性が最も高いセグメントを見つけ出す。
340:245-246(1989)に記載されている。
タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般的には、抗原性エピトープの数より少ない。例えば、Geysenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002(1983)を参照されたい。本発明の融合ポリペプチド特異的抗体の作製については、後でさらに詳述する。
開示の方法の実施において有用な変異ROSポリペプチド特異的試薬には、とりわけ、生体試料中のCD74−ROS融合ポリペプチドに対応し、かつ生体試料中のCD74−ROS融合ポリペプチド発現の検出および定量化に適した、融合ポリペプチド特異的抗体およびAQUAペプチド(重同位体で標識したペプチド)が含まれる。融合ポリペプチド特異的試薬は、生体試料中で発現したCD74−ROS融合ポリペプチドを特異的に結合し、生体試料中で発現したCD74−ROS融合ポリペプチドの存在/レベルを検出、および/または定量化することができる、生物学的または化学的な、任意の試薬である。この用語には、下記の好ましい抗体試薬およびAQUAペプチド試薬が含まれるが、これらに限定されるものではなく、同等の試薬は本発明の範囲内にある。
本発明の方法の実施における使用に適した試薬には、CD74−ROS融合ポリペプチド特異的抗体が含まれる。本発明の融合体特異的抗体は、本発明のCD74−ROS融合ポリペプチド(例えば、配列番号:1)を特異的に結合するが、野生型CD74も野生型ROSも実質上結合しない、単離抗体である。他の好適な試薬にはエピトープ特異的抗体が含まれ、これらは、野生型ROSタンパク質配列の細胞外ドメイン(このドメインは本明細書中に開示の切断型ROSキナーゼには存在しない)内のエピトープに特異的に結合し、そのため、試料中の野生型ROSの存在(または欠如)を検出することができる。
312:604(1984))を参照されたい。該抗体は、米国特許第4,474,893号(Reading)または米国特許第4,816,567号(Cabillyら)に開示の方法に従って作製される組換えモノクローナル抗体であってもよい。また、該抗体は、米国特許第4,676,980号(Segelら)に開示の方法に従って化学的に構築した特異的抗体であってもよい。
J. Am. Chem. Soc. 85:21-49(1962))を参照されたい。本明細書に記載のように作製したポリクローナル抗体を、後で詳述するように、スクリーニングおよび単離することもできる。
J. Immunol. 6:511(1976);また、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Ausubelら(編)(1989)も参照されたい。このようにして作製したモノクローナル抗体はきわめて特異的であり、本発明が提供するアッセイ方法の選択性および特異性を向上させる。例えば、適切な抗原(例えば、CD74−ROS融合ポリペプチドの融合ジャンクションを含有する合成ペプチド)を含む溶液を、マウスに注入することができ、(従来の技術に合わせて)十分な時間の後に、そのマウスを屠殺して脾細胞を得る。次いで、この脾細胞を、典型的にはポリエチレングリコール存在下で、骨髄腫細胞と融合させることによって不死化して、ハイブリドーマ細胞を作製する。ウサギ融合ハイブリドーマは、例えば、1997年10月7日に発行された、C. Knight、米国特許第5,675,063号に記載のように作製することができる。次いで、このハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン(HAT)などの好適な選択培地中で増殖させ、後述するように、所望の特異性を有するモノクローナル抗体があるかどうかについてその上清をスクリーニングした。分泌された抗体を、沈澱、イオン交換、または親和性クロマトグラフィーなどのような従来法によって組織培養液上清から回収することができる。
Nat'l Acad. Sci. 87:8095(1990)を参照されたい。あるアイソタイプのモノクローナル抗体が特定用途に好ましい場合には、特定のアイソタイプを、最初の融合から選択することによって直接調製することができるし、あるいはクラススイッチバリアントを単離するためのシブセレクション技術を用いることによって、種々のアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌している親ハイブリドーマから二次的に調製することができる(Steplewskiら、Proc. Nat'l. Acad. Sci., 82:8653(1985);Spiraら、J. Immunol. Methods, 74:307(1984))。このモノクローナル抗体の抗原結合部位をPCRによってクローニングすることができ、単鎖抗体をファージディスプレイ組換え抗体または可溶性抗体として大腸菌中で産生させる(例えば、ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS, 1995, Humana Press、Sudhir Paul(編)を参照されたい)。
開示の方法の実施において有用なCD74−ROS融合ポリペプチド特異的試薬には、生体試料中の発現したCD74−ROS融合ポリペプチドの絶対的な定量化に好適な重同位体標識ペプチドも含まれ得る。複雑な混合物中のタンパク質の絶対的な定量化(AQUA)のためのAQUAペプチドの作製および使用については記載されている。WO第/03016861号、「Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by
Multistage Mass Spectrometry」、Gygiら、およびGerberら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:6940-5(2003))も参照されたい(これらの教示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
本発明が提供する融合体特異的試薬には、上記のセクションBにおいて詳細に記載したような、CD74−ROSポリヌクレオチドの検出用に好適な核酸プローブおよびプライマーも含まれる。蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)またはPCR増幅などのアッセイにおけるこのようなプローブの具体的な使用については、下記のセクションFに記載する。
本発明の方法を、当業者に知られている多様な種々のアッセイ形態で行うこともできる。
本発明の方法の実施において有用なイムノアッセイは、ホモジニアスイムノアッセイまたはヘテロジニアスイムノアッセイであってもよい。ホモジニアスアッセイにおいて、この免疫学的反応は、通常、変異ROSポリペプチド特異的試薬(例えば、CD74−ROS融合ポリペプチド特異的抗体)、標識した分析物、および目的とする生体試料を必要とする。標識から生じるシグナルは、抗体が標識した分析物に結合することによって、直接的または間接的に修飾される。免疫学的な反応およびその程度の検出の両方は、ホモジニアス溶液中で行われる。用い得る免疫化学標識には、遊離ラジカル、放射性同位体、蛍光色素、酵素、バクテリオファージ、補酵素などが含まれる。半導体ナノ結晶標識、あるいは「量子ドット」を都合よく用いることもでき、これらの調製および使用については十分に記載されている。一般的には、K.
Barovsky, Nanotech. Law & Bus. 1(2):Article 14(2004)およびこの中に引用される特許を参照されたい。
Ligand-Receptor Interactions and their Application」);米国特許第4,659,678号(Forrestら、「Immunoassay of Antigens」);米国特許第4,376,110号(Davidら、「Immunometric Assays Using Monoclonal
Antibodies」)も参照されたい。試薬−抗体複合体を形成させるための好適な条件は、当業者に周知である。同上を参照されたい。CD74−ROS融合ポリペプチド特異的モノクローナル抗体を、標識モノクローナル抗体および結合モノクローナル抗体の両方の供給源としての役割を果たす単一のハイブリドーマ細胞株による、「ツーサイト(two-site)」アッセイまたは「サンドイッチ」アッセイにおいて用いることもできる。このようなアッセイは、米国特許第4,376,110号に記載されている。CD74−ROS融合ポリペプチドの結合がバックグラウンドと比較して検出可能となるように、検出可能な試薬の濃度を十分にするべきである。
in Clinical Cytometry)46:72-78(2001)。簡単に説明すると、例えば、細胞数測定解析用の以下のプロトコルを用いることもできる:2%パラホルムアルデヒドによる37℃で10分間の細胞固定後、90%メタノール中、氷上でf0分間の透過化処理。次いで、細胞を、CD74−ROS融合ポリペプチド特異的一次抗体で染色し、洗浄して、蛍光標識した二次抗体で標識することもできる。次いで、使用する機器の規定のプロトコルに従って、これらの細胞をフローサイトメーター(例えば、Beckman Coulter FC500)上で解析する。このような解析は、腫瘍において発現したCD74−ROS融合ポリペプチドのレベルを同定するであろう。ROS阻害治療薬を用いた腫瘍治療後の同様な解析は、ROSキナーゼの標的化阻害剤に対する、CD74−ROS融合ポリペプチドを発現している腫瘍の応答性を明らかにするであろう。
HANDBOOK 37、BioScientific/Springer-Verlagを参照されたい。簡単に説明すると、例えば、患者の試料を、パラホルムアルデヒド中で固定し、次いで、メタノール中で固定し、ウマ血清のようなブロッキング溶液でブロッキングし、CD74−ROS融合ポリペプチドに対する一次抗体でインキュベートし、次いで、Alexa488のような蛍光色素で標識した二次抗体でインキュベートして、落射蛍光顕微鏡で解析することもできる。
同様に、上記のセクションEに詳述しているように、腫瘍からの細胞を含む生体試料における、発現した変異ROSポリペプチドの検出/定量化のためのAQUAペプチドを調製して、標準的なAQUAアッセイに用いることもできる。したがって、本発明の方法のいくつかの好ましい実施形態において、CD74−ROS融合ポリペプチド特異的試薬には、セクションEに上述しているように、CD74−ROS融合ポリペプチドの融合ジャンクションを含有するペプチド配列に対応する重同位体標識リン酸化ペプチド(AQUAペプチド)が含まれる。
Harbor, N.Y.(1989)を参照されたい。PCRオリゴマーは、化学的に合成してもよく、酵素で生成させてもよく、あるいは組換え源から産生させてもよい。オリゴマーは、特定の遺伝子または条件を同定するために最適化された条件下で用いられる、センス方向(5’から3’)およびアンチセンス方向(3’から5’)の2種類のヌクレオチド配列からなることが好ましい。密接に関連したDNAまたはRNAの配列を検出および/または定量化するために、同様の2種類のオリゴマー、ネストセットのオリゴマー、または縮重プールのオリゴマーでさえも、よりストリンジェンシーの低い条件下で用いることができる。
B. J.、Trends Genet. 7:149-154(1991)に総説されるように、このような技術には、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、FACS、または人工染色体構築物、例えば、酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌のP1構築物、または単一染色体cDNAライブラリーが含まれる。
New York, N. Y.(1988)に記載されるように)FISHを用いて、これを他の物理的染色体マッピング技術および遺伝子地図データと関連づけることもできる。遺伝子地図データの例は、1994 Genome Issue of Science(265:1981f)に見いだすことができる。CD74−ROS融合ポリペプチドまたは切断型ROSポリペプチドをコードする遺伝子の物理的染色体地図上の部位と、特定の疾患、あるいは特定の疾患の疾病素質との間の関連性は、その遺伝的疾患に関連するDNA領域の範囲の決定を補助し得る。本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保因者、または罹患者の間の遺伝子配列の相違を検出することができる。
本発明の方法の実施において有用な生体試料は、CD74−ROS融合ポリペプチドの存在を特徴とする癌が存在または進行している、あるいは存在または進行している可能性のある、任意の哺乳動物から得ることができる。一実施形態では、該哺乳動物はヒトであり、このヒトは、肺癌、例えばNSCLCの治療のためのROS阻害治療の候補者となり得る。該ヒト候補者は、現在ROSキナーゼ阻害剤で治療している、またはその治療を検討している患者であってもよい。別の一実施形態では、該哺乳動物はウマまたはウシのような大型動物であり、一方、他の実施例では、該哺乳動物はイヌまたはネコのような小型動物であり、これらの全てが肺癌を含む癌を発症することが知られている。
CD74−ROSの転座および/または融合ポリペプチドが存在する癌を選択的に同定できることにより、診断の目的でそのような腫瘍を正確に同定するための新しい重要な方法、ならびに、癌の治療用の単一の薬剤として投与する場合に、そのような腫瘍がROS阻害治療組成物に反応性である可能性が高いのかどうか、あるいは別のキナーゼを標的とする阻害剤に部分的にまたは完全に非反応性である可能性が高いのかどうかを決定する際に有用となる情報を得るための新しい重要な方法が可能になる。
また、本明細書に記載の新規CD74−ROS融合ポリペプチドの発見によって、これらの変異ROSタンパク質の活性、特にそれらのROSキナーゼ活性を阻害する新しい化合物の開発も可能となる。したがって、本発明はまた、部分的には、化合物がCD74−ROS融合ポリヌクレオチドおよび/またはCD74−ROS融合ポリペプチドを特徴とする癌の進行を抑制するかどうかを判定する方法も提供し、前記方法には、前記化合物が前記癌において前記CD74−ROS融合ポリペプチドの発現および/または活性を阻害するかどうかを判定するステップが含まれる。好ましい一実施形態では、本発明の変異ROSポリヌクレオチドおよび/または変異ROSポリペプチドを検出する少なくとも1つの試薬を用いて、CD74−ROS融合ポリペプチドの発現および/または活性の阻害を判定する。本発明の好ましい試薬については、上述している。ROSキナーゼ活性の阻害に好適な化合物については、下記のセクションGでさらに詳述する。
本発明によって、該CD74−ROS融合ポリペプチドがヒトNSCLCの少なくとも1つのサブグループにおいて生じることをここで示してきた。したがって、CD74−ROS融合タンパク質を発現する哺乳動物の癌(例えば、NSCLC)の進行を、そのような癌におけるROSキナーゼ活性を阻害することによってin vivoで抑制することができる。変異ROSキナーゼの発現を特徴とする癌におけるROS活性は、その癌(例えば腫瘍)をROSキナーゼ阻害治療薬と接触させることによって阻害することができる。したがって、本発明は、部分的には、癌におけるROSキナーゼの発現および/または活性を阻害することによってCD74−ROS融合ポリペプチドを発現する癌の進行を抑制するための方法を提供する。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の方法の実施において有用なROS阻害治療薬は、標的化される小分子阻害剤である。小分子標的化阻害剤は、典型的には、特異的に、かつ多くの場合不可逆的に、それらの標的酵素の触媒部位に結合し、かつ/あるいはATP結合溝またはその酵素がその活性に必要なコンフォメーションをとることを妨げるその酵素内の他の結合部位に結合して、その酵素の活性を阻害するあるクラスの分子である。例示的な小分子標的化キナーゼ阻害剤は、Gleevec(登録商標)(イマチニブ、STI-571)であり、これは、CSF1RおよびBCR−ABLを阻害し、その特性はよく記載されている。Dewarら、Blood 105(8):3127-32(2005)を参照されたい。
また、本発明の方法において有用なROSキナーゼ阻害治療薬は、ROS活性に必要とされる重要な触媒部位もしくは結合部位または触媒ドメインもしくは結合ドメインに特異的に結合し、リガンド、基質、または第2の分子の第1の分子への到達を阻止することおよび/またはこの酵素がその活性に必要なコンフォメーションをとるのを妨げることによってこのキナーゼを阻害する標的化抗体であってもよい。ヒト化標的特異的抗体の作製、スクリーニング、および治療的使用については、よく記載されている。Merluzziら、Adv Clin Path. 4(2):77-85(2000)を参照されたい。ヒト化標的特異的抑制抗体の高処理の作製およびスクリーニングのために、Morphosys社のヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー(HuCAL(登録商標))のような市販の技術およびシステムを利用することができる。
anti-Epidermal Growth Factor Receptor Single-Chain Antibodies」、2004年4月15日、Raischら;米国特許公開第20040033543号、「Treatment of
Renal Carcinoma Using Antibodies Against the EGFr」、2004年2月19日、Schwabらなどを参照されたい。受容体チロシンキナーゼ活性抑制抗体を作製および使用するための標準化された方法は、当技術分野において知られている。例えば、欧州特許第EP1423428号、「Antibodies that Block Receptor Tyrosine Kinase Activation, Methods
of Screening for and Uses Thereof」、2004年6月2日、Borgesらを参照されたい。
開示の方法の実施において有用なROS阻害化合物は、ROSキナーゼそのもの以外のタンパク質または分子の活性を阻害することによって、間接的にROS活性を阻害する化合物であってもよい。このような阻害治療薬は、ROS自体をリン酸化または脱リン酸化する(したがって、活性化または不活性化する)重要な調節キナーゼの活性を調節する、あるいはリガンドの結合を妨げる標的化阻害剤であってもよい。他の受容体チロシンキナーゼと同様に、ROSは、アダプタータンパク質および下流のキナーゼのネットワークを通して下流のシグナル伝達を制御する。この結果として、これらの相互作用しているタンパク質または下流のタンパク質を標的化することによって、ROS活性による細胞の増殖および生存の誘導を阻害することができる。
ROS阻害治療薬には、ROSをコードする遺伝子および/または該CD74−ROS融合遺伝子の転写を阻止することによってROSキナーゼ活性を阻害する、アンチセンス阻害化合物および/または転写阻害化合物も含まれていてもよい。癌の治療用のアンチセンス治療薬による、VEGFR、EGFR、およびIGFR、ならびにFGFRを含む種々の受容体キナーゼの阻害については、記載されている。例えば、米国特許第6,734,017号;第6,710,174号、第6,617,162号;第6,340,674号;第5,783,683号;第5,610,288号を参照されたい。
H.、Sci AM. pp.40-46(1990);Van Der Krolら、BioTechniques 6(10):958-976(1988);Skorskiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1994)91:4504-4508を参照されたい。EGFRのアンチセンスRNA阻害剤を用いた、in vivoでのヒト癌腫増殖の阻害については、最近記載されている。米国特許公開第20040047847号、「Inhibition of Human Squamous Cell Carcinoma Growth In vivo by
Epidermal Growth Factor Receptor Antisense RNA Transcribed from a Pol III
Promoter」、2004年3月11日、Heらを参照されたい。同様に、哺乳動物のROS遺伝子(図4(配列番号:8を参照されたい)あるいはCD74−ROS融合ポリヌクレオチドまたは切断型ROSポリヌクレオチド(図2(配列番号:2)または切断型を参照されたい)に対する少なくとも1種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するROS阻害治療薬を、上記のような方法に従って調製することができる。ROS阻害アンチセンス化合物を含有する医薬組成物を、後で詳述するように調製および投与することができる。
RNA干渉の過程を通して、ROSの翻訳を阻害し、したがってROSの活性を阻害する、低分子干渉RNA分子(siRNA)組成物も、本発明の方法において望ましいように用いることができる。RNA干渉、すなわち、標的タンパク質をコードするmRNAと相補的な配列を含有する外因性の短い二本鎖RNA分子の導入による、標的タンパク質の発現の選択的なサイレンシングについては、よく記載されている。例えば、米国特許公開第20040038921号、「Composition and Method for Inhibiting Expression of a Target Gene」、2004年2月26日、Kreutzerら;米国特許公開第20020086356号、「RNA
Sequence-Specific Mediators of RNA Interference」、2003年6月12日、Tuschlら;米国特許公開第20040229266号、「RNA
Interference Mediating Small RNA Molecules」、2004年11月18日、Tuschlらを参照されたい。
Application Guide」;Promegaの「RNAi:A Guide to Gene Silencing」を参照されたい。 また、ROS阻害siRNA製品も市販されており、本発明の方法において適切に用いることができる。例えば、Dharmacon社、Lafayette、CO (カタログ番号M-003162-03、MU-003162-03、D-003162-07 thru-10 (siGENOME(商標)SMARTselection and SMARTpool(登録商標)siRNAs)を参照されたい。
52:456;McCutchanら,(1968),J. Natl. Cancer Inst. 41:351;Chuら(1987),Nucl. Acids Res. 15:1311;Fraleyら(1980),J.
Biol. Chem. 255:10431;Capecchi(1980),Cell 22:479)。また、カチオン性リポソームを用いてDNAを細胞内に導入することもできる(Feignerら(1987)、Proc.
Natl. Acad. Sci USA
84:7413)。市販のカチオン性脂質製剤には、Tfx50(Promega)またはリポフェクトアミン 200(Life Technologies)などがある。あるいは、ウイルスベクターを用いて、細胞にdsRNAを送達して、RNAiを媒介させることもできる。米国特許公開第20040023390号、「siRNA-mediated Gene Silencing with Viral Vectors」、2004年2月4日、Davidsonらを参照されたい。
to suppress gene expression in mammalian cells (2002)Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 5515-5520;Yuら、(2002)Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 6047-6052;Paul, C.ら、(2002)Nature
Biotechnology 19, 505-508;McManusら、(2002)RNA 8, 842-850も参照されたい。
本発明の方法の実施において有用なROSキナーゼ阻害治療用組成物を、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道(エアロゾル)、直腸、膣、および局所(頬および舌下など)の投与を含む経口または腹膜の経路を含むが、これらに限定されない、当技術分野で知られている任意の方法によって、哺乳動物に投与することができる。
Cell Bio., 2, 139;DELIVERY STRATEGIES FOR ANTISENSE
OLIGONUCLEOTIDE THERAPEUTICS、Akbtar(編)、1995、Maurerら、1999、Mol. Membr. Biol., 16, 129-140;HoflandおよびHuang、1999、Handb.
Exp. Pharmacol, 137, 165-192;ならびにLeeら、2000、ACS Symp. Ser., 752, 184-192に記載されている。Beigelmanら、米国特許第6,395,713号、およびSullivanら、PCT第WO94/02595号には、核酸分子の送達のための一般的な方法についてさらに記載されている。これらのプロトコルは、事実上、あらゆる核酸分子の送達に利用することができる。
Cancer Res., 5, 2330-2337、およびBarryら、国際PCT公開第WO99/3 1262号に記載されているような、針を使用しない技術によって行うことができる。
Transplant, 8, 47-58)(Alkermes社、Cambridge, Mass.);血液脳関門を越えて薬剤を送達することができ、神経細胞による取り込みの機構を変化させ得る、ポリブチルシアノアクリレート製のもののような、充填ナノ粒子(Prog Neuro-psychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999)。本発明の方法において有用なROS阻害化合物の送達戦略の他の非限定的な例には、Boadoら、1998、J.
Pharm. Sci, 87, 1308-1315;Tylerら、1999、FEBS Lett., 421, 280-284;Pardridgeら、1995、PNAS
USA., 92, 5592-5596;Boado、1995、Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107;Aldrian-Herradaら、1998、Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916;およびTylerら、1999、PNAS
USA., 96, 7053-7058に記載される物質が含まれる。
1005-1011)。このようなリポソームは、おそらく血管が新生された標的組織における溢出および捕獲によって、腫瘍中に選択的に蓄積されることが示されている(Lasicら、Science 1995, 267, 1275-1276;Okuら、1995、Biochim.
Biophys. Acta, 1238, 86-90)。長期循環リポソームは、特に、MPS組織内に蓄積されることが知られている従来のカチオン性リポソームと比較して、DNAおよびRNAの薬物動態および薬力学を向上させる(Liuら、J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870;Choiら、国際PCT公開第WO96/10391号;Ansellら、国際PCT公開第WO96/10390号;Hollandら、国際PCT公開第WO96/10392号)。また、長期循環リポソームは、肝臓および脾臓のような代謝的に活発なMPS組織における蓄積を回避できるため、カチオン性リポソームと比較して、薬剤をヌクレアーゼ分解からより強く保護する可能性も高い。
Publishing社(A. R. Gennaro(編)1985)に記載されている。例えば、保存剤、安定剤、色素、および賦香剤を用いることができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、p−ヒドロキシ安息香酸エステルが含まれる。さらに、抗酸化剤および懸濁剤を用いることもできる。
本発明はまた、部分的には、化合物が癌においてCD74−ROS融合ポリペプチドの活性を阻害するかどうかを判定することによって、化合物がCD74−ROSの転座および/または融合ポリペプチドを特徴とする癌の進行を抑制するかどうかを判定する方法も提供する。いくつかの好ましい実施形態では、骨髄、血液、または腫瘍からの細胞を含有する生体試料を調べることによって、ROSの活性の阻害を判定する。他の好ましい一実施形態では、少なくとも1つの本発明の変異ROSポリヌクレオチドまたは変異ROSポリペプチド特異的試薬を用いて、ROSの活性の阻害を判定する。
包括的なリン酸化ペプチドプロファイリングによる、NSCLC患者由来のROSキナーゼ活性の同定
最近記載された、複雑な混合物から修飾ペプチドを単離して質量分析で特性決定を行うための強力な技術(「IAP」技術、Rushら、前掲を参照されたい)を用いて、CS042を含む数人のヒトNSCLC患者におけるキナーゼ活性化の包括的なリン酸化プロファイルを調べた。リン酸化チロシン特異的抗体(CELL SIGNALING TECHNOLOGY社、Beverly, MA,
2003/04カタログ#9411)を用いてIAP技術を行い、NSCLC細胞株の抽出液からリン酸化チロシンを含むペプチドを単離し、次いで、その特性決定を行った。
合計0.5gの腫瘍組織を、1.25×108細胞/mLで、尿素溶解緩衝液(20mM
HEPES pH8.0、9M 尿素、1mM バナジン酸ナトリウム、2.5mM ピロリン酸ナトリウム、1mM β−グリセロリン酸)中にホモジナイズして溶解して、超音波で破砕した。超音波で破砕した溶解液を、20,000×gの遠心分離によって清澄化して、以前に記載されているようにタンパク質を還元してアルキル化した(Rushら、Nat. Biotechnol. 23(1):94-101(2005)を参照されたい)。試料を20mM
HEPES pH 8.0で希釈して、尿素の最終濃度を2Mにした。トリプシン(0.001M HCl中に1mg/mL)をこの溶解液上清に1:100v/vで添加した。試料を室温で一晩消化させた。
MOPS/NaOH pH7.2、10mM Na2HPO4、50mM NaCl)中に再懸濁して、12,000×gで10分間の遠心分離によって不溶性物質を除去した。
IP溶出液(40μL)中のペプチドを、溶出した抗体からStop and Go抽出チップ(StageTips)を用いて濃縮および分離させた(Rappsilberら、Anal. Chem., 75(3):663-70(2003)を参照されたい)。このマイクロカラムから、ペプチドを、1μLの60%MeCN、0.1%TFAで、7.6μLの0.4%酢酸/0.005%ヘプタフルオロ酪酸(HFBA)中に溶出させた。この試料を、不活性のサンプルインジェクションバルブを有するFamosオートサンプラー(Dionex)を用いて、Magic C18 AQ逆相樹脂(Michrom Bioresources)の詰まった10cm×75μmのPicoFritキャピラリーカラム(New Objective)上にロードした。このカラムを、0.4%酢酸、0.005%HFBA中のアセトニトリルの45分間の直線濃度勾配によって、流速280nL/分(Ultimate、Dionex)で展開した。
(BioWorks 3.0の一部として供給されるSequest Browser
package(v.27, rev.12)中の)TurboSequest(ThermoFinnigan)を用いて、MS/MSスペクトルを評価した。以下の設定で、Sequest
BrowserプログラムCreateDtaを用いて、生のデータファイルから個々のMS/MSスペクトルを抽出した:下限分子量、700;上限分子量、4,500;イオンの最小数、20;最小TIC、4×105;かつプレカーサー荷電状態、不特定。試料注入前の生のデータファイルの開始から溶出勾配の終了まで、スペクトルを抽出した。Sequest解析用にさらにMS/MSスペクトルを選択するために、IonQuestプログラムおよびVuDtaプログラムは用いなかった。以下のTurboSequestパラメータでMS/MSスペクトルを評価した:ペプチドマストレランス、2.5;フラグメントイオントレランス、0.0;修飾ごとに異なるアミノ酸の最大数、4;マスタイプ親、平均;マスタイプ断片、平均;内部切断部位の最大数、10;水およびアンモニアのbおよびyイオンからのニュートラルロスは相関解析において考慮した。エラスターゼ消化から収集されるスペクトルを除き、タンパク質分解酵素を特定した。
CD74−ROS融合遺伝子の単離および配列決定
NSCLC患者において活性化型のROSキナーゼの存在が認められた場合には、キメラなROS転写産物が存在するかどうかを決定するために、ROSのキナーゼドメインをコードしている配列のcDNA末端の5’高速増幅を行った。
RNeasy Miniキット(Qiagen)を用いて、CS045細胞株からRNAを抽出した。DNAは、DNeasy Tissueキット(Qiagen)を用いて抽出した。cDNA末端の高速増幅は、5' RACEシステム(Invitrogen)を用いて、cDNA合成用のROS−GSP1プライマーならびにネストPCR反応用のROS−GSP2プライマーおよびROS−GSP3プライマーで行った。
RT−PCRのために、SuperScript(商標)IIIファーストストランド合成システム(Invitrogen)を用いて、ファーストストランドcDNAを、2.5μgの全RNAからオリゴ(dT)20で合成した。次いで、以下のCD74−F1およびROS−GSP3のプライマー対を用いて、CD74−ROS融合遺伝子を増幅した:
ROS−GSP1:ACCCTTCTCGGTTCTTCGTTTCCA(配列番号:7)
ROS−GSP2:GCAGCTCAGCCAACTCTTTGTCTT(配列番号:8)
ROS−GSP3:TGCCAGACAAAGGTCAGTGGGATT(配列番号:9)
CD74−F1:GCAGAATGCCACCAAGTATGGCAA(配列番号:10)
得られた産物の配列解析によって、ROSのC端末がCD74遺伝子のN末端に融合していることが明らかにされた(図1、パネルBおよびCを参照されたい)。このCD74−ROS融合遺伝子は、インフレームであり、CD74の最初の208アミノ酸がROSの最後の495アミノ酸に融合されており(図1、パネルBを参照されたい)、結果として融合タンパク質が生じていた。CD74は染色体5q32に位置し、一方、ROSは染色体6q22に位置していた。したがって、該融合遺伝子は、t(5;6)(q32;q22)によって引き起こされていた。
FISHアッセイを用いた、ヒト癌試料中のCD74−ROS融合タンパク質の発現の検出
以前に記載されているように、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)アッセイを用いて、ヒトNSCLC腫瘍試料中のCD74−ROS融合タンパク質の存在を検出した。例えば、Vermaら、HUMAN CHROMOSOMES:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York, N.Y.(1988)を参照されたい。200を超える、パラフィン包埋したヒトNSCLC腫瘍試料を調べた。
Burlingame, CA)中の4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI;mg/mL)を核対比染色に適用した。
PCRアッセイを用いた、ヒト癌試料中の変異ROSキナーゼの発現の検出
以前に記載されている、ゲノムもしくは逆転写酵素(RT)のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、ヒト癌試料中の切断型ROSキナーゼおよび/またはCD74−ROS融合タンパク質の存在を検出することもできる。例えば、Coolsら、N. Engl. J. Med. 348:1201-1214(2003)を参照されたい。
Claims (16)
- 以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含有する単離ポリヌクレオチド:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有するCD74−ROS融合ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列;
(b)CD74−ROS融合ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列であって、配列番号:2のヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列;
(c)(a)のヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であって、且つROSキナーゼ活性を維持するCD74−ROS融合ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列;
(d)(b)のヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であって、且つROSキナーゼ活性を維持するCD74−ROS融合ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列;ならびに、
(e)(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項2に記載の組換えベクターが導入された、組換え宿主細胞。
- 組換えCD74−ROS融合ポリペプチドを作製する方法であって、請求項1の(a)〜(d)に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターが導入された組換え宿主細胞を前記ポリペプチドの発現に好適な条件下において培養するステップと、前記ポリペプチドを回収するステップとを含む方法。
- 以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有し、且つROSキナーゼ活性を維持するCD74−ROS融合ポリペプチドである単離ポリペプチド:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列;および
(b)(a)のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列。 - 請求項5に記載のポリペプチドを特異的に結合または検出するが、野生型CD74も野生型ROSも結合または検出しない、抗体である、単離試薬。
- 肺癌における変異ROSポリヌクレオチドおよび/または変異ROSポリペプチドの存在を検出する方法であって、
肺癌を有する患者または肺癌を有する疑いのある患者から採取した生体試料において、請求項1に記載のポリヌクレオチドおよび/または請求項5に記載のポリペプチドの存在を検出するステップを含む方法。 - 前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項7に記載の方法。
- 変異ROSポリヌクレオチドまたは変異ROSポリペプチドの存在によって、少なくとも1つのROSキナーゼ阻害治療薬を含有する組成物に反応性を示す可能性の高い癌を同定する、請求項7または8に記載の方法。
- フローサイトメトリー(FC)の形態、免疫組織化学(IHC)の形態、免疫蛍光(IF)アッセイの形態、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)の形態、およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイの形態からなる群から選択される形態で実施される、請求項7または8に記載の方法。
- 前記CD74−ROS融合ポリペプチドのキナーゼ活性を検出する、請求項7または8に記載の方法。
- 化合物が請求項1に記載のCD74−ROS融合ポリヌクレオチドおよび/または請求項5に記載のCD74−ROS融合ポリペプチドを特徴とする癌の進行を抑制するかどうかをインビトロで判定する方法であって、前記化合物が前記癌において前記CD74−ROS融合ポリペプチドの発現および/または活性を阻害するかどうかを判定するステップを含む方法。
- 前記CD74−ROS融合ポリペプチドの発現および/または活性の阻害の判定は、請求項1に記載のポリヌクレオチドおよび/または請求項5に記載のポリペプチドを検出することに基づいて行われる、請求項12に記載の方法。
- 非小細胞肺癌(NSCLC)の進行を阻害するための、請求項1に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNAを含有する医薬であって、前記NSCLCは、請求項1に記載のポリヌクレオチドまたは請求項5に記載のポリペプチドの存在によって特徴づけられる、医薬。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNAは、以下からなる群:
(a)配列番号:1のアミノ酸配列を含有するCD74−ROS融合ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列;ならびに、
(b)CD74−ROS融合ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列であって、配列番号:2のヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列の一部と相補的である、請求項14に記載の医薬。 - 生体試料中のCD74−ROS融合ポリヌクレオチドおよび/またはCD74−ROS融合ポリペプチドの検出用のキットであって、請求項1に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドおよび/または請求項6に記載の少なくとも1つの試薬、ならびに1つまたは複数の第2の試薬を含むキット。
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