KR20030017894A - 유방암 및 난소암 진단에 유용한 ｂｒｃａ１, ｂｒｃａ２유전자 돌연변이 및 이를 이용한 검색 방법 - Google Patents

유방암 및 난소암 진단에 유용한 ｂｒｃａ１, ｂｒｃａ２유전자 돌연변이 및 이를 이용한 검색 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BRCA1, BRCA2 유전자의 돌연변이에 대한 것이다. 돌연변이는 BRCA1 유전자에 10 종, BRCA2 유전자에 10 종으로써 총 20 종이다. 돌연변이의 위치는 BRCA1의 경우 875, 1041-1043, 3033, 3860, 4277, 5133, 5187, 5333, 5564, 5615-5625이며, BRCA2의 경우 IVS4+67, IVS8+56, 1590, 1923, 2485, 2718, 4562, 6319, IVS11-9, IVS14+10이다. 본 발명의 내용인 BRCA1, BRCA2 유전자의 돌연변이는 지금까지 알려져 있지 않았으며, 한국인 특이적인 유전자 염기서열 상의 변이로써, 이는 유방암 및 난소암의 소인을 진단하는데 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 유방암 및 난소암의 소인을 진단하는 효율적인 방법에 관한 것이다.

Description

유방암 및 난소암 진단에 유용한 ＢＲＣＡ１, ＢＲＣＡ２ 유전자 돌연변이 및 이를 이용한 검색 방법 {Breast and ovarian cancers suseceptibility mutations of BRCA 1 and BRCA 2, and detection method using them}
본 발명은 인체 유전학 분야로서 유방암 및 난소암의 발병 유전자로 알려진 BRCA1과 BRCA2 유전자에 관한 것이다. 구체적으로는, 유방암 및 난소암의 소인 진단시 사용될 수 있는 한국인 특이적인 생식세포 돌연변이 및 이들을 BRCA1, BRCA2유전자로부터 검출하는 방법에 관한 것이다.
유방암의 발병 원인은 환경적요인, 호르몬, 유전적 원인 등으로 나눌 수 있으며, 특히 전체 유방암 발생의 5 - 10%는 유전적 소인에 의한 것으로 알려져 있다. 유전성 유방암이 속하는 암 유전학(Cancer Genetics)은 매우 복잡한 현상으로써 암발생 유전자(Oncogene)와 암억제 유전자(Tumor Suppressor Gene)의 복합적인 작용에 의해 발생한다. 암발생 유전자는 주로 우성이고 지금까지 백 여가지 이상이 발견되었으며, 암억제 유전자는 십 여종이 발견되었는데, 투-힛트(Two-Hit) 가설에 의하면 두 개의 대립형질이 모두 비정상적으로 되어 암이 발생한다(Knudson, et al., 1993).
BRCA1 유전자의 염색체상의 위치는 1990년 최초로 홀(Hall)에 의해 밝혀졌고, BRCA2는 1994년 우스터(Wooster)에 의해 밝혀졌으며, 이 두가지 유전자는 조기발병 유방암의 발생과 관련성이 높음이 시사되었다. 더 나아가, BRCA1 및 BRCA2 유전자의 생식세포 돌연변이를 부모로부터 유전 받아 유방암이 발병한다는 사실이 밝혀졌다(Claus, et al., 1996).
BRCA1은 염색체 17번에 위치하며, 유방암 및 난소암의 발병위험성을 증가시키는 유전자로는 처음으로 검증된 유전자이며, 22개의 엑손(Exon)으로 구성되어있다. 염색체 13번에 위치하며, 26개의 엑손으로 구성된 BRCA2 역시 BRCA1에 이어 유방암 및 난소암의 발병위험성을 증가시키는 유전자로 검증되었다(Miki, et al., 1994). 양쪽 부모중 한 사람으로부터, BRCA1, BRCA2 돌연변이 유전자를 유전받은 사람은 70세가 될 때까지 유방암 발병 확률은 87%에 이르며, 40∼50세 이하의 폐경기 이전에 유방암이 발병할 확률은 59% 이다(Ford, et al., 1994). BRCA1은 유방암뿐만 아니라 난소암의 발병에도 관련이 있어, 돌연변이 BRCA1 유전자를 가진 사람의 난소암 발병률은 70 세 이전에 44 %에 이른다(Ford, et al., 1994). 돌연변이가 일어난 BRCA 유전자는 모계뿐만 아니라 부계로부터 유전될 수도 있으며, 여성뿐 아니라 남성도 돌연변이 유전자를 가진 경우, 유방암의 발병율은 높아지게 된다. BRCA1 돌연변이를 가진 사람은 대장암 발병위험성도 높이며, 남성의 경우 전립선암의 발병위험성을 높인다(Struewing, et al., 1997).
BRCA1 및 BRCA2 유전자의 돌연변이 발생빈도는 민족별로 차이가 있는데, 미국내 전체 애시캐나지 유태인(Ashkenazi Jews)의 경우 치명적인 결손 돌연변이 발생빈도가 전체 인구의 2% 에 이른다(Roa., et al. 1996). 전 세계적으로 BRCA1 및 BRCA2 유전자의 뉴클레오티드 변이양상은 매우 다양하게 나타나는데, 지금까지 수백 여 종의 돌연변이가 보고되어져 있다. 유방암은 국내에서 연간 4,500 명의 신규 환자가 발생되고 있으며, 여성에게 있어 위암에 이어 두 번째로 높은 발병율을 보이고 있다(한국 중앙 암 등록사업연례보고서). 이러한 국내환경에도 불구하고, 국내의 경우 한국인을 대상으로 한 뉴클레오티드 돌연변이는 알려진 바가 거의 전무한 실정이다. 미국을 중심으로 한 인간 게놈프로젝트가 1차 종료되었는데, 앞으로 질병을 유발하는 유전자를 밝히고 관련 유전자의 변이양상을 찾아 이를 분자수준에서 진단에 응용하고자 하는 노력이 다양하게 시도되고 있다. 이러한 국제적인 게놈산업의 경향을 고려할 때 한국인을 대상으로 한 유전자의 돌연변이 및 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism)을 포함하는 뉴클레오티드 변이양상에대한 정보의 획득은 유방암 및 난소암의 발병원인을 밝히고 소인을 진단하는데 있어 매우 중요하다. 지금까지 국제적으로 밝혀진 BRCA1, 2 유전자의 뉴클레오티드 상의 돌연변이를 포함하는 변이양상은 데이터베이스화되어 인터넷상에서 접근 가능하다(Breast Cancer Information Core : http://www.nhgri.nih.gov/ Intramural_research/Lab_transfer/Bic/).
BRCA1, BRCA2 유전자의 돌연변이 유무를 분석하는 것은 유방암 및 난소암의 발병 위험성을 조기에 진단함으로써, 좀 더 적극적인 예방 프로그램을 수행하여 발병 위험성을 최소화 할 수 있는 장점이 있다. 그러나 BRCA1, BRCA2의 돌연변이 형태는 매우 다양하고, 특정 부위에 선택적으로 나타나지 않는 관계로, 전체 엑손 및 엑손/인트론 경계부위를 모두 분석하여야 하는 어려움이 있다.
따라서, 많은 수의 유방암 환자 샘플을 분석함으로써, BRCA 유전자상에 존재하는 돌연변이 형태를 파악하게 되면, 향후 샘플 분석시 모든 엑손을 분석하지 않고 돌연변이가 존재할 것으로 예상되는 BRCA 절편만 분석하여도 전체 엑손을 분석하는 것과 동일한 효과를 도출할 수 있게 된다. 그러므로, 많은 관련 회사 및 연구기관에서는 BRCA1, BRCA2 유전자를 분석하여 유용한 단일염기다형성 및 돌연변이를 발굴하고자 하고 있으며, 이는 향후 진단마커로 활용될 수 있을 뿐 아니라, 더 나아가 DNA 칩(Chip) 개발에 필수적인 칩 컨텐츠(Chip Contents)로도 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 지금까지 밝혀지지 않았던, 한국인 유방암, 난소암 환자의 BRCA1, BRCA2 유전자의 돌연변이 및 단일염기다형성을 발굴함으로써, 유방암 및 난소암 발병의 소인을 진단하는데 이용하고자 하는바 발명의 목적을 두고 있다.
도 1은 BRCA1 유전자의 875번째 뉴클레오티드(엑손 11에 위치)인 T가 C로 치환된 돌연변이의 F-CSGE 분석 그래프이고;
도 2는 BRCA2 유전자의 2485번째 뉴클레오티드(엑손 11에 위치)인 T가 결손된 돌연변이의 F-CSGE 분석 그래프이고;
도 3은 BRCA1 유전자의 1041∼1043번째 뉴클레오티드(엑손 11에 위치)인 AGC가 결손되고 그 위치에 T가 삽입된 돌연변이의 F-CSGE 분석 그래프이고;
도 4는 BRCA2 유전자의 인트론 4상의 67번째 뉴클레오티드인 A가 T로 치환된 돌연변이의 F-CSGE 분석 그래프이다.
본 발명에서 돌연변이(Mutation) 및 다형성(Polymorphism)을 표현하는데 사용된 용어들의 정의는 다음과 같다.
IVS는 Intervening Sequence, 즉 인트론을 의미한다. 돌연변이의 정의에 있어 표시되는 숫자는 BRCA1, BRCA2 유전자의 염기서열상에서 돌연변이가 시작된 위치를 의미하며, IVS 문자가 표시되지 않은 돌연변이의 숫자는 인트론(Intron) 염기서열을 제외한 mRNA의 염기서열상의 위치를 의미한다. 본 발명에서 염기서열상의 위치를 설명하는 숫자는 GenBank Accession번호 U14680(BRCA1의 경우), U43746(BRCA2의 경우)상의 염기서열을 참조하여 표시하였다. GenBank Accession 번호에 따라 BRCA1, BRCA2 돌연변이의 표기가 달라질 수 있다.
본 발명은 모든 정상 BRCA1, BRCA2 유전자의 염기서열에 적용된다. 삽입(insertion) 돌연변이는 "ins"으로 표시하고, 결손(deletion) 돌연변이는 "del"로 표시하였다. "ins"과 "del" 다음의 문자는 실제 삽입 또는 결손된 뉴클레오티드(nucleotide)들을 의미한다. 뉴클레오티드가 치환(substitute)된 돌연변이를 표시할 때 기호 ">"를 사용하였는데, ">"앞의 문자는 정상 BRCA1, BRCA2 유전자의 뉴클레오티드이며, ">" 뒤의 문자는 돌연변이 BRCA1, BRCA2 유전자의 뉴클레오티드이다. 그리고, ">" 뒷의 X는 ">" 앞의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환되어 종결코돈(stop codon)이 생겨, 숫자 뒤의 염기서열이 코딩하는 아미노산이 결손되었음을 의미한다.
우선, 본 발명은 정상(normal) 또는 돌연변이(mutant) BRCA1 유전자에 결합(hybridize)하는 하기 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)에 관한 것이다:
(1) BRCA1 유전자의 875번째 뉴클레오티드인 T가 C로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 875번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(2) BRCA1 유전자의 1041∼1043번째 뉴클레오티드인 AGC가 결손되고 대신 그 위치에 T가 삽입되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 1041∼1043번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(3) BRCA1 유전자의 3033번째 뉴클레오티드인 G가 T로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 3033번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(4) BRCA1 유전자의 3860번째 뉴클레오티드인 T가 C로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 3860번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(5) BRCA1 유전자의 4277번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 4277번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(6) BRCA1 유전자의 5187번째 뉴클레오티드인 A가 C로 치환되어 있는 것을검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 5187번째 유전자를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(7) BRCA1 유전자의 5333번째 뉴클레오티드인 A가 G로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 5333번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(8) BRCA1 유전자의 5564번째 뉴클레오티드인 G가 A로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 5564번째 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(9) BRCA1 유전자의 5615∼5625번째 유전자가 모두 결손되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 5615∼5626번째 유전자를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드; 및,
(10) BRCA1 유전자의 5133~5135번째 유전자가 모두 결손되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 5133~5135번째 유전자를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드.
상기 첫 번째 돌연변이는 BRCA1에 나타난 875 T>C로서, 252번째 아미노산인 아르기닌(Arginine)을 코딩하는 코돈에서 T 뉴클레오티드가 C로 바뀌었으므로, 아미노산은 변하지가 않는 싸일런트(silent) 돌연변이다. 본 돌연변이의 결과에 대해 정확히 확인되지는 않았지만, mRNA의 이차구조의 변화를 초래하여, 스플라이싱(splicing) 및 BRCA1 유전자의 변화양상에 변화를 유발할 수 있으며 조절 단백질의 유전자에 대한 결합 친화도에 변화가 올 수도 있다고 본다.
상기 두 번째 돌연변이는 BRCA1에 나타난 1041 delAGCinsT로서, 1041번째부터 1043번째 뉴클레오티드가 결손되고 그 위치에 티민(T) 뉴클레오티드가 삽입되어, 308번째 아미노산인 세린(Serine)을 코딩하는 코돈이 종결코돈(Stop codon)으로 바뀌게 된다. 그 결과, 단백질 결손이 생겨 기능이 없는 BRCA1 단백질이 만들어지게 된다.
상기 세 번째 돌연변이는 BRCA1에 나타난 3033G>T로서, 3033번째 뉴클레오티드인 G가 T로 치환되어, 972번째 아미노산인 글리신(Glycin)을 코딩하는 코돈이 종결코돈으로 바뀌게 된다. 그 결과, 단백질 결손이 생겨 기능이 없는 BRCA1 단백질이 만들어지게 된다.
상기 네 번째 돌연변이는 BRCA1에 나타난 3860 T>C로서, 3860번째 뉴클레오티드인 T가 C로 치환되지만, 1247번째 아미노산인 글리신에는 변화가 일어나지 않는 싸일런트 돌연변이다. 본 돌연변이의 결과에 대해 정확히 확인되지는 않았지만, mRNA의 이차구조에 변형을 초래하여, 스플라이싱 및 BRCA1 유전자의 발현양상에 변화를 초래할 수 있으며, 조절 단백질의 유전자에 대한 결합 친화도에 변화가 올 수도 있다고 보인다.
상기 다섯 번째 돌연변이는 BRCA1에 나타난 4277 C>T로서, 4277번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환되지만, 1386번째 아미노산인 세린(Serine)에는 변화가 없는 싸일런트 돌연변이이다. 본 돌연변이의 결과에 대해 정확히 확인되지는 않았지만, mRNA의 이차구조에 변형을 초래하여, 스플라이싱 및 BRCA1 유전자의 발현양상에 변화를 초래할 수 있으며, 조절 단백질의 유전자에 대한 결합 친화도에 변화가 올 수도 있다고 보인다.
상기 여섯 번째 돌연변이는 BRCA1에 나타난 5187A>C로서, 5187번째 뉴클레오티드인 A가 C로 치환되어, 1690번째 아미노산인 리신(Lysine)이 글루타민 (Glutamine)으로 치환된다. 그 결과, 정상 BRCA1과는 다른 아미노산 서열이 얻어지는데, 모든 종류의 아미노산 치환은 BRCA1 단백질의 생체내 기능을 변화시킬 수 있으며, 특히 리신은 산성(acidic)이며 글루타민은 염기성(basic) 아미노산이므로, 글루타민은 정상적인 BRCA1 단백질의 기능을 방해한다.
상기 일곱 번째 돌연변이는 BRCA1에 나타난 5333 A>G로서, 5333번째 뉴클레오티드인 A가 G로 치환되지만, 1738번째 아미노산인 글리신에는 변화가 없는 싸일런트 돌연변이이다. 본 돌연변이의 결과에 대해 정확히 확인되지는 않았지만, mRNA의 이차구조에 변형을 초래하여, 스플라이싱 및 BRCA1 유전자의 발현양상에 변화를 초래할 수 있으며, 조절 단백질의 유전자에 대한 결합 친화도에 변화가 올 수도 있다고 보인다.
상기 여덟 번째 돌연변이는 BRCA1에 나타난 5564G>A로서, 5564번째 뉴클레오티드인 G가 A로 치환되어, 1815번째 아미노산인 트립토판(Tryptophan)을 코딩하는 코돈이 종결코돈으로 바뀐다. 그 결과, 단백질 결손이 생겨 기능이 없는 BRCA1 단백질이 만들어지게 된다.
상기 아홉 번째 돌연변이는 BRCA1에 나타난 5615del11로서, 5615번째로부터 5625번째 뉴클레오티드까지 총 11개의 뉴클레오티드가 결손되어, 1839번째 코돈이 종결코돈으로 바뀌고, 그 결과, 단백질 결손이 생겨 기능이 없는 BRCA1 단백질이만들어지게 된다.
상기 열 번째 돌연변이는 BRCA1에 나타난 5133delCAC로서, 5133번째부터 5135번째 뉴클레오티드까지 세 개의 염기가 결손되어, 1672번째 아미노산인 히스티딘(Histidine)이 결손된다. 그 결과, 정상 BRCA1과는 다른 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 BRCA1 단백질이 만들어지게 되므로 정상적인 기능을 할 수 없다.
본 발명은 또한 정상 또는 돌연변이 BRCA2 유전자에 결합하는 하기 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:
(1) BRCA2 유전자의 인트론 4상의 67번째 뉴클레오티드인 A가 C로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 인트론 4상의 67번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(2) BRCA2 유전자의 인트론 8상의 56번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환되어있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 인트론 8상의 56번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(3) BRCA2 유전자의 1590번째 뉴클레오티드인 A가 G로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 1590번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(4) BRCA2 유전자의 1923번째 뉴클레오티드인 C가 A로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 1923번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(5) BRCA2 유전자의 2485번째 뉴클레오티드인 T가 결손되어있는 것을 검출할수 있는, BRCA2 유전자의 2485번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(6) BRCA2 유전자의 2718번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA 2 유전자의 2718번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(7) BRCA2 유전자의 4562번째 뉴클레오티드인 A가 C로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 4562번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(8) BRCA2 유전자의 6319번째 뉴클레오티드인 A가 G로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 6319번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
(9) BRCA2 유전자의 인트론 11 상의 9번째 뉴클레오티드인 T가 C로 치환되어있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 IVS11-9번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드; 및,
(10) BRCA2 유전자의 인트론 14상의 10번째 뉴클레오티드인 G가 C로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 인트론 14상의 10번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드.
상기 첫 번째 돌연변이는 BRCA2에 나타난 IVS4+67 A>C로서, IVS4+67위치의 뉴클레오티드인 A가 C로 치환된 것이며, 엑손(Exon)이 아닌 인트론(Intron) 부위에 나타난 돌연변이이다. 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로 아미노산 서열에는변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성차이 때문에 BRCA2 발현양상의 변화를 초래 할 수 있다.
상기 두 번째 돌연변이는 BRCA2에 나타난 IVS8+56 C>T로서, IVS8+56위치의 뉴클레오티드인 C가 T로 치환된 것이며, 엑손이 아닌 인트론 부위에 나타난 돌연변이이다. 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성차이 때문에 BRCA2 발현양상의 변화를 초래할 수 있다.
상기 세 번째 돌연변이는 BRCA2에 나타난 1590A>G로서, 1590번째 뉴클레오티드인 A가 G로 치환되었지만, 454번째 아미노산인 리신(Lysine)에는 변화가 없는 싸일런트 돌연변이다. 본 돌연변이의 결과에 대해 정확히 확인되지는 않았지만, mRNA의 이차구조에 변형을 초래하여, 스플라이싱 및 BRCA1 유전자의 발현양상에 변화를 초래할 수 있으며, 조절 단백질의 유전자에 대한 결합 친화도에 변화가 올 수도 있다고 보인다.
상기 네 번째 돌연변이는 BRCA2에 나타난 1923C>A로서, 1923번째 뉴클레오티드인 C가 A로 치환되었지만, 565번째 아미노산인 알라닌(Alanine)에는 변화가 없는 싸일런트 돌연변이이다. 본 돌연변이의 결과에 대해 정확히 확인되지는 않았지만, mRNA의 이차구조에 변형을 초래하여, 스플라이싱 및 BRCA2 유전자의 발현양상에 변화를 초래할 수 있으며, 조절 단백질의 유전자에 대한 결합 친화도에 변화가 올 수도 있다고 보인다.
상기 다섯 번째 돌연변이는 BRCA2에 나타난 2485delT로서, 2485번째 뉴클레오티드인 T가 결손되어, 771 번째 코돈이 종결코돈으로 바뀌게 된다. 그 결과, 단백질 결손이 생겨 기능이 없는 BRCA2 단백질이 만들어지게 된다.
상기 여섯 번째 돌연변이는 BRCA2에 일어난 2718 C>T로서, 2718번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환되었지만, 830번째 아미노산인 아스파라진(Asparagine)에는 변화가 없는 싸일런트 돌연변이이다. 본 돌연변이의 결과에 대해 정확히 확인되지는 않았지만, mRNA의 이차구조에 변형을 초래하여, 스플라이싱 및 BRCA2 유전자의 발현양상에 변화를 초래할 수 있으며, 조절 단백질의 유전자에 대한 결합 친화도에 변화가 올 수도 있다고 보인다.
상기 일곱 번째 돌연변이는 BRCA2에 나타난 4562 A>C로서, 4562번째 뉴클레오티드인 A가 C로 치환되어, 1145번째 아미노산인 리신이 트레오닌(Threonine)으로 바뀌므로, 정상 BRCA2와는 다른 아미노산 서열을 갖게 되는데, 모든 종류의 아미노산 치환은 BRCA2 단백질의 생체내 기능을 변화시킬 수 있으며, 리신은 염기성 아미노산이며 트레오닌은 친수성 성질이 강하므로, 두 아미노산의 특성이 서로 달라 BRCA2 단백질의 기능에 차이가 생기게 될 가능성이 매우 높다.
상기 여덟 번째 돌연변이는 BRCA2에 나타난 6319A>G로서, 6319번째 뉴클레오티드인 A가 G로 치환되어, 2031번째 아미노산인 트레오닌(Threonine)이 알라닌(Alanine)으로 바뀌므로, 정상 BRCA2와는 다른 아미노산 서열을 갖게 되는데, 트레오닌은 구조적으로 측쇄에 히드록실기를 가지고 있어서 친수성 특징을 띠고 있다. 그러나, 알라닌은 지방족(Aliphatic) 측쇄를 가지고 있으므로 소수성 특성을 띠는 아미노산이다. 이렇게 화학적 성질이 다른 아미노산으로의 변화는 기능이 없는 BRCA2를 만들어 낼 수 있다.
상기 아홉 번째 돌연변이는 BRCA2에 나타난 IVS11-9 T>C로서, IVS11-9번째 뉴클레오티드인 T가 C로 치환된 것이며, 엑손이 아닌 인트론 부위에 나타난 돌연변이이다. 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로 아미노산 서열에는 변화가 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성차이 때문에 BRCA2의 발현양상에 변화를 초래할 수 있다.
상기 열 번째 돌연변이는 BRCA2에 나타난 IVS14+10 G>C로서, IVS14+10번째 뉴클레오티드인 G가 C로 치환된 것이며, 엑손이 아닌 인트론 부위에 나타난 돌연변이이다. 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로 아미노산서열의 변화는 없으나, 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성차이 때문에 BRCA2의 발현양상에 변화를 초래할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 돌연변이의 BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자에 포함하고 있는 사람은 유방암 및/또는 난소암의 발생가능성이 높은 것으로 나타났다.
그러한 돌연변이 여부의 확인하기 위해서는, 예를 들어, 혈액과 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 생물학적 샘플로부터 상기 BRCA1 및/또는 BRCA2가 상기 돌연변이들을 포함하고 있는지를 확인함으로써 실행될 수 있다. BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자를 증폭하기 위하여, 예를 들어, 엑손의 단부나 엑손에 붙어있는 인트론의 단부에 결합(hybridize)하는 프라이머(primer)를 사용하는 PCR법을 사용할 수 있다. 인트론에서의 돌연변이를 검출하기 위하여, 특히 엑손에 인접한 부분의 인트론을 증폭하는 프라이머를 사용할 수도 있다.
한편, PCR법 등에 의해 증폭된 유전자에서 돌연변이를 검색할 수 있는 분자생물학 기법은 많은데, 그 중 가장 대표적인 것이 형질특이적 올리고뉴클레오티드(ASO: Allele Specific Oligonucleotide)를 이용하는 방법이다. ASO는 돌연변이 및 그 주변 염기서열을 포함하거나 또는 이에 상보적인 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드로서, 인간 게놈 DNA에 특이적으로 결합시켜 그 결합 양상을 분석함으로써, 알려진 돌연변이 유무를 탐지해낼 수 있다. 이러한 ASO는 보통 15 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성되어 있고, 방사선 표지(radio label), 형광 표지(fluorescent label), 효소 표지(enzymatic label), 시퀀스 택(sequence tag), 바이오틴(biotin), 기타 리간드 등과 같이 당업계에 공지된 기술에 의해 표지될 수 있다.
따라서, 본 발명은 하나의 예로서 본 명세서상의 서열 3 내지 서열 42로 구성된 군에서 선택된 형질특이적 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
서열 3과 서열 4는 BRCA1 유전자의 875 T>C 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 형질특이적 올리고뉴클레오티드로서, 전자는 정상인 서열에 우선적으로 결합하는 서열로서 대조 서열(control)이고, 후자는 상기 돌연변이 서열에 우선적으로 결합한다.
서열 5와 서열 6은 BRCA1 유전자의 1041 delAGCinsT 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 7과 서열 8은 BRCA1 유전자의 3033G>T 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 9와 서열 10은 BRCA1 유전자의 3860 T>C 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 11과 서열 12는 BRCA1 유전자의 4277 C>T 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 13과 서열 14는 BRCA1 유전자의 5187A>C 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 15와 서열 16은 BRCA1 유전자의 5333 A>G 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 17과 서열 18은 BRCA1 유전자의 5564G>A 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 19와 서열 20은 BRCA1 유전자의 5615del11 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 21과 서열 22는 BRCA1 유전자의 5133delCAC 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 23과 서열 24는 BRCA2 유전자의 IVS4+67 A>C 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 25와 서열 26은 BRCA2 유전자의 IVS8+56 C>T 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 27과 서열 28은 BRCA2 유전자의 1590A>G 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 29와 서열 30은 BRCA2 유전자의 1923C>A 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 31과 서열 32는 BRCA2 유전자의 2485delT 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 33과 서열 34는 BRCA2 유전자의 2718 C>T 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 35와 서열 36은 BRCA2 유전자의 4562 A>C 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 37과 서열 38은 BRCA2 유전자의 6319A>G 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 39와 서열 40은 BRCA2 유전자의 IVS11-9 T>C 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
서열 41과 서열 42는 BRCA2 유전자의 IVS14+10 G>C 돌연변이에 관한 것으로서 상기와 동일하다.
이들 형질특이적 뉴클레오티드는 유방암 또는 난소암의 위험성이 높은 사람을 진단하는데 유용하다. 이들 형질특이적 올리고뉴클레오티드는 상기 특정 돌연변이 유전자를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드에 결합한다.
또한, 본 발명은 또다른 예로서 본 명세서상의 서열 43 내지 서열 78로 구성된 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 프라이머(primer)를 제공한다. 이들 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머는 타겟 폴리뉴클레오티드의 증폭에 유용하며,그로부터 얻어진 서열 정보로부터 상기 돌연변이의 확인을 위한 상기 탐침(probe)들이 제작될 수 있다.
서열 43 내지 서열 78에서 각각 2개씩 순차적으로 한 쌍을 이루고 있는 서열들은 전방향(forward) 프라이머와 역방향(reverse) 프라이머로서, 예를 들어, 홀수 번째 서열인 서열 65가 전방향 프라이머이고 뒤따르는 짝수 번째 서열인 서열 66이 역방향 프라이머이다.
서열 43과 서열 44는 BRCA1의 875T>C 돌연변이 및/또는 1041delAGCinsT 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 11-1을 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 45와 서열 46은 BRCA1의 3033G>T 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 11-7을 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 47과 48은 BRCA1의 3860T>C 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 11-9를 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 49와 50은 BRCA1의 4277C>T 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 12를 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 51과 52는 BRCA1의 5133delCAC 돌연변이 및/또는 5187A>C 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 17을 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 53과 54는 BRCA1의 5333A>G 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 20을 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 55와 56은 BRCA1의 5564G>A 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 23을 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 57과 58은 BRCA1의 5615del11bp 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 24를 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 59와 60은 BRCA2의 IVS4+67A>C 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 4를 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 61과 62는 BRCA2의 IVS8+56C>T 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 인트론 8 일부분 및 엑손 8을 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 63과 64는 BRCA2의 1590A>G 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 10-2를 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 65와 66은 BRCA2의 1923C>A 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 10-3을 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 67과 68은 BRCA2의 2485delT 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 11-2을 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 69와 70은 BRCA2의 2718C>T 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 11-3을 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 71과 72는 BRCA2의 4562A>C 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 11-8을 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 73과 74는 BRCA2의 6319A>G 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 엑손 11-14를 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 75와 76은 BRCA2의 IVS11-9T>C 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 인트론 11 일부 및 엑손 11를 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
서열 77과 78은 BRCA2의 IVS14+10G>C 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드인 인트론14 일부 및 엑손 14를 증폭하는데 사용되는 한 쌍의 프라이머이다.
본 발명은 또한 상기와 같은 돌연변이 유전자가 배열되어 있는 DNA 칩에 관한 것으로서, 그러한 DNA 칩은,
고상 칩과, n개의 다른 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드로 구성되어 있으며,
상기 "n"은 1 이상의 정수이고, 상기 올리고뉴클레오티드는 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 효과적으로 결합할 수 있게 고상 칩에 고정되어 있으며,
다른 뉴클레오티드 서열을 가진 상기 올리고뉴클레오티드는 서로 다른 위치로서 상기 고상 칩에 고정되어 있어서, 상기 고상 칩상의 특정 위치가 특정한 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 독점적으로 결합하고,
상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 앞서 설명한 돌연변이 유전자를 포함하는 올리고뉴클레오티드인 것으로 되어있다.
본 발명은 또한 앞서 설명한 돌연변이 유전자를 이용하여 사람에 있어서 유방암 또는 난소암의 소인(predisposition) 또는 높은 감수성(susceptibility)을 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 유방암 및 난소암의 발병위험성을 진단하는데 있어 유용하게 사용될 수 있는 BRCA1, BRCA2 유전자의 돌연변이의 존재유무를 확인하는 방법은 이하의 실시예에 상세히 설명되어있는 F-CSGE를 수행한 후 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 확인하는 기술이외에 하기와 같이 여러 가지 방법들이 있다.
(가) 엑손 및 인트론 경계부분을 포함하는 타겟 절편들을 각각 한 쌍의 프라이머로 증폭하여 F-CSGE를 수행하지 않고, 바로 다이디옥시 반응을 통한 시퀀싱으로 돌연변이의 존재유무를 확인 할 수 있다. 이 경우 본 발명의 상기 돌연변이가 일어난 부위 및 이를 포함하는 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 탐침을 쓰지 않고, 바로 돌연변이의 존재유무를 확인할 수 있다. 또는 BRCA1, BRCA2를 클로닝하여 벡터에 삽입한후 시퀀싱을 수행 할 수도 있다. 이 경우 정상 BRCA1, BRCA2유전자의 염기서열과 시퀀싱 결과를 서로 비교하여 돌연변이의 존재유무를 알 수 있다.
(나) 돌연변이 존재 유무를 확인하는 또 다른 방법으로는 제한효소절단법이 있다. 이는 BRCA1, BRCA2 유전자의 정상유전자와 돌연변이 유전자의 염기서열이 서로 다르다는 점에 착안하여, 적당한 제한효소 또는 제한효소와 동일한 결과를 도출하는 화합물을 이용하여 정상유전자는 절단되고, 돌연변이 유전자는 절단되지 않거나, 역으로 정상유전자는 절단되지 않고, 돌연변이 유전자는 절단되는 원리를 이용하는 방법이다.
(다) 또다른 방법으로서 SSCP(Single Strand Conformation Sensitive Polymorphsim)는 유전자의 절편중 단쇄(Single Strand)를 분석하여 돌연변이 유무를 분석할 수 있다. 이는 돌연변이의 유무에 따라서 단쇄의 이중구조가 다르다는점에 착안하여 전기영동 또는 이와 유사한 결과를 도출할 수 있는 시스템을 이용하여 진단에 이용할 수 있다.
(라) 또다른 방법으로서 이형이중가닥(Heteroduplex) 분석법은 이형이중가닥을 생성시켜 이를 ABI377과 같은 장비를 이용하여 분석하는 방법이다. 이와 유사한 방법으로는 생성된 이형이중가닥을 2-D로 분리하는 TDGS(Two-Dimensional Gene Scanning)와 D-HPLC, DGGE 등이 있으며, 이들 모두 본 발명의 돌연변이들의 존재유무를 확인하는데 이용될 수 있다.
(마) 또다른 방법으로서 프라이머 연장(Primer Extension) 분석법은 돌연변이의 유무를 확인하고자 할 때, 돌연변이가 일어날 수 있는 유전자상의 염기위치의 5' 방향에 선택적으로 결합하는 프라이머를 제작하여 부착시킨 후, 중합효소를 이용하여 프라이머를 연장시켜 돌연변이의 유무를 확인하는 방법이다.
본 발명은 또한 상기 BRCA1 및/또는 BRCA2 돌연변이에 기인한 유방암 및/또는 난소암 진단용 키드(kit)에 관한 것으로서, 하나 이상의 컨테이터 수단(container means)과, 그러한 하나 이상의 컨테이너 수단을 밀폐된 공간내에 수용하도록 구획(compartment)되어 있는 캐리어 수단(carrier means)으로 구성되어 있으며, 적어도 하나의 컨테이너 수단에는 상기 돌연변이 유전자를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 내포하고 있다.
이하 실시예를 참조하여 본 발명의 구체적인 내용을 설명하지만 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다.
(실시예)
(1) 게놈 DNA의 분리
유방암 및 난소암 환자의 게놈 DNA는 200 ㎕ EDTA-말초혈액으로부터 QIAamp DNA Mini Kit(Cat. No. 13323)을 이용하여 분리하였다. 4㎍의 게놈 DNA를 추출할 수 있었다.
(2) 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통한 BRCA1, BRCA2 유전자의 증폭
중합효소연쇄반응은 다중(multiplex) 방법으로 실행하였다. 이는 각 PCR 단위 튜브에 동일한 템플레이트(template)를 넣고, 프라이머 쌍을 한 가지가 아닌 이중(duplex), 삼중(triplex) 또는 사중(quadraplex)로 조합을 만들어 수행하는 방법이다. 이는 중합효소연쇄반응에 소요되는 비용을 1/3 수준으로 절감하는 효과가 있다. BRCA1과 BRCA2는 엑손의 개수가 매우 많은 거대 유전자이다. 특히 BRCA1의 엑손11은 그 크기가 매우 커서 한 쌍의 프라이머를 가지고 중합효소연쇄반응을 할 수 없는 관계로, 총 10개의 중복절편으로 나누어 열 쌍의 프라이머로 증폭하였다. 본 명세서에서는 각각의 10개 중복절편을 엑손 11-1, 11-2, 11-3, 11-4, 11-5, 11-6, 11-7, 11-8, 11-9, 11-10이라 명명하였다. BRCA2는 엑손 10, 엑손 11 및 엑손 27의 크기가 크기 때문에, 엑손 10은 10-1, 10-2, 10-3, 10-4로 나누고, 엑손 11은 11-1, 11-2, 11-3, 11-4, 11-5, 11-6, 11-7, 11-8, 11-9, 11-10, 11-11, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15로 나누었으며, 엑손 27은 27-1, 27-2로 나누어 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 그 결과, BRCA1과 BRCA2는 총 75개의 절편으로 증폭하였으며, 표 1에서 개시한 바와 같이 25개의 다중 중합효소연쇄반응을 통해 증폭하였다. 각 중합효소연쇄반응 산물은 20bp의 전방향 및 역방향 프라이머(올리고뉴클레오티드)염기서열과 최소 40bp의 5'-, 3'-flanking region을 포함하도록 디자인하였다. 다중 PCR 구성조합은 표 2에 표시한 바와 같다.
NO Multiplex Exon
1 Duplex 11.2, 23
2 Triplex 11.7, 19, 24
3 Triplex 2, 11.1, 14
4 Triplex 11.3, 17, 21
5 Triplex 12, 15, 16
6 Triplex 3, 11.8, 22
7 Triplex 7, 10, 11.5
8 Triplex 5, 11.3, 9
9 Quadraplex 6, 11.6, 18, 20
10 Quadraplex 8, 9, 11.4, 11.10
NO Multiplex Exon
11 Duplex 5, 6, 11.6
12 Triplex 2, 10.2, 11.2
13 Triplex 11.7, 13, 20
14 Triplex 9, 10, 3, 14.3
15 Triplex 3, 11.1, 24
16 Triplex 4, 11.13, 25
17 Triplex 10.1, 10.4, 23
18 Triplex 7, 11.10, 16
19 Triplex 11.8, 17, 27.1
20 Triplex 11.3, 11.11, 15
21 Triplex 11.14, 11.9, 14.1
22 Triplex 8, 11.5, 26
23 Triplex 11.4, 11.9, 14.1
24 Triplex 18, 21, 27.2
25 Triplex 11.5, 11.12, 12
성 분 부피(㎕)
10X Taq-buffer (without MgCl2) 1.5
MgCl2 1.5
Primer Mix 4
dNTP´s (25mM each) 2
Taq Polymerase 0.4
DNA(게놈 DNA) 1
DDW 4.6
Total volume 15
(3) F-CSGE(Fluorescence Conformation Sensitive Gel Electrophoresis)
F-CSGE는 유전자 염기서열상에 존재하는 유전자변이를 검색하는데 이용되는 방법이다. 유전자 상에 돌연변이가 존재할 경우, 돌연변이 대립형질과 정상 대립형질을 이형이중가닥(heteroduplex)화시킬 수 있다. 그 결과, DNA 이중쇄(double strand)의 3차 구조모양을 서로 다르게 만듦으로써 전기영동시 이동속도의 차이가 생기는 점을 이용하여, 돌연변이를 검색할 수 있었다.
중합효소연쇄반응 산물은 0.2㎜ 두께의 12% 폴리아크릴아마이드 겔(99:1 ratio of acrylamide (BioRad) to 1,4bis-(acryloyl)piperazine(BAP, Fluka, Deisenhofen, Germany), 15% 포름아마이드(v/v))에서 1 X TBE 버퍼상에서 전기영동 하였다. 전기영동은 40℃, 2,000V에서 5시간 실시하였으며, 각 레인마다 한가지 종류의 다중 중합효소 연쇄반응 산물을 분석하였다.(Loading Mixture의 성분 : TAMRA가 부착된 Size Standard, 0.5㎕, 이온이 제거된 포름아마이드, 0.5㎕). 데이타 분석은 진스켄 및 제노타이퍼(PE Biosystems) 소프트웨어를 이용하였다. 도 1 내지 도 4에 개시되어 있는 바와 같이, 돌연변이가 있는 유전자와 돌연변이가 없는 유전자는 F-CSGE를 통해 나타난 분석결과가 상이한 양상을 보이므로, F-CSGE상에서의 분석결과가 다른 DNA는 DNA 시퀀싱을 통해 그 변이 유무를 최종 분석하였다.
(4) DNA 염기서열분석
F-CSGE분석을 통해 나타난 돌연변이 및 SNP의 존재가 예상되는 중합효소연쇄반응 산물은 F-CSGE 분석에 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 다시 증폭하였으며, ABI3700 시퀀서(Sequencer)에서 POP6 겔을 이용하여 분석하였다. 그 결과 F-CSGE를 통해 돌연변이가 존재하는 것으로 파악된 DNA 절편상의 구체적인 돌연변이 양상을 분석하였다.
도 1은 BRCA1유전자의 엑손 11-1을 분석한 결과를 설명하는 도면으로서, F-CSGE 결과 확연한 그래프 모양의 차이를 보였으며, 시퀀싱 결과 875번째 뉴클레오티드인 T가 C로 치환되었음을 알 수 있었다. 도 2는 BRCA2유전자의 엑손 11-2를 분석한 결과를 설명하는 도면으로서, F-CSGE 결과 확연한 그래프 모양의 차이를 보였으며, 시퀀싱 결과 2485번째 뉴클레오티드인 T가 결손되었음을 알 수 있었다. 도 3은 BRCA1 유전자의 엑손 11-1을 분석한 결과를 설명하는 도면으로서, F-CSGE 결과 확연한 그래프 모양의 차이를 보였으며, 시퀀싱 결과 1041번째 뉴클레오티드인 AGC가 결손되고 그 위치에 T가 삽입되었음을 알 수 있었다. 도 4는 BRCA2 유전자의 인트론 4를 분석한 결과를 설명하는 도면으로서, F-CSGE 결과 확연한 그래프 모양의 차이를 보였으며, 시퀀싱 결과 67번째 뉴클레오티드인 A가 T로 치환되었음을 알 수 있었다.
지금까지 한국인을 대상으로 한 유방암 및 난소암을 유발하는 유전자인 BRCA1, BRCA2 유전자의 염기서열상에 존재하는 돌연변이에 대한 검색은 거의 전무한 실정이었으며, BRCA1, 2 전체를 시퀀싱하여 돌연변이의 유무를 검색하는 것은 많은 시간과 비용이 소요되는 단점이 있으나, 본 발명을 통해 한국인에 특이적인 돌연변이 형태를 밝힘으로써, 향후 저비용, 고효율적으로 유방암 및 난소암의 소인을 진단하는데 있어 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Claims (11)

  1. 정상 또는 돌연변이 BRCA1 유전자에 결합(hybridize)하는 하기 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드:
    (1) BRCA1 유전자의 875번째 뉴클레오티드인 T가 C로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 875번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (2) BRCA1 유전자의 1041∼1043번째 뉴클레오티드인 AGC가 결손되고 대신 그 위치에 T가 삽입되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 1041∼1043번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (3) BRCA1 유전자의 3033번째 뉴클레오티드인 G가 T로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 3033번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (4) BRCA1 유전자의 3860번째 뉴클레오티드인 T가 C로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 3860번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (5) BRCA1 유전자의 4277번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 4277번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (6) BRCA1 유전자의 5187번째 뉴클레오티드인 A가 C로 치환되어 있는 것을검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 5187번째 유전자를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (7) BRCA1 유전자의 5333번째 뉴클레오티드인 A가 G로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 5333번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (8) BRCA1 유전자의 5564번째 뉴클레오티드인 G가 A로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 5564번째 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (9) BRCA1 유전자의 5615∼5625번째 유전자가 모두 결손되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 5615∼5626번째 유전자를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드; 및,
    (10) BRCA1 유전자의 5133~5135번째 유전자가 모두 결손되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA1 유전자의 5133~5135번째 유전자를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드.
  2. 정상 또는 돌연변이 BRCA2 유전자에 결합하는 하기 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드:
    (1) BRCA2 유전자의 인트론 4상의 67번째 뉴클레오티드인 A가 C로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 인트론 4상의 67번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (2) BRCA2 유전자의 인트론 8상의 56번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환되어있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 인트론 8상의 56번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (3) BRCA2 유전자의 1590번째 뉴클레오티드인 A가 G로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 1590번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (4) BRCA2 유전자의 1923번째 뉴클레오티드인 C가 A로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 1923번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (5) BRCA2 유전자의 2485번째 뉴클레오티드인 T가 결손되어있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 2485번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (6) BRCA2 유전자의 2718번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 2718번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (7) BRCA2 유전자의 4562번째 뉴클레오티드인 A가 C로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 4562번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (8) BRCA2 유전자의 6319번째 뉴클레오티드인 A가 G로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 6319번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드;
    (9) BRCA2 유전자의 인트론 11 상의 9번째 뉴클레오티드인 T가 C로 치환되어있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 인트론 11 상의 9번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드; 및,
    (10) BRCA2 유전자의 인트론 14상의 10번째 뉴클레오티드인 G가 C로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, BRCA2 유전자의 인트론 14상의 10번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는, 올리고뉴클레오티드.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 3 내지 서열 22로 구성된 군에서 선택된 형질특이적 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 23 내지 서열 42로 구성된 군에서 선택된 형질특이적 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드에 방사선 표지(radio label), 형광 표지(fluorescent label), 효소 표지(enzymatic label), 시퀀스 택(sequence tag), 바이오틴(biotin), 기타 리간드 등과 같이 당업계에 공지된 기술에 의해 표지하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  6. BRCA 1 유전자에 특이적으로 결합하는 서열 43 내지 서열 58로 구성된 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  7. BRCA 2 유전자에 특이적으로 결합하는 서열 59 내지 서열 78로 구성된 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  8. 고상 칩과, n개의 다른 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드로 구성되어 있으며,
    상기 "n"은 1 이상의 정수이고, 상기 올리고뉴클레오티드는 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 효과적으로 결합할 수 있게 고상 칩에 고정되어 있으며,
    다른 뉴클레오티드 서열을 가진 상기 올리고뉴클레오티드는 서로 다른 위치로서 상기 고상 칩에 고정되어 있어서, 상기 고상 칩상의 특정 위치가 특정한 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 독점적으로 결합하고,
    상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 제 1 항 또는 제 2 항의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  9. BRCA1 유전자의 875 T>C 돌연변이, 1041 delAGCinsT 돌연변이, 3033G>T 돌연변이, 3860 T>C 돌연변이, 4277 C>T 돌연변이, 5187A>C 돌연변이, 5333 A>G 돌연변이, 5564G>A 돌연변이, 5615del11 돌연변이나 5133delCAC 돌연변이 유전자의 존재 유무로 개인에게 있어서 유방암 및/또는 난소암의 소인(predisposition) 또는 높은 감수성(susceptibility)을 확인하는 방법.
  10. BRCA2 유전자의 IVS4+67 A>C 돌연변, IVS8+56 C>T 돌연변이, 1590A>G 돌연변이, 1923C>A 돌연변이, 2485delT 돌연변이, 2718 C>T 돌연변이, 4562 A>C 돌연변이, 6319A>G 돌연변이, IVS11-9 T>C 돌연변이나 IVS14+10 G>C 돌연변이 유전자의 존재 유무로 개인에게 있어서 유방암 및/또는 난소암의 소인(predisposition) 또는 높은 감수성(susceptibility)을 확인하는 방법.
  11. 하나 이상의 컨테이터 수단(container means)과, 그러한 하나 이상의 컨테이너 수단을 밀폐된 공간내에 수용하도록 구획(compartment)되어 있는 캐리어 수단(carrier means)으로 구성되어 있으며, 적어도 하나의 컨테이너 수단에는 제 10 항상의 돌연변이 유전자를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 내포하고 있는, 유방암 및/또는 난소암 진단용 키드.
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