ES2712941T3 - Método para la detección de mutaciones en BRAF y PI3K - Google Patents

Abstract

Un método para la detección de mutaciones V600E y V600K de BRAF, en donde el método comprende las etapas de: - someter una muestra de ensayo que comprende ácidos nucleicos a una amplificación con una mezcla de amplificación que comprende dos cebadores ARMS, en donde los dos cebadores ARMS tienen la SEQ ID Nº 3 y la SEQ ID Nº 4, comprendiendo adicionalmente la mezcla de amplificación un cebador de amplificación que comprende o consiste en la SEQ ID Nº 5; y - detectar cualquier producto de amplificación obtenido, mediante la hibridación de cualquiera de dichos productos con dos o más sondas, en donde cada sonda se hibrida específicamente con la región del producto de amplificación correspondiente a la secuencia marcadora 5' del correspondiente cebador ARMS.

Description

DESCRIPCION

Metodo para la deteccion de mutaciones en BRAF y PI3K

Antecedentes de la invencion

B-raf (o BRAF) es una parte de la ruta de transduccion de la senal Ras/Raf/MEK/MAP y tiene un papel en la regulacion de la ruta de senalizacion de la ruta de senalizacion MAPcinasa/ERK. Las mutaciones en este genero se han asociado con distintos canceres tales como el cancer colorrectal (CRC), cancer pulmonar de celulas no pequenas (NSCLC), melanomas malignos y adenocarcinomas.

Las mutaciones oncogenicas en BRAF, casi todas de las cuales son la mutacion V600E, se han expuesto en el cancer de colon (Davies H, et al, 2002, Nature 417:949-54; Rajagopalan H, et a/., 2002, Nature 4l8:934). La mutacion V600E se localiza en el exon 15 del gen de BRAF: en la posicion 1799 de la secuencia codificante de BRAF se cambia una T por una A, que da como resultado el cambio de una valina presente en el tipo silvestre de la protelna BRAF, en una glutamina € en la protelna correspondiente con el gen mutado. La mutacion V600K (1798­ 1799 GT>AA), menos abundante, tambien se ha detectado, y constituye la segunda mutacion mas abundante en patologlas tales como el melanoma (Rubinstein et al, 2010, Journal of Translational Medicine 8, No se dan las pp.). Otras mutaciones geneticas de BR^a F identificadas son V600D, V600M y V600A.

La ruta de fosfatidilinositol 3 cinasa (PI3K) tiene un importante papel en muchos procesos celulares incluyendo la proliferacion, adhesion, supervivencia y motilidad celular. La mala regulacion de esta ruta se ha observado en muchos tipos de enfermedades malignas humanas y se ha asociado comunmente con alteraciones geneticas en los componentes de la ruta. Dichas alteraciones geneticas incluyen las mutaciones activadoras en la subunidad p110a de la PI3K, PI3KCA (Hurst et al, 2009, BMC Research Notes 2:66). La mayorla de las mutaciones de PI3K se producen tanto en el exon 9 de PI3KCA, que codifica el dominio helicoidal, o exon 20 del PI3KCA, que codifica el dominio cinasa (Engelman, 2009, Nat. Rev. Cancer 9: 550-562). Cuatro mutaciones de PI3K frecuentes en los exones mencionados anteriormente son E542K, E545D, E545K (los tres localizados en el exon 9) y H1047R (exon 20).

Recientes publicaciones sugieren que las mutaciones en BRAF y PI3K pueden conferir una resistencia a la terapia con anti-EGFR (Lurkin et al, 2010, PLoS ONE, 5, (1); De Roock et al, 2010, Lancet Oncol. 11: 753-62; De Roock et al, 2011, Lancet Oncol. 12: 594-603; Bardelli & Sienna, 2010, J Clin Oncol; 28(7): 1254-1261).

Hay una alta demanda de metodos de deteccion de mutaciones de los genes PI3K y BRAF. Recientemente, se ha desvelado un metodo para la deteccion simultanea de mutaciones geneticas que son relevantes para la respuesta al tratamiento anti-EGFR (Lurkin et al., 2010, PLoS ONE, 5, (1)). El metodo incluye el analisis de las mutaciones de PI3K en los exones 9 y 20, as! como el analisis de las mutaciones BRAF en el exon 15. Basicamente, se disenaron dos PCR multiples; una primera que comprende un par de cebadores de amplificacion del exon 15 de BRAF; y la segunda que comprende dos pares de cebadores para la amplificacion de los exones PI3K 9 y 20. Posteriormente, los productos de las PCR obtenidos se someten a purificacion, desnaturalizacion e incubacion con las sondas que se hibridan con una de las cadenas de su producto de amplificacion correspondiente, en una posicion adyacente al sitio de mutacion. Entonces se llevan a cabo reacciones de extension en un ciclador termico, en el que solo se incorpora el ddNTP complementario de la mutacion que esta presente en la muestra en el producto de extension, y se detecta con un secuenciador automatico.

Otros metodos de deteccion en estos genes incluyen los metodos ARMS en tiempo real (sistema de amplificacion de mutacion refractaria), tal como los escritos en Ellison et al., 2010, Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 29: 132. Ellison et al. Compara los analisis de mutacion por secuenciacion de ADN y ARMS en cuanto a su capacidad para detectar mutaciones en especlmenes de biopsias cllnicas e incluye los analisis de una mutacion en ^b R^a F.

ARMS es un metodo para la deteccion de mutaciones puntuales, basado en el principio del cebado de amplificacion por PCR especlfica de alelo (documento, EP0332435; Newton et al., 1989, Nucleic Acid Research 17, 2503-2516). Este sistema se basa en una estrategia en la que cada oligonucleotido cebador o cebador se disena de manera que solo funciona como un cebador para la PCR cuando se hibrida con su correspondiente secuencia de ADN diana especlfica. La tecnica necesita que el extremo 3' del nucleotido del cebador de PCR sea especlfico de alelo. Esto implica que el nucleotido del extremo 3' se corresponda con el de la mutacion puntual. Por lo tanto, el cebador se disena de dos maneras: La manera “normal”, es refractaria a la amplificacion por PCR de la matriz de ADN “mutante”, y la forma mutante, que es refractaria a la amplificacion por PCR del ADN normal.

En algunos casos, una unica base no coincidente 3' no evita completamente la extension no especlfica del oligonucleotido cebador cuando se tiene como diana el ADN correspondiente a otra mutacion puntual, y la amplificacion progresa. En dichos casos, una introduccion deliberada de una falta de coincidencia cerca del extremo 3' del cebador apropiado especlfico de alelo (en el segundo, tercero, incluso cuarto nucleotido desde el extremo 3' del cebador) permite aumentar la especificidad del cebador.

La tecnica ARMS implica que tengan lugar al menos dos PCR en una mezcla de reaccion que se corresponde cada una con la amplificacion con uno de los cebadores de ARMS. Cada uno de los cebadores de ARMS necesita un segundo cebador (habitualmente llamado “cebador comun”, y que se llamara de aqul en adelante “cebador de amplificacion”) para generar el producto especlfico de alelo.

La presencia de la secuencia diana especlfica en la muestra se revela por visualization del producto despues de la electroforesis en gel de agarosa y tincion con bromuro de etidio. De manera alternativa, los resultados se pueden analizar en un formato de tubo cerrado en tiempo real incorporando sondas fluorescentes tales como Taqman, Scorpions, balizas moleculares o colorantes fluorescentes intercaladores tales como Yo-Pro o Sybr verde.

El estado de la tecnica a menudo se enfrenta con el problema de detectar las mutaciones V600E y V600K de BRAF y las mutaciones de PI3K E542K, E545D, E545K y H1047R. Sin embargo, hasta donde se sabe, ninguno de los metodos de detection existentes en la tecnica, perite la detection de ninguno de los productos de amplificacion obtenidos de estas mutaciones, por medio de su hibridacion con sondas especlficas. Esto es debido al hecho de que cualquier sonda que se pudiera disenar para la hibridacion con cualquiera de los productos de amplificacion correspondientes con una de las mutaciones de estos genes, se unirla tambien inespeclficamente a los productos de amplificacion de mutaciones similares como mutaciones proximas en el mismo gen, debido a la similitud de secuencia entre ellas. Por eso, los metodos de deteccion de las mutaciones en BRAF o PI3K del estado de la tecnica tienen el inconveniente de la deteccion de que cualquiera de los productos de amplificacion obtenidos no se puede llevar a cabo mediante la hibridacion de las sondas especlficas de mutation anteriores, y, en particular, con las micromatrices que contienen dichas sondas.

Este inconveniente se aplica tanto a la estrategia de amplificacion ARMS multiple, as! como la estrategia de amplificacion ARMS individual, en la que los productos de amplificacion de cada mutacion se obtienen en vasos de reaccion independiente.

Otro problema asociado es que las mutaciones de BRAF y PI3K que pueden estar presentes como factores de pronostico para la estadificacion del tumor, metastasis, evolution, heterogeneidad celular, o heterogeneidad alelica, a menudo se encuentran en muestras con baja abundancia con respecto a la forma de tipo silvestre. Y, aunque hay disponibles muchos metodos diagnosticos para la deteccion de mutaciones, la mayorla no pueden detectar con precision mutaciones con baja abundancia. La secuenciacion de Sanger es la mejor convencionalmente para la identification de la mutacion ya que solo puede detectar mutaciones con abundancias por encima de aproximadamente un 20 % (Ogino et al., 2005, J. Mol. Diagn. 7: 413-421; Li etal., 2008, Nat. Med. 14: 579-584).

El documento WO2011/019704 desvela un metodo dirigido a detectar la presencia de mutaciones BRAF en una muestra, comprendiendo el metodo: (a) aislar el acido nucleico de la muestra; (b) llevar a cabo una reaccion de amplificacion de las secuencias de acido nucleico de la muestra, en el que dicha reaccion de amplificacion comprende un cebador capaz de hibridarse especlficamente a un secuencia BRAF mutante en una primera position de una secuencia BRAF en el que dicho primer cebador tiene las SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8 o SEQ ID N° 9, y un segundo cebador capaz de hibridarse especlficamente con una segunda posicion de una secuencia de BRAF en el que dicho segundo cebador tiene la SEQ ID N° 10, en el que la reaccion de amplificacion es capaz de producir un producto de amplificacion especlfico BRAF mutante cuando las secuencias de la muestra comprende una secuencia BRAF mutante y (c) visualizar los productos de la amplificacion producidos por dicha reaccion de amplificacion, en el que la deteccion de un producto de la amplificacion especlfico del BRAF mutante es un indicador positivo de la presencia de una mutacion de BRAF en dicha muestra.

Las SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 9 y SEQ ID N° 10 se definen como pares de cebadores especlficos de BRAF mutante V600E a modo de ejemplo; las SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 7 y SEQ ID N° 10 se definen como pares de cebadores especlficos de BRAF mutante V600D a modo de ejemplo; SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 y S^e Q ID N° 10 se definen como pares de cebadores especlficos de BRAF mutante V600K a modo de ejemplo; ^s E^q ID N° 6, SEQ ID N° 8 y SEQ ID N° 10 se definen como pares de cebadores especlficos de BRAF mutante V600M a modo de ejemplo; S^e Q ID N° 3 y SEQ ID N° 10 se definen como pares de cebadores especlficos de BRAF mutante V600A a modo de ejemplo. Todas las secuencias descritas en el documento WO2011/019704 son 100 % especlficas de la diana BRAF. El metodo descrito en el documento WO2011/019704 no permite distinguir el mutante de BRAF exacto que esta presente en la muestra.

El documento EP2236627 desvela polinucleotidos cebadores que se pueden utilizar en los ensayos para la deteccion de las mutaciones H1047R, H1047L, E542K, y E545K del gen PIK3CA. Las SEQ ID N° 3 a 9, y en particular la SEQ ID N° 5 se proporcionan como secuencias de cebador directo para detectar la mutacion E542K; las SEQ ID N° 10 a 16, y en particular la SEQ ID N° 14 se proporcionan como secuencias de cebador directo para detectar la mutacion E545K; las SEQ ID N° 20 a 26, y en particular la SEQ ID N° 21 se proporcionan como secuencias de cebador directo para detectar la mutacion H1047R; y las SEQ ID N° 27 a 33, y en particular la SEQ ID N° 28 se proporcionan como secuencias de cebador directo para detectar la mutacion H1047L. Todos estos cebadores son cebadores ARMS y cumplen el patron complementario de los cebadores ARMS respecto a sus regiones diana. Los cebadores inversos son cebadores Scorpions marcados, que presentan una complementariedad perfecta con sus regiones diana. Los amplicones que pueden generarse se detectan por medio del fluoroforo presente en el cebador Scorpions.

Hamfjord et al (Diagnostic molecular pathology, vol. 20, n° 3, 2011, paginas 158-165) presenta un “ensayo ARMS aumentado oscilante” para detectar 7 mutaciones en el gen KRAS y 1 mutacion, 1799T>A (V600E), en el gen BRAF. El metodo consiste en el aislamiento del ADN de un bloque FFPE, y se somete a amplificacion de PCR en tiempo real con cebadores de ARMS que comprenden algunas busquedas adicionales (oscilante) para aumentar la sensibilidad y la especificidad junto con un cebador inverso universal. Se llevaron a cabo varios experimentos para determinar las condiciones mas ventajosas de la amplificacion por PCR en tiempo real.

Por lo tanto, es altamente deseable proporcionar un metodo que, a diferencia de los metodos del estado de la tecnica, permita detectar especlficamente cualquier producto de amplificacion, obtenido a partir de cualquiera de las mutaciones de BRAF V600E y V600K, y mutaciones de PI3K E542K, E545D, E545K y H1047R presentes en la muestra, por hibridacion de los productos de amplificacion correspondientes con sondas especlficas de la diana. tambien es deseable que el metodo permita la deteccion de mutaciones presentes en bajos porcentajes en la muestra. La invencion descrita en el presente documento tiene por tanto el objetivo de proporcionar un metodo robusto y fiable para la deteccion de mutaciones BRAF y PI3K, y mitigar de esta manera los inconvenientes de la tecnica anterior.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona un metodo de deteccion de las 2 mutaciones de BRAF V600E y V600K, y opcionalmente una cualquiera de las 4 mutaciones de PI3K E542K, E545D, E545K y H1047R presentes en una muestra, mediante la hibridacion de cualquier producto de amplificacion obtenida a partir de un acido nucleico que tenga cualquiera de estas mutaciones, con sondas especlficas de la diana.

La invencion se basa en la amplificacion de 2 mutaciones BRAF V600E y V600K y opcionalmente una o mas de las 4 mutaciones de PI3K E542K, E545D, E545K y H1047R presentes en una muestra, con los cebadores ARMS de la presente invencion.

Cada uno de los cebadores ARMS tiene una longitud total de 36 a 50 nucleotidos, estando su extremo 3' disenado de acuerdo con el metodo de amplificacion ARMS (sistema de mutacion refractaria a la amplificacion, metodo para la deteccion de mutaciones puntuales basado en el principio del cebado especlfico de alelo de amplificacion por PCR), y constituyendo este extremo 3' una secuencia diana especlfica seleccionada de entre las SEC ID N° 1 y SEC ID N° 2, respectivamente, en el caso de las mutaciones V600E y V600K de BRAF y las SEC ID N° 12, SEC ID N° 13, SEC ID N° 14 y SEC ID N° 15, respectivamente, en el caso de las mutaciones E542K, E545D, E545K y H1047R de PI3K, comprendiendo adicionalmente cada cebador una secuencia marcadora 5' especlfica no de la diana diferente de desde 15 a 20 nucleotidos.

Por lo tanto, el cebador ARMS que se utiliza en el metodo de la presente invencion comprende una secuencia especlfica de la diana en el extremo 3', que es capaz de hibridarse con el acido nucleico diana que comprende una mutacion como se ha descrito anteriormente de una manera especlfica de alelo. Este cebador tambien comprende una secuencia 5' que no es especlfica de la diana y por lo tanto no complementaria con el acido nucleico diana. Esta secuencia es una secuencia marcadora que es util para la deteccion del producto de amplificacion a lo largo de la hibridacion posterior con una sonda disenada especlficamente para hibridarse a la region del producto de amplificacion complementaria a la secuencia marcadora. Esto permite la deteccion especlfica del producto de amplificacion mediante los metodos descritos en el presente documento.

El metodo de la presente invencion permite detectar especlficamente cualquier producto de amplificacion obtenido de las 2 mutaciones V600E y V600K de BRAF y opcionalmente las mutaciones E542K, E545D, E545K y H1047R de PI3K presentes en una muestra, mediante la hibridacion de dicho producto con dos o mas sondas que se hibridan especlficamente en la region correspondiente al marcador proporcionado por el cebador especlfico.

Las secuencias marcadoras en 5' de los diferentes cebadores son diferentes entre ellas. Esta diferencia es lo que hace posible la union especlfica de diferentes productos de amplificacion a sus sondas correspondientes, por cada sonde especlfica de uno de los productos de amplificacion tiene que haber una secuencia de nucleotido capaz de hibridarse con este en la region correspondiente al marcador proporcionado por el cebador especlfico.

A lo largo de la presente memoria descriptiva de patente estos cebadores especlficos de mutacion en su extremo 3' de acuerdo con el metodo de amplificacion ARMS se denominaran “cebadores ARMS”. Adicionalmente, tambien se hace referencia al cebador o cebadores que se combinan con los cebadores ARMS para la amplificacion de un ADN diana, como cebadores comunes, que se llamaran de aqul en adelante “cebadores de amplificacion”. Los cebadores ARMS especlficos para las mutaciones de BRAF y PI3K de la presente invencion, se puede representar como se indica en la Tabla 1.

El marcadorl, marcador2, marcador3, marcador4, marcador5 y marcador 6, son secuencias de nucleotido de 15 a 20 nucleotidos y mas preferentemente, de 17 a 19 nucleotidos de longitud, siendo todos diferentes entre ellos. En otras palabras, no hay una homologla sustancial entre las secuencias marcadoras. Sin homologla sustancial significa menos del 50 % (es decir, dos secuencias marcadoras no deben compartir mas del 50 % de sus nucleotidos).

El contenido de G-C del marcador puede ser del 11-71 %, mas preferentemente del 40-60 %. La Tm del marcador puede ser de 39-70 °C. Preferentemente, la longitud total del cebador ARMS esta entre 39 y 47 nucleotidos.

Los cebadores ARMS particularmente preferidos son los de SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18 y SEQ ID N° 19, que se corresponden con las mutaciones E542K, E545D, E545K y H1047R de PI3K, respectivamente.

Ademas de los cebadores ARMS, la mezcla de amplificacion comprende un cebador de amplificacion, que se combina con los cebadores ARMS para generar los productos de amplificacion. El cebador de amplificacion comprende o consiste en la SEQ ID N° 5.

El metodo de la presente invencion comprende por lo tanto poner en contacto una muestra de ensayo que comprende acidos nucleicos con uno o mas cebadores ARMS diagnosticos especlficos para las mutaciones de BRAF y, opcionalmente de PI3K anteriores, en presencia de uno o mas cebadores de amplificacion, nucleotido trifosfatos apropiados, y un agente de polimerizacion, y en las condiciones apropiadas de manera que cada cebador ARMS diagnostico se extiende solamente cuando su mutacion correspondiente esta presente en la muestra; la presencia o ausencia de cada mutacion se detecta en referencia a la presencia o ausencia del correspondiente producto de extension del cebador diagnostico. La presencia o ausencia de cualquiera de dichos productos se determinara mediante hibridacion de cualquier producto de amplificacion obtenido, con sondas especlficas del marcador.

Los metodos de amplificacion y detection de mutaciones de BRAF y PI3K de la presente invencion se diferencian de las del estado de la tecnica en el uso de cebadores ARMS descritos en el presente documento. La amplificacion con estos cebadores permite la hibridacion especlfica posterior de los productos de amplificacion con sondas especlficas de secuencia.

En particular, la amplificacion de las 2 mutaciones V600E y V600K de BRAF, y opcionalmente una o mas de las 4 mutaciones E542K, E545D, E545K y H1047R de PI3K, con uno o mas de los cebadores ARMS de la presente invencion que se presentan en la Tabla 1 permite, al contrario que con los metodos de deteccion de BRAF y PI3K del estado de la tecnica, para detectar cualquier producto de amplificacion resultante mediante hibridacion con las sondas especlficas de secuencia. Preferentemente, sondas especlficas de secuencia que se pueden proporcionar en una micromatriz.

El hecho clave que permite que la union especlfica entre los productos de amplificacion y sus sondas correspondientes es que las sondas de deteccion se hibridan especlficamente con su producto de amplificacion correspondiente en la region correspondiente con el marcador1, marcador2, marcador3, marcador4, marcador5 o marcador 6 proporcionados por el correspondiente cebador ARMS. Esta region de marcadores no tiene una homologla sustancial entre los diferentes cebadores. De esta manera, se consigue la especificidad entre cualquier producto de amplificacion y su sonda correspondiente.

Para un entendimiento mas facil del metodo de la presente invencion, la Figura 12 representa un esquema de este. Como ejemplo se ha seleccionado la mutacion V600E de BRAF.

El metodo de la presente invencion constituye una ventaja relevante frente a los metodos del estado de la tecnica, siendo la razona que la hibridacion especlfica de los productos de amplificacion con sondas especlficas da como resultado un metodo de deteccion de una etapa mucho mas simple que los metodos del estado de a tecnica para la deteccion de las mutaciones de BRAF y PI3K.

El presente metodo de deteccion presenta valores de sensibilidad de manera que puede detectarse el 1 % de mutantes en BRAF o PI3K en un escenario de ts.

Lurkin et al., 2010, PLoS ONE, 5, (1), desvela un metodo de deteccion basado en amplificacion de ADN seguido por hibridacion con sondas. En particular, se disenaron dos PCR multiples, la primera permitla la deteccion del exon 15 de BRAF, y la segunda que permitla la deteccion de los exones 9 y 20 de PI3K. Los productos de amplificacion obtenidos de cada gen se hibridan inespeclficamente a una sonda, hibridandose la sonda con los correspondientes productos en una posicion adyacente al sitio de la mutacion de interes. La deteccion especlfica solo se consigue con la extension del hlbrido formado por la sonda y el producto de amplificacion. Los productos obtenidos se procesan y analizan posteriormente en un secuenciador automatico, con el marcador fluorescente en el ddNTP incorporado indicando al presencia o ausencia de la mutacion. Por lo tanto, en Lurkin et al., los productos de amplificacion obtenidos inespeclficamente se unen a la sonda proporcionada, y solo con la extension del hlbrido formado por la sonda y el producto de amplificacion se conseguira la deteccion especlfica. Esto significa que se necesita al menos una reaccion adicional a la de amplificacion para conseguir la deteccion. Al contrario que Lurkin et al., de acuerdo con el metodo de la presente invencion, la deteccion tiene lugar mediante una hibridacion directa de cualquier producto de amplificacion obtenido con su sonda especlfica.

El metodo de la presente invencion tambien permite una amplificacion por PCR multiple, con dos o mas cebadores ARMS de la presente invencion. Adicionalmente, el metodo de la presente invencion permite la deteccion de mutaciones que estan presentes en la muestra con un porcentaje bajo.

Uno de los aspectos de la presente invencion se corresponde con un metodo para la deteccion de las mutaciones V600E y V600K de BRAF, en el que el metodo comprende las etapas de:

- someter una muestra de ensayo que comprende los acidos nucleicos a una amplificacion con una mezcla de amplificacion que comprende dos cebadores ARMS, en el que los dos cebadores ARMS tienen la SEQ ID N° 3 y la SEQ ID N° 4,

comprendiendo la mezcla de amplificacion adicionalmente un cebador de amplificacion que comprende o consiste en la SEQ ID N° 5; y

- detectar cualquier producto de amplificacion obtenido, mediante la hibridacion de cualquiera de dichos productos con dos o mas sondas, en el que cada sonda se hibrida especlficamente con la region del producto de amplificacion correspondiente a la secuencia marcadora 5' del correspondiente cebador ARMS.

Otro aspecto de la presente invencion se refiera a un kit para detectar las mutaciones V600E y V600K de BRAF en una muestra de ensayo que comprende un acido nucleico, en el que dicho kit comprende una muestra de reactivos para la amplificacion del acido nucleico, que comprende:

- dos cebadores ARMS de SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4, y

- un cebador de amplificacion que comprende o consiste en la SEQ ID N° 5,

Comprendiendo ademas el kit una micromatriz en la que se inmovilizan dos o mas sondas, hibridandose cada sonda especlficamente a la region del producto ARMS correspondiente de manera complementaria a una secuencia marcadora 5' del cebador ARMS correspondiente.

Un aspecto relacionado de la presente invencion se corresponde con un metodo de amplificacion de un acido nucleico que tiene una o mas mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K, y/o una o mas mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, en el que el metodo comprende poner en contacto una muestra que comprende acidos nucleicos con una mezcla de amplificacion que comprende uno o mas cebadores ARMS, caracterizada porque cada cebador ARMS tiene una longitud total de desde 36 a 50 nucleotidos, y comprende una secuencia especlfica de diana 3' seleccionada de entre las SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14 y SEQ ID N° 15, respectivamente, comprendiendo ademas cada cebador ARMS una secuencia 5' diferente no especlfica de la diana de desde 15 a 20 nucleotidos, comprendiendo ademas la mezcla de amplificacion uno o mas cebadores de amplificacion.

Ademas de los cebadores ARMS y de amplificacion, la mezcla de amplificacion puede comprender tambien reactivos adicionales para la amplificacion de acido nucleico, tales como una ADN polimerasa y dNTP.

El marcador 5' se puede seleccionar de entre una de las siguientes secuencias SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24 y SEQ ID N° 25.

Las sondas de la presente invencion pueden comprender una secuencia seleccionada de entre SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24 y SEQ ID N° 25, y pueden contener nucleotidos adicionales a los especificos de la region marcadora.

Preferentemente, una o mas sondas con las que se ponen en contacto los productos de amplificacion tienen una longitud de 15 a 45 nucleotidos, la region de la sonda que se hibrida especificamente con la region del producto correspondiente con la secuencia 5' del cebador ARMS, tiene una longitud de 15 a 20 nucleotido. Mas preferentemente aun, una o mas sondas comprenden secuencias seleccionadas de entre SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24 y SEQ ID N° 25.

Preferentemente, las sondas de la presente invention se seleccionan de entre SEQ ID N° 8 (BRAF V600E), SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11 (BRAF V600K), SEQ ID N° 26 (PI3K E542K), SEQ ID N° 27 (PI3K E545D), SEQ ID N° 28 (PI3K E545K), SEQ ID N° 29 y SEQ ID N° 30 (PI3K H1047R).

Las sondas pueden estar inmovilizadas en un soporte solido. El conjunto de sondas de la micromatriz y el soporte solido pueden comprender adicionalmente una o mas sondas de control.

Otro aspecto de la presente invencion se corresponde con un metodo de amplificacion de acidos nucleicos que se corresponden con las mutaciones V600E y V600K de BRAF, en el que el metodo comprende poner en contacto una muestra qua contiene acidos nucleicos con una mezcla de amplificacion que comprende dos cebadores ARMS de SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4, comprendiendo ademas la mezcla de amplificacion un cebador de amplificacion que comprende o consiste en la SEC ID N° 5.

Un aspecto relacionado de la presente invencion se corresponde con un cebador ARMS de 36 a 50 nucleotidos, que se caracteriza en que dicho cebador comprende una secuencia 3' especifica de la diana BRAF seleccionada de ente las SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 2, o una secuencia especifica de la diana 3' PI3K seleccionada de entre las SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14 y SEQ ID N° 15, asi como una secuencia marcadora 5' no especifica de diana de entre 15 a 20 nucleotidos. Preferentemente, secuencia marcadora 5' tiene 17 a 19 nucleotidos de longitud. El uno o mas cebadores ARMS se puede seleccionar de entre el grupo que comprende las SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18 y SEQ ID N° 19.

Otro aspecto mas de la presente invencion se corresponde con el uso de los metodos de detection y amplificacion, o el kit, como se describe en el presente documento, para el diagnostico y/o pronostico de una afeccion patologica en una paciente, o para prever la respuesta de una paciente a la terapia con anticuerpo anti-EGFR. Preferentemente la afeccion patologica es un cancer. Mas preferentemente, el cancer es un cancer colorrectal.

Un aspecto relacionado se refiere a un metodo para la deteccion/diagnostico del cancer en un paciente que comprende un metodo de deteccion o amplificacion como se describe en el presente documento. Adicionalmente, un aspecto relacionado de la presente invencion se corresponde con la prediction de la respuesta de un paciente a la terapia con anticuerpos anti-EGFR mediante la ejecucion de los metodos y el kit de la presente invencion.

Las realizaciones se proporcionan mediante las reivindicaciones dependientes.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1.

La Figura 1 es un esquema que muestra la hibridacion especifica del producto de amplificacion obtenido con un cebador ARMS de la presente invencion que se corresponde con una mutation V600E, y la sonda especifica correspondiente. Como se indica en la figura, solo el producto ARMS de la mutacion V600E de BRAF se une especificamente a la sonda correspondiente a V600E, mientras que el producto ARMS de V600K no lo hace. De manera similar, solo el producto de amplificacion de V600K se une especificamente a la sonda correspondiente a V600K, mientras que el producto ARMS de V600E no lo hace (no mostrado).

Figura 2.

La Figura 2 representa una visualization en un gel de agarosa al 2 %, de los productos de la amplificacion multiple ARMS de las mutaciones V600E y V600K de BRAF, que se llevan a cabo con los cebadores ARMS y de amplificacion de la presente invencion, de acuerdo con el Ejemplo 1 (Multiple 1), y las muestras/lmeas celulares/clones indicados que se corresponden con las mutaciones V600E o V600K de BRAF indicadas.

Figura 3.

La Figura 3 representa la visualizacion de la hibridacion con una micromatriz que comprende las sondas como se describe en el presente documento, de los productos que resultan de la amplificacion por ARMS multiple de acuerdo con el Ejemplo 1 de la presente invencion,

(a) Muestra que comprende la mutacion V600E de BRAF. P: Marcador de position; Circulos: productos de amplificacion IC/EC; Cuadrados: puntos correspondientes a la hibridacion del producto de amplificacion por ARMS multiple correspondientes a la mutacion V600E de BRAF, y su sonda especifica.

(b) Clon de 10e3 copias/5 pi de la mutacion V600K de BRAF. P: Marcador de posicion; CIrculos: productos de amplificacion IC/EC; Rectangulos: puntos correspondientes a la hibridacion del producto de amplificacion por ARMS multiple correspondientes a la mutacion V600K de BRAF, y su sonda especlfica. Los puntos denominados “P” se corresponden con el Marcador de Posicion; Los puntos rodeados por CIrculos, se corresponden con los productos de amplificacion IC o EC; los puntos rodeados por cuadrados (en (a)), se corresponden con la union especlfica del producto de amplificacion con ARMS V600E BRAF con sus sondas especlficas; los puntos rodeados por rectangulos (en (b)), se corresponden con la union especlfica del producto de amplificacion con ARMS V600K BRAF con sus sondas especlficas. IC: Control interno; EC: Control de extraction.

Figura 4.

La Figura 4 representa la visualization de la hibridacion con una microsonda que comprende las sondas como se describen en el presente documento, de los productos que resultan de la amplificacion con ARMS multiple de acuerdo con el Ejemplo 2 de la presente invention.

(a) Llnea celular HTC 116 que contienen la mutacion H1047R de PI3K; (b) Muestra cllnica que comprende la mutacion E542K de PI3K. Los puntos denominados “P” se corresponden con el Marcador de Posicion; los puntos rodeados por CIrculos se corresponden con los productos de amplificacion IC o EC; los puntos rodeados por Cuadrados se corresponden con la union especlfica del producto de amplificacion con ARMS H1047R PI3K con sus sondas especlficas (en (a)) o a la union especlfica del producto de amplificacion con ARMS E542K PI3K con sus sondas especlficas (en (b)).

Descripcion detallada de la invencion

En los siguientes pasajes, se definen con mas detalle diferentes aspectos de la presente invencion. Cada aspecto definido de esta manera se puede combinar con cualquier otro aspecto o aspectos a menos de que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier caracterlstica indicada como que es preferida o especialmente ventajosa se puede combinar con cualquier otra caracterlstica o caracterlsticas preferidas o ventajosas.

Un primer aspecto de la presente invencion proporciona un metodo para la detection de mutaciones V600E y V600K de BRAF, en el que el metodo comprende las etapas de:

- someter una muestra de ensayo que comprende acidos nucleicos a la amplificacion con una mezcla de amplificacion que comprende dos cebadores ARMS, en el que los dos cebadores ARMS tienen la SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4,

comprendiendo adicionalmente la mezcla de amplificacion un cebador de amplificacion que comprende o consiste en la SEQ ID N° 5; y

- detectar cualquier producto de la amplificacion obtenido, mediante hibridacion de cualquiera de dichos productos con dos o mas sondas, en el que cada sonda se hibrida especlficamente con la region del producto de amplificacion correspondiente a la secuencia marcadora 5' del correspondiente cebador ARMS.

Un aspecto relacionado de la presente invencion es un metodo para la deteccion de una o mas mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K, y/o una o mas de las mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, en una muestra de ensayo que comprende acidos nucleicos en el que dicho metodo comprende:

- someter la muestra a una amplificacion con una mezcla de amplificacion que comprende uno o mas cebadores ARMS, caracterizados por que cada cebador tiene una longitud total de 36 a 50 nucleotidos, y comprende una secuencia especlfica de la diana en 3' seleccionada de entre las SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, o SeQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14 y SEQ ID N° 15, respectivamente, comprendiendo cada cebador adicionalmente una secuencia marcadora 5' no especlfica de diana diferente de desde 15 a 20' nucleotidos.

comprendiendo adicionalmente la mezcla de amplificacion uno o mas cebadores de amplificacion, y

- detectar cualquier producto de amplificacion obtenido, mediante hibridacion de cualquiera de dichos productos con una o mas sondas especlficas, en el que la sonda especlfica de cualquier mutacion de BRAF o PI3K se hibrida especlficamente con el producto al menos en la region de producto que se corresponde con la secuencia marcadora 5' proporcionada por el cebador ARMS especlfico correspondiente.

Un segundo aspecto de la presente invencion corresponde con un kit para detectar las mutaciones V600E y V600K de BRAF en una muestra de ensayo que comprende acido nucleico, y en el que dicho kit comprende una mezcla de reactivos para la amplificacion de acido nucleico, que comprende:

- dos cebadores ARMS de SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4, y

- un cebador de amplificacion que comprende o consiste en la SEQ ID N° 5,

comprendiendo adicionalmente el kit una micromatriz en la que se inmovilizan dos o mas sondas, hibridandose cada sonda especlficamente a la region en el producto ARMS correspondiente complementaria a una secuencia marcadora 5' del cebador ARMS correspondiente.

Otro aspecto de la presente invencion se corresponde con un metodo de amplificacion de acidos nucleicos correspondientes con las mutaciones V600E y V600K de BRAF, en el que el metodo comprende poner en contacto una muestra que contiene acidos nucleicos con una mezcla de amplificacion que comprende dos cebadores ARMS de SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4, comprendiendo adicionalmente la mezcla de amplificacion un cebador de amplificacion que comprende o consiste en la SEQ ID N° 5.

Un aspecto relacionado de la presente invencion es un kit para la deteccion de una o mas mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K, y/o una o mas mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R presentes en la muestra. Especlficamente la invencion se refiere a un kit para la deteccion de cualquiera de dichas mutaciones en la muestra de ensayo que comprende el acido nucleico, en el que dicho kit comprende una o mas mezclas de reactivos para la amplificacion de acido nucleico, comprendiendo cada mezcla: - uno o mas cebadores ARMS caracterizados porque cada cebador tiene una longitud de 36 a 50 nucleotidos que comprende una secuencia especlfica de diana 3' seleccionada de entre la SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14 y SEQ ID N° 15, respectivamente, comprendiendo adicionalmente cada cebador una secuencia marcadora no especlfica de la diana 5' de desde 15 a 20 nucleotidos, y

- uno o mas cebadores de amplificacion.

Comprendiendo adicionalmente el kit una micromatriz en la que estan inmovilizadas una o mas sondas. Cada sonda especlfica se hibrida especlficamente con la region en el correspondiente producto ARMS complementario a la secuencia marcadora 5' del correspondiente cebador ARMS.

Un aspecto relacionado de la presente invencion se refiere a un metodo para la amplificacion de un acido nucleico en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho acido nucleico una o mas mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K , y/o una o mas mutaciones de PI3K seleccionada de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, en el que dicho metodo comprende poner en contacto dicha muestra con uno o mas cebadores ARMS caracterizados porque cada cebador tiene una longitud total de 36 a 50 nucleotidos y comprende una secuencia 3' especlfica de la diana seleccionada de entre SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14 y SEQ ID N° 15, respectivamente, comprendiendo cada cebador una secuencia marcadora no especlfica de la diana 5' de desde 15 a 20 nucleotidos, comprendiendo adicionalmente la mezcla de amplificacion uno o mas cebadores de amplificacion.

Mas preferentemente, cada cebador ARMS tiene una longitud total de 39 a 47 nucleotidos; la secuencia especlfica de la diana 3' tiene una longitud de 212 a 30 nucleotidos; la secuencia marcadora 5' tiene una longitud de desde 17 a 19 nucleotidos; la sonda de deteccion tiene una longitud de 28 a 38 nucleotidos.

En una realizacion, el metodo o kit se refiere a la deteccion o amplificacion de una o mas mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R. Por ejemplo, se puede detectar o amplificar una unica mutacion seleccionada de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, se puede detectar o amplificar cualquier combinacion de dos o tres mutaciones seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R o se pueden detectar o amplificar todas de E542K, E545D, E545K y H1047R. En una realizacion, se detectaban o amplificaban todas de V600E, V600K, E542K, E545D, E545K y H1047R.

De acuerdo con los metodos y el kit de la presente invencion, ademas de los cebadores ARMS y de amplificacion, tambien pueden estar presentes cualquiera de entre otros componentes adicionales conocidos por el experto que sean necesario para la amplificacion de un acido nucleico, y en particular, para la amplificacion por PCR en la mezcla de amplificacion. De esta manera, una ADN polimerasa y dNTP, tambien pueden estar presentes en la mezcla de amplificacion.

Preferentemente, el producto de amplificacion se transforma en un ADN de cadena sencilla antes de la hi bridacion con la sonda correspondiente. Mas preferentemente, se obtiene un ADN de cadena sencilla mediante desnaturalizacion del producto de amplificacion, mas preferentemente, mediante desnaturalizacion por calor. La sonda se hibrida especlficamente a la region en el producto complementario a la secuencia marcadora 5' del cebador ARMS especlfico. Preferentemente, las sondas estan comprendidas en una micromatriz, y mas preferentemente, las sondas estan inmovilizadas en un soporte solido.

Definiciones

Lo siguiente puede ser util en el entendimiento de la invencion.

“Cebador” significa “cebador de una reaction de amplification de acido nucleico”.

A lo largo de la presente divulgation, a menos de que se establezca otra cosa, la expresion “cebadores ARMS” se refiere a cebadores especlficos de la mutation de BRAF y PI3K disenados en su extremo 3' de acuerdo con el metodo de amplification ARMS, y que comprenden una secuencia marcadora 5' no especlfica de la diana; y la expresion “cebadores de amplification” se refiere al os cebadores que se combinan con los cebadores ARMS para la amplification de un ADN diana.

Los cebadores ARMS utilizados en los diferentes aspectos de la invention se pueden representar como se representan en la Tabla 1 anteriormente, en la que las caracterlsticas de la secuencia marcadora 5' o el marcador tambien se indican.

El marcador hace que la sonda sea especlfica del producto de amplification. Preferentemente, el marcador 5' puede seleccionarse de entre una de las siguientes secuencias: SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24 y SEQ ID N° 25.

Se ha descrito una amplification de una o mas mutaciones en BRAF y/o PI3K con uno o mas cebadores ARMS seleccionados de entre el grupo de SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18 y SEQ ID N° 19:

GATTAGCGCAGTGCACTACGGTGATTTTGGTCTAGCTTCAGA (SEQ ID N° 3) (BRAF V600E) AGATCGTTATCAATCGCATGGTGATTTTGGTCTAGCTACTAA (SEQ ID N° 4) (BRAF V600K) AGACCTTAGCATAGCTTAAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTGTCTA (SEQ ID N° 16) (PI3K E542K)

ACT AT AGCCGAGTACGGCCCT CT CT CT GAAAT CAGT GAT (SEQ ID N° 17) (PI3K E545D) TAACTGGCTATCCGGAGGATCCTCTCTCTGAAATCAGTA (SEQ ID N° 18) (PI3K E545K) CGATATGATATGCTAGTTGAAACAAATGAATGATGCTCGT (SEQ ID N° 19) (PI3K H1047R).

Los nucleotidos en negrita se corresponden con el marcador 5'.

Como cebador de amplification, se puede utilizar cualquier cebador posible que, cuando se utiliza en combination con uno o mas de los cebadores ARMS anteriores para la amplification, se producen productos de amplification de 10 pb o mas cortas.

En una realization preferida, el cebador de amplification combinado con los cebadores ARMS anteriores producen productos de amplification de 500 pb o mas cortas, en otra realization preferida de alrededor de 200 pb, en una realization mas preferida, de entre 200 pb y 100 pb. Preferentemente el cebador de amplification tiene una longitud de desde 18 a 24 nucleotidos, y mas preferentemente de entre 21 y 22 nucleotidos.

Preferentemente, un cebador de amplification comprende la SEQ ID N° 5, y mas preferentemente, un cebador que consiste en la secuencia SEQ ID N° 5, se utiliza en combination con uno o mas de los siguientes cebadores ARMS: - Un cebador de desde 36 a 50 nucleotidos que comprende una secuencia 3' especlfica de secuencia seleccionada de entre la SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 2,

comprendiendo adicionalmente el cebador una secuencia marcadora 5' no especlfica de diana de entre 15 a 20 nucleotidos, as! como

- Cebadores de SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4.

Tambien, preferentemente, un cebador de amplification que comprende la SEQ ID N° 20, y mas preferentemente un cebador de amplification que consiste en la secuencia de SEQ ID N° 20, se utiliza en combination con cualquiera de los cebadores ARMS:

- Un cebador de desde 36 a 50 nucleotidos que comprende en su position 3' una secuencia especlfica de la diana seleccionada de entre las SEQ ID N° 12, SEQ iD N° 13 y SEQ ID N° 14, comprendiendo adicionalmente el cebador en su extremo 5' una secuencia marcadora no especlfica de la diana de desde 15 a 20 nucleotidos; as! como

- Cebadores de SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17 y SEQ ID N° 18.

Tambien, preferentemente, un cebador de amplification que comprende la SEQ ID N° 21, y mas preferentemente un cebador de amplification que consiste en la secuencia de SEQ ID N° 21, se utiliza en combination con cualquiera de los cebadores ARMS:

- Un cebador de desde 36 a 50 nucleotidos que comprende en su position 3' una secuencia especlfica de la diana seleccionada de entre las SEQ ID N° 15, comprendiendo adicionalmente el cebador en su extremo 5' una secuencia marcadora no especlfica de la diana de desde 15 a 20 nucleotidos; as! como

- Un cebador de SEQ ID N° 19.

En un aspecto preferido, cualquier sonda de deteccion especlfica tiene una longitud de desde 15 a 45 nucleotidos, la region que se hibrida especlficamente con el correspondiente producto ARMS en la region correspondiente a la secuencia marcadora 5' tiene entre 15 y 20 nucleotidos. Cada sonda puede comprender nucleotidos adicionales, sea en el extremo 5' y/o 3', hasta una longitud total de entre 15 a 45 nucleotidos.

Preferentemente, las sondas especlficas para la deteccion de las mutaciones V600E y V600K de BRAF, o de cualquiera de las mutaciones E542K, E545D, E545K y H1047R de PI3K, comprenden las secuencias de nucleotidos de SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24 y SEQ ID N° 25, respetivamente.

Se pueden utilizar una o mas sondas diferentes para la deteccion de cada mutacion de BRAF o PI3K.

Las sondas mas preferidas para cada una de las mutaciones se presentan en la Tabla 2.

En particular, las sondas se pueden inmovilizar en una micromatriz. Una micromatriz es una coleccion de puntos de oligonucleotido microscopicos. Una micromatriz de ADN (tambien conocida comunmente como un chip, chip de ADN, o biochip) es una coleccion de puntos de ADN microscopicos unidos a una superficie solida. Las sondas se sintetizan y entonces se unen mediante modificacion de superficie a una superficie solida por un enlace covalente a una matriz qulmica (mediante epoxi-silano, amino-silano, lisina, poliacrilamida u otros). Las superficies solidas se conocen en la tecnica e incluyen perlas microscopicas, as! como soportes solidos.

En particular, las sondas de la presente invencion se pueden inmovilizar en un soporte solido.

De esta manera, ademas de la mezcla para la amplificacion, el kit de la presente invencion comprende una micromatriz en la que se inmovilizan dos o mas sondas, hibridandose cada sonda especlficamente a la region en el producto ARMS correspondiente complementario de una secuencia marcadora 5' del cebador ARMS correspondiente.

Se pueden incluir uno o mas controles en los metodos y el kit de la presente invencion. Preferentemente, un par de cebadores de amplificacion que se corresponden con cualquier gen humano constitutivo y ubicuo conocido por el experto en la tecnica, se pueden incluir en la mezcla de amplificacion. Mas preferentemente, se utilizan los cebadores correspondientes al gen de p-actina. La amplificacion con dicho para de cebadores permite confirmar la extraccion del acido nucleico presente en la muestra de ensayo, y constituye el “control endogeno” o “control de extraccion”. Adicionalmente, se incluyen preferentemente un ADN plasmldico y un par de cebadores con la capacidad de amplificarlo, en la mezcla de amplificacion, y constituyen el “control de amplificacion” o “control interno”. Preferentemente, la micromatriz puede comprender uno o mas sondas de control con la capacidad de hibridarse con las secuencias de ADN de control correspondientes, en particular, a los productos de los controles de la extraccion y amplificacion. Preferentemente, el kit de la presente invencion comprende adicionalmente reactivos para la visualizacion de la hibridacion entre cualquier producto de amplificacion y la micromatriz de sondas.

Un aspecto relacionado de la presente invencion se corresponde con uno o mas cebadores ARMS de una longitud de 36 a 50 nucleotidos, caracterizados porque cada cebador comprende en su extremo 3' una secuencia especlfica de la diana BRAF seleccionada de entre la SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 2, o una secuencia especlfica de diana PI3K seleccionada de entre SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14 y SEQ ID N° 15, cada cebador comprende adicionalmente una secuencia marcadora no especlfica de la diana en su extremo 5', de desde 15 a 20 nucleotidos. Preferentemente, los marcadores en la posicion 5' de los cebadores ARMS contienen 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleotidos. Los cebadores ARMS especialmente preferidos son los seleccionados de entre el grupo que comprende las SEQ ID N° SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18 y SEQ ID N° 19.

Otro aspecto mas de la presente invencion se corresponde con el uso de los metodos descritos en el presente documento, o del kit descrito en el presente documento, para el diagnostico y/o pronostico de una afeccion patologica en un paciente, en particularmente, de cancer, as! como para la prediction de la respuesta de un paciente a la terapia con anticuerpos anti-EGFR.

Tambien se describe un metodo in vitro para diagnosticar un sujeto o evaluar un sujeto en cuanto a una quimioterapia apropiada, que comprende:

(i) proporcionar una muestra tumoral del sujeto;

(ii) determinar si esta presente una mutation en BRAF y/o PI3K en la muestra utilizando los metodos descritos en el presente documento.

La etapa (ii) anterior comprende por lo tanto la detection de una o mas mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K, o una o mas mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, en el que el metodo comprende las etapas de:

- someter dicha muestra tumoral que comprende los acidos nucleicos a una amplification con una mezcla de amplification que comprende uno o mas cebadores ARMS, caracterizada porque cada cebador ARMS tiene una longitud total de desde 36 a 50 nucleotidos, y comprende una secuencia especlfica de diana 3' seleccionada de entre las SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14 y SEQ ID N° 15, respectivamente,

comprendiendo cada cebador ARMS una secuencia marcadora 5' no especlfica de diana de desde 15 a 20 nucleotidos, comprendiendo la mezcla de amplificacion adicionalmente uno o mas cebadores de amplificacion; y - detectar cualquier producto de amplificacion obtenido, mediante la hibridacion de cualquiera de dichos productos con dos o mas sondas, en el que cada sonda se hibrida especlficamente con la region del producto de amplificacion correspondiente a la secuencia marcadora 5' del correspondiente cebador ARMS.

Realizaciones preferidas de los cebadores que se van a utilizar se exponen en otra parte del presente documento. Una etapa adicional puede incluir la selection de un tratamiento apropiado correlativo a la presencia o ausencia de una mutacion de BRAf o PI3K.

Los tipos de muestras de ensayo que use pueden procesar con la presente invencion pueden ser un frotis, biopsias embebidas en parafina, sangre, esputo, lavado colonico, lavado bronquial, as! como saliva, plasma y llquido cefalorraquldeo, y cualquier otro fluido corporal, o tejido obtenido de un individuo. El individuo es un ser humano. La muestra de ensayo puede ser igualmente una secuencia de acido nucleico que se corresponde con la secuencia presente en la muestra de ensayo. Todo o parte de la region de interes presente en la muestra de acido nucleico se puede amplificar utilizando cualquier tecnica conveniente tal como PCR, antes de su uso en el metodo de la invencion.

La extraction de material genetico puede llevarse a cabo mediante tecnicas de extraction automaticas, as! como manuales del estado de la tecnica.

Un metodo de extraccion de ADN especialmente preferido de los tejidos y otras muestras en el Kit EZ1® DNA Tissue de QIAGEN. Tambien se prefiere el producto AHPrep® DNA/RnA FFPE de QIAGEN, que pretende la purification simultanea de ADN genomico y ARN total de secciones de tejidos fijadas en formalina, embebidas en parafina. tambien se puede utilizar cualquier otra tecnica y metodos para el procesamiento manual o automatico de muestras para extraer ADN y otros acidos nucleicos, de los que sea consciente el experto, en la presente invencion. En una realization preferida de la presente invencion, el vaso en el que tiene lugar el metodo de la presente invencion comprende, ademas de uno o mas cebadores ARMS y el uno o mas cebadores de amplificacion, tambien se incluyen otros componentes para la amplificacion del ADN presente en la muestra, en particular, nucleotidos trifosfatos apropiados, tales como dATP, dCTP, dGTP, dTTP, una enzima adecuada para la polimerizacion en la mezcla de reactivos de amplificacion.

Se puede utilizar cualquier enzima conveniente para la polimerizacion. En particular, cualquier ADN polimerasa con capacidad para discriminar entre secuencias matriz normales y mutantes respecto a cualquier extension significativa. Ejemplos de enzimas convenientes incluyen enzimas termoestables que no tienen actividad exonucleasa significativa 3'-5', con velocidades de polimerizacion de alrededor de 10 nucleotidos/segundo, dando lugar de esta manera a fragmentos de amplificacion de 600-1000 pb en etapas de extension convencionales. Preferentemente, se puede utilizar la ADN polimerasa HotStarTaq de QIAGEN. Tambien se puede utilizar cualquier otra enzima con estas caracterlsticas conocidas en el estado de la tecnica. Por ejemplo, la ADN polimerasa “AmpliTaq Gold” de PE Applied Biosystems.

La amplificacion ARMS de las diferentes mutaciones de la presente invencion se pueden llevar a cabo sea individualmente, o en una reaccion de amplificacion multiple de dos o mas de las mutaciones. En ambos casos, el kit PCR multiple de QIAGEN se utiliza mas preferentemente para la amplificacion por ARMS, con los metodos y kits de la presente invencion.

El metodo de la presente invencion se puede llevar a cabo en uno o mas vasos, comprendiendo cada vaso al menos un cebador ARMS, y al menos un cebador de amplificacion, junto con otros agentes para la amplificacion.

El agente para la polimerizacion y las condiciones apropiadas se pueden seleccionar por el experto. Las condiciones de ciclado termico convencional se pueden utilizar para la amplificacion de las mutaciones de acuerdo con la presente invencion.

Las condiciones de ciclado termico que han demostrado que funcionan particularmente bien con las muestras y que se pueden utilizar de acuerdo con las distintas realizaciones de la invencion son las siguientes:

Se pueden utilizar las combinaciones de cebadores ARMS de la presente invencion para la deteccion multiple de una o mas de las mutaciones de BRAF o PI3K presentes en una muestra. Por lo tanto, el vaso de reaccion en el que tiene lugar el metodo, puede comprender 2, 3, 4, 5 o 6 de los cebadores ARMS de la Tabla 1, o de los cebadores seleccionados de entre las SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18 y SEQ ID N° 19, as! como uno o mas cebadores de amplificacion que se pueden combinar con los cebadores anteriores para la amplificacion de una o mas mutaciones de BRAF y/o PI3K presentes en una muestra. Los pares de cebador adicionales, preferentemente los que se corresponden con los controles de extraccion y/o internos y/o pares de cebadores para la amplificacion de otras mutaciones, tambien pueden incluirse en la mezcla de amplificacion.

Las posibles combinaciones de cebadores ARMS son mezclas de cebadores que comprenden:

- Cebadores ARMS of SEQ ID N° 3 (BRAF V600E) y SEQ ID N° 4 (BRAF V600K) (Componentes de la mezcla de amplificacion 1);

- Cebadores ARMS of SEQ ID N° 16 (PI3K E542K) y SEQ ID N° 19 (PI3K H1047R) (Componentes de la mezcla de amplificacion 2);

- Cebadores ARMS of SEQ ID N° 17 (PI3K E545D) y SEQ ID N° 18 (PI3K E545K) (Componentes de la mezcla de amplificacion 3);

- Cebadores ARMS of SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18 y SEQ ID N° 19 (PI3K E542K, PI3K E545D, PI3K E545K y PI3K H1047R, respectivamente) (Componentes de la mezcla de amplificacion 4).

Las posibles combinaciones de ARMS y cebadores de amplificacion son mezclas de cebadores que comprenden: - Cebador ARMS de SEQ ID N° 3 (BRAF V600E), Cebador ARMS de SEQ ID N° 4 (BRAF V600K), Cebador de amplificacion de SEQ ID N° 5 (“Cebador” de Amplificacion Comun para Cebadores ARMS de SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4) (Componentes de la mezcla de amplificacion 1);

- Cebadores ARMS de SEQ ID N° 16 (PI3K E542K) y SEQ ID N° 19 (PI3K H1047R), Cebadores de amplificacion de SEQ ID N° 20 y SEQ ID N° 21 (“Cebadores” de Amplificacion correspondientes con Cebadores ARMS de SEQ ID N° 16 y SEQ ID N° 19, respectivamente) (Componentes de la mezcla de amplificacion 2);

- Cebadores ARMS de SEQ ID N° 17 (PI3K E545D) y SEQ ID N° 18 (PI3K E545K) y Cebador de amplificacion de SEQ ID N° 20 (“Cebador” de Amplificacion Comun para Cebadores ARMS de SE^q ID N° 17 y ^s E^q ID N° 18) (Componentes de la mezcla de amplificacion 3);

- Cebadores ARMS de SEQ ID N° 16 (PI3K E542K), SEQ ID N° 17 (PI3K E545D), SEQ ID N° 18 (PI3K E545K) y SEQ ID N° 19 (PI3K H1047R), Cebador de amplificacion de SEQ ID N° 20 (“Cebador” de Amplificacion Comun para Cebadores ARMS de SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17 y SEQ ID N° 18) y SEQ ID N° 21 (“Cebador” de Amplificacion correspondientes con Cebador ARMS de SEQ ID N° 19) (Componentes de la mezcla de amplificacion 4).

Los componentes restantes de las diferentes mezclas de amplificacion incluyen una ADN polimerasa, dNTP y cualquier otro componente necesario para que tenga lugar la amplificacion. Ademas, las diferentes mezclas de amplificacion pueden contener adicionalmente cebadores directos o inversos para la amplificacion de los controles interno y extraccion, as! como pares de cebadores para la amplificacion de otras mutaciones.

El metodo de la presente invention ha demostrado que detecta facilmente cantidades de ADN mutado de BRAF y PI3K de desde 1 ng a 1 pg. En particular, el metodo de la presente invencion ha demostrado detectar sin problemas, 5 pl de una llnea celular con 200 ng/pl de ADN mutado de BRAF o PI3K, as! como diluciones en serie del primero hasta 0,2 ng/pl. El llmite de detection del kit de la presente invencion es de 1.000 copias de BRAF o PI3K mutantes en una muestra de 5 pl. La sensibilidad del valor de deteccion del kit de la presente invencion para las diferentes mutaciones de BRAF o PI3K es del 1 %. Con respecto a los parametros diagnosticos, el valor de la sensibilidad diagnostica del kit de la presente invencion para las mutaciones de BRAF y PI3K es mayor del 98 %.

Se puede introducir un marcador en el producto de amplificacion de ADN durante la amplificacion ARMS para permitir una deteccion adicional; en particular, se puede detectar un marcador que proporciona una senal por metodos colorimetricos, por metodos fluorescentes, o por cualquier metodo de marcado conocido en la tecnica. El marcador pueden ser agentes radioactivos, quimioluminiscentes, luminiscentes y fluorescentes. En un aspecto preferido, el marcador que se utiliza es biotina. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro tipo de marcador conocido en la tecnica (por ejemplo, digoxigenina). En un aspecto preferido, al menos uno de los cebadores que se utiliza esta marcado en el extremo 5' con biotina. Preferentemente el cebador de amplificacion esta marcado. Ademas, el marcado de ADN amplificado puede conseguirse alternativamente anadiendo nucleotidos modificados que albergan un marcador (por ejemplo, derivados dUTP biotinilados o digoxigenina) a la mezcla de PCR. En ciertas realizaciones, se pueden utilizar marcadores radioactivos, as! como fluoroforos.

Se pueden utilizar metodos alternativos conocidos por el experto, que pueden hacer posible la deteccion de la interaction entre cualquier producto de amplificacion y su sonda correspondiente, incluyendo metodos que emplean el marcado de la sonda.

En una realization preferida de la presente invencion, los productos de amplificacion, desnaturalizado previamente se incubaron con las sondas especlficas de diana que se hibridan con los productos de amplificacion al menos en la region correspondiente al marcador 5' de nucleotidos proporcionados por el cebador especlfico.

Preferentemente, la desnaturalizacion del ADN amplificado se puede llevar a cabo por calor. Tambien se pueden utilizar otras maneras para preparar un ADN de cadena sencilla despues de la amplificacion; por ejemplo, por medios qulmicos.

En un aspecto preferido, la muestra de ensayo que comprende los acidos nucleicos que se van a analizar se divide en dos o mas allcuotas, en las que:

- una de las allcuotas se somete a amplificacion con una mezcla que comprende los cebadores de SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4 y SEQ ID N° 5 (Mezcla de Amplificacion 1);

- otra de las allcuotas se somete a amplificacion con una mezcla que comprende los cebadores de SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20 y SEQ ID N° 21 (Mezcla de Amplificacion 2); y

- otra de las allcuotas se somete a amplificacion con una mezcla que comprende los cebadores de SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18 y SEQ ID N° 20 (Mezcla de Amplificacion 3) o cualquiera,

- una de las allcuotas se somete a amplificacion con la Mezcla 1 anterior

- otra de las allcuotas se somete a amplificacion con una mezcla que comprende los cebadores de SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20 y SEQ ID N° 21 (Mezcla de Amplificacion 4).

El metodo comprende adicionalmente la desnaturalizacion de cualquier producto de amplificacion obtenido, y su hibridacion posterior con una micromatriz que comprende una o mas de las sondas seleccionadas de entre las SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 29 y SEQ ID N° 30.

En una realizacion preferida de la presente invencion, las sondas para la deteccion de los productos de la amplificacion se proporcionan en una micromatriz. La tecnologla de micromatriz hace posible la deteccion simultanea de productos de amplificacion diferentes, que se corresponde con una o mas mutaciones presentes en una muestra, en presencia de cualquier control necesario para asegurar la fiabilidad de los resultados.

Por lo tanto, la invencion tambien se refiere a una micromatriz que comprende una o mas de las sondas seleccionadas de entre SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 29 y SEQ ID N° 30.

En una realizacion preferida de la presente invencion, un ADN de cadena sencilla obtenido de uno o mas de los productos de amplificacion se incuba con una pluralidad de sondas especlficas de la diana proporcionada en una micromatriz. Al menos una, pero preferentemente mas que una sonda con capacidad para hibridarse con cada secuencia diana, se proporcionan en una micromatriz. En ciertas realizaciones de la invencion, el ADN de cadena sencilla puede incubarse con sondas especificas de la diana proporcionadas en solucion; sin embargo, se prefiere que las sondas se disponen en una micromatriz.

Se describen en el presente documento sondas contenidas en una micromatriz, que se pueden colocar en un portaobjetos o contenidas en un vaso de reaccion, que entonces se llama vaso de matriz. Los vasos de matrices tienen diferentes formatos de presentacion, que incluyen vasos de matriz individuales, tales como pocillos o tubos, o conjuntos de vasos de matriz dispuestos en tiras de pocillos o tubos, o placas planas. Habitualmente, las placas consisten en conjuntos de tiras de vasos de matriz. Por lo tanto, una matriz de la presente invencion puede sestar contenida en un vaso de matriz individual. De manera alternativa, dos o mas micromatrices pueden estar contenidas en una tira de vasos. En una realizacion preferida la tira de vasos esta constituida por 8 vasos. Ademas, tres o mas vasos de matriz pueden estar dispuestos en un conjunto de tiras de vasos. En otra realizacion preferida la tira de vasos es una placa de microtitulacion. En otra realizacion preferida, la placa de microtitulacion esta constituidas por 95 vasos de matriz.

En realizaciones preferidas, las sondas de la micromatriz se pueden inmovilizar en un soporte solido en el que el soporte solido puede ser el fondo de un vaso de matriz o un soporte solido diferente unido al fondo del vaso de matriz. Esto significa que la superficie de la micromatriz puede ser el fondo plano de un vaso de matriz. De manera alternativa, la superficie de la micromatriz puede ser un soporte solido unido al fondo del vaso de matriz.

En una realizacion de la presente invencion, el vaso de reaccion tiene un tamano tipico de un vaso de reaccion de laboratorio. Los volumenes de capacidad tipicos estan en el intervalo de 100 pl a 2,5 ml, pero tambien pueden ser menores o mayores en realizaciones especiales. El vaso de reaccion puede tener un volumen de capacidad normal para un tubo de Eppendorf convencional de hasta 1,5 ml. Volumenes de capacidad preferidos adicionales son de hasta 0,4 ml, hasta 0,5 ml, hasta 0,7 ml, hasta 1,0 ml o hasta 2,0 ml. Debido al marcado del ADN amplificado , cualquiera de las moleculas de la muestra interactuan con las moleculas de sonda de la superficie de la micromatriz, un relativo indicador se une al marcador y produce senales visibles que se pueden detectar en un dispositivo de deteccion.

La interaccion de la sonda y las moleculas de la muestra se identifican por la localizacion de la senal en la superficie de la micromatriz. En el caso particular en el que los productos de amplificacion estan marcados con biotina, el agente indicador puede ser peroxidasa de rabano rusticano unido covalentemente a estreptavidina. Esta ultima se une especificamente a la biotina, y la peroxidasa desencadena la precipitacion de sustratos tales como el de tetrametilbencidina (TMB).

Cualquier otra reaccion que de como resultado un precipitado sobre los elementos de la matriz, y que se puedan utilizar para detectar la interaccion entre la diana y las moleculas de la sonda de acuerdo con la presente invencion, se pueden utilizar igualmente. Cualquier otro metodo conocido en el estado de la tecnica, tal como la fluorescencia, se puede utilizar para la deteccion de la interaccion entre los productos de amplificacion y las sondas correspondientes. El metodo dependera del marcado exacto de los productos de amplificacion.

Las sondas de la presente invencion se pueden obtener por diferentes metodos, tales como la sintesis quimica (por ejemplo, por el metodo fosfotriester convencional) o tecnicas de modificacion genetica, por ejemplo, por clonacion molecular de los plasmidos recombinantes en los que las secuencias de nucleotido correspondientes se han insertado y se puede obtener mas tarde por digestion con nucleasas.

Las sodas individuales o mezclas de sondas de cada mutacion se pueden inmovilizar en una unica localizacion del soporte solido, en dos localizaciones distintas del soporte solido y en tres o mas localizaciones distintas del soporte solido.

De manera adicional, una o mas sondas de control tambien se proporcionan en distintas localizaciones.

En una realizacion preferida, la visualizacion de las interacciones entre los productos de amplificacion y sus correspondientes sondas especificas o de control, consiste en las siguientes etapas:

- Primero, la imagen de la matriz se captura utilizando un dispositivo optico;

- Luego, la imagen se analiza;

- Finalmente, se proporciona un informa que contiene una interpretacion del resultado.

Preferentemente, la imagen se analiza por medio de un software apropiado. Se puede utilizar cualquier dispositivo adecuado para este procesamiento.

La deteccion de las mutaciones de BRAF y PI3K con el metodo de la presente invencion es compatible con la deteccion de otras mutaciones en estos mismos genes, asi como de mutaciones en otros genes relevantes en el cancer.

El metodo de la presente invencion se puede combinar con otros metodos de deteccion de mutaciones, sea en genes BRAF y PI3^k y/o en cualquier otro gen relevante en el cancer, llevando a cabo un diagnostico y/o pronostico completo del cancer.

El metodo de deteccion de las 2 mutaciones V600E y V600K de BRAF, y opcionalmente una o mas de las 4 mutaciones E542K, E545D, E545K y H1047R de PI3K de la presente invencion se pueden aplicar a cualquier patologla y a cualquier muestra sospechosa de correlacionarse con mutaciones BRAF o Pl3K.

Los ejemplos proporcionados posteriormente simplemente ilustran la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1

Se preparo la siguiente mezcla de reactivos para la amplificacion por ARMS multiple de las mutaciones V600E y V600K de BRAF en muestras/llneas celulares/clones:

A continuacion, 5 pl de un eluldo total de 30 pl obtenido de secciones de tejido embebido en parafina (muestra) de diferentes llneas celulares o clones, se anadieron hasta un volumen de reaccion final de 50 pl.

Las condiciones de ciclado termico de la PCR eran:

Los resultados de la amplificacion por ARMS multiple de BRAF se representan en la Figura 2 y la Figura 3.

Los diferentes productos ARMS de las muestras/clones o llneas celulares indicados en la Tabla 3 o la Figura 2, se visualizaron en un gel de agarosa al 2 %, en el que los productos de las diferentes reacciones de amplificacion se analizaron.

La longitud de los diferentes productos de amplificacion era las siguientes:

- Longitud de la banda especlfica de mutacion correspondiente a las mutaciones V600E y V600K: 144 pb;

- Longitud de la banda de IC: 101 pb (el producto de amplificacion del gen de beta-actina);

- Longitud de la banda de EC: 112 pb (producto de amplificacion del plasmido ppg25).

A pesar del hecho de que la longitud de los diferentes productos de amplificacion es similar, se pueden apreciar diferencias entre los pocillos que contienen alguna banda especlfica de mutacion junto con las bandas de control, y los pocillos que solo contienen bandas de control. Esta diferencia se corresponde con el producto de amplificacion especlfico de mutacion.

En estos experimentos se ha comprobado que la amplificacion ARMS solo tiene lugar cuando la muestra sometida a amplificacion es la de una muestra /clon / llnea celular, que se corresponde con una de las mutaciones para la que los cebadores ARMS se hablan incluido en la mezcla de reactivos utilizada para la amplificacion multiple.

Se ha confirmado por secuenciacion de ADN que los productos ARMS obtenidos en cada pocillo resultaban realmente de la amplificacion especifica de la muestra /clon/linea celular, con el correspondiente cebador ARMS. La amplificacion por ARMS en cada multiple es especifica.

Se ha confirmado que pequenas variaciones en el numero de ciclos de amplificacion (2-3 ciclos de amplificacion extras o menos) no modifican los resultados obtenidos.

Los diferentes productos de amplificacion por ARMS multiple se desnaturalizaron e hibridaron con micromatrices de sondas. La visualizacion de los resultados correspondientes se representa en la Figura 3.

Ejemplo 2

La composicion de las mezclas de amplificacion 2 y 3 correspondientes al PI3K se presentan a continuacion. Las condiciones de reaccion restantes son las mismas que las que se presentan en el Ejemplo 1 para BRAF.

Los resultados correspondientes con 5 pl de la linea celular HTC 116 (0,2 ng/pl) que contiene la mutacion H1047R de PI3K (a), o de 5 pl de una muestra clinica que contenia ADN a una concentracion de 20 ng/pl (b), despues de su respectiva amplificacion con los reactivos de la mezcla de amplificacion 2, y la hibridacion posterior de los productos obtenidos con una micromatriz de sonda, y la posterior visualizacion, se representan en las Figuras 4 a) y 4 b), respectivamente.

Ejemplo 3

La inclusion en las mezclas de amplificacion, de los cebadores directo e inverso que son necesarios para la amplificacion del control interno y el control de extraccion, asi como de un plasmido tal como pBSK con una insercion, tambien necesaria para la amplificacion del control interno, a las concentraciones presentadas posteriormente, no alteraban los resultados obtenidos:

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para la deteccion de mutaciones V600E y V600K de BRAF, en donde el metodo comprende las etapas de:

- someter una muestra de ensayo que comprende acidos nucleicos a una amplificacion con una mezcla de amplificacion que comprende dos cebadores ARMS, en donde los dos cebadores ARMS tienen la SEQ ID N° 3 y la SEQ ID N° 4,

comprendiendo adicionalmente la mezcla de amplificacion un cebador de amplificacion que comprende o consiste en la SEQ ID N° 5; y

- detectar cualquier producto de amplificacion obtenido, mediante la hibridacion de cualquiera de dichos productos con dos o mas sondas, en donde cada sonda se hibrida especlficamente con la region del producto de amplificacion correspondiente a la secuencia marcadora 5' del correspondiente cebador ARMS.

2. El metodo de la reivindicacion 1 en el que la mezcla de amplificacion comprende una ADN polimerasa y dNTP.

3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que los productos de amplificacion se hibridan con al menos dos sondas de una longitud de entre 15 y 45 nucleotidos, comprendiendo una la secuencia SEQ ID N° 6 y comprendiendo la otra la secuencia SEQ ID N° 7.

4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que una de las sondas tiene la SEQ ID N° 8, y la otra sonda se selecciona de entre las SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10 y SEQ ID N° 11.

5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que permite ademas detectar una o mas mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, comprendiendo ademas el metodo:

- someter la muestra de ensayo a una amplificacion con uno o mas cebadores ARMS, teniendo cada cebador ARMS una longitud total de entre 36 y 50 nucleotidos, y comprendiendo una secuencia especlfica de diana 3' seleccionada de entre las SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, S^eQ ⁱD N° 14 y SEQ ID N° 15, respectivamente, comprendiendo ademas cada cebador ARMS una secuencia marcadora 5' no especlfica de diana diferente de entre 15 y 20 nucleotidos, comprendiendo ademas la mezcla de amplificacion uno o mas cebadores de amplificacion; y - detectar cualquier producto de amplificacion obtenido, mediante la hibridacion de cualquiera de tales productos con una o mas sondas, en donde cada sonda se hibrida especlficamente con la region del producto de amplificacion correspondiente a la secuencia marcadora 5' del cebador ARMS correspondiente.

6. Un kit para detectar las mutaciones V600E y V600K de BRAF en una muestra de ensayo que comprende un acido nucleico, en donde dicho kit comprende una mezcla de reactivos para la amplificacion de acido nucleico, que comprende:

- dos cebadores ARMS de SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4, y

- un cebador de amplificacion que comprende o consiste en la SEQ ID N° 5,

comprendiendo ademas el kit una micromatriz en la que estan inmovilizadas dos o mas sondas, hibridandose cada sonda especlficamente a la region del correspondiente producto ARMS complementaria a la secuencia marcadora 5' del cebador ARMS correspondiente.

7. El kit de la reivindicacion 6, en el que la micromatriz comprende dos o mas sondas, teniendo una sonda la SEQ ID N° 8 y al menos otra sonda que se selecciona de entre las SeQ ID N° 9, SEQ ID N° 10 y SEQ ID N° 11.

8. El kit de las reivindicaciones 6 o 7 que comprende ademas una o mas de las siguientes mezclas de amplificacion: - una mezcla de amplificacion que comprende los cebadores de SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20 y SEQ ID N° 21;

- una mezcla de amplificacion que comprende los cebadores de SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18 y SEQ ID N° 20; y - una mezcla de amplificacion que comprende los cebadores de SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SeQ ID N° 19, SEQ ID N° 20 y SEQ ID N° 21;

comprendiendo ademas la micromatriz una o mas sondas seleccionadas de entre las SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 29 y SEQ ID N° 30.

9. Un metodo de amplificacion de acidos nucleicos correspondientes con las mutaciones V600E y V600K de BRAF, en donde el metodo comprende poner en contacto una muestra que contiene acidos nucleicos con una mezcla de amplificacion que comprende dos cebadores ARMS de SEQ ID N° 3 y SEQ ID N° 4, comprendiendo ademas la mezcla de amplificacion un cebador de amplificacion que comprende o consiste en la SEQ ID N° 5.

10. Uso del metodo de deteccion de mutaciones de BRAF de las reivindicaciones 1 a 6, o del kit de las reivindicaciones 6 a 8, o del metodo de amplificacion de la reivindicacion 9 para el diagnostico y/o el pronostico de una afeccion patologica en un paciente, o para predecir la respuesta de un paciente a una terapia con anticuerpos anti-EGFR.