CN111733240B - 一种肿瘤生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肿瘤生物标志物及其应用，涉及生物标志物技术领域。所述肿瘤生物标志物为环状RNA，所述环状RNA的碱基序列选自SEQ ID NO.1中所示的序列。本发明的SEQ ID NO.1所示序列的环状RNA与鼻咽癌或头颈部肿瘤相关，可作为RARS‑MAD1L1融合基因的判断标志，该环状RNA在血液及其相关样本中能够稳定、恒定的存在，具有高度特异性和有效性，可作为鼻咽癌和头颈部肿瘤等头颈部肿瘤检测的有效生物标志物。

Description

一种肿瘤生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物标志物技术领域，尤其是涉及一种肿瘤生物标志物及其应用。
背景技术
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)起源于鼻咽上皮细胞，在东南亚、北非、中东等地区最为常见。其中，超过70％的患者由于症状隐匿及高侵袭性首次确诊即为局部晚期。虽然鼻咽癌对放化疗敏感，但局部复发和远处转移仍是鼻咽癌治疗失败的主要原因。近年来，针对肿瘤分子机制的研究取得了令人满意的效果。然而，针对鼻咽癌分子分型的研究并不深入，发现新的肿瘤标志和治疗靶点对鼻咽癌的治疗及预防复发转移是至关重要的。
基因融合是由两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下，构成的嵌合基因。肿瘤特异的融合基因是理想的分子诊断标志和治疗靶标，如BCR-ABL存在于大多数慢性粒细胞白血病中并可使用伊马替尼靶向治疗；EML4-ALK基因融合非小细胞肺癌的克唑替尼靶向治疗等。近来发现染色体重排产生的融合基因不仅在血液肿瘤及软组织肉瘤发生中起关键作用，而在部分上皮性癌中也可能起驱动作用。2018年，曾木圣等人在鼻咽癌中首次发现Chr5q34上的精氨酰-tRNA合成酶(RARS)基因正链的第1-7号外显子与Chr7p22.3上的有丝分裂停滞缺陷1-样蛋白1(MAD1L1)基因的负链第19号外显子的染色体间融合，融合位点主要发生在RARS基因的7号外显子和MAD1L1的19号外显子。通过临床标本的检测，明确了10.03％(35/349)鼻咽癌和10.7％(9/84)头颈肿瘤的检测率，同时发现了在DNA水平的断裂位点和蛋白水平的表达。RARS-MAD1L1融合基因能够增强鼻咽癌的增殖、克隆形成能力和干细胞标志物的表达，增加侧群细胞比例以及放化疗的抵抗，并加剧诱导基因组不稳定性，RARS-MAD1L1与AIMP2相互作用，激活FUBP1/c-Myc通路，且RARS-MAD1L1阳性的鼻咽癌及头颈肿瘤标本中c-Myc和ABCG2表达水平更高，因此明确了RARS-MAD1L1融合基因可作为一个新的肿瘤标志物，为鼻咽癌的靶向治疗提供了潜在新靶标。
本申请人发现现有技术至少存在以下技术问题：然后目前已知检测RARS-MAD1L1融合基因的方案是通过FISH技术，但是该检测技术存在以下问题：1、检测相对复杂，对人员、设备、检测过程、结果判读要求较高，存在主客观因素偏倚；2、存在假阳性的可能性；3、阳性阈值的选择对检测的敏感性及特异性也会产生影响。研究报道，当参考值设定为≥10％时，特异性只有23％，这种较低的特异性可能与＜2个信号距离的标准设定有关，当参考值提高到20％时，特异性上升至66％，而敏感性却只有64％。更重要的是，RARS-MAD1L1融合基因未能从鼻咽癌及头颈肿瘤患者的外周血中检测出，目前只能通过患者组织FISH检测才能明确患者具备RARS-MAD1L1融合基因，这对于鼻咽癌患者治疗及预后的判断增加了难度。
环状RNA(CircRNAs)是非编码RNA的一种，与线性RNA不同，CircRNA无5’端帽和3’poly A尾结构，具有环状共价键闭环结构，这使得CircRNA对核酸酶有更高的耐受性，并延长其在外周循环中的寿命。越来越多的研究表明，融合基因不仅能够编码参与肿瘤发生的融合蛋白，还可以产生与肿瘤进展有关的非编码RNA。例如，白血病中MLL/AF9融合基因产生的CircRNA(FcircM9)具有促进肿瘤生长的活性，非小细胞肺癌(NSCLC)融合基因(EML4-ALK)产生的CircRNA(F-circEA-2a)可以促进肿瘤的侵袭迁移；NSCLC融合基因(EML4-ALK)产生的另一种CircRNA(F-circEA-4a)可以促进肿瘤的侵袭迁移并可在血浆中检测，可能成为检测NSCLC中EML4-ALK融合基因的一种新的“液体活检”标志物。因此，CircRNA在多种生物学功能中发挥着重要作用，如细胞增殖、迁移、侵袭和多能性。此外，与传统的肿瘤组织活检生物标志物相比，体液中的CircRNA可作为更方便、无创的“液体活检”生物标志物，用于肿瘤的检测。因此申请人研究发现在鼻咽癌中RARS-MAD1L1融合基因产生特定的CircRNA(环状RNA)，其在临床肿瘤患者组织标本中，尤其在血液中可检测。更重要的是，只有携带RARS-MAD1L1融合基因才能产生相应特定的环状RNA：F-circRM。因此，申请人提供了一种快速有效的可以直接通过检测血液，兼顾灵敏性和特异性的方案，用于检测来源于RARS-MAD1L1融合基因新型CircRNA，并根据检测结果预测患者预后及指导制定后续个体化治疗方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤生物标志物及其应用。本发明的肿瘤生物标志物能够在患者血液或其相关血液产品中稳定恒定的存在，且具有高度特异性和有效性，可以作为鼻咽癌或头颈部肿瘤检测的有效生物标志物。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种肿瘤生物标志物，所述肿瘤生物标志物为环状RNA，所述环状RNA的碱基序列选自SEQ ID NO.1中所示的序列。
根据一种优选实施方式，所述肿瘤为鼻咽癌或头颈部肿瘤。
根据一种优选实施方式，所述环状RNA来自与所述鼻咽癌或所述头颈肿瘤相关的特异融合基因。
根据一种优选实施方式，与所述鼻咽癌或所述头颈部肿瘤相关的特异融合基因为精氨酰-tRNA合成酶(RARS)基因和有丝分裂停滞缺陷1-样蛋白1(MAD1L1)基因的融合基因RARS-MAD1L1。
所述的肿瘤生物标志物在制备检测与鼻咽癌或头颈部肿瘤相关的诊断产品中的应用。
根据一种优选实施方式，所述诊断产品为试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述的肿瘤生物标志物的试剂。
根据一种优选实施方式，所述试剂为引物，所述引物的碱基序列选自SEQ IDNO.2-12中的任意一种和SEQ ID NO.13-23中的任意一种所示的序列。
根据一种优选实施方式，所述试剂为探针。
根据一种优选实施方式，所述试剂盒所检测的包含所述生物标志物的检测样品来自血液或由其制备的血液产品。
根据一种优选实施方式，所述血液产品为血浆。
基于上述技术方案，本发明的肿瘤生物标志物及其应用至少具有如下技术效果：
本发明提供的肿瘤生物标志物，所述生物标志物为环状RNA，所述环状RNA的碱基序列选自SEQ ID NO.1中所示的序列。含有RARS-MAD1L1融合基因的鼻咽癌或头颈部肿瘤患者血液中存在特定的环状RNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示的环状RNA与鼻咽癌或头颈部肿瘤相关，可作为RARS-MAD1L1融合基因的判断标志，该环状RNA在血液及其相关样本中能够稳定、恒定的存在，具有高度特异性和有效性，可以作为鼻咽癌和头颈部肿瘤等头颈部肿瘤检测的生物标志物。而且对该环状RNA进行相应检测的试剂例如引物和探针均可以用于制备肿瘤检测试剂盒，为鼻咽癌和头颈部肿瘤的检测、诊断、治疗以及预后评估提供一种新的思路和手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中的RARS-MAD1L1融合基因阳性及阴性病人血浆中的环状RNA的检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种肿瘤生物标志物，该生物标志物为环状RNA，环状RNA的碱基序列选自SEQ ID NO.1中所示的序列。优选地，SEQ ID NO.1所示的序列为环状RNA的线性形式。
优选地，所述肿瘤为鼻咽癌或头颈部肿瘤。优选地，环状RNA来自与鼻咽癌或头颈部肿瘤相关的特异融合基因。优选地，与鼻咽癌或头颈部肿瘤相关的特异融合基因为精氨酰-tRNA合成酶(RARS)基因和有丝分裂停滞缺陷1-样蛋白1(MAD1L1)基因的融合基因RARS-MAD1L1。优选地，SEQ ID NO.1所示的序列为RARS和MAD1L1两个基因进行融合的标志物。
本发明还提供了前述的肿瘤生物标志物在制备检测与鼻咽癌或头颈部肿瘤相关的诊断产品中的应用。优选地，诊断产品为试剂盒。试剂盒包括用于检测所述的肿瘤生物标志物的试剂。优选地，试剂为引物。优选地，引物的碱基序列选自SEQ ID NO.2-12中的任意一种，如表3所示，和SEQ ID NO.13-23中的任意一种所示的序列，如表4所示。即，SEQ IDNO.2-12中的任意一种和SEQ ID NO.13-23中的任意一种所示的序列的组合可以用于检测SEQ ID NO.1中所示的序列的环状RNA。
优选地，所述试剂为探针。
优选地，试剂盒所检测的包含生物标志物的检测样品来自血液或由其制备的血液产品。优选地，血液产品为血浆。
实施例
本实施例提供了通过检测样品中的环状RNA来检测鼻咽癌病人是否具有RARS-MAD1L1融合基因或其融合类型的方法，具体如下：
取三例RARS-MAD1L1融合基因阳性和五例非RARS-MAD1L1融合基因的华西医院鼻咽癌病人血浆样本，均签署知情同意书。
检测样本中环状RNA的步骤如下：
(1)提取血浆RNA。
1)提取血浆RNA：在250μl血浆中加入750μl TRIzolTM LS Reagent(invitrogen，美国，货号：10296010)裂解血浆，充分混匀，室温静置5min；
2)加200μl氯仿，充分混匀，室温静置3min，然后于4℃，13000g离心15min；
3)取上清约500μl，加入500μl异丙醇，充分混匀，室温静置10min，然后于4℃，13000g离心10min；
4)弃上清，留沉淀，加入1ml 75％的乙醇洗涤后，于4℃，13000g离心5min；
5)重复步骤4)一次；
6)弃乙醇，晾至略干，加入10μl RNase-free的水溶解RNA后，立即置于冰上。
(2)逆转录体系。
使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa，日本,货号RR047A)进行，按其说明书方法进行：取由血浆中抽提的RNA 10μl与以下表1中的试剂混合均匀。然后将PCR仪在37℃加热15min，85℃加热5s后放冰上待用。
表1
Figure BDA0002547303960000061
Figure BDA0002547303960000071
(3)PCR体系及引物。
3.1PCR。
引物的碱基序列：G275:5’-CTTATAAAAGACCTGAAGATCCCCAA-3’(SEQ ID NO.2)；G289:5’-CTCGGGTTCTTTGAATTTGCAG-3’(SEQ ID NO.13)。
使用Taq DNA Polymerase(Mg2+plus buffer)(Vazyme Biotech，中国，货号：P101)PCR试剂盒进行PCR。
PCR体系如下表2所示：
表2
ddH<sub>2</sub>O 19.5μl
Taq Buffer 5μl
dNTP Mix(10mM each) 1μl
模板DNA 20μl
G275(10μM) 2μl
G289(10μM) 2μl
Taq Polymerase 0.5μl
Total 50μl per tube
PCR反应条件：
步骤1：95℃ 3min，
步骤2：95℃ 15s，
步骤3：60℃每个循环降低0.5℃ 15s，
步骤4：72℃ 15s，
步骤5：返回步骤2，20个循环，
步骤6：95℃ 15s，
步骤7：50℃ 15s，
步骤8：72℃ 15s，
步骤9：返回步骤6，15个循环，
步骤10：72℃ 15s
PCR产物片段理论长度为159bp，对应RARS-MAD1L1融合基因产生的环状RNA：F-cricRM。可以通过一轮PCR后用2％琼脂糖胶电泳见明显理论长度的条带，可以此判断患者血浆样本中含有F-cricRM，再推断患者携带RARS-MAD1L1融合基因；也可以纯化回收PCR产物进行测序确认环状RNA序列，再推断患者携带RARS-MAD1L1融合基因。
图1示出了本实施例中的RARS-MAD1L1融合基因阳性及阴性病人血浆中的环状RNA的检测结果。根据图1的结果可以看出，RARS-MAD1L1阳性样本(图中6、7和8)中存在环状RNA，其中6号样本检测出的环状RNA的线性形式的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，长度159nt，融合类型：F-circRM:RARS-MAD1L1融合基因。7号样本检测出的环状RNA的线性形式的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，长度159nt，融合类型F-circRM:RARS-MAD1L1融合基因。8号样本检测出的环状RNA的线性形式的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，长度159nt，融合类型：F-circRM:RARS-MAD1L1融合基因。而RARS-MAD1L1阴性样本未检测出如SEQ ID NO.1所述的环状RNA(图1中的1-5)。由此说明，SEQ ID NO.1所示序列的环状RNA特异性地存在于RARS-MAD1L1阳性患者中，其可作为判断RARS-MAD1L1融合基因的标志物，并可进一步作为鼻咽癌或头颈部肿瘤尤其是与精氨酰-tRNA合成酶(RARS)基因和有丝分裂停滞缺陷1-样蛋白1(MAD1L1)基因的融合(RARS-MAD1L1)相关导致的鼻咽癌或头颈部肿瘤的标志物。
另外，还可以通过表3中示出的上游引物的其中之一和表4中示出的下游引物的其中之一的组合进行PCR以确定患者是否具有RARS-MAD1L1融合基因。
表3用于检测RARS-MAD1L1的融合基因型的上游引物
F0 CTCGGGTTCTTTGAATTTGCAG SEQ ID NO.2
F1 CCTCGGGTTCTTTGAATTTGC SEQ ID NO.3
F2 GGGTTCTTTGAATTTGCAGGG SEQ ID NO.4
F3 GCCACCAGCCCCTCG SEQ ID NO.5
F4 TTCTTTGAATTTGCAGGGTATGAC SEQ ID NO.6
F5 CGGGTTCTTTGAATTTGCAG SEQ ID NO.7
F6 TTCTTTGAATTTGCAGGGTATGAC SEQ ID NO.8
F7 CCCTCGGGTTCTTTGAATTT SEQ ID NO.9
F8 GTTCTTTGAATTTGCAGGGTATG SEQ ID NO.10
F9 GGTTCTTTGAATTTGCAGGGTA SEQ ID NO.11
F10 CAGCCCCTCGGGTT SEQ ID NO.12
表4用于检测RARS-MAD1L1的融合基因型的下游引物
R0 CTTATAAAAGACCTGAAGATCCCCAA SEQ ID NO.13
R1 TCTTGCAGGTGAGCGATGA SEQ ID NO.14
R2 ATAAAAGACCTGAAGATCCCCA SEQ ID NO.15
R3 ATAAAAGACCTGAAGATCCCCAAT SEQ ID NO.16
R4 AAAGACCTGAAGATCCCCAATAG SEQ ID NO.17
R5 ACCTGAAGATCCCCAATAGGA SEQ ID NO.18
R6 TGAAGATCCCCAATAGGAGGT SEQ ID NO.19
R7 GTTAGATAATCTGGAAATTTGTCTTGCA SEQ ID NO.20
R8 AGGTGAAACTGTTAGATAATCTGG SEQ ID NO.21
R9 ATAGGAGGTGAAACTGTTAGATAATCT SEQ ID NO.22
R10 AAGATCCCCAATAGGAGGTGA SEQ ID NO.23
本发明的肿瘤生物标志物仅需要患者250μl血浆完成后续检测。且提取血浆中总RNA方案成熟，后续的检测步骤实验条件已优化，可以高效快速的完成，结果判读简单。因此，本发明对肿瘤生物标志物的检测方法较目前FISH检测方案而言，兼顾特异性及敏感性、非侵入性、可以反复多次获取病理信息、重复性好、操作简便、检测人员及设备要求低、结果判读简单的优点。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种肿瘤生物标志物及其应用
<130> 2020.6.18
<141> 2020-06-18
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 170
<212> RNA
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uuugaauuug caggguauga cgugcucagg uuaaaucaug uaggagacug ggggacccag 60
uuuggcaugc ucaucgcuca ccugcaagac aaauuuccag auuaucuaac aguuucaccu 120
ccuauugggg aucuucaggu cuuuuauaag gccaccagcc ccucggguuc 170
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<211> 22
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ataggaggtg aaactgttag ataatct 27
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
aagatcccca ataggaggtg a 21

Claims (5)

1.一种生物标志物在制备检测RARS-MAD1L1融合基因的诊断产品中的应用，所述生物标志物为环状RNA，所述环状RNA的线性形式碱基序列为SEQ ID NO.1中所示的序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断产品为试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述生物标志物的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂为引物，所述引物的碱基序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.13所示的序列。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的检测样品来自患者血液或由其制备的血液产品。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述血液产品为血浆。
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WO2014183301A1 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 Sun Yat-Sen University Reagent and method for tumor detection and therapy
CN108148912A (zh) * 2018-03-08 2018-06-12 四川大学 肿瘤的生物标志物、应用和肿瘤检测试剂盒

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