CN108148912B - 肿瘤的生物标志物、应用和肿瘤检测试剂盒 - Google Patents

肿瘤的生物标志物、应用和肿瘤检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肿瘤的生物标志物、应用和肿瘤检测试剂盒，涉及生物技术及医学领域。本发明的研究表明，肿瘤患者例如含有EML4‑ALK或SLC34a2‑ROS1融合基因的非小细胞肺癌患者血液中存在特定的环状RNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1‑6所示；揭示SEQ ID NO.1‑6所示环状RNA与非小细胞肺癌相关，该环状RNA在血浆样本中稳定、恒定的存在，具有高度特异性和有效性，其可以作为肿瘤检测的生物标志物；其相应的检测该环状RNA的试剂例如引物和探针均可以用于制备肿瘤检测试剂盒，为肿瘤检测、诊断、治疗以及预后评估提供一种新的思路和手段。

Description

肿瘤的生物标志物、应用和肿瘤检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术及医学领域，具体而言，涉及肿瘤的生物标志物、应用和肿瘤检测试剂盒。
背景技术
肺癌是目前全球致死率和发生率最高位的肿瘤，其中超过85％为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。传统的化疗在治疗非小细胞肺癌方面作用有限，诊断后中位生存期往往不足一年。近年来，针对肺癌的分子机制的研究取得了长足进步，明确肺癌的分子分型，选择适合其靶点的靶向药物，对非小细胞肺癌治疗可以取得令人满意的疗效。
基因融合是由两个或多个基因的编码区首尾相连,置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下,构成的嵌合基因。在NSCLC中已发现棘皮动物微管结合蛋白4(EML4)基因和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因的融合。EML4-ALK融合基因是发生于非小细胞肺癌中的促癌的基因突变，占非小细胞肺癌发生率的4-5％。EML4-ALK导致酪氨酸激酶异常表达，引起细胞的恶性转化。目前，靶向药物克唑替尼(Crizotinib)已在临床中用于EML4-ALK融合基因检测阳性的晚期NSCLC患者，能明显延长EML4-ALK融合基因检测阳性患者的总生存期。SL34A2-ROS1融合基因在NSCLC中的发生率约为1.0％-3.4％，在EGFR/KRAS/ALK均阴性的人群中的发生率则可至5.7％，病理类型主要是腺癌。SL34A2-ROS1基因发生融合时丢失细胞外区域，保留跨膜和细胞内酪氨酸激酶区域，融合位点主要发生在ROS1基因的第32、34、35、36号外显子。ROS1受体酪氨酸激酶参与激活多条下游信号转导通路，包括RAS-MAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT3、PLCγ/IP3和SHP2/VAV3途径，进而调控肿瘤细胞的生长增殖、细胞周期、分化、转移和迁移。ROS1基因和ALK基因在酪氨酸激酶区域序列存在49％同源性，而在激酶催化区的ATP结合位点二者同源性高达77％，因此ALK抑制剂克唑替尼在治疗ROS1融合基因阳性的NSCLC中具有明显疗效。ROS1融合基因为肺癌的个体化治疗提供新的方案，明确ROS1融合基因在肺腺癌中的阳性率，了解阳性患者临床病理特征及推断好发人群对临床实践具有重要的意义。
研究发现，EML4与ALK的融合机制为在2号染色体短臂上的发生了臂内倒位继而产生融合基因，而且通常为EML4不同外显子与ALK20号外显子之间的融合从而产生了不同的融合类型。融合类型包括E13-A20，E6a/b-A20，E20-A20，E15-A20，E14-A20，E18-A20，E2-A20，E17-A20等，目前常见的类型为V1、V3a/b，其结果导致ALK激酶活性的激活从而产生致癌活性。目前，针对EML4-ALK和SL34A2-ROS1融合蛋白的分子靶向药物克唑替尼(crizotinib)已在III期临床试验中取得令人振奋的疗效，在非小细胞肺癌ALK和ROS1阳性的患者中，克唑替尼正逐渐取代标准的一、二线化疗方案。同时，二代的ALK抑制剂色瑞替尼(ceritinib)和艾乐替尼(alectinib)业已面世，在针对克唑替尼耐药的ALK阳性的非小细胞肺癌患者的使用中获得了美国食品与药品总局(US Food and Drug Administration)的审批。同时，使用色瑞替尼(ceritinib)和艾乐替尼(alectinib)治疗ROS1阳性的临床前研究也在紧锣密鼓的进行。
随着针对ALK及ROS1阳性的药物的顺利研发与临床使用，随之而来的问题是采取何种技术手段筛选明确基因融合变异的患者？目前常规使用的方法是：1.检测肺癌组织中DNA水平的荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)；2.检测肺癌组织中mRNA水平的PCR技术；3.基于ALK基因在与EML4基因融合之后ALK蛋白水平会显著增加，也可从肺癌组织的ALK免疫组化(immunohistochemistry，IHC)水平反映融合状态。
FISH技术是目前临床上针对ALK及ROS1融合基因检测的金标准。但是其也存在一些问题：1.检测相对复杂，对人员、设备、检测过程、结果判读要求较高，存在主客观因素偏倚；2.存在假阳性的可能性；3.阳性阈值的选择对检测的敏感性及特异性也会产生影响。研究报道，当参考值设定为≥10％时，特异性只有23％，这种较低的特异性可能与＜2个信号距离的标准设定有关，当参考值提高到20％时，特异性上升至66％，而敏感性却只有64％。
RT-PCR检测特异性及敏感性均较高，理论上，合适的引物设计能扩增出微量的核酸。虽然PCR检测具有高敏感性、高特异性的特点，但操作相对复杂，成本高，对组织样本要求高，对变异类型的检测存在盲区，经改进方法后敏感性进一步提高，但是操作仍相对复杂，临床推广存在一定困难。IHC检测特点为低成本、相对简单、检测周期短，理论上能检测所有融合变异类型，但是在实际应用中，商业化抗体的检测敏感性和特异性有待进一步提高，发展方向为研发更具特异性的抗体。此外，以上方法均需要可观的临床组织样本，往往只有术后或者多次穿刺的患者样本能够满足需求。因此，临床上亟需建立一种快速有效的可以直接通过检测血液，兼顾灵敏性和特异性的新的EML4-ALK及SLC34a2-ROS1融合基因的检测方法。
发明内容
环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类内源性的非编码RNA。研究表明，circRNAs广泛存在于不同细胞中，且具有组织特异性。而且，血浆等体液中发现也存在circRNAs，这表明circRNA可以作为肿瘤的生物标志物。
为提高肺癌病人的生存率，越来越多的研究者期望找到可用于临床诊断、分型和预后等相关的生物标记物，而circRNA具备成为新型肺癌生物标志物的潜力。
本发明的目的在于提供一种肿瘤的生物标志物，其为环状RNA，该环状RNA选自碱基序列如SEQ ID NO.1-6中任意一种所示的序列。
本发明的另一目的在于提供上述生物标志物的应用。
本发明的另一目的在于提供一种肿瘤检测试剂盒。
本发明是这样实现的：
一种肿瘤的生物标志物，其为环状RNA，所述环状RNA选自SEQ ID NO.1-6。
需要说明的是，SEQ ID NO.1-6所示的序列为环状RNA的线性形式。
用于检测如上所述的生物标志物的引物或探针在制备肿瘤检测试剂盒中的应用。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述肿瘤为肺癌。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述肺癌为非小细胞肺癌。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述非小细胞肺癌与棘皮动物微管结合蛋白4(EML4)基因和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因的融合(EML4-ALK)相关，或者所述非小细胞肺癌与溶质转运蛋白家族34磷酸钠协同转运蛋白2(SLC34a2)基因和c-ros肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶(ROS1)基因的融合(SLC34a2-ROS1)相关。
其中，SEQ ID NO.1-4为EML4和ALK两个基因以V3a和V3b进行融合的标志物，SEQID NO.5-6为SLC34a2和ROS1两个基因进行融合的标志物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述引物的碱基序列如SEQ ID NO.7-371所示。
一种肿瘤检测试剂盒，其包括用于检测样品中环状RNA的试剂，该环状RNA选自碱基序列如SEQ ID NO.1-6中任意一种所示的序列。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂为引物，所述引物选自SEQ IDNO.7-58中的任意一种和SEQ ID NO.59-100中的一种，或者所述引物选自SEQ ID NO.111-239中的任意一种和SEQ ID NO.240-371中的任意一种。
其中，SEQ ID NO.7-58中的任意一种和SEQ ID NO.59-100中的一种的组合可以检测SEQ ID NO.1-4所示的环状RNA，SEQ ID NO.111-239中的任意一种和SEQ ID NO.240-371中的任意一种的组合可以检测SEQ ID NO.5-6所示的环状RNA。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂为探针。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述样品为血液和由其制备的血液产品如血浆。
本发明具有以下有益效果：
本发明的研究表明，肿瘤患者例如含有EML4-ALK或SLC34a2-ROS1融合基因的非小细胞肺癌患者血液中存在特定的环状RNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1-6所示；揭示SEQ IDNO.1-6所示环状RNA与非小细胞肺癌相关，可作为EML4-ALK V3a/3b融合基因及SLC34a2-ROS1融合基因的判断标志，该环状RNA在血液及其相关样本中稳定、恒定的存在，具有高度特异性和有效性，其可以作为肿瘤检测的生物标志物；其相应的检测该环状RNA的试剂例如引物和探针均可以用于制备肿瘤检测试剂盒，为肿瘤检测、诊断、治疗以及预后评估提供一种新的思路和手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中的EML4-ALKV3a/3b融合基因阳性病人血浆中的环状RNA的检测结果；
图2为本发明实施例2中的SLC34A2-ROS1融合基因阳性病人血浆中的环状RNA的检测结果；
图3为本发明实施例3中的采用G102/G103和G103/G106的引物组合方式确定SLC34a2-ROS1融合基因类型的PCR结果；
图4为本发明实施例3中的引物G103、G102和G106对应SLC34a2和ROS1不同融合类型上的位置结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了检测肺癌病人是否具有EML4-ALK融合基因或其融合类型的方法，具体如下：
取三份EML4-ALKV3a/3b融合基因阳性和三例非EML4-ALK融合基因的华西医院肺癌病人血浆样本，均签署知情同意书。
检测样本中环状RNA的步骤如下：
1.提取血浆RNA
1)提取血浆RNA:在250μl血浆中加入750μl Trizol LS试剂裂解血浆，充分混匀，室温静置5min；
2)加200μl氯仿，充分混匀，室温静置3min，然后于4℃，12000g离心15min；
3)取上清约500μl，加入500μl异丙醇，充分混匀，室温静置10min，然后于4℃，12000g离心10min；
4)弃上清，留沉淀，加入1ml 75％的乙醇洗涤后，于4℃，7500g离心5min；
5)重复步骤4)一次；
6)弃乙醇，晾至略干，加入10μl RNase-free的水溶解RNA后，立即置于冰上；
7)用1μl RNA测RNA浓度
3.逆转录体系
使用
Figure BDA0001591308300000061
Kit试剂盒(Life，USA,货号AM1710)进行，按其说明书方法进行：取由血浆中抽提的RNA、10μl和试剂盒中的Random Decamers、2μl，混合均匀，85℃加热3min后立即放冰上，再加入以下成分：
10x RT Buffer 2μl
dNTP Mix 4μl
RNase Inhibitor 1μl
MMLV-RT 1μl
Total 20μl
混合均匀，55℃加热1hr，92℃孵育10min后放冰上待用。
4.PCR体系及引物：
4.1第一轮PCR
引物序列：EA-F1:5’-GCAGAGCCCTGAGTACAAGC-3’(SEQ ID NO.7)；EA-R1:5’-GCTTGGTTGATGATGACATCTTTATG-3’(SEQ ID NO.59)。
使用Vazyme Biotech,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymeras(p505-d1-AB)PCR试剂盒进行第一轮PCR
PCR体系如下：
2x Phanta Max Buffer 25μl
dNTP 1μl
上述引物EA-F1(10μM) 2μl
上述引物EA-R1(10μM) 2μl
Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl
步骤3的cDNA 2μl
ddH<sub>2</sub>O 17μl
Total 50μl
PCR反应条件：
步骤1：95℃3min，
步骤2：95℃15s，
步骤3：55℃15s，
步骤4：72℃35s，
步骤5：返回步骤2，40个循环，
步骤6：72℃5min
PCR产物片段理论长度为503bp或者505bp，分别对应EML4-ALK V3a/V3b融合基因产生的F-cricEA-2A和F-cricEA-4A。但由于血浆样本中F-circEA含量较低，第一轮PCR后用1.5％琼脂糖胶电泳可能未见明显理论长度的条带，所以进行下面的巢式PCR。
4.2巢式PCR
所用引物序列：EA-F2:5’-CAACTACTGCTTTGCTGGCA-3’(SEQ ID NO.8)；EA-R2:5’-TCTGTGTATTTGGAGAGGTTGTG-3’(SEQ ID NO.60)。
使用Vazyme Biotech,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymeras(p505-d1-AB)PCR试剂盒，PCR体系如下：
2x Phanta Max Buffer 25μl
dNTP 1μl
上述引物EA-F2(10μM) 2μl
上述引物EA-R2(10μM) 2μl
Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl
第一轮PCR产物 2μl
ddH<sub>2</sub>O 17μl
Total 50μl
PCR反应条件：
步骤1：95℃3min
步骤2：95℃15s
步骤3：55℃15s
步骤4：72℃30s，
步骤5：返回步骤2，40个循环，
步骤6：72℃5min。
1.5％琼脂糖胶电泳检测，若PCR片段长度约为是271bp，鉴定出病人组织中有F-circEA-4A:EML4-ALK(V3a/3b)；若PCR片段长度约为是269bp，鉴定出病人组织中有F-circEA-2A:EML4-ALK(V3a/3b)。纯化回收PCR产物进行测序确认环状RNA序列，进一步判断病人含有融合基因。
结果如图1所示，图1中：A为各样本的PCR产物电泳图，其中：Positive表示阳性对照，negative表示阴性对照，M表示Marker，数字1，2，3表示EML4-ALK融合基因阳性病人血浆样本，4，5，6表示非EML4-ALK病人血浆样本；B为1号病人组织样本PCR产物的测序图，中间箭头所指表示环状RNA的环化位点。
根据图1的结果可以看出，EML4-ALK阳性样本(图中1、2和3)中存在环状RNA，其中1号样本检测出的环状RNA的线性形式的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，长度550nt，融合类型：F-circEA-4A:EML4-ALK(V3a)型；
2号样本检测出的环状RNA的线性形式的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，长度548nt，融合类型：F-circEA-2A:EML4-ALK(V3a)型；
3号样本检测出的环状RNA有2个，其的线性形式的碱基序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.3的长度583nt，融合类型：F-cricEA-4A:EML4-ALK(V3b)型；SEQ ID NO.4的长度581nt，融合类型：F-cricEA-2A:EML4-ALK(V3b)型；
而非EML4-ALK阳性样本未检测出如SEQ ID NO.1-4所述的环状RNA(图1A中的4/5/6)；由此说明，SEQ ID NO.1-4所述的环状RNA特异性地存在于EML4-ALK(V3a/V3b)阳性患者中，其可作为判断EML4-ALK融合基因的标志物，并可进一步作为非小细胞肺癌尤其是与棘皮动物微管结合蛋白4(EML4)基因和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因的融合(EML4-ALK)相关导致的非小细胞肺癌的标志物。
实施例2
本实施例提供了检测ALK阳性病人是否具有EML4-ALK融合基因或其融合类型的方法，具体如下：
1.收集待测病人的全血，4℃，1500g离心10min，收集上清血浆，-80℃保存；
2.提取血浆RNA
同实施例1。
3.逆转录体系
同实施例1。
4.PCR体系及引物：
4.1第一轮PCR
所用引物序列：EA-F1:5’-GCAGAGCCCTGAGTACAAGC-3’(SEQ ID NO.7)；EA-R1:5’-GCTTGGTTGATGATGACATCTTTATG-3’(SEQ ID NO.59)。
使用Vazyme Biotech,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymeras(p505-d1-AB)PCR试剂盒进行第一轮PCR
PCR体系如下：
2x Phanta Max Buffer 25μl
dNTP 1μl
EA-F1(10μM) 2μl
EA-R1(10μM) 2μl
Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl
步骤3的cDNA 2μl
ddH<sub>2</sub>O 17μl
Total 50μl
PCR反应条件：
步骤1：95℃3min，
步骤2：95℃15s，
步骤3：55℃15s，
步骤4：72℃35s，
步骤5：返回步骤2，40个循环，
步骤6：72℃5min
PCR产物片段理论长度为503bp或者505bp。
4.2巢式PCR
引物序列：EA-F2:5’-CAACTACTGCTTTGCTGGCA-3’(SEQ ID NO.8)；EA-R2:5’-TCTGTGTATTTGGAGAGGTTGTG-3’(SEQ ID NO.60)。
使用Vazyme Biotech,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymeras(p505-d1-AB)PCR试剂盒，PCR体系如下：
2x Phanta Max Buffer 25μl
dNTP 1μl
EA-F2(10μM) 2μl
EA-R2(10μM) 2μl
Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl
第一轮PCR产物 2μl
ddH<sub>2</sub>O 17μl
Total 50μl
PCR反应条件：
步骤1：95℃3min
步骤2：95℃15s
步骤3：55℃15s
步骤4：72℃30s，
步骤5：返回步骤2，40个循环，
步骤6：72℃5min
1.5％琼脂糖胶电泳检测，若PCR片段长度约为是271bp，鉴定出病人组织中有F-circEA-4A:EML4-ALK(V3a/3b)；若PCR片段长度约为是269bp，鉴定出病人组织中有F-circEA-2A:EML4-ALK(V3a/3b)。纯化回收PCR产物进行测序确认环状RNA序列，进一步判断病人含有融合基因。
此外，需要说明的是，在其他的实施例中，还可以使用如表1上游引物和表2中的下游引物进行组合来检测以确定该名患者具有EML4-ALK v3a/b的融合基因型。
表1用于检测EML4-ALK v3a/b的融合基因型的上游引物
Figure BDA0001591308300000101
Figure BDA0001591308300000111
Figure BDA0001591308300000121
表2用于检测EML4-ALK v3a/b的融合基因型的下游引物
Figure BDA0001591308300000122
Figure BDA0001591308300000131
实施例3
本实施例提供了检测肺癌病人是否具有SLC34a2-ROS1融合基因的方法，具体如下：
取4例肺癌患者(其中两例是具有SLC34a2-ROS1融合基因的病人，两例是没有SLC34a2-ROS1融合基因的病人)的血浆样本，均签署知情同意书。
1.提取血浆RNA
同实施例1。
2.逆转录体系
同实施例1。
3.PCR体系及引物：
所用引物序列：G103：5’-TCCTGAAGAGTGGGTAGGTT-3’(SEQ ID NO.111)；WK23：5’-TGTATGAAGGAACAGCAGTGG-3’(SEQ ID NO.242)；WK24：5’-GTGAAGATTGGAGACTTTGGAC-3’(SEQID NO.243)。
PCR反应体系：
体系1(WK24/G103检测CF1)：
2x Phanta Max Buffer 25μl
dNTP 1μl
WK24(10μM) 2μl
G103(10μM) 2μl
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl
cDNA 1μl
ddH<sub>2</sub>O 18μl
Total 50μl
体系2(WK23/G103检测CF2)：
2x Phanta Max Buffer 25μl
dNTP 1μl
WK23(10μM) 2μl
G103(10μM) 2μl
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl
cDNA 1μl
ddH<sub>2</sub>O 18μl
Total 50μl
PCR反应条件：
步骤1：95℃3min
步骤2：95℃15s
步骤3：61℃15s
步骤4：72℃2min，
步骤5：返回步骤2；44个循环，
步骤6：72℃5min。
4.PCR产物电泳和测序：
1.5％琼脂糖胶电泳检测，并纯化回收PCR产物进行测序。
结果如图2所示，图2A和2C中：--表示阴性对照，+表示阳性对照，M表示Marker，数字1，2表示检测CF1的病人血浆样本，3，4表示检测CF2的病人血浆样本。图2B和2D分别为2号和4号病人样本的测序图，中间箭头所指表示环状RNA的环化位点。
根据图2可以看出，SLC34a2-ROS1阳性样本(图2A中2和图2C中4)中存在环状RNA，其中2号样本检测出的环状RNA碱基序列如SEQ ID NO.5所示，长度1867bp，融合类型CF1；4号样本检测出的环状RNA碱基序列如SEQ ID NO.6所示，长度834bp，融合类型CF2；而非SLC34a2-ROS1阳性样本未检测出如SEQ ID NO.5-6所述的环状RNA；由此说明，SEQ IDNO.5-6所述的环状RNA特异性存在于SLC34a2-ROS1融合阳性患者中，其可作为判断SLC34a2-ROS1融合基因的标志物，并可进一步作为非小细胞肺癌尤其是溶质转运蛋白家族34磷酸钠协同转运蛋白2和c-ros1肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶基因融合(SLC34a2-ROS1)导致的非小细胞肺癌的标志物。
实施例4
本实施例提供了一种检测ROS1阳性病人(具有SLC34a2-ROS1融合基因的病人)的血浆RNA中是否存在环状RNA的方法。具体如下：
1.收集病人全血，4℃，1500g离心10min，收集上清血浆，-80℃保存；
2.提取血浆RNA
同实施例1。
3.逆转录体系
同实施例1。
4.PCR体系及引物：
所用引物序列：G103：5’-TCCTGAAGAGTGGGTAGGTT-3’(SEQ ID NO.111)；G102：5’-TTCCAACCCAAGAGGAGATTG-3’(SEQ ID NO.240)；G106：5’-CAGTGGGAGAAAGCTGAAGATAA-3’(SEQ ID NO.241)。
PCR反应体系：
PCR反应体系：
体系1(G102/G103)：
2x Phanta Max Buffer 25μl
dNTP 1μl
G102(10μM) 2μl
G103(10μM) 2μl
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl
cDNA 1μl
ddH<sub>2</sub>O 18μl
Total 50μl
体系2(G103/G106)
2x Phanta Max Buffer 25μl
dNTP 1μl
G103(10μM) 2μl
G106(10μM) 2μl
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl
cDNA 1μl
ddH<sub>2</sub>O 18μl
Total 50μl
PCR反应条件：
步骤1：95℃3min
步骤2：95℃15s
步骤3：61℃15s
步骤4：72℃2min，
步骤5：返回步骤2；44个循环，
步骤6：72℃5min。
5PCR产物电泳
电泳结果图如3所示，如果1.5％琼脂糖胶电泳引物为G103/G102(SEQ ID NO.111/240)的PCR片段长度是1184bp，则可鉴定出病人血浆中有含有CF1。
若琼脂糖胶电泳引物为G103/G106(SEQ ID NO.111/241)的PCR片段长度是1659bp，则可鉴定出病人血浆中有含有CF1。
若琼脂糖胶电泳引物为G103/G102(SEQ ID NO.111/240)的PCR片段长度是456bp，鉴定出病人血浆中有含有CF2。
G103、G102和G106对应在SLC34a2和ROS1不同融合类型的位置如图4所示，图中4中，F1代表SLC34a2外显子2-4与ROS1基因的外显子32-42的融合；F2代表ROS1与ROS1基因的外显子34-37的融合；由于PCR引物设计的位置不同，可以确定G103/G106的扩增产物是来自与F1融合方式的环状RNA即CF1；而G103/G102扩增产物是来自与F2融合方式的环状RNA即CF2。
此外，还可以通过表3中所述的上游引物和4所示下游引物组合进行PCR确定患者具有SLC34a2-ROS1的融合基因型。
表3用于检测SLC34a2-ROS1的融合基因型的上游引物
Figure BDA0001591308300000171
Figure BDA0001591308300000181
Figure BDA0001591308300000191
Figure BDA0001591308300000201
Figure BDA0001591308300000211
表4用于检测SLC34a2-ROS1的融合基因型的下游引物
Figure BDA0001591308300000212
Figure BDA0001591308300000221
Figure BDA0001591308300000231
Figure BDA0001591308300000241
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川大学
<120> 肿瘤的生物标志物、应用和肿瘤检测试剂盒
<160> 371
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 550
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
aauucgagca ucaccuucuc cccagcccuc uucacaaccu cuccaaauac acagacaaac 60
uccagaaagc aagaaugcua cucccaccaa aagcauaaaa cgaccaucac cagcugaaaa 120
gucacauaau ucuugggaaa auucagauga uagccguaau aaauugucga aaauaccuuc 180
aacacccaaa uuaauaccaa aaguuaccaa aacugcagac aagcauaaag augucaucau 240
caaccaagug uaccgccgga agcaccagga gcugcaagcc augcagaugg agcugcagag 300
cccugaguac aagcugagca agcuccgcac cucgaccauc augaccgacu acaaccccaa 360
cuacugcuuu gcuggcaaga ccuccuccau cagugaccug aaggaggugc cgcggaaaaa 420
caucacccuc auucgggguc ugggccaugg agccuuuggg gagguguaug aaggccaggu 480
guccggaaug cccaacgacc caagcccccu gcaaguggcu gugaagacgc ugccugaagu 540
gugcucugaa 550
<210> 2
<211> 548
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
auucgagcau caccuucucc ccagcccucu ucacaaccuc uccaaauaca cagacaaacu 60
ccagaaagca agaaugcuac ucccaccaaa agcauaaaac gaccaucacc agcugaaaag 120
ucacauaauu cuugggaaaa uucagaugau agccguaaua aauugucgaa aauaccuuca 180
acacccaaau uaauaccaaa aguuaccaaa acugcagaca agcauaaaga ugucaucauc 240
aaccaagugu accgccggaa gcaccaggag cugcaagcca ugcagaugga gcugcagagc 300
ccugaguaca agcugagcaa gcuccgcacc ucgaccauca ugaccgacua caaccccaac 360
uacugcuuug cuggcaagac cuccuccauc agugaccuga aggaggugcc gcggaaaaac 420
aucacccuca uucggggucu gggccaugga gccuuugggg agguguauga aggccaggug 480
uccggaaugc ccaacgaccc aagcccccug caaguggcug ugaagacgcu gccugaagug 540
ugcucuga 548
<210> 3
<211> 583
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
aauucgagca ucaccuucuc cccagcccuc uucacaaccu cuccaaauac acagacaaac 60
uccagaaagc aagaaugcua cucccaccaa aagcauaaaa cgaccaucac cagcugaaaa 120
gucacauaau ucuugggaaa auucagauga uagccguaau aaauugucga aaauaccuuc 180
aacacccaaa uuaauaccaa aaguuaccaa aacugcagac aagcauaaag augucaucau 240
caaccaagca aaaaugucaa cucgcgaaaa aaacagccaa guguaccgcc ggaagcacca 300
ggagcugcaa gccaugcaga uggagcugca gagcccugag uacaagcuga gcaagcuccg 360
caccucgacc aucaugaccg acuacaaccc caacuacugc uuugcuggca agaccuccuc 420
caucagugac cugaaggagg ugccgcggaa aaacaucacc cucauucggg gucugggcca 480
uggagccuuu ggggaggugu augaaggcca gguguccgga augcccaacg acccaagccc 540
ccugcaagug gcugugaaga cgcugccuga agugugcucu gaa 583
<210> 4
<211> 581
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
auucgagcau caccuucucc ccagcccucu ucacaaccuc uccaaauaca cagacaaacu 60
ccagaaagca agaaugcuac ucccaccaaa agcauaaaac gaccaucacc agcugaaaag 120
ucacauaauu cuugggaaaa uucagaugau agccguaaua aauugucgaa aauaccuuca 180
acacccaaau uaauaccaaa aguuaccaaa acugcagaca agcauaaaga ugucaucauc 240
aaccaagcaa aaaugucaac ucgcgaaaaa aacagccaag uguaccgccg gaagcaccag 300
gagcugcaag ccaugcagau ggagcugcag agcccugagu acaagcugag caagcuccgc 360
accucgacca ucaugaccga cuacaacccc aacuacugcu uugcuggcaa gaccuccucc 420
aucagugacc ugaaggaggu gccgcggaaa aacaucaccc ucauucgggg ucugggccau 480
ggagccuuug gggaggugua ugaaggccag guguccggaa ugcccaacga cccaagcccc 540
cugcaagugg cugugaagac gcugccugaa gugugcucug a 581
<210> 5
<211> 1867
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
accauggcuc ccuggccuga auugggagau gcccagccca accccgauaa guaccucgaa 60
ggggccgcag gucagcagcc cacugccccu gauaaaagca aagagaccaa caaaacagau 120
aacacugagg caccuguaac caagauugaa cuucugccgu ccuacuccac ggcuacacug 180
auagaugagc ccacugaggu ggaugacccc uggaaccuac ccacucuuca ggacucgggg 240
aucaaguggu cagagagaga caccaaaggg aagauucucu guuucuucca agggauuggg 300
agauugauuu uacuucucgg auuucucuac uuuuucgugu gcucccugga uauucuuagu 360
agcgccuucc agcugguugg agcuggaguc ccaaauaaac caggcauucc caaauuacua 420
gaagggagua aaaauucaau acagugggag aaagcugaag auaauggaug uagaauuaca 480
uacuauaucc uugagauaag aaagagcacu ucaaauaauu uacagaacca gaauuuaagg 540
uggaagauga cauuuaaugg auccugcagu aguguuugca cauggaaguc caaaaaccug 600
aaaggaauau uucaguucag aguaguagcu gcaaauaauc uaggguuugg ugaauauagu 660
ggaaucagug agaauauuau auuaguugga gaugauuuuu ggauaccaga aacaaguuuc 720
auacuuacua uuauaguugg aauauuucug guuguuacaa ucccacugac cuuugucugg 780
cauagaagau uaaagaauca aaaaagugcc aaggaagggg ugacagugcu uauaaacgaa 840
gacaaagagu uggcugagcu gcgaggucug gcagccggag uaggccuggc uaaugccugc 900
uaugcaauac auacucuucc aacccaagag gagauugaaa aucuuccugc cuucccucgg 960
gaaaaacuga cucugcgucu cuugcuggga aguggagccu uuggagaagu guaugaagga 1020
acagcagugg acaucuuagg aguuggaagu ggagaaauca aaguagcagu gaagacuuug 1080
aagaaggguu ccacagacca ggagaagauu gaauuccuga aggaggcaca ucugaugagc 1140
aaauuuaauc aucccaacau ucugaagcag cuuggaguuu gucugcugaa ugaaccccaa 1200
uacauuaucc uggaacugau ggagggagga gaccuucuua cuuauuugcg uaaagcccgg 1260
auggcaacgu uuuauggucc uuuacucacc uugguugacc uuguagaccu guguguagau 1320
auuucaaaag gcugugucua cuuggaacgg augcauuuca uucacaggga ucuggcagcu 1380
agaaauugcc uuguuuccgu gaaagacuau accaguccac ggauagugaa gauuggagac 1440
uuuggacucg ccagagacau cuauaaaaau gauuacuaua gaaagagagg ggaaggccug 1500
cucccaguuc gguggauggc uccagaaagu uugauggaug gaaucuucac uacucaaucu 1560
gauguauggu cuuuuggaau ucugauuugg gagauuuuaa cucuugguca ucagccuuau 1620
ccagcucauu ccaaccuuga uguguuaaac uaugugcaaa caggagggag acuggagcca 1680
ccaagaaauu guccugauga ucuguggaau uuaaugaccc agugcugggc ucaagaaccc 1740
gaccaaagac cuacuuuuca uagaauucag gaccaacuuc aguuauucag aaauuuuuuc 1800
uuaaauagca uuuauaaguc cagagaugaa gcaaacaaca guggagucau aaaugaaagc 1860
uuugaag 1867
<210> 6
<211> 830
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
accauggcuc ccuggccuga auugggagau gcccagccca accccgauaa guaccucgaa 60
ggggccgcag gucagcagcc cacugccccu gauaaaagca aagagaccaa caaaacagau 120
aacacugagg caccuguaac caagauugaa cuucugccgu ccuacuccac ggcuacacug 180
auagaugagc ccacugaggu ggaugacccc uggaaccuac ccacucuuca ggacucgggg 240
aucaaguggu cagagagaga caccaaaggg aagauucucu guuucuucca agggauuggg 300
agauugauuu uacuucucgg auuucucuac uuuuucgugu gcucccugga uauucuuagu 360
agcgccuucc agcugguugg agaugauuuu uggauaccag aaacaaguuu cauacuuacu 420
auuauaguug gaauauuucu gguuguuaca aucccacuga ccuuugucug gcauagaaga 480
uuaaagaauc aaaaaagugc caaggaaggg gugacagugc uuauaaacga agacaaagag 540
uuggcugagc ugcgaggucu ggcagccgga guaggccugg cuaaugccug cuaugcaaua 600
cauacucuuc caacccaaga ggagauugaa aaucuuccug ccuucccucg ggaaaaacug 660
acucugcguc ucuugcuggg aaguggagcc uuuggagaag uguaugaagg aacagcagug 720
gacaucuuag gaguuggaag uggagaaauc aaaguagcag ugaagacuuu gaagaagggu 780
uccacagacc aggagaagau ugaauuccug aaggaggcac aucugaugag 830
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcagagccct gagtacaagc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
caactactgc tttgctggca 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttgtagtcgg tcatgatggt c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggagaaggtg atgctcgaat t 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcttgctcag cttgtactca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttcaggtcac tgatggagga 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tttgcttggt tgatgatgac atc 23
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aattcgagca tcaccttctc cccag 25
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aattcgagca tcaccttctc cc 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agccctcttc acaacctctc 20
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cacaacctct ccaaatacac aga 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aaactccaga aagcaagaat gc 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gaccatcacc agctgaaaag tc 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tgcagagccc tgagtacaag c 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ccaactactg ctttgctggc a 21
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ctgcaagtgg ctgtgaaga 19
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gtgaagacgc tgcctgaa 18
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ccatcatgac cgactacaac 20
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgtatgaagg ccaggtgt 18
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ctgagtacaa gctgagcaag 20
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
catcagtgac ctgaaggag 19
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gaagacgctg cctgaag 17
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tgcaagtggc tgtgaag 17
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cctgaagtgt gctctgaaa 19
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
cccaactact gctttgct 18
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cgctgcctga agtgtgctct gaaaa 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gctgcctgaa gtgtgctctg aaaat 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ctgcctgaag tgtgctctga aaatt 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tgcctgaagt gtgctctgaa aattc 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gcctgaagtg tgctctgaaa attcg 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cctgaagtgt gctctgaaaa ttcga 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ctgaagtgtg ctctgaaaat tcgag 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tgaagtgtgc tctgaaaatt cgagc 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gaagtgtgct ctgaaaattc gagca 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
aagtgtgctc tgaaaattcg agcat 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
agtgtgctct gaaaattcga gcatc 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gtgtgctctg aaaattcgag catca 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tgtgctctga aaattcgagc atcac 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gtgctctgaa aattcgagca tcacc 25
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
tgctctgaaa attcgagcat cacct 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gctctgaaaa ttcgagcatc acctt 25
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ctctgaaaat tcgagcatca ccttc 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
tctgaaaatt cgagcatcac cttct 25
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ctgaaaattc gagcatcacc ttctc 25
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
tgaaaattcg agcatcacct tctcc 25
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gaaaattcga gcatcacctt ctccc 25
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
tgtgctctga aaattcgagc at 22
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
gctctgaaaa ttcgagcatc accttc 26
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gctctgaaaa ttcgagcatc ac 22
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
agtgtgctct gaattcgagc 20
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
gctctgaatt cgagcatcac c 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gcctgaagtg tgctctgaat t 21
<210> 59
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
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gcttggttga tgatgacatc tttatg 26
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tgcaaacagg agggaga 17
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<213> 人工序列
<400> 185
ccttgtagac ctgtgtgtag a 21
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 186
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<213> 人工序列
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 188
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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tgtatgaagg aacagcagtg g 21
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 262
gagccatggt cttcaaagct ttcat 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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agggagccat ggtctcatca gatgt 25
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tcaggccagg gagccatggt ctcat 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttcaggccag ggagccatgg tctca 25
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caattcaggc cagggagcca tggtct 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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tcccttggaa gaaacagaga at 22
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<213> 人工序列
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cccaattcag gccaggga 18
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<213> 人工序列
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caggtgcctc agtgttatct 20
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<213> 人工序列
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tggtcttcaa agctttcatt tat 23
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<213> 人工序列
<400> 303
ggggtcatcc acctcagt 18
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<213> 人工序列
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cccttcgagg tacttatcgg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gctttcattt atgactccac tg 22
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tcttggttac aggtgcctca 20
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aagagtgggt aggttccagg 20
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ggagccatgg tcttcaaa 18
<210> 310
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tggaaggcgc tactaagaat atc 23
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tggaaggcgc tactaaga 18
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tgggcatctc ccaattca 18
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<213> 人工序列
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ggcgctacta agaatatcca g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaatcaatct cccaatccct t 21
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<213> 人工序列
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agaatatcca gggagcaca 19
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<213> 人工序列
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aagagtgggt aggttccag 19
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<213> 人工序列
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gagccatggt ctcatcagat gtg 23
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<213> 人工序列
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cagggagcca tggtctcat 19

Claims (4)

1.用于检测生物标志物的引物在制备肿瘤检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标志物为环状RNA，所述环状RNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物包括SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.59所示的引物对以及SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.60所示的引物对；
所述肿瘤为非小细胞肺癌，所述非小细胞肺癌与棘皮动物微管结合蛋白4基因和间变性淋巴瘤激酶基因的融合(EML4-ALK)相关。
2.一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于，其包括用于检测样品中环状RNA的试剂，所述环状RNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述试剂为引物，所述引物包括SEQ ID NO.7和SEQID NO.59所示的引物对以及SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.60所示的引物对。
3.根据权利要求2所述的肿瘤检测试剂盒，其特征在于，所述样品为血液和由其制备的血液产品。
4.根据权利要求3所述的肿瘤检测试剂盒，其特征在于，所述血液产品为血浆。
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