ES2539830T3 - ROS quinasa mutante y de translocación en el carcinoma pulmonar no microcítico humano - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS, comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS que comprende la secuencia de aminoácidos N-terminal de SLC34A2 que consiste en los restos 1-126 de SEQ ID NO:5, y el dominio quinasa de ROS que consiste en los restos 1945-2222 de SEQ ID NO:7; (d) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos N-terminal de SLC34A2 que consiste en los nucleótidos 1-378 de SEQ ID NO:6, y la secuencia de nucleótidos del dominio quinasa de ROS que consiste en los nucleótidos 6032-6865 de SEQ ID NO:8; y (e) una secuencia de nucleótidos complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a)-(d).

Description

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beneficiarse de la terapia con inhibidores de ROS.

B. Polinucléotidos aislados

La presente descripción proporciona, en parte, polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos de fusión de SLC34A2-ROS, sondas nucleotídicas que se hibridan con estos polinucleótidos, y métodos, vectores y células hospedantes para utilizar dichos polinucleótidos para producir polipéptidos de fusión recombinantes.

A menos que se indique lo contrario, todas las secuencias de nucleótidos determinadas mediante la secuenciación de una molécula de ADN en la presente se determinaron empleando un secuenciador de ADN automático (tal como el modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.), y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de ADN determinadas en la presente se determinaron empleando un secuenciador de péptidos automático. Tal como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada mediante esta estrategia automática, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en la presente puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas de modo automático generalmente son al menos aproximadamente 90% idénticas, más generalmente de al menos aproximadamente 95% hasta al menos aproximadamente 99,9% idénticas a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real puede determinarse de modo más preciso mediante otras estrategias, que incluyen métodos de secuenciación de ADN manuales muy conocidos en la técnica. Como también se conoce en la técnica, una única inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos determinada, comparada con la secuencia real, provocará un desplazamiento de marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos, de modo que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos realmente codificada por la molécula de ADN secuenciada, comenzando en el punto de dicha inserción o deleción.

A menos que se indique lo contrario, cada secuencia de nucleótidos indicada en la presente se presenta como una secuencia de desoxirribonucleótidos (abreviados como A, G, C y T). Sin embargo, una “secuencia de nucleótidos” de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido significa, para una molécula o polinucleótido de ADN, una secuencia de desoxirribonucleótidos, y para una molécula o polinucléotido de ARN, la correspondiente secuencia de ribonucleótidos (A, G, C y U), en la que cada desoxirribonucleótido de timidina (T) en la secuencia de desoxirribonucleótidos especificada está reemplazada por el ribonucléotido uridina (U). Por ejemplo, con referencia a una molécula de ARN que tiene la secuencia de SEQ ID NO:2 o 4, o indicada empleando las abreviaturas de desoxirribonucleótidos, pretende indicar una molécula de ARN que tiene una secuencia en la que cada desoxirribonucleótido A, G o C de SEQ ID NO:2 o 4 ha sido reemplazado por el correspondiente ribonucleótido A, G

o C, y cada desoxirribonucleótido T ha sido reemplazado por un ribonucleótido U.

La descripción proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3;

(b)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS, comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4;

(c)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS que comprende la secuencia de aminoácidos N-terminal de SLC34A2 (restos 1-126 de SEQ ID NO:5) y el dominio quinasa de ROS (restos 1945-2222 de SEQ ID NO:7);

(d)

una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos N-terminal de SLC34A2 (restos 1-378 de SEQ ID NO:6) y la secuencia de nucleótidos del dominio quinasa de ROS (restos 6032-6865 de SEQ ID NO:8);

(e)

una secuencia de nucleótidos que comprende al menos seis nucleótidos contiguos que incluyen la zona de unión de la fusión (restos 376-381 de SEQ ID NO:2 o restos 376-381 de SEQ ID NO:4) de un polinucleótido de fusión de SLC34A2-ROS;

(f)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende al menos seis nucleótidos contiguos que incluyen la zona de unión de la fusión (restos 126-127 de SEQ ID NO:1 o restos 126-127 de SEQ ID NO:3) de un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS; y

(g)

una secuencia de nucleótidos complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a)-(f).

Empleando la información proporcionada en la presente, tal como las secuencias de nucleótidos en las figuras 2A-B (SEQ ID NO:2 y 4), puede obtenerse una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica un polipéptido de ROS mutante de la invención, empleando procedimientos de clonación y selección convencionales, tales como los utilizados para clonar ADNc empleando ARNm como material de partida. Como ejemplo de la invención, los polinucleótidos descritos en las figuras 2A-2B (SEQ ID NO:2 y 4) se aislaron a partir de ADN genómico procedente de una línea de células NSCLC humanas (tal como se describe más en fondo en el siguiente

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ejemplo 4). El gen de fusión también puede identificarse en bancos de ADN genómico o de ADNc en otros cánceres

o carcinomas pulmonares en los que se produce la translocación de SLC34A2-ROS (4p15, 6q22), o en los que una deleción u otra translocación diferente resulta en la expresión de una ROS quinasa truncada que carece del dominio extracelular de la quinasa de tipo salvaje.

La secuencia de nucleótidos determinada de los productos del gen de translocación de SLC34A2-ROS (SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4) codifica dos variantes de la proteína de fusión de quinasa (largo y corto) de 724 aminóácidos (véase la figura 2A (SEQ ID NO:1) y la figura 1) y de 621 aminoácidos (véase la figura 2B (SEQ ID NO:3) y la figura 1), respectivamente. Los polinucleótidos de fusión de SLC34A2-ROS comprenden la porción de la secuencia de nucleótidos de SLC34A2 de tipo salvaje (veáse la figura 3 (SEQ ID NO:6)) que codifica el N-terminal de esta proteína (exones 1-4) con la porción de la secuencia de nucleótidos de ROS de tipo salvaje (veáse la figura 4 (SEQ ID NO:8) que codifica los dominios transmembrana y quinasa de esta proteína (exones 32-43 o exones 34-43, respectivamente) (véase la figura 1). El dominio quinasa comprende los restos 322-599 en el primer variante de la proteína de fusión (largo) (codificado por los nucléotidos 964-1797 del polinucleótido del primer variante de fusión) y los restos 219-496 en el segundo variante de la proteína de fusión (corto) (codificado por los nucléotidos 655-1488 del polinucleótido del segundo variante de fusión).

Tal como se indicó, la presente invención proporciona, en parte, la forma madura de las proteínas de fusión de SLC34A2-ROS. Según la hipótesis de la señal, las proteínas segregadas por células de mamífero tienen una secuencia conductura secretora o señal que se rompe y escinde de la proteína madura tras haberse iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. La mayoría de las células de mamífero, e incluso células de insecto, rompen las proteínas segregradas con la misma especificidad. Sin embargo, en algunos casos, la ruptura de la proteína segregada no es totalmente uniforme, lo cual produce dos o más especies maduras de la proteína. Además, es sabido que la especificidad de ruptura de una proteína segregada viene determinada, en último término, por la estructura primaria de la proteína completa, es decir, es inherente a la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por tanto, la pesente invención proporciona, en parte, secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS maduro cuya secuencia de aminoácidos es codificada por el clon de ADNc identificado como ATCC n.º de depósito PTA-7877, que se depositó en the American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, EEUU) el 20 de septiembre, 2006, según las disposiciones del Tratado de Budapest.

Un polipéptido de SLC34A2-ROS maduro cuya secuencia de aminoácidos es codificada por el clon de ADNc deposita significa la forma madura de esta proteína de fusión producida mediante la expresión en una célula de mamífero (por ejemplo, células COS, tal como se describe a continuación) del marco de lectura abierto completo codificado por la secuencia de ADN humano del clon contenida en el vector en la célula hospedante depositada.

Tal como se ha indicado, los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, o en forma de ADN, que incluye, por ejemplo, ADNc y ADN genómico obenido por clonación o producido de modo sintético. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario. El ARN o ADN monocatenario puede ser la hebra codificadora, también conocida como hebra sentido, o puede ser la hebra no codificadora, también conocida como hebra antisentido.

Los polinucleótidos aislados de la invención son moléculas de ácidos nucleicos, ADN o ARN, que han sido retiradas de su entorno nativo. Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para los fines de la presente invención. Otros ejemplos de moléculas de ADN aisladas incluyen moléculas de ADN recombinante mantenidas en células hospedantes heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcial o sustancialmente) en disolución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcripciones de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN de la presente invención. Las moléculas de ácidos nucleicos aisladas según la presente invención incluyen también las moléculas producidas de modo sintético.

Los polinucleótidos aislados de la descripción incluyen las moléculas de ADN que aparecen en la figura 2A-B (SEQ ID NO:2 y 4), las moléculas de ADN que comprenden la secuencia codificadora de las proteínas de fusión de SLC34A2-ROS maduras que aparecen en la figura 1 (SEQ ID NO:1 y 3), y las moléculas de ADN que comprenden una secuencia sustancialmente diferente de las descritas anteriormente, pero que, debido a la degeneración del código genético, siguen siendo un polipéptido de ROS mutante de la invención. El código genético es muy conocido en la técnica y, así, los expertos en la técnica están habituados a generar estos variantes degenerados.

En otra realizacion, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS que comprende la secuencia de nucleótidos de la translocación SLC34A2-ROS contenida en el clon de ADNc depositado descrito anteriormente. Preferiblemente, esta molécula de ácido nucleico codificará el polipéptido de fusión maduro codificado por el clon de ADNc depositado. En otra realización, la invención proporciona una secuencia de nucleótidos aislada que codifica un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS que comprende la secuencia de aminoácidos N-terminal de SLC34A2 (restos 1-126 de SEQ ID NO:5) y el dominio quinasa de ROS (restos 1945-2222 de SEQ ID NO:7). En un ejemplo, el polipéptido que comprende el dominio quinasa de ROS comprende los restos 1750-2347 o 1853-2347 de SEQ ID NO:7 (véase la figura 1, panel B). En otro ejemplo, la secuencia de aminoácidos N-terminal mencionada anteriormente de SLC34A2 y el dominio quinasa de ROS son codificados por las secuencias de nucleótidos que comprenden los nucleótidos 1-378 de SEQ ID NO:6 y

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polinucleótidos según la invención empleados para hibridarse con una porción de un ácido nucleico de la invención, puesto que dicho polinucleótido se hibridará con cuaquier molécula de ácido nucleico que contienga un tramo de poli(A) o con su complemento (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc bicatenario).

Tal como se indicó, las moléculas de ácidos nucleicos de la presente descripción, que codifican un polipéptido de ROS quinasa mutante de la invención, pueden incluir las que codifican la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro por sí solas; la secuencia codificadora del polipéptido maduro y secuencias adicionales, tales como las que codifican la secuencia conductora o secretora, tales como una secuencia de pre-, pro-o pre-pro-proteína; la secuencia codificadora del polipéptido maduro, con o sin las secuencias codificadoras adicionales mencionadas anteriormente, junto con secuencias no codificadoras adicionales que incluyen, por ejemplo, intrones y secuencias no codificadoras 5’ y 3’, tales como las secuencias transcritas no traducidas que desempeñan un papel en la transcripción, el procesamiento de ARNm, que incluyen señales de corte y empalme y de poliadenilación, por ejemplo, la unión a ribosomas y la estabilidad de ARNm; una secuencia codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionales, tales como las que proporcionan funcionalidades adicionales.

Así, la secuencia que codifica el polipéptido puede estar condensada con una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del polipéptido condensado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como el marcador proporcionado en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otras, muchas de las cuales están disponibles en el mercado. Tal como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. El marcador “HA” es otro péptido útil para la purificación, que se corresponde con un epitopo derivado de la proteína de la hemaglutinina de la gripe, que se ha descrito en Wilson et al., Cell, 37: 767 (1984). Tal como se analiza a continuación, otras de estas proteínas de fusión incluyen el propio polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS condensado con Fc en el N-o C-terminal.

La presente invención se refiere además a variantes de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención, que codifican porciones, análgos o derivados de un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS o del polipéptido de ROS quinasa truncado descritos en la presente. Los variantes pueden aparecer en la naturaleza, tales como un variante alélico natural. Un “variente alélico” significa una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus concreto sobre un cromosoma de un organismo. Véase, por ejemplo, GENES II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1985). Pueden producirse variantes que no aparecen en la naturaleza empleando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica.

Estos variantes incluyen los producidos mediante sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar a uno o más nucléotidos. Los variantes pueden estar alterados en regiones codificadoras, en regiones no codificadoras o en ambas. Las alteranciones en las regiones codificadoras pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. Entre estas, se prefieren especialmente las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades (por ejemplo, actividad quinasa) de los polipéptidos de ROS quinasa mutantes descritos en la presente. También se prefieren especialmente a este respecto las sustituciones conservativas.

La descripción incluye polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que es al menos 90% idéntica, y más preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a un polinucleótido de ROS mutante de la invención (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de fusión de RB-ROS que tiene la secuencia de aminoácidos completa que aparece en la figura 2A-B (SEQ ID NO:1 o 3); o una secuencia de nucléotidos que codifica el N-terminal de SLC34A2 y el dominio quinasa de ROS (véase la figura 1, panel B; y las figuras 3 y 4); o un nucleótido complementario a dichos ejemplos de secuencias).

Un polinucléotido que tiene una secuencia de nucleótidos que es al menos, por ejemplo, 95% “idéntica” a una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica un polipéptido de ROS quinasa mutante significa que la secuencia de nucleótidos del polinucléotido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido ROS mutante. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucléotidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro nucleótido, o una serie de nucleótidos de hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones 5’-o 3’-terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier punto entre estas posiciones terminales, dispersas de forma individual entre los nucleótidos en la secuencia de referencia, o en uno o más grupo contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Desde un punto de vista práctico, cualquier molécula de ácido nucleico concreta que sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que aparecen en la figura 2A-B (SEQ ID NO:2 o 4) o a la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc depositado descrito anteriormente, puede determinarse de modo convencional empleando programas informáticos conocidos, tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575

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Science Drive, Madison, Wis. 53711). El programa Bestfit emplea el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2: 482-489 (1981), para descubrir el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se emplea Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia concreta es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de un polinucleótido de fusión de SLC34A2-ROS de referencia según la presente invención, los parámetros se ajustan, por supuesto, de modo que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y se permitan huecos en la homología de hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.

La presente descripción incluye, en su alcance, moléculas de ácidos nucleicos que son al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de ácidos nucleicos que aparecen en la figura 2A-2B (SEQ ID NO:2 o 4), o a los nucleótidos 379-2172 de SEQ ID NO:2 o los nucleótidos 379-1863 de SEQ ID NO:4, o a la secuencia de ácido nucleido del ADNc depositado, independientemente de que codifiquen un polipéptido que tenga actividad ROS quinasa. Esto es porque, aunque una molécula de ácido nucleico concreta no codifique un polipéptido de fusión que tenga actividad ROS quinasa, los expertos en la técnica todavía sabrán cómo emplear la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, como una sonda de hibridación o como cebador de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tenga actividad quinasa incluyen, entre otros, (1) aislar el gen de la translocación de SLC34A2-ROS o sus variantes alélicos en un banco de ADNc; (2) la hibridación in situ (por ejemplo, “FISH”) con un frotis de cromosomas en metafase para proporcionar la localización cromosómica precisa del gen de la translocación de SLC34A2-ROS, según se describe en Verma et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, Nueva York (1988); y análisis de la transferencia Northern para detectar la expresión de ARNm de la proteína de fusión de SLC34A2-ROS en tejidos específicos.

Sin embargo, se prefieren las moléculas de ácidos nucleicos que tienen secuencias que son al menos 95% idénticas a una polipéptido de ROS quinasa mutante de la invención, o a la secuencia de ácido nucleico del ADNc depósitado, que, de hecho, codifican un polipéptido de fusión que tiene actividad ROS quinasa. Esta actividad puede ser similar, pero no necesariamente idéntica, a la actividad de la proteína de fusión de SLC34A2-ROS descrita en la presente (tanto la proteína de longitud completa como la proteína madura o un fragmento de la proteína que conserve la actividad quinasa), según se mide en un ensayo biológico concreto. Por ejemplo, la actividad quinasa de ROS puede estudiarse determinando su capacidad para fosforilar uno o más sustratos peptídicos que contienen tirosina, por ejemplo, el “péptido relacionado con Src” (RRLIEDAEYAARG), que es un sustrato para muchas tirosina quinasas de receptor y no receptor.

Debido a la degeneración del código genético, los expertos en la técnica reconocerán inmediatamente que un gran número de moléculas de ácidos nucleicos que tienen una secuencia que es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico del ADNc depositado o a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la figura 2A-B (SEQ ID NO:2 y 4), codificarán un polipéptido de fusión que tiene actividad ROS quinasa. De hecho, puesto que los variantes degenerados de estas secuencias de nucleótidos codifican todos el mismo polipéptido, esto será evidente para los expertos en la técnica, incluso sin realizar el ensayo de comparación descrito anteriormente. También se reconoce en la técnica que, para las moléculas de ácidos nucleicos que no son variantes degenerados, un número razonable de estas también codificarán un polipéptido que conserve la actividad ROS quinasa. Esto es debido a que los expertos en la técnica conocen perfectamente las sustituciones de aminoácidos que es menos probable que afecten, o que en absoluto afecten significativamente a la función de la proteína (por ejemplo, sustituir un aminoácido alifático por un segundo aminoácido alifático).

Por ejemplo, se proporcionan directrices acerca de cómo conseguir sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas en Bowie et al., “Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions,” Science, 247: 1306-1310 (1990), que describe dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio. El primer método se basa en el proceso de la evolución, en el que las mutaciones son aceptadas o rechazadas por la selección natural. La segunda estrategia emplea la ingeniería genética para introducir cambios en aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado, y selecciones para identificar las secuencias que conservan la funcionalidad. Estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos. Los expertos en la técnica que están familiarizados con estas técnicas también conocerán cuáles son los cambios de aminoácidos que es probable que puedan realizarse en una posición concreta de la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los aminoácidos enterrados requieren cadenas lateales no polares, mientras que pocas características de las cadenas laterales de la superficie en general se conservan. Otras de estas sustituciones fenotípicamente silenciosas se describen en Bowie et al., supra, y en las referencias citadas allí.

Pueden utilizarse los métodos para la secuenciación de ADN que son muy conocidos y que en general están disponibles en la técnica para implementar cualquier realización de polinucleótidos de la invención. Los métodos pueden emplear enzimas, tales como el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, SEQUENASE® (US Biochemical Corp, Cleveland, Ohio), Taq polimerasa (Perkin Elmer), polimerasa T7 termoestable (Amersham, Chicago, III.), o combinaciones de polimerasas recombinantes y exonucleasas correctoras, tales como el sistema de amplificación ELONGASE, comercializado por Gibco BRL (Gaithersburg, Md.). Preferiblemente, el proceso se automatiza con máquinas tales como Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, Nev.), termociclador Peltier (PTC200; MJ Research,

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Watertown, Mass.) y los secuenciadores de ADN ABI 377 (Perkin Elmer).

Las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido de ROS mutante de la invención pueden extenderse empleando una secuencia de nucleótidos parcial y empleando diversos métodos conocidos en la técnica para detectar secuencias cadena arriba, tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, un método que puede emplearse, la PCR “de sitio de restricción”, emplea cebadores universales para recuperar una secuencia desconocida adyacente a un locus conocido (Sarkar, G., PCR Methods Applic., 2: 318-322 (1993)). En particular, primero se amplifica el ADN genómico en presencia de un cebador para una secuencia conectora y un cebador específico de la región conocida. Los ejemplos de cebadores son los descritos en el ejemplo 4 de la presente. Las secuencias amplificadas después se someten a una segunda ronda de PCR con el mismo cebador de conector y otro cebador específico interno al primero. Los productos de cada ronda de PCR se transcriben con una ARN polimerasa apropiada y se secuencian empleando una transcriptasa inversa.

También puede emplearse una PCR inversa para amplificar o extender secuencias empleando cebadores divergentes basados en una región conocida (Triglia et al., Nucleic Acids Res., 16: 8186 (1988)). Los cebadores pueden diseñarse empleando el software de análisid de cebadores OLIGO 4.06 (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), u otro programa apropiado, para que tengan una longitud de 22-30 nucleótidos, para que tengan un contenido en GC del 50% o mayor, y para que se reasocien con la secuencia diana a unas temperaturas de aproximadamente 68-72 ºC. El método emplea varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida de un gen. El fragmento después se circulariza mediante acoplamiento intramolecular y se emplea como molde de PCR.

Otro método que puede utilizarse es la PCR de captura, que implica una amplificación por PCR de fragmentos de ADN adyacentes a una secuenca conocida en ADN cromosómico artificial de levadura y humano (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic., 1: 111-119 (1991)). En este método, también pueden emplearse múltiples digestiones con enzimas de restricción y acoplamientos para colocar una secuencia bicatenaria modificada en una proción desconocida de la molécula de ADN antes de realizar la PCR. Otro método que puede utilizarse para recuperar secuencias desconocidas es el descrito en Parker et al., Nucleic Acids Res., 19: 3055-3060 (1991)). Además, se puede utilizar la PCR, cebadores anidados y bancos PROMOTERFINDER® para realizar un paseo en un ADN genómico (Clontech, Palo Alto, Calif.). Este proceso evita la necesidad de seleccionar bancos y es útil para descubrir zonas de unión de intrón/exón.

Cuando se seleccionan ADNc de longitud completa, resulta preferible emplear bancos que han sido seleccionados según el tamaño para que incluyan ADNc más largos. Además, son preferibles bancos cebados aleatoriamente, porque contendrán más secuencias que incluyan las regiones 5’ de genes. El empleo de un banco cebado aleatoriamente puede resultar especialmente preferible en situaciones en las que un banco de oligo-d(T) no contenga un ADNc de longitud completa. Los bancos genómicos pueden ser útiles para la extensión de la secuencia hacia las regiones reguladoras no transcritas 5’ y 3’.

Pueden emplearse sistemas de electroforesis capilar, que están disponibles en el mercado,para analizar el tamaño o confirmar la secuencia de nucleótidos de los productos de la secuenciación o de PCR. En particular, la secuenciación capilar puede emplear polímeros fluidos para la separación electroforética, cuatro tintes fluorescentes diferentes (uno para cada nucleótido) que son activados por láser, y la detección de las longitudes de onda emitidas mediante una cámara con dispositivo de carga acoplada. La intensidad de salida/de la luz puede convertirse en una señal eléctrica empleando un software apropiado (por ejemplo, GENOTYPER y SEQUENCE NAVIGATOR, Perkin Elmer), y el proceso completo desde la carga de las muestras al análisis por ordenador y la presentación de los datos electrónicos puede estar controlado por ordenador. La electroforesis capilar es especialmente preferible para la secuenciación de pequeños trozos de ADN que puedan estar presentes en cantidades limitadas en una muestra concreta.

C. Vectores y células hospedantes

La presente invención también proporciona vectores recombinantes que comprenden un polinucléotido aislado de la presente invención, células hospedantes que están genéticamente modificadas con los vectores recombinantes, y la producción de polipéptidos de SLC34A2-ROS recombinantes o sus fragmentos por medio de técnicas recombinantes.

Las construcciones recombinantes pueden introducirse en las células hospedantes empleando técnicas muy conocidas, tales como infección, transducción, transfección, transvección, electroporación y transformación. El vector puede ser, por ejemplo, un fago, plásmido, vector vírico o retrovírico. Los vectores retrovíricos pueden ser competentes en la replicación o defectuosos en la replicación. En este último caso, la propagación vírica en general se producirá solo en las células hospedantes complementadoras.

Los polinucleótidos pueden unirse a un vector que contenga un marcador seleccionable para la propagación en un hospedante. En general, un vector plasmídico se introduce en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, este puede encapsularse in vitro empleando una línea celular encapsulante apropiada, y después transducirse en las células hospedantes.

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Se prefieren los vectores que comprenden regiones de control de acción en cis para el polinucleótido de interés. Los factores de acción en trans apropiados pueden ser suministrados por el hospedante, ser suministrados por un vector complementador o ser suministrados por el propio vector tras su introducción en el hospedante. En ciertas realizaciones preferidas a este respecto, los vectores proporcionan la expresión específica, que puede ser inducible y/o específica del tipo celular. Entre estos vectores, se prefieren en particular los que son inducibles por factores ambientales que sean fáciles de manipular, tales como la temperatura y aditivos de nutrientes.

Los vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores derivados de cromosmas, episomas y virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas de levaduras, elementos cromosómicos de levaduras, virus, tales com baculovirus, papovavirus, virus de vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia, y retrovirus, y vectores derivados de sus combianaciones, tales como cósmidos y fágmidos.

El inserto de ADN que comprende un polinucléotido de SLC34A2-ROS o un polinucleótido ROS truncado de la invención debe estar unido operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli, los promotores temprano y tardío de SV40, y promotroes de LTR retrovíricos, por nombrar unos cuantos. Los expertos en la técnica conocen otros promotores adecuados. Las construcciones de expresión contendrán también sitios para el inicio y terminación de la transcripción y, en la región trascrita, un sitio de unión a ribosomas para la traducción. La porción codificadora de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluirá preferiblemente un inicio de la traducción al principio y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) colocado de modo apropiado al final del polipéptido que se va a traducir.

Tal como se ha indicado, los vectores de expresión incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Estos marcadores incluyen la resistencia a la dihidrofolato reductasa o la neomicina para un cultivo de células eucariotas, y genes de resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina para cultivoar en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de los hospedantes apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura; células de insecto, tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales, tales como células CHO, COS y de melanoma de Bowen; y células vegetales. Los medios de cultivo y las condiciones apropiados para las células hospedantes descritas anteriormente son conocidos en la técnica.

Entre los vectores preferidos para su uso en las bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles en Qiagen; los vectores pBS, los vectores Phagescript, los vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles en Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles en Pharmacia. Entre los vectores eucariotas preferidos se incluyen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles en Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia. Para los expertos en la técnica serán evidentes otros vectores adecuados.

Entre los promotores bacterianos conocidos adecuados para su uso en la presente invención se incluyen los promotores lacI y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores lambda PR y PL, y el promotor trp. Los promotores eucariotas adecuados incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de timidina quinasa de HSV, los promotores temprano y tardío de SV40, los promotores de LTR retrovíricos, tales como los del virus del sarcoma de Rous (RSV), y promotores de metalotioneína, tal como el promotor de metalotioneína-I de ratón.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden emplearse una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, tales como factor alfa, alcohol oxidasa, y PGH. Para un análisis, véase Ausubel et al. (1989), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., y Grant et al., Methods Enzymol., 153: 516-544 (1997).

La introducción de la construcción en la célula hospedante puede realizarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Estos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986).

La transcripción de ADN que codifica un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS de la presente invención por eucariotas superiores puede aumentar insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de acción de cis del ADN, que generalmente tienen de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan para aumentar la actividad transcripcional de un promotor en un tipo de célula hospedante concreta. Los ejemplos de potenciadores incluyen el potenciador de SV40, que está localizado en el lado tardío del origen de la replicación en las pares de bases 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación, y potenciadores adenovíricos.

Para la secreción de la proteína traducida hacia el lumen del retículo endoplásmico, hacia el espacio periplásmico o hacia el entorno extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

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secuencias de péptidos epitópicas equivalentes y muy homólogas en otras especies de mamífero, por ejemplo, murinas o de conejo, o viceversa. Los anticuerpos útiles para la práctica de los métodos de la descripción incluyen

(a) anticuerpos monoclonales, (b) anticuerpos policlonales purificados que se unen específicamente al polipéptido diana (por ejemplo, la zona de unión de la fusión del polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS (véase la figura 7, panel inferior), (c) los anticuerpos descritos en (a)-(b) anteriores que se unen a epitopos equivalentes y muy homólogos o a sitios de fosforilación en otras especies no humanas (por ejemplo, ratón, rata), y (d) fragmentos de (a)-(c) anteriores que se unen al antígeno (o más preferiblemente al epitopo) al cual se unen los ejemplos de anticuerpos descritos en la presente.

El término “anticuerpo” o “anticuerpos”, tal como se emplea en la presente, se refiere a todos los tipos de inmunoglobulinas, que incluyen IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, y puede tener su origen en cualquier especie que incluye (por ejemplo) ratón, rata, conejo, caballo, o ser humano, y pueden ser anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, M. Walker et al., Molec. Immunol., 26: 403-411 (1989); Morrision et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 81: 6851 (1984); Neuberger et al., Nature, 312: 604 (1984)). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes producidos según los métodos descritos en la patente de EEUU n.º 4.474.893 (Reading) o la patente de EEUU n.º 4.816.567 (Cabilly et al.). Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos específicos construidos químicamente preparados según el método descrito en la patente de EEUU n.º 4.676.980 (Segel et al.).

El sitio epitópico preferido de un anticuerpo específico de un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS de la invención en un fragmento peptídico que consiste fundamentalmente en aproximadamente 11 a 17 aminoácidos de la secuencia de un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS humano (SEQ ID NO:1 yo 3), incluyendo dicho fragmento la zona de unión de la fusión (que aparece en el resto 126 en el primer y segundo variante de la proteína de fusión (véase la figura 1 (panel C) y la figura 7 (panel inferior)). Se apreciará que los anticuerpos que se unen específicamente a epitopos/péptidos más cortos o más largos que incluyen la zona de unión de la fusión de un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS están dento del alcance de la presente descripción.

La descripción incluye el uso de anticuerpos y moléculas equivalentes, tales como dominios de unión de proteínas o aptámeros de ácidos nucleicos, que se unen, de una manera específica de la proteína de fusión o de la proteína truncada, fundamentalmente al mismo epitopo al cual se une un anticuerpo específico de un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS o un anticuerpo específico del epitopo del punto de truncamiento de ROS útiles en los métodos de la invención. Véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature, 312: 604 (1984). Estos reactivos equivalentes que no son anticuerpos pueden emplearse de modo adecuado en los métodos de la descripción, tal como se describe más a fondo a continuación.

Los anticuerpos policlonales útiles en la práctica de los métodos de la invención pueden producirse según técnicas convencionales mediante la inmunización de un animal adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, etc.) con un antígeno que incluya un epitopo específico de la proteína de fusión deseado (por ejemplo, la zona de unión de la fusión (véase la figura 7, panel inferior), la recolección del suero inmunológico del animal, y la separación de los anticuerpos policlonales del suero inmunológico, y la purificación de los anticuerpos policlonales que tienen la especificidad deseada, según procedimientos conocidos. El antígeno puede ser un antígeno peptídico sintético que comprenda la secuencia epitópica deseada, seleccionado y construido según técnicas muy conocidas. Véase, por ejemplo, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, capítulo 5, pp. 75-76, Harlow & Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Czernik, Methods In Enzymology, 201: 264-283 (1991); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 21-49 (1962)). Los anticuerpos policlonales producidos según se describe en la presente pueden seleccionarse y aislarse como se describe más a fondo a continuación.

Los anticuerpos monoclonales también pueden emplearse de modo beneficioso en los métodos de la invención, y pueden producirse en líneas celulares de hibridoma según la técnica conocida de Kohler y Milstein, Nature 265: 49597 (1975); Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511 (1976); véase también CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al. eds. (1989). Los anticuerpos monoclonales producidos de esta manera son muy específicos, y mejoran la selectividad y la especificidad de los metodos de ensayo proporcionados por la invención. Por ejemplo, una disolución que contiene el antígeno apropiado (por ejemplo, un péptido sintético que comprenda la zona de unión de la fusión de un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS) puede inyectarse en un ratón y, después de un tiempo suficiente (según las técnicas convencionales), el ratón se sacrifica y se obtienen las células esplénicas. Las células esplénicas entonces se inmortalizan mediante su fusión con células de mieloma, generalmente en presencia de polietilenglicol, para producir células de hibridoma. Pueden producirse hibridomas de fusión de conejo, por ejemplo, según se describe en la patente de EEUU n.º 5.675.063, C. Knight, otorgada el 7 de octubre de 1997. Las células de hibridoma entonces se cultivan en un medio de selección adecuado, tal como hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), y el sobrenadante se selecciona para detectar los anticuerpos monoclonales que tienen la especificidad deseada, tal como se describe a continuación. El anticuerpo segregado puede recuperarse del sobrenadante del cultivo de tejido mediante métodos convencionales, tales como precipitación, intercambio iónico o cromatografía de afinidad, o similares.

También pueden producirse fragmentos Fab monoclonales en Escherichia coli mediante técnicas recombinantes conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, W. Huse, Science, 246: 1275-1281 (1989); Mullinax et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., 87: 8095 (1990). Si se prefieren anticuerpos monoclonales de un isotipo para una

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aplicación concreta, los isotipos concretos pueden prepararse directamente, mediante la selección a partir de la fusión inicial, o prepararse de modo secundario, a partir de un hibridoma parental que segregue un anticuerpo monoclonal de un isotipo diferente emplando la técnica de selección sib para aislar variantes de clase de conmutación (Steplewski, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 82: 8653 (1985); Spira et al., J. Immunol. Methods, 74: 307 (1984)). El sitio de combinación con el antígeno del anticuerpo monoclonal puede clonarse mediante PCR y producirse anticuerpos monocatenarios como anticuerpos recombinantes presentados sobre fagos o anticuerpos solubles en E. coli (véase, por ejemplo, ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS, 1995, Humana Press, Sudhir Paul editor).

Además, la patente de EEUU n.º 5.194.392, Geysen (1990), describe un método general para detectar o determinar la secuencia de monómeros (aminoácidos y otros compuestos) que es un equivalente topológico del epitopo (es decir, un “mimotopo”), que es complementario con un paratopo concreto (sitio de unión al antígeno) de un anticuerpo de interés. Más en general, este método implica detectar o determinar una secuencia de monómeros que es un equivalente topográfico de un ligando que es complementario con el sitio de unión al ligando de un receptor concreto de interés. De forma similar, la patente de EEUU n.º 5.480.971, Houghten et al. (1996), describe oligopéptidos peralquilados de alquilo C1-C lineal y conjuntos y bancos de dichos péptidos, así como métodos para emplear dichos conjuntos y bancos de oligopéptidos para determinar la secuencia de un oligopéptido peralquilado que se une preferentemente con una molécula aceptora de interés. Así, mediante estos métodos también pueden prepararse, de forma rutinaria, análogos no peptídicos de los péptidos que portan epitopos de la descripción.

Los anticuerpos útiles en los métodos de la invención, tanto policlonales como monoclonales, pueden seleccionarse para la especificidad de la proteína de fusión y el epitopo según técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Czemik et al., Methods in Enzymology, 201: 264-283 (1991). Por ejemplo, los anticuerpos pueden seleccionarse frente a un banco de péptidos mediante ELISA para asegurar la especificidad par el antígeno deseado y, si se quiere, para la reactividad solo con un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS de la invención y no con SLC34A2 de tipo salvaje ni con ROS de tipo salvaje. Los anticuerpos también pueden ensayarse mediante un análisis de la transferencia Western frente a preparaciones de células que contienen la proteína diana para confirmar la reactividad solo con la diana deseada y para asegurarse de que no se produce una unión apreciable con otras proteínas de fusión que impliquen a ROS. La producción, la selección y el uso de anticuerpos específicos de proteínas de fusión son conocidos por los expertos en la técnica, y se han descrito. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de EEUU 20050214301, Wetzel et al., 29 de septiembre de 2005.

Los anticuerpos específicos de polipéptidos de fusión útiles en los métodos de la invención pueden mostrar cierta reactividad cruzada limitada con epitopos de fusión similares en otras proteínas de fusión o con epitopos en SLC34A2 de tipo salvaje y ROS de tipo salvaje que forman la zona de unión de la fusión. Esto no resulta inesperado, puesto que la mayoría de los anticuerpos muestra algún grado de reactividad cruzada, y los anticuerpos antipéptidos a menudo tienen reactividad cruzada con epitopos que tienen una alta homología o identidad con el péptido inmunizante. Véase, por ejemplo, Czernik, supra. La reactividad cruzada con otras proteínas de fusión se caracteriza con facilidad mediante un análisis de la transferencia Western junto con marcadores de peso molecular conocido. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de reacción cruzada pueden estudiarse para identificar los sitios muy homólogos o idénticos a la secuencia del polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS a la cual se une el anticuerpo. La reactividad cruzada no deseada puede eliminarse mediante selección negativa empleando la purificación de anticuerpos sobre columnas de péptidos (por ejemplo, eliminando por selección los anticuerpos que se unen a SLC34A2 de tipo salvaje y/o ROS de tipo salvaje).

Los anticuerpos especificos del polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS de la descripción que son útiles para practicar los métodos descritos en la presente son específicos, de manera ideal, para el polipéptido de fusión humano, pero no se limitan solo a la unión con la especie humana, per se. La descripción incluye la producción y el uso de anticuerpos que también se unen a epitopos conservados y altamente homólogos o idénticos en otras especies de mamífero (por ejemplo, ratón, rata, mono). Las secuencias muy homólogas o idénticas en otras especies pueden identificarse con facilidad mediante comparaciones de secuencias convencionales, tales como el empleo de BLAST, con las secuencias del polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS humano descrito en la presente (SEQ ID NO:1 y 3).

Los anticuerpos empleados en los métodos de la invenciòn también pueden caracterizarse y validarse para su uso en un formato de ensayo concreto, por ejemplo, FC, IHC y/o ICC. El uso de anticuerpos específicos del polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS en estos métodos se describe más a fondo en la siguiente sección F. Los anticuerpos también pueden conjugarse de modo ventajoso con tintes fluorescentes (por ejemplo, Alexa488, PE), o con marcadores tales como puntos cuánticos, para su uso en análisis multiparamétricos junto con otros anticuerpos de transducción de señales (fosfo-AKT, fosfo-Erk 1/2) y/o de marcador celular (citoqueratina), según se describe más a fondo en la siguiente sección F.

En la práctica de los métodos de la descripción, la expresión y/o la actividad de SLC34A2 de tipo salvaje y/o ROS de tipo salvaje en una muestra biológica concreta también puede estudiarse de modo ventajoso empleando anticuerpos (fosfoespecíficos o totales) para estas proteínas de tipo salvaje. Por ejemplo, están disponibles en el mercado anticuerpos específicos del sitio de fosforilación del receptor CSF (véase CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly Mass., 2005/06 n.os de catálogo 3151, 3155, y 3154; y Upstate Biotechnology, 2006, n.º de catálogo 06-457).

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Estos anticuerpos también pueden ser producidos según métodos convencionales, tal como se describió anteriormente. Las secuencias de aminoácidos de SLC34A2 y ROS humanas están publicadas (véanse las figuras 3 y 4, y los n.os de registro de SwissProt mencionados), así como las secuencias de estas proteínas procedentes de otras especies.

La detección de la expresión y/o activación de SLC34A2 de tipo salvaje y de ROS de tipo salvaje, junto con la expresión del polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS, en una muestra biológica (por ejemplo, una muestra de tumor), puede proporcionar información sobre si la proteína de fusión está dirigiendo por sí sola al tumor, o si ROS de tipo salvaje también está activada y está dirigiendo al tumor. Este información es útil desde el punto de vista clínico para evaluar si se deben tomar medidas contra la proteína de fusión o contra la proteína o proteínas de tipo salvaje o todas, o si es probable que sea más beneficioso inhibir el avance del tumor, y para seleccionar un producto terapéutico apropiado o una de sus combinaciones. Los anticuerpos específicos para el dominio extracelular de ROS quinasa de tipo salvaje, que no están presentes en la ROS quinasa truncada descrita en la presente, pueden ser particularmente útiles para determinar la presencia/ausencia de la ROS quinasa mutante.

Se entenderá que puede emplearse más de un anticuerpo en la práctica de los métodos descritos anteriormente. Por ejemplo, uno o más anticuerpos específicos del polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS, junto con uno o más anticuerpos específicos para otra quinasa, receptor o sustrato de quinasa del cual se sospecha que está, o que potencialmente está, activado en un cáncer en el que el polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS se expresa, pueden emplearse simultáneamente para detectar la actividad de estas otras moléculas de señalización en una muestra biológica que comprenda células de dicho cáncer.

Los expertos en la técnica apreciarán que los polipéptidos de fusión de SLC34A2-ROS de la presente invención y sus fragmentos que portan el epitopo de la zona de unión de la fusión descritos anteriormente pueden combinarse con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), para producir polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una mayor semivida in vivo. Esto se ha demostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas que consisten en los primeros dos dominios del polipéptido de CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas humanas (documento 394.827; Traunecker et al., Nature, 331: 84-86 (1988)). Las proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica unida por disulfuro, debido a la parte IgG, también pueden ser más eficaces para la unión y la neutralización de otras moléculas distintas al polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS monomérico por sí solo (Fountoulakis et al., J. Biochem., 270: 3958-3964 (1995)).

Péptidos marcados con isótopos pesados (péptidos AQUA)

Los reactivos específicos del polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS útiles en la práctica de los métodos descritos también pueden comprender péptidos marcados con isótopos pesados adecuados para la cuantificación absoluta del polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS expresado en una muestra biológica. Se ha descrito la producción y el uso de péptidos AQUA para la cuantificación absoluta de proteína (AQUA) en mezclas complejas. Veáse el documento WO/03016861, “Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry,” Gygi et al., y también Gerber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 6940-6945 (2003).

La metodología AQUA emplea la introducción de una cantidad conocida de al menos un patrón de péptido marcado con un isótopo pesado (que tienen una firma exclusiva que puede detectarse mediante cromatografía LC-SRM) en una muestra biológica digerida para determinar, por comparación con el patrón peptídico, la cantidad absoluta de un péptido con la misma secuencia y modificación en la proteína en la muestra biológica. Brevemente, la metodología AQUA tiene dos etapas: la selección y validación de patrones internos peptídicos, y el desarrollo del método; y la puesta en práctica empleando los patrones internos peptídicos validados para detectar y cuantificar una proteína diana en una muestra. El método es una poderosa técnica para detectar y cuantificar una proteína/péptido concreto dentro de una mezcla biológica compleja, tal como un lisado de células, y puede emplearse, por ejemplo, para cuantificar el cambio en la fosforilación de proteínas como resultado de un tratamiento con fármacos, o para cuantificar las diferencias en el nivel de una proteína en diferentes estados biológicos.

En general, para desarrollar un patrón interno adecuado, se elige un péptido (o un péptido modificado) concreto dentro de una secuencia de proteína diana, basándose en su secuencia de aminoácidos y en la proteasa concreta que se va a utilizar para la digestión. Después se genera el péptido mediante una síntesis peptídica en fase sólida, de forma que un resto es reemplazado por el mismo resto que contiene isótopos estables (13C, 15N). El resultado es un péptido que es químicamente idéntico a su homólogo nativo formado mediante proteolisis, pero que puede distinguirse con facilidad mediante MS a través del desplazamiento de masas de 7-Da. El péptido de patrón interno AQUA recién sintetizado después se evalúa mediante LC-MS/MS. Este proceso proporciona información cualitativa acerca de la retención del péptido mediante una cromatografía en fase inversa, la eficacia de ionización, y la fragmentación a través de disociación inducida por colisión. Se eligen los iones de los fragmentos informativos y abundantes para conjuntos de péptidos de patrón interno y nativos, y después se controlan de modo específico en una sucesión rápida como una función de la retención cromatográfica para formar un método de control de la reacción seleccionada (LC-SRM) basado en el perfil exclusivo del patrón peptídico.

La segunda etapa de la estrategia AQUA es su puesta en práctica para medir la cantidad de una proteína o de una

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proteína modificada en mezclas complejas. Lisados de células completas se fraccionan generalmente mediante una electroforesis en gel de SDS-PAGE, y se cortan y extraen las regiones del gel donde se produce la migración de las proteínas. A este proceso le sigue una proteolisis dentro del gel en presencia de los péptidos AQUA y un análisis de LC-SRM (véase Gerber et al., supra). Los péptidos AQUA se siembran en la mezcla compleja de péptidos obtenida mediante la digestión del lisado de células completas con una enzima proteolítica, y se someten a a una purificación de inmunoafinidad según se describió anteriormente. El tiempo de retención y el patrón de fragmentación del péptido nativo formado mediante digestión (por ejemplo, tripsinización) son idénticos a los del péptido de patrón interno AQUA determinados previamente; por tanto, un análisis de LC-MS/MS empleando un experimento SRM produce una medición muy específica y sensible del patrón interno y del analito directamente a partir de mezclas extremadamente complejas de péptidos.

Puesto que se añade una cantidad absoluta del péptido AQUA (por ejemplo, 250 fmol), puede utilizarse la proporción de las áreas bajo la curva para determinar los niveles de expresión precisos de una proteína o una forma fosforilada de una proteína en el lisado de células original. Además, el patrón interno está presente durante la digestión dentro del gel a medida que se forman los péptidos nativos, de modo que la eficacia de extracción del péptido de los trozos del gel, las pérdidas absolutas durante la manipulación de la muestra (que incluye una centrifugación al vacío), y la variabilidad durante la introducción en el sistema de LC-MS no afectan a la proporción determinada de abundancias de los péptidos nativos y AQUA.

Se desarrolla un patrón de péptido AQUA para una secuencia conocida previamente identificada mediante el método IAP-LC-MS/MS dentro de una proteína diana. Si el sitio está modificado, puede desarrollarse un péptido AQUA que incorpore la forma modificada del resto concreto dentro del sitio, y puede desarrollarse un segundo péptido AQUA que incorpore la forma no modificada del resto. De esta forma, los dos patrones pueden empleaerse para detectar y cuantificar las formas modificadas y no modificadas del sitio en una muestra biológica.

También pueden generarse patrones internos de péptidos estudiando la secuencia de aminoácidos primaria de una proteína y determinando los límites de los péptidos producidos mediante ruptura con proteasa. Como alternativa, una proteína puede ser realmente digerida con una proteasa y después puede secuenciarse un fragmento peptídico concreto producido. Las proteasas adecuadas incluyen serina proteasas (por ejemplo, tripsina, hepsina), metaloproteasas (por ejemplo, PUMP1), quimotripsina, catepsina, pepsina, termolisina, carboxipeptidasas, etc.

Se selecciona una secuencia peptídica dentro de una proteína diana según uno o más criterios para optimizar el uso del péptido como patrón interno. Preferiblemente, el tamaño del péptido se selecciona para minimizar las posibilidades de que la secuencia peptídica esté repetida en otro lugar en otras proteínas no diana. Así, un péptido tiene preferiblemente al menos aproximadamente 6 aminoácidos. El tamaño del péptido también se optimiza para maximizar la frecuencia de ionoización. Así, no se prefieren péptidos más largos que aproximadamente 20 aminoácidos. El intervalo preferido es de aproximadamente 7 a 15 aminoácidos. También se selecciona una secuencia peptídica que sea poco probable que sea químicamente reactiva durante la espectrometría de masas, y así se evitan las secuencias que comprenden cisteína, triptófano o metionina.

Una secuencia peptídica que no incluye una región modificada de la región diana puede seleccionarse de modo que el patrón interno de péptido pueda emplearse para determinar la cantidad de todas las formas de la proteína. Como alternativa, puede resultar deseable un patrón interno de péptido que incluya un aminoácido modificado para detectar y cuantificar solo la forma modificada de la proteína diana. Los patrones de péptidos para ambas regiones modifica y no modificada pueden emplearse juntos, para determinar el grado de una modificación en una muestra concreta (es decir, para determinar cuál es la fracción de la cantidad total de proteína que representa a la forma modificada). Por ejemplo, pueden emplearse patrones de péptidos para la forma fosforilada y no fosforilada de una proteína de la cual se sabe que está fosforilada en un sitio concreto, para cuantificar la cantidad de forma fosforilada en una muestra.

El péptido se marca empleando uno o más aminoácidos marcados (es decir, el marcador es una parte real del péptido) o, menos preferiblemente, los marcadores pueden unirse después de la síntesis según métodos convencionales. Preferiblemente, el marcador es un marcador que altera la masa seleccionado que se basa en las siguientes consideraciones: la masa debe ser exclusiva para desplazar las masas de los fragmentos producidos mediante el análisis de MS hasta regiones del espectro con bajo fondo; el componente de firma de masa iónica es la porción del resto marcador que muestra preferiblemente una firma de masa iónica exclusiva en un análisis de MS; la suma de las masas de los átomos constituyentes del marcador es preferible y exclusivamente diferente a la de los fragmentos de todos los aminoácidos posibles. Como resultado, los péptidos y aminoácidos marcados pueden distingurise con facilidad de los no marcados mediante el patrón de iones/masa en el espectro de masas resultante. Preferiblemente, el componente de firma de masa iónica imparte una masa a un fragmento de la proteína que no se corresponde con la masa del resto para ninguno de los 20 aminoácidos naturales.

El marcador debe ser robusto bajo las condiciones de fragmentación de MS y no sufrir una fragmentación desfavorable. La química del marcaje debe ser eficaz bajo una gama de condiciones, en particular condiciones desnaturalizantes, y el marcador marcado preferiblemente permanece soluble en el sistema tampón de MS elegido. El marcador preferiblemente no reprime la eficacia de ionización de la proteína y es químicamente no reactivo. El marcador puede contener una mezcla de dos o más especies isotópicamente diferenciadas para generar un patrón

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espectrométrico de masas exclusivo en cada posición del fragmento marcado. Los isótopos estables, tales como 2H,13C, 15N, 17O, 18O, o 34S, están entre los marcadores preferidos. También pueden prepararse parejas de patrones internos de péptidos que incorporen un marcador de isótopo diferente. Los restos aminoácidos preferidos en los que pueden incorporarse un marcador de isótopo pesado incluyen leucina, prolina, valina y fenilalanina.

Los patrones internos de péptidos se caracterizan según su proporción de masa a carga (m/z), y preferiblemente, también según su tiempo de retención en una columna cromatográfica (por ejemplo, una columna de HPLC). Los patrones internos que coeluyen con los péptidos no marcados de secuencia idéntica se seleccionan como patrones internos óptimos. El patrón interno después se analiza fragmentando el péptido mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, mediante disociación inducida por colisión (CID) empleando, por ejemplo, argón o helio como gas de colisión. Después los fragmentos se analizan, por ejemplo, mediante espectrometría de masas de múltiples etapas (MSn) para obtener un espectro de iones de fragmentos, para obtener una firma de fragmentación del péptido. Preferiblemente, los fragmentos del péptido presentan diferencias significativas en las proporciones de m/z para permitir que los picos que se corresponden con cada fragmente estén bien separado, y se obtiene una firma que es exclusiva del péptido diana. Si no se obtiene una firma de los fragmentos adecuada en la primera etapa, se realizan más etapas de MS hasta que se obtiene una firma exclusiva.

Los iones de fragmentos en los espectros de MS/MS y MS3 generalmente son muy específicos para el péptido de interés, y, junto con los métodos de LC, permiten un medio muy selectivo para detectar y cuantificar un péptido/proteína diana en una mezcla compleja de proteínas, tal como un lisado celular, que contenga muchos miles

o decenas de miles de proteínas. Puede ensayarse cualquier muestra biológica que contenga potencialmente un péptido/proteína diana de interés. Se emplean preferiblemente extractos celulares brutos o parcialmente purificados. En general, la muestra tendrá al menos 0,01 mg de proteína, generalmente una concentración de 0,1-10 mg/ml, y puede ajustarse al pH y la concentración del tampón deseado.

Entonces se añade una cantidad conocida de un patrón interno de péptido marcado, preferiblemente aproximadamente 10 femtomoles, que se corresponde con una proteína diana que se va a detectar/cuantificar, a una muestra biológica, tal como un lisado de células. Después la muestra sembrada se digiere con una o más proteasas durante un periodo de tiempo adecuado para permitir la digestión. Entonces se realiza una separación (por ejemplo, mediante HPLC, HPLC de fase inversa, electroforesis capilar, cromatografía de intercambio iónico, etc.) para aislar el patrón interno marcado y su correspondiente péptido diana de los otros péptidos en la muestra. La LC microcapilar es un método preferido.

Cada péptido aislado después se estudia controlando una reacción seleccionada en el MS. Esto implica emplear el conocimiento previo obtenido a través de la caracterización del patrón interno de péptido y después se requiere del MS para controlar de modo continuo un ion específico en el espectro de MS/MS o MSn para el péptido de interés y el patrón interno. Después de la elución, se calcula el área bajo la curva (AUC) para el patrón de péptido y el péptido diana. La proporción de las dos áreas proporciona la cuantificación absoluta que puede normalizarse para el número de células empleado en el análisis y el peso molecular de la proteína, para proporcionar el número de copias preciso de la proteína por células. Otros detalles de la metodología AQUA se describen en Gygi et al., y Gerber et al., supra.

De modo deseable, pueden producirse patrones de péptidos internos AQUA (péptidos marcados con isótopos pesados), según se describió anteriormente, para detectar y cuantificar cualquier sitio exclusivo (por ejemplo, la zona de unión de la fusión dentro de un polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS) dentro de un polipéptido de ROS mutante de la invención. Por ejemplo, puede prepararse un fosfopéptido AQUA que se corresponda con la secuencia de la zona de unión de la fusión del polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS (véase la figura 7 (panel inferior)). Pueden producirse patrones de péptidos para la zona de unión de la fusión de SLC34A2-ROS, y estos patrones pueden emplearse en la metodología AQUA para detectar y cuantificar la zona de unión de la fusión (es decir, la presencia del polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS) en una muestra biológica.

Por ejemplo, un ejemplo de péptido AQUA de la descripción comprende la secuencia de aminoácidos LVGDDF (véase la figura 7, panel inferior), que se corresponde con los tres aminoácidos inmediatamente flanqueantes a cada lado de la zona de unión de la fusión en el segundo variante (corto) del polipéptido de fusión de SLC34A2-ROS (véase SEQ ID NO:11). Se apreciará que los péptidos AQUA más grandes que comprenden la secuencia de la zona de unión de la fusión (y otros restos cadena abajo o cadena arriba de esta) también pueden construirse. De modo similar, un péptido AQUA más pequeño que comprenda menos de todos los restos de dicha secuencia (pero que todavía comprenda el punto de la zona de unión de la fusión en sí mismo) puede construirse de modo alternativo. La selección y la producción de los péptidos AQUA peferidos puede realizarse como se describió anteriormente (véase Gygi et al., y Gerber et al., supra).

Sondas de ácidos nucleicos

Los reactivos específicos de la fusión proporcionados por la invención también incluyen cebadores y sondas de ácidos nucleicos adecuados para la detección de un polinucleótido de SLC34A2-ROS, según se describió en detalle en la anterior sección B. El uso espcífico de dichas sondas en ensayos, tales como la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) o la amplificación por PCR, se describe en la siguiente sección F.

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