KR100973049B1

KR100973049B1 - 사이토크롬 피450 2디6 유전자의 유전형 분석을 위한해플로타입 마커 단일염기변이 및 이를 이용한 유전자분석칩

Info

Publication number: KR100973049B1
Application number: KR1020070052764A
Authority: KR
Inventors: 신재국; 정현주; 김은영; 이상섭; 손지홍
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2006-09-11
Filing date: 2007-05-30
Publication date: 2010-07-29
Also published as: CN101522911A; CN101522911B; KR20080023622A

Abstract

본 발명은 사이토크롬 P450 2D6 유전자의 유전형 분석을 위한 일배체형 마커 단일염기변이(htSNP) 및 이를 이용한 유전자 칩에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 CYP2D6 유전자의 일배체형 분석을 위한 htSNP의 선별 방법 및 상기 htSNP를 이용하여 CYP2D6 유전자의 유전형을 결정하는 방법 및 이를 위한 유전형 분석칩에 관한 것이다.

본 발명의 방법을 이용하면 한국인의 CYP2D6 유전자의 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism; SNP)을 근거로 얻어진 htSNP를 이용하여 시간 및 비용 효율적으로 한국인과 유전적 특성이 유사한 일본 또는 중국 등의 아시아인종에서 발견되는 CYP2D6 유전자의 변이형을 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 이러한 아시아인의 CYP2D6 효소활성의 개인차나 CYP2D6 결핍에 의해 발생가능한 이상징후를 예측하는데도 유용하게 사용될 수 있다.

CYP2D6, 단일염기다형성, 일배체형, htSNP, 유전자 분석칩

Description

사이토크롬 피450 2디6 유전자의 유전형 분석을 위한 해플로타입 마커 단일염기변이 및 이를 이용한 유전자 분석칩 {htSNP FOR DETERMINING A GENOTYPE OF CYTOCHROME P450 2D6 GENE AND GENOTYPING CHIP USING THEREOF}

도 1 내지 도 6은 본 발명에서 선별된 htSNP 조합을 예시한 것이다.

도 7 및 8은 본 발명에서 선별된 htSNP 조합 중 한 종류에 대하여 스냅샷 (SNaPshot) 분석을 수행한 결과이다.

도 9는 유전자 분석칩을 이용하여 유전형을 분석하는 과정을 나타낸 것이다.

도 10은 유전자 분석칩상의 프로브를 나타낸 것이다.

도 11은 롱 (long) PCR을 이용하여 CYP2D6 유전자를 증폭하는 것을 나타낸 것이다.

도 12는 ASPE 반응 과정을 나타낸 것이다.

도 13은 실시예 3에 따라 CYP2D6 유전자의 변이를 분석한 결과를 나타내는 유전자 칩이다.

본 발명은 사이토크롬 P450 2D6 유전자의 유전형 분석을 위한 htSNP 및 이를 이용한 유전자 분석칩에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 CYP2D6 유전자의 일배체형 분석을 위한 htSNP의 선별 방법, 상기 htSNP를 이용하여 CYP2D6 유전자의 유전형을 결정하는 방법 및 이를 위한 유전자 분석칩에 관한 것이다.

개체간의 유전적 다양성은 약물의 독성 및 효능에 있어서 개체간 차이를 가져온다. 따라서, 약물 개발의 초기 단계에서 이와 같은 약제학적으로 중요한 단백질의 유전적 다양성에 대한 효과를 고려하는 것은 약물 개발의 실패에 대한 위험성을 낮출 수 있는 중요한 요소이다. 이러한 개체간 유전적 다양성을 측정하는 하나의 조사 집단이 되는 것이 "일배체형 (haplotype)"이다. 일배체형이란 하나의 조사 집단 내에 존재하는 각 유전자 서열의 다형성의 조합을 의미하며, 이것은 개별적인 다형성보다 유전적 다양성에 관한 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 정보를 제공한다.

한편, 인간 사이토크롬 P450은 약물, 발암원 및 독소와 같은 외래 화학물질과 스테로이드, 지방산 및 비타민과 같은 내부 기질의 산화를 촉진하는 헴단백질의 일원이다 (Nelson et al., Pharmacogenetics 6:1-42, 1996). 간을 포함하여 신장, 장관 및 폐와 같은 기관에서 다양한 사이토크롬 P450의 아형이 발견되었다. 이 중에서 인간 사이토크롬 P450 2D6 (Cytochrome P450 2D6, 이하 'CYP2D6'라 함) 유전 자는 22번째 염색체에 위치해 있으며, CYP2D6 유전자의 한쪽 면에는 유사 유전자(pseudogenes)인 CYP2D7과 CYP2D8이 위치해 있다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 효소는 정신활성약물 (psychoactive drugs), 심혈관계 약물, 모르핀계 약물 등 100여 가지 이상의 임상적으로 중요한 약물들을 대사하는 것으로 알려져 있다.

CYP2D6 유전자에 의해 코딩되는 효소는 간에서 주로 생산되며 사이토크롬 P450 효소의 총량의 약 2%를 차지하지만 30% 정도의 약물 대사에 관여하는 중요한 효소이다. 개체 내에서 상기 효소의 활성은 매우 다양하여 이들은 그 활성 정도에 따라 각각 PM (poor metabolizers), IM (intermediate metabolizers), EM (extensive metabolizers) 및 UM (ultrarapid metaboilzers) 군으로 분류되고 있다. 상기와 같이 효소의 활성이 각각 다르게 나타나는 것은 CYP2D6의 유전적 다형성에 의한 것이다. 현재, CYP2D6의 유전적 다형성은 약 80여 가지 이상으로 알려져 있으며 (www.imm.ki.se/cypalleles/cyp2d6.htm), 종족간의 뚜렷한 차이를 보이고 있다. 그런데, 이러한 유전자 변이와 일배체형에 대해 다양한 종류가 보고되어 있기 때문에 분석시간과 비용의 효율성을 증대하기 위해 최소한의 단일염기다형성 (SNP)을 통해 정확한 일배체형을 결정하는 것이 중요하다.

최근에 서양인에서 주로 발견되는 CYP2D6 유전자 변이를 중심으로 스냅샷 (SNaPshot) 분석을 이용하여 11개의 SNP을 분석하는 방법 (Sistonen J et al., Clin Chem. 2005 Jul;51(7):1291-5), 및 로슈사나 쥬리랩사의 CYP2D6 진단칩이 보고되었다. 그러나, 이들은 CYP2D6 변이 유전자의 조합이 서양인에서 발견되는 변이를 중심으로 이루어져 있을 뿐이므로, 한국인을 포함한 동양인에 대한 CYP2D6 유전 자 변이 진단에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다.

따라서, 한국인에서 주로 발견되는 CYP2D6 유전자의 일배체형 태그 SNP (haplotype tag SNP, 이하 'htSNP'라 함)를 선별하여 최소한의 표지 세트를 구성하고 이를 이용하여 CYP2D6 유전형을 결정할 수 있는 방법에 대한 개발이 절실히 요구되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 한국인에서 발견되는 CYP2D6 유전자의 일배체형을 분석할 수 있는 htSNP를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 htSNP를 이용하여 인간 CYP2D6 유전자의 유전형을 결정하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 유전자 분석칩을 포함하는 키트를 이용하여 인간 CYP2D6 유전자의 유전형을 결정하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 인간으로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 채취된 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 핵산을 주형으로 하고 인간 CYP2D6 유전자 또는 이의 단편을 증폭할 수 있는 프라이머로 PCR을 수행하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 얻은 PCR 산물의 염기서열에서 변이의 존재 유무를 확인하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계에서 변이가 존재하는 것으로 확인된 PCR 산물의 염기서열에서 일배체형 (haplotype)을 분석하는 단계; 및

(f) 상기 (e) 단계에서 분석된 일배체형의 염기서열을 SNP태거 (SNPtagger) 소프트웨어를 이용하여 분석하여 htSNP를 선별하는 단계를 포함하는, 인간 CYP2D6 유전자의 htSNP를 선별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 인간으로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 핵산을 주형으로 하고 인간 CYP2D6 유전자 또는 이의 단편을 증폭할 수 있는 프라이머로 PCR을 수행하는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계에서 얻은 PCR 산물의 염기서열에서 -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T 로 이루어진 군에서 하나; -1028T>C, -377A>G , 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1758G>A; 1887insTA; 2573insC; 2988G>A; 4125-4133insGTGCCCACT; 2D6 결실 (deletion); 및 2D6 중복 (duplication)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 11개의 CYP2D6 유전자 변이의 존재 유무를 SNaPshot 기법을 이용하여 조사하는 단계 를 포함하는, 인간 CYP2D6 유전자의 유전형을 결정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 검사하고자 하는 유전자를 추출한 다음, 다중 (multiplex) PCR을 수행하여 동정하고자 하는 SNP 주변을 포함하는 PCR 산물을 얻는 단계;

(b) 각 대립유전자 (allele)의 특이적인 염기를 동정할 수 있는 ASPE (allele specific primer extension) 프라이머를 이용하여 ASPE 반응을 수행하는 단계;

(c) 상기 반응산물을 유전자 칩에 혼성화시키는 단계; 및

(d) 상기 칩을 분석하는 단계를 포함하는, 유전자 분석칩을 이용하여 인간 CYP2D6 유전자의 유전형을 결정하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 CYP2D6 유전형 판별을 위한 SNaPshot 방법의 유전형 분석용 키트 및 SNP 검사용 Zip Code 올리고염기 칩을 포함하는 유전형 분석용 칩을 제공한다.

본 발명에서 "인간"은 "한국인 또는 이와 유사한 유전적 특성을 가지는 아시아인"을 말하고, "생물학적 시료"는 피험자의 혈액, 피부 세포, 점막 세포 및 모발을 포함하며, 바람직하게는 혈액일 수 있다.

본 발명에서 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 DNA, 보다 바람직하게는 게놈 (genomic) DNA 일 수 있다.

본 명세서에 기재된 변이에 대하여 설명하면 다음과 같다.

예컨대, "-1584C>T" 변이란 인간 CYP2D6 유전자의 염기서열에서 -1584번째 염기가 C에서 T로 치환된 것을 말한다.

"2573insC" 변이란 인간 CYP2D6 유전자의 염기서열에서 2573번째 염기에 C가 삽입(부가)된 것을 말하며, "4125-4133insGTGCCCACT" 변이란 인간 CYP2D6 유전자의 4125번째 염기부터 4133번째 염기 위치에 GTGCCCACT의 9개의 염기가 삽입된 것을 말한다.

또한, "2D6 결실 (deletion)" 변이란 인간 CYP2D6 유전자 전체가 염색체 상에서 결실된 것을 말한다.

나아가, 본 발명에서 "2D6 중복 (duplication)" 변이란 인간 CYP2D6 유전자가 둘 이상 동일 염색체 상에 중복되어 있는 것을 말한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 한국인 CYP2D6 유전자의 변이 분석을 통해 한국인에서 주로 발견되는 CYP2D6 유전자의 유전형을 규명하였고, 이를 토대로 각각의 일배체형의 최적의 표지 세트인 htSNP를 선별하고, 이의 유용성을 확인하였다는 점에 특징이 있다.

본 발명에 따른 인간 CYP2D6 유전자의 htSNP를 선별하는 방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) 인간으로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;

(f) 상기 (e) 단계에서 분석된 일배체형의 염기서열을 SNP태거 소프트웨어를 이용하여 분석하여 htSNP를 선별하는 단계.

상기 (a) 단계에서 채취된 시료로부터 핵산을 추출하는 방법은 특별히 한정되지 않으며 당업계에 공지된 기술 또는 시판되고 있는 추출용 키트를 사용할 수 있다. 예를 들면, DNA 또는 RNA 추출용 키트는 Qiagen (미국) 및 Stratagene (미국)에서 구입할 수 있다. 상기에서 RNA를 추출하여 사용하는 경우에는 역전사에 의해 cDNA를 제조하여 사용한다.

상기 (c) 단계에서 상기 인간 CYP2D6 유전자의 단편은 인간 CYP2D6 유전자의 공지된 변이, 예컨대 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism; SNP)을 포함하고 있는 단편을 말한다. 상기 인간 CYP2D6 유전자 또는 이의 단편을 증폭할 수 있는 프라이머는 인간 CYP2D6 유전자 또는 이의 단편의 염기서열을 바탕으로 하여 디자인될 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 17 내지 서열번호 23, 서열번호 25 내지 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 (d) 단계에서 확인되는 변이는 단일염기다형성, 유전자의 결실 및 유전자의 중복을 포함하지만, 이에 제한되지는 않으며, 예를 들어, 표 11에 나타낸 33개의 변이를 포함할 수 있다.

또한, 상기 (d) 단계에서 변이의 존재 유무의 확인은 당업계에 공지된 변이 검출방법에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 서열분석, 전기영동분석, RFLP 분석 등을 이용하여 수행할 수 있다. 상기 서열분석은 자동염기서열분석기를 사용하거나 파이로시퀀싱 (pyrosequencing)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기 파이로시퀀싱은 DNA 시퀀싱에 이용되기도 하는 공지의 SNP 분석방법으로 DNA가 중합되는 동안 방출되는 PPi (inorganic pyrophosphate)의 빛의 발현을 검출하는 방법이다.

변이의 존재 유무는 야생형 CYP2D6 유전자의 염기서열과 비교하여 확인할 수 있다. 야생형 CYP2D6 유전자의 염기서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 서열번호 1 (GenBank accession No. AY545216)의 염기서열, 또는 당업계에 공지된 CYP2D6 유전형들의 각 염기서열 또는 정보를 토대로 하여 비교하여 확인할 수 있다 (GenBank accession No. M33388, http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm). 또는, RFLP를 수행하여 야생형 CYP2D6 유전자의 제한효소 절단 양상과 비교하여 확인할 수도 있다. CYP2D6 유전자의 결실 또는 중복 변이의 경우에는 PCR 산물의 전기영동분석을 통해 확인할 수 있다.

상기 (d) 단계에서 변이가 존재하는 것으로 확인된 PCR 산물의 염기서열에서 일배체형의 분석은 전장염기서열분석을 통해 수행할 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 (a) 내지 (e) 단계를 반복하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 종족이나 환자 등과 같은 어떤 특정 집단에서 CYP2D6 유전자의 변이 양상을 분석하고자 하는 경우에는, 각 CYP2D6 유전형의 빈도를 조사하여 상기 집단에서 많이 발견되는 CYP2D6 유전형들을 선정한 후, 이를 대상으로 이후의 (f) 단계를 수행할 수 있다.

상기 (f) 단계에서는 상기 (e) 단계에서 분석된 일배체형의 염기서열을 SNP태거 소프트웨어로 분석하여 htSNP를 선별한다. 상기 SNP태거 소프트웨어는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Genehunter, Merlin, Allegro, SNPHAP, htSNP finder (PCA based) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 http://www.well.ox.ac.uk/∼xiayi/haplotype 또는 http://slack.ser.man.ac.uk/progs/htsnp.html의 웹사이트를 이용할 수 있다.

이렇게 선별된 htSNP는 다이플로타입 (diplotype) 결정시 정확도를 높이기 위하여 검증될 수 있다. 인체의 유전형은 두 가닥의 염색체에 의해 결정되므로 유전형을 판독하면 두 개의 일배체형 조합으로 판정된다. 그러나 여러 개의 SNP을 동시에 분석한 경우 특정 일배체형의 조합이 다른 일배체형의 조합과 동일한 변이 분석 결과를 나타낼 가능성이 있다. 따라서, 본 발명에 의해 개발된 진단법을 이용하여 유전형이 판독된 경우 정확한 유전형을 지목할 수 있는지 검증되어야 한다. 이러한 검증은 Matlab (The Math Works Inc., 미국) 프로그램을 이용하여 유전자 분석 결과로부터 정확한 유전형 판독이 가능한지 분석될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 한국인에서 발견되는 CYP2D6 유전형에 대한 htSNP를 선별하기 위하여, 먼저 한국인에서 발견되는 CYP2D6 유전자의 변이를 조사하였다. 그 결과, 한국인에서 주로 발견되는 33개의 변이와 이에 따른 12종의 일배체형 (유전형)을 규명하였다 (표 11 및 12 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 한국인에서 주로 발견되는 CYP2D6 유전형을 용이하게 구분할 수 있는 최소 마커인 htSNP를 선별하기 위하여, 12종의 CYP2D6 유전형의 염기서열을 SNPtagger 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 본 발명에서 선별된 htSNP 조합의 예를 도 1 내지 도 6에 나타내었다.

상기 방법으로 본 발명에서 선별된 htSNP 조합은 인간 CYP2D6 유전자의 유전형을 분석하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 인간 CYP2D6 유전자의 유전형을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) 인간으로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 얻은 PCR 산물의 염기서열에서 -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T 로 이루어진 군에서 하나; -1028T>C, -377A>G , 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1758G>A; 1887insTA; 2573insC; 2988G>A; 4125-4133insGTGCCCACT; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 11개의 CYP2D6 유전자 변이의 존재 유무를 조사하는 단계.

상기 (b) 단계에서 핵산을 추출하는 방법은 위에서 기재한 바와 같다.

상기 인간 CYP2D6 유전자의 단편은 위에서 기재한 바와 같이 인간 CYP2D6 유전자의 공지된 변이, 예컨대 단일염기다형성을 포함하고 있는 단편을 말한다. 상기 (c) 단계에 사용될 수 있는 프라이머는, 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 17 내지 서열번호 23, 서열번호 25 내지 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 (d) 단계에서 조사되는 변이는 도 1 내지 도 6에 나타낸 htSNP 중에서 선택될 수 있다. 상기 (d) 단계에서는 도 1에 나타낸 -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T 로 이루어진 군에서 하나; -1028T>C, -377A>G , 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1758G>A; 1887insTA; 2573insC; 2988G>A; 4125-4133insGTGCCCACT; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 변이의 존재 유무를 조사할 수 있다.

또한, 도 2에 나타낸 -1584C>G; -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1758G>A; 2573insC; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; -1245insGA, -1028T>C, -377A>C, 3877G>A , 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; 4125-4133insGTGCCCACT; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 변이의 존재 유무를 조사할 수도 있다.

또한, 도 3에 나타낸 -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T 로 이루어진 군에서 하나; -1584C>G; -1028T>C, -377A>G , 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1758G>A; 1887insTA; 2573insC; 4125-4133insGTGCCCACT; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 변이의 존재 유무를 조사할 수도 있다.

또한, 도 4에 나타낸 -1584C>G; -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1758G>A; 2573insC; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; -1245insGA, -1028T>C, -377A>G, 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; 4125-4133insGTGCCCACT; -1235A>G; 1887insTA; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 변이의 존재 유무를 조사할 수도 있다.

또한, 도 5에 나타낸 -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T로 이루어진 군에서 하나; -1028T>C, -377A>G, 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1661G>C 및 4180G>C로 이루어진 군에서 하나; 1758G>A; 1887insTA; 2573insC; 2988G>A; 4125-4133insGTGCCCACT; -1235A>G; 1887insTA; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 변이의 존재 유무를 상기 (d) 단계에서 조사할 수도 있다.

또한, 도 6에 나타낸 -1584C>G; -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1758G>A; 2573insC; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; -1245insGA, -1028T>C, -377A>G, 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; 1887insTA; 2988G>A; 4125-4133insGTGCCCACT; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 변이의 존재 유무를 조사할 수도 있다.

바람직하게는 도 1에 예시한 변이의 존재 유무를 조사할 수 있다. 이와 같이 상기 (d) 단계에서 조사되는 변이는 한국인에서 주로 발견되는 CYP2D6 유전자 변이에 대한 것이므로 한국인에서 CYP2D6 유전자의 일배체형과 유전형을 결정하는데 매우 특이적이다.

상기 (d) 단계에서 상기 PCR 산물의 염기서열에 CYP2D6 유전자의 변이가 존재하는지 그 여부의 조사는 당업계에 공지된 다형성 분석 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는 스냅샷 분석 ([Peter M. Vallone, et al., Int J Legal Med, 2004, 118:147-157] 참조), 전기영동 분석 또는 이들의 조합을 이용하여 수행할 수 있다. 상기 CYP2D6 유전자의 변이가 단일염기다형성인 경우에는 스냅샷 분석을 이용할 수 있다.

상기 스냅샷 분석은 SNP 위치의 인접부위에 어닐링 (annealing)되는 서열 (상기 SNP 부위는 포함하지 않음)을 갖는 프라이머와 ddNTP를 이용한 PCR 반응을 통하여 유전자형을 분석하는 방법이다. 본 발명에 사용되는 스냅샷 분석은 상기 단계 c)에서 조사되는 CYP2D6 유전자의 SNP를 토대로 하여 공지에 방법에 따라 설계 및 제작한 것을 사용할 수 있으며, SNP 위치의 바로 옆 염기가 3′말단이 되고 상기 SNP 위치의 인접부위에 어닐링되는 서열을 포함하며, 5′말단에는 T 염기가 부가된 것이라면 제한없이 사용될 수 있다. 이때, 상기 SNP 위치의 인접부위에 어닐링되는 서열은 약 20 bp의 길이를 갖는 것이 바람직하며, 한 번에 여러 개의 SNP를 구분하고자 하는 경우 각 SNP에 대한 스냅샷 프라이머들의 5′ 말단 T 염기의 길이를 각각 다르게 설계, 예를 들어 T 염기를 5개씩 5′위치에 더 첨가하여 프라이머 간에 사이즈 차이를 만들어 합성하여 PCR 산물의 길이를 각각 다르게 할 수 있다. 이렇게 만들어진 스냅샷 프라이머에 각 SNP에 상보적인 ddNTP가 결합을 하게 되고 이들 합성물들은 SNP에 따라 길이 차이가 발생함으로 한 번에 여러 개의 SNP 구분이 가능하다.

예컨대, 상기 (c) 단계에서 도 1에 나타낸 htSNP 조합을 조사하는 경우에는 서열번호 37 내지 서열번호 44, 서열번호 48 및 서열번호 49로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 프라이머를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 37 내지 서열번호 44, 서열번호 48 및 서열번호 49의 프라이머를 모두 사용할 수 있다. 이후, 스냅샷 분석으로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 공지된 서열분석법으로 분석할 수 있다. 상기 서열분석법으로는 당업계에 공지된 방법이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 자동염기서열분석법일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명에서 선별된 htSNP 조합의 유용성을 확인하였다. 이를 위해 도 1에 나타낸 htSNP 조합을 이용하여 스냅샷 분석을 실시한 후, 얻은 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 방법이 한국인에서 발견되는 CYP2D6 유전형을 동시에 고속으로 분석할 수 있음을 확인하였다 (도 7 및 8 참조).

본 발명의 방법에 의해 분석될 수 있는 CYP2D6 유전자의 유전형은 CYP2D6*1A, CYP2D6*2A, CYP2D6*5, CYP2D6*2N, CYP2D6*10B, CYP2D6*14B, CYP2D6*18, CYP2D6*21B, CYP2D6*41A, CYP2D6*49, CYP2D6*52 및 CYP2D6*60을 포함한다. 각 유전형 및 이에 따른 변이에 대하여 표 11에 나타내었다. 표 11을 참고로 하여 설명하면, 예컨대 CYP2D6*1A 유전형은 야생형이고, CYP2D6*2A 유전형은 야생형 CYP2D6 유전자의 염기서열에서 SNP 1, SNP 5, SNP 8, SNP 9, SNP 12-SNP 18, SNP 21, SNP 25 및 SNP 28 위치에 변이를 포함하는 유전형이다. 또한, CYP2D6*5 유전형은 2D6 결실 변이를 포함하는 유전형으로서, CYP2D6 유전자가 인간 염색체 상에서 완전 결여된 것으로 효소생산이 전혀 일어나지 않는다. CYP2D6*2N 유전형은 2D6 중복 변이를 포함하는 유전형으로서 CYP2D6 유전자가 두 개 이상 동일 염색체에 존재한다.

또한, 본 발명은 유전자 분석칩을 이용하여 인간 CYP2D6 유전자의 유전형을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:

(c) 상기 반응산물을 유전자 칩에 혼성화시키는 단계; 및

(d) 상기 칩을 분석하는 단계.

또한, 본 발명은 SNP 검사용 Zip Code 올리고염기 칩을 포함하는 유전형 분석용 키트를 제공한다 (도 9 참조).

상기 단계 (b)에서, ASPE 반응을 위해서는 각각의 SNP에 맞는 한 쌍의 프라이머를 제작하게 되는데, 상기 ASPE 프라이머는 다형성을 나타내는 염기 (SNP site)를 3' 말단에 포함하여 대립유전자 (allele)와 특이적으로 결합하는 시퀀스로 제작되며, 5' 방향으로는 24 bp의 올리고뉴클레오타이드인 Zip Code가 포함되어 있으며, 상기 Zip Code는 각각의 대립유전자마다 다른 서열을 갖도록 제작된다.

본 발명에서는, 논문 등을 통해 공개된 서열들 및 생명정보학 기법을 통해 선별되어 설계된 서열들 중, 실험적 검증을 통해 다른 시료와 상호교차반응이 일어나지 않는 최적의 Zip Code 서열을 선별하였으며, 선별된 서열은 T_m 값이 61℃±2 이며 Zip code 서로 간에 간섭이 없도록 제작되었고, 헤어 핀 이차 구조의 ΔG 값이 -2 이상인 서열만이 선택되었다.

상기와 같이 구성된 ASPE 프라이머를 이용하여 ASPE 반응을 수행하면, 프라이머의 3' 말단에 해당되는 대립유전자를 가지고 있는 시료만이 프라이머와 반응하여 대립유전자 특이적 연장 반응이 일어나게 된다. 이때, 사이아닌 5 (Cyanine 5, Cy5) 형광물질이 공유결합된 dUTP (Cy5-dUTP)를 섞어 연장반응을 수행하면, 각 대립유전자를 가지고 있는 시료만이 Cy5 형광물질을 표지하게 된다 (도 12 참조). 이 때 형광물질은 Cy5에 제한되지 않고, Cy3, TAMRA, Texas-Red, Cy3.5, Rhodamin 6G, SyBR Green 등 당분야에서 사용가능한 여러 가지가 대체되어 사용될 수 있다.

본 발명의 분석칩 상에는 상기 Zip Code와 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드를 프로브 (cZip Code)가 심어져 있어, 상기와 같이 Zip Code 프라이머를 이용하여 연장된 시료에 포함되어 있는 각 대립유전자를 동정할 수 있게 된다 (도 10 참조).

상기 프로브는 3' 방향에 10 bp의 염기 서열을 스페이서로 삽입하여 타겟과 교잡반응이 잘 일어나도록 유도하였으며, 예를 들어, 상기 스페이서 서열은 5'-CAG GCC AAGT-3'인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 53 내지 서열번호 79의 염기 서열을 갖는 것이 바람직하다.

상기 단계 (c) 및 (d)에서 상기 반응산물을 유전자 칩에 혼성화시키고, 혼성화된 칩을 분석하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 일반적인 DNA칩 스캐너를 어느 것이던지 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 Axon사의 GenePix 4100B 스캐너를 이용하고, 스캐닝된 이미지를 GenePix Pro 6.0 software를 이용하여 분석할 수 있다.

본 발명의 유전자 분석칩을 이용하여 CYP2D6 유전자의 변이를 분석하면 서열분석을 통해 확인된 결과와 동일한 결과를 얻을 수 있으므로, 다양한 유전자의 변이를 경제적으로 용이하게 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 한국인에서 CYP2D6 유전자의 유전형 분석

<1-1> 게놈 DNA의 분리

174명의 한국인으로부터 채취한 혈액 시료로부터 게놈 DNA 분리 키트 (Qiagen 사)를 이용하여 게놈 DNA를 각각 분리하였다.

<1-2> CYP2D6 유전자의 증폭 및 전장 염기서열 분석

상기 실시예 <1-1>에서 분리된 총 174개의 게놈 DNA 샘플 중에서 임의로 택한 51개의 샘플을 주형으로 하고 하기의 프라이머 쌍으로 PCR을 수행하여 인간 CYP2D6 유전자를 구성하는 9개의 엑손과 1.8kb의 프로모터 부위가 증폭되도록 하였다.

유전자 증폭에 사용된 프라이머

프라이머명	염기서열 (5'→3')	서열번호
CYP505	CACTGGCTCCAAGCATGGCAG	2
3'2D6	ACTGAGCCCTGGGAGGTGGTA	3

PCR은 94℃에서 1분간 반응시킨 다음 98℃에서 10초, 64℃에서 30초 및 72℃에서 7분간 30 사이클을 반복하고 최종적으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. 그 결과, 6,569 bp 크기의 PCR 산물을 수득하였다 (하기 표 2 참조).

프라이머의 위치와 PCR 산물의 크기

프라이머명	위치	PCR 산물의 크기
CYP505	-1848∼-1828	6,569 bp
3'2D6	4732∼4749	6,569 bp

이후, 증폭된 PCR 산물을 주형으로 하고 하기 표 3에 나타낸 총 13종의 프라이머를 이용하여 증폭된 CYP2D6 유전자의 염기서열을 분석하였다.

전장 염기서열분석에 사용된 프라이머

프라이머명	염기서열 (5'→3')	서열번호
CYP505	CACTGGCTCCAAGCATGGCAG	2
3'2D6	ACTGAGCCCTGGGAGGTAGGTA	3
CYP507	AACGTTCCCACCAGATTTC	4
CYP509	GTAAGTGCCAGTGACAGATAAG	5
2d6-11	AGGATCCTTTGTTCAGGATATGTTGC	6
2d6-12	CACCAAGTACCCCACTTCCC	7
2d6-1	CATGTGGACTTCCAGAACACACC	8
2d6-2	GGTTCAAACCTTTTGCACTG	9
2d6-3	GTCGTGCTCAATGGGCTG	10
2d6-4	AAGGTGGATGCACAAAGAGT	11
2d6-5	GACCTAGCTCAG GAGGGACT	12
2d6-6	AGCTGGATGAGCTGCTAACT	13
2d6-7	CCTGACCTCCTCCAACATAG	14
2d6-8	CACCTAGTCCTCAATGCCAC	15
2d6-9	GAGTCTTGCAGGGGTATCAC	16

<1-3> 각 유전형에 따른 개별적 분석

상기 실시예 <1-1>에서 분리한 나머지 123개의 게놈 DNA 샘플에 대해서는 하기의 방법에 따라 동양인에서 주로 발견되는 *2A, *5, *2N, *10B, *14B, *18, *21B, *41A, *49, *52, *60 변이에 대한 유전형 분석을 개별적으로 수행하였다.

a) CYP2D6*5 유전형의 분석

CYP2D6*5 유전형을 분석하기 위해 하기 표 4에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응조건으로는 94℃에서 1분간 반응시킨 다음 98℃에서 10초, 64℃에서 30초 및 72℃에서 5분간 30 사이클을 반복하고 72℃에서 10분간 반응시켰다. 그 결과, 야생형의 경우 9개의 엑손을 포함하는 5.1 kb의 PCR 산물이 증폭되었고, CYP2D6*5 변이형의 경우 3.5 kb의 PCR 산물이 증폭되었다.

프라이머의 서열, 위치 및 PCR 산물의 크기

프라이머명	염기서열 (5'→3')	서열번호	위치	PCR 산물의 크기
5'2D6	CCAGAAGCCTTTGCAGGCTTC	17	1279∼1300	5.1 kb
3'2D6	ACTGAGCCCTGGGAGGTGGTA	3	6350∼6371	5.1 kb
5'2D6*5	CACCAGGCACCTGTACTCCTC	18	7396∼7416	3.5 kb
3'2D6*5	CAGGCATGAGCTAAGGCACCCAGAC	19	9353∼9377	3.5 kb

b) CYP2D6*2N 유전형의 분석

CYP2D6*2N 유전형을 분석하기 위해 하기 표 4에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94 ℃에서 1분간 반응시킨 다음 98 ℃에서 10초, 64 ℃에서 30초 및 72 ℃에서 8분간 30 사이클을 반복하고 72 ℃에서 10분간 반응시켰다. 그 결과 CYP2D6*2N 변이형의 경우 7.8kb의 PCR 산물을 수득하였다.

프라이머의 서열, 위치 및 PCR 산물의 크기

프라이머명	염기서열 (5'→3')	서열번호	위치	PCR 산물의 크기
4268Cnew	TGGGTGTTTGCTTTCCTGGTGAC	20	4245∼4268	7.8kb
Primer 10B	GTGGTGGGGCATCCTCAGT	21	302∼321	7.8kb

c) CYP2D6*2 및 *41 유전형의 분석

CYP2D6*2 유전형과 CYP2D6*41 유전형의 경우, -1584C>G 변이를 제외하고는 동일한 변이 (-1235A>G; -740C>T; -678G>A; 인트론 1에서의 CYP2D7로의유전자 전환 (gene conversion); 1661G>C; 2850C>T; 4180G>C)를 가진다. 따라서, 우선 인트론 1에서의 CYP2D7로의 유전자 전환의 변이 서열을 하기 표 6에 기재된 프라이머를 이용하여 AS-PCR 방법 (Johanson, Molecular Pharmacology, 46:452-459, 1994)으로 분석하였다.

인트론 1에서의 CYP2D7로의 유전자 전환이 일어난 경우, 서열번호 25의 프라이머 9와 서열번호 21의 프라이머 10B를 사용하여 PCR반응을 하면 증폭산물을 얻을 수 있으며, 정상인 경우에서는 서열번호 25의 프라이머 9와 서열번호 26의 프라이머 10의 조합으로 반응을 한 경우에만 증폭산물을 얻게 된다. 따라서, 두 개의 프라이머 조합, 즉 프라이머 9/프라이머 10과 프라이머9/프라이머10B의 조합으로 각각 반응하여 증폭된 산물의 유무에 따라 인트론 1에서의 CYP2D7로의 유전자 전환을 확인할 수 있다.

PCR은 94℃에서 5 분간 반응시킨 다음 94℃에서 30 초, 64℃에서 30 초 및 72℃에서 30 초간 35 사이클을 반복하고 72℃에서 10 분간 반응시켰다. 이후, -1584C>G 변이를 하기 표 6에 기재된 시퀀싱 프라이머를 이용하여 파이로시퀀싱으로 분석하여 -1584G 인 경우를 CYP2D6*2 유전형으로, -1584C인 경우를 CYP2D6*41 유전형으로 결정하였다.

프라이머의 서열

변이	프라이머명	염기서열 (5'→3')	서열번호
-1584C>G	F	Biotin-TCACCCCAGGAATTCAAGAC	22
	R	GGCTTCAAGCAATTCTCCTG	23
	파이로시퀀싱 프라이머	GTATTTTTTGTAGAGACC	24

d) CYP2D6*10B, *14, *18 및 *49 유전형의 분석

CYP2D6*10B, *14, *18 및 *49 유전형은 PCR-RFLP 방법으로 분석하였다 (Johanson, Molecular Pharmacology, 46:452-459, 1994; Wang, Drug Metabolism and Dispososition, 27:385-388, 1998; 및 Geadigk, Pharmacogenetics, 9:669-682, 1999). 이때 사용한 프라이머는 하기 표 7과 같으며, 실험조건은 하기 표 8에 나타낸 바와 같다.

각 유전형에 따른 프라이머의 서열 및 위치

유전형	프라이머명	염기서열 (5'→3')	서열번호	위치
*10	Primer 9	ACCAGCCCCCTCCACCGG	25	-196～197
	Primer 10	TCTGGTAGGGGAGCCTCA	26	302～321
	Primer 10B	GTGGTGGGGCATCCTCAGT	21	302～321
14, 49	Primer e	GTGGATGGTGGGGCTAATGCCTT	27	1637～1659
14, 49	Primer f	CAGAGACTCCTCGGTCTCTCGCT	28	2124～2102
*18	5'4213	GCATCCTAGAGTCCAGTCC	29	5371～5389
*18	3'4213	CCTGTCTCAGCGGCCAGGCGGTGGG	30	5985～6015

각 유전형에 따른 제한효소 및 RFLP 양상

유전형	PCR 산물의 크기 (bp)	제한효소	야생형의 RFLP 양상 (bp)	변이형의 RFLP 양상 (bp)
*10B	534	HphI	474+60	376+98+60
*14b	486	MspI	279+207	486
*18	645 또는 654	MwoI	348+258+39	272+258+85+39
*49	486	Sau3A I	347+142	286+142+61

e) CYP2D6*21, *52 및 *60 유전형의 분석

CYP2D6*21, *52 및 *60 유전형의 분석은 PCR-파이로시퀀싱법으로 분석하였다. 분석에 사용한 프라이머의 서열을 하기 표 9에 나타낸 바와 같다.

각 유전형에 따른 프라이머의 서열

유전형	프라이머명	염기서열 (5'→3')	서열번호
*21B	F	biotin-TGGTGTAGGTGCTGAATGCTGT	31
	R	AGCCACTCTCACCTTCTCCATC	32
	파이로시퀀싱 프라이머	TCAGGTCTCGGGGGGG	33
*52	F	Biotin-AGGCAACGACACTCATCACC	34
	R	GATACCCCTGCAAGACTCCA	35
	파이로시퀀싱 프라이머	GGCATCCAGGAAGTGT	36
*60	F	biotin-ATCTCCCACCCCCAGGAC	45
	R	AGGGAGGCGATCACGTTG	46
	파이로시퀀싱 프라이머	GGCGATCACGTTGCT	47

상기 실시예 <1-2> 및 <1-3>에서 얻은 데이터들을 GenBank accession No. M33388에 공지된 CYP2D6의 서열을 근거로 하여 비교 분석하고 각 대립인자들의 빈도를 조사하였다. 그 결과, 한국인에서 주로 발견되는 CYP2D6 유전자 일배체형의 종류 및 빈도는 하기 표 10과 같다.

한국인에서 발견되는 CYP2D6 유전자의 일배체형

일배체형 (대립인자)	활성		대립인자 빈도
일배체형 (대립인자)	생체 내 (in vivo)	시험관 내 (in vitro)	대립인자 빈도
*1A	Normal	Normal	31
*2A	Normal(dx, d, s)		10
2XN(2N)	Incr (d)		1.4
*5	None		6.3
*10B	Decr (d)	Decr (b)	42.2
*14B	None (d)		0.86
*18	None (d)	Decr (d)	0.57
*21B	None		0.86
*41A	Decr (s)		3.7
*49		Decr (dx)	2.58
*52		Incr (dx)	0.29
*60			0.29

상기 표 10에서 Normal은 정상 수준, Incr는 증가함, Decr는 감소함, None은 활성 없음을 각각 나타낸다. 또한, 괄호안의 표기는 분석에 사용한 표지약물의 약자이다: b, bufuralol; d, debrisoquine; dx, dextromethorphan; s, sparteine.

한국인에서 주로 발견되는 12종의 유전형을 중심으로 유전자를 선택하여 Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature Committee (http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm)를 기준으로 각 유전형의 변이를 하기 표 11에 나타내었다. 표 11에서 '1'은 야생형을, '2'는 변이형을 각각 나타낸다.

실시예 2 : htSNP의 선별 및 검증

상기 실시예 1에서 확인한 한국인에서 발견되는 12종의 CYP2D6 유전형을 구분하기 위해, 표 11에 나타낸 33개의 변이를 모두 분석하는 것은 시간과 비용적인 면에서 효율성이 매우 떨어진다. 따라서, 상세한 일배체형의 정보를 이용하여 표지 유전자 변이인 htSNP를 선정하여 유전형을 결정하면 경제적인 유전형 판별이 가능하다. 상기 htSNP는 각각의 일배체형의 정확한 표시를 위해 필요한 마커이며 여러 가지 조합을 구성하게 된다. 이 최적화된 표지 세트인 htSNP 조합을 SNP태거 소프트웨어(http://www.well.ox.ac.uk/~xiayi/haplotype/)를 이용하여 선별하였다. 선별된 htSNP 조합의 예를 도 1 내지 도 6에 나타내었으며, 각 선별된 htSNP 조합은 최적의 표지 세트로서, '1'은 야생형을 '2'는 변이형을 나타내며, V 표시는 htSNP를 나타낸다.

이후, 찾아낸 조합 중 다이플로타입 (diplotype)을 고려하여 서로 겹치지 않고 다이플로타입 유전형을 결정할 수 있는지를 Matlab 소프트웨어 (version 7.1, The Math Works Inc., USA)를 사용하여 분석하였으며, 이를 이용하여 체크한 후 조합을 결정하였다.

검증 결과, 서로 겹치지 않고 다이플로타입 유전형을 결정할 수 있음을 확인하였다. 이는 본 발명에서 선택한 htSNP 조합이 서로 동일한 것이 없어 유전형을 결정함에 있어 부정확한 분석이 전혀 없음을 나타내는 것이다.

실시예 3 : SNaPshot 분석

상기 실시예 2에서 선별된 htSNP 조합을 이용하여 CYP2D6 유전자의 고속 유전형 분석 기술의 하나인 스냅샷 분석을 수행하였다. 이를 위해 도 1의 htSNP 조합을 선택하였으며, 각 htSNP로 선별되는 변이의 위치는 하기 표 12와 같다. 하기 표 12에서 htSNP1 내지 htSNP3의 경우에는 해당하는 여러 개의 변이 중에서 하나의 SNP 만을 분석하여도 유전형 판별이 가능하다. 또한, htSNP9의 경우에는 9개의 염기(GTGCCCACT)가 삽입되어 반복되는 양상을 보이게 되므로, 4125번째 염기부터 4133번째 염기 위치 중 어느 하나의 염기 위치만을 분석하여 야생형 유전자의 염기서열과 비교함으로써 유전형 판별이 가능하다.

본 발명에 따른 htSNP 조합으로 선별되는 변이의 위치

htSNP	해당하는 변이	변이 위치
htSNP 1	SNP 2, 7, 19	-1426 C>T
htSNP 2	SNP 3,6,10,27,30,31	3877 G>A
htSNP 3	SNP 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 25	2850 C>T
htSNP 4	SNP 20	1611 T>A
htSNP 5	SNP 22	1758 G>A
htSNP 6	SNP 23	1887insTA
htSNP 7	SNP 24	2573insC
htSNP 8	SNP 26	2988 G>A
htSNP 9	SNP 29	4125-4133 ins9 bp
htSNP 10	SNP 32	결실
htSNP 11	SNP 33	중복

상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 CYP2D6 유전자를 증폭하여 약 6.7 kb 의 산물을 얻었다. 그리고, CYP2D6*5를 구분하기 위해 서열번호 50의 프라이머 CYP2D6_3 (5'-ACCTCTCTGGGCCCTCAGGGA-3')와 서열번호 19의 프라이머 3'2D6*5를 이용하여 CYP-REP-Del 부위를 증폭하였으며, PCR은 94℃에서 1분간 반응시킨 다음 98℃에서 10초, 64℃에서 30초 및 72℃에서 3분간 30 사이클을 반복하고 최종적으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. 그 결과, 6,569 bp 크기의 PCR 산물을 수득하였다.

상기와 같이 증폭된 PCR 산물의 반응되지 않은 프라이머와 dNTP 등은 남아 있으면 스냅샷 과정에 영향을 줄 수 있으므로, 이들을 제거하기 위해 PCR 산물 5 ㎕당 ExoSAP-IT (USB Corporation) 2㎕를 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 다음, 80℃에서 15분간 반응시켜 남아 있는 효소를 비활성화시켰다. 효소 처리된 산물을 주형 3 ㎕ (6.7 kb의 CYP2D6 유전자 2 ㎕와 3.5 kb의 CYP-REP-DEL 1 ㎕의 혼합물), 스냅샷 멀티플렉스 레디 리액션 믹스 (SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix, ABI) 1 ㎕, 1/2 텀 (term) 완충액 (200 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, pH 9) 4 ㎕ 및 Pooled SNaPshot 프라이머를 넣어 전체 반응물의 양을 10㎕로 맞춘 다음, 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 30초간 40 사이클 반복하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응하였다. 사용한 Pooled SNaPshot 프라이머의 처리 농도를 하기 표 13에 나타내었다.

Pooled SNaPshot 프라이머의 염기서열 및 처리 농도

프라이머명	염기서열 (5'→3')	농도 (M)	서열번호
2D6-1426R	GCCACCACGTCTAGCTTTTT	0.05	37
2D6+1611R (P30)	TTTTTTTTTTGGGCCCATAGCGCGCCAGGA	0.3	38
2D6+1758	CGCCTTCGCCAACCACTCC	0.2	39
2D6+2573 (P38)	TTTTTTTTTTTTTTTTTGGGACCCAGCCCAGCCCCCCC	0.02	40
2D6+2850R (P55)	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGTCAGCCACCACTATGC	0.06	41
2D6+2988 (P39)	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTGCAGGGGCCGAGGGAG	0.3	42
2D6+3877 (P45)	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGGGCATCCAGGAAGTGTT	0.3	43
2D6+4125 (P50)	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTTCTCGGTGCCCACTG	0.04	44
2D6+1887R (P60)	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGGAGGCGATCACGTTGCT	0.2	48
2D6-5R (P65)	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCGTCACTGGTCAGGGGTC	0.05	49

반응이 끝난 후에 반응물 10 ㎕에 SAP (USB Corporation) 1 ㎕를 넣고 37℃에서 1시간, 65℃에서 15분간 반응시켰다. 반응이 모두 끝나면 반응물 0.5 ㎕, LIZ120 (ABI) 0.2 ㎕, Hi-Di 폼아미드 (ABI) 9.3 ㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트에 분주하였다. 분주된 샘플들을 95℃에서 2분간 반응시킨 후, 3100 유전자 분석기 (ABI)로 분석하였다. 분석한 결과는 도 7에 나타낸 바와 같다.

그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이, 각 SNP에 따라 피크의 색깔과 크기가 일치하였으며 야생형과 변이형이 명확히 구분이 됨을 알 수 있다.

또한, CYP2D6 중복을 스냅샷을 이용하여 분석하기 위해 CYP-REP-Dup 부위를 서열번호 51의 Dup-F_2 (5'-CCTCACCACAGGACTGGCCACC-3')와 서열번호 52의 Dup-R (5'-CACGTGCAGGGCACCTAGAT-3')을 이용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 증폭하여 3.3 kb 크기의 PCR 산물을 수득하였다. PCR 반응 이후, PCR 산물로부터 반응하고 남은 프라이머 등을 제거하기 위해 PCR 산물 5㎕당 ExoSAP-IT(USB Corporation) 2㎕를 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다.

이후, 80℃에서 15분간 반응시켜 남아있는 ExoSAP-IT을 비활성화시켰다. 효소 처리된 산물을 주형 3 ㎕, 스냅샷 멀티플렉스 레디 리액션 믹스 1 ㎕, 1/2 텀 완충액 4 ㎕ 및 서열번호 53의 NaPshot 프라이머 (CYP2D6-5R, 5'-CTCGTCACTGGTCAGGGGTC-3')를 넣어 전체 반응물의 양을 10㎕로 맞춘 다음, 상기와 동일한 조건으로 스냅샷 반응을 수행한 다음, 3100 유전자 분석기로 분석하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, SNP에 따라 peak 피크의 색깔과 크기가 일치하였으며 야생형과 변이형이 명확히 구분이 됨을 알 수 있다.

이와 같은 방법으로 야생형 및 변이 유전형을 포함하는 50개의 샘플에 대하여 시퀀싱을 통한 타당성 검사 (validation)를 수행한 결과, 100% 일치하는 결과를 얻었다. 이는 본 발명의 방법이 재현성이 높고 정확하다는 것을 나타낸다.

따라서, 상기 방법은 한국인에서 주로 발견되는 12종의 CYP2D6 일배체형을 구분함으로서 이들 조합에 의한 CYP2D6 유전형을 동시에 고속으로 분석할 수 있는 방법이며, 한국인에서 발견되는 유전적 변이를 포함함으로써 유전형 결정에 정확도가 높다. 또한, 한국인과 유전적 특성이 매우 유사한 일본인의 경우에도 거의 모든 유전형 분석이 가능하며, 기존에 알려진 결과로부터 중국인에서도 90% 이상의 범위에서 CYP2D6 유전형을 판별할 수 있는 기술이라 사료된다.

실시예 3 : 유전자 분석칩을 이용한 유전형 분석

<3-1> Zip Code 칩의 제작

1) 프로브 제작

ASPE PCR 반응에 사용하는 ZipCode와 상보적인 염기서열로 디자인하였고 프로브는 3' 방향에 10 bp의 뉴클레오타이드 서열 (5'-CAG GCC AAGT-3')을 스페이서로 삽입하여 타겟과 교잡반응이 잘 일어나도록 유도하였다.

또한, 상기 스페이서의 5' 방향으로 24 bp의 Zip Code 올리고염기가 포함되어 있으며, 상기 프로브 (cZip Code)의 염기서열은 하기 표 14에 기재된 바와 같다. 이때, 굵은 글씨는 10개의 스페이서 서열이다 (도 10).

프로브명	염기서열 (5'→3')	서열번호
cZip2	CAGGCCAAGTATCTTGCGCGGCAGCTCGTCGACCG	54
cZip7	CAGGCCAAGTGTGGTCCATCACAAACAGGGAGTCG	55
cZip8	CAGGCCAAGTCTTGAGCGATGACGGACGGGAAAAG	56
cZip9	CAGGCCAAGTAAGTTGGGGATCTGTAGACCCAGCC	57
cZip14	CAGGCCAAGTGGATTGCACCGTCAGCACCACCGAG	58
cZip15	CAGGCCAAGTTCCCAGGACGGCGCTGGCACGTTGA	59
cZip16	CAGGCCAAGTCGGCGTCCACGTCGAGTTCCTTCGC	60
cZip19	CAGGCCAAGTTTCGGGGAAACTCCGCACCGCCACG	61
cZip20	CAGGCCAAGTTAGGTTTGCCAGTGCGTTGGATCG	62
cZip21	CAGGCCAAGTTCGACAACCCGGTTGGAGGATTCAG	63
cZip22	CAGGCCAAGTCCAAAAGCTTTACGCCAGCGCCGAA	64
cZip24	CAGGCCAAGTAGATCGGTGAGCAGTTCAAAGCCGG	65
cZip27	CAGGCCAAGTGGGTATCCGTTCGGTGTTGCGTAGT	66
cZip31	CAGGCCAAGTTGGTGCTGGCGCAGACCTTTGTCTC	67
cZip32	CAGGCCAAGTACCGCGCAAATGGACAGTGTGGCCA	68
cZip33	CAGGCCAAGTGACCCCAACTTGACACGTCGCAAGG	69
cZip40	CAGGCCAAGTCGTAAGCCTCGTCAGCTATCCGGGG	70
cZip41	CAGGCCAAGTCCAAACGCACCCCAACCTGTCCGGA	71
cZip44	CAGGCCAAGTCGGCGGTGGCATTGTCACTGCTGCT	72
cZip50	CAGGCCAAGTGCAGTTCGTGGCCATGGTGACCGCT	73
cZip56	CAGGCCAAGTCGTTGTGGTAGCGGCACTGGTGGTG	74
cZip61	CAGGCCAAGTCTGGGTGTGGGTGCTCGTACGCCGA	75
cZip101	CAGGCCAAGTCGGCACATAGGACGGGGTTCAGATA	76
cZip102	CAGGCCAAGTGAACAAGATTGGTCCTGGAGGTGCG	77
cZip104	CAGGCCAAGTTCGGATGGCGTTCAGTAGGAGAAGG	78
cZip106	CAGGCCAAGTACACTCTCCATGCGGTAGACCTGAC	79
cZip109	CAGGCCAAGTGAACCTAATGAAGACGGGGGGTGCT	80

2) 스팟팅 및 프로브 고정

칩 제작을 위한 기판은 아민이 코팅되어 있는 코닝 (Corning) 사의 GAPSII 유리 슬라이드를 사용하였다. SMP4XB 핀을 사용하여 OmniGrid100 스팟터로 스팟팅하였으며, 스팟팅 조건은 온도 22℃, 습도 54%로 하였고, 27종의 프로브는 각각 2회 반복으로 스팟팅하였다. 스팟팅 후 7,500 μJ/㎠의 UV를 조사하여 유리 슬라이드에 프로브를 고정시켰다.

3) Zip Code 테스트용 유전형분석칩 구성

CYP2D6 유전자의 9개의 유전형 표지 (SNP; 위 표에서 굵은 글씨로 표시)를 이용하여, 11개의 유전형 (CYP2D6 *1, *2, *5, *10B, *14A, *14B, *18, *21, *41, *49, *2N)을 검증하였다.

CYP2D6의 대립유전자	염기 변화
*1	없음 (wt)
*2	1584C>G; 1235A>G; 2850C>T; 4180G>C
*5	CYP2D6 결실됨
*10B	100C>T; 4180G>C
*14A	100C>T; 1758G>A; 2850C>T; 4180G>C
*14B	1758G>A; 2850C>T; 4180G>C
*18	4125-4133insGTGCCCACT
*21	1584C>G; 1235A>G; 2573 insC; 2850C>T
*41	1584C; 1235A>G; 2850C>T; 4180G>C
*49	1235A>G; 100C>T; 1611T>A; 4180G>C
*2N	CYP2D6 중복됨

<3-2> 타겟제작

1) 롱 (Long) PCR

CYP 2D6 게놈 DNA 샘플 2 ㎕, 1X LA 완충액, 2.5 mM MgCl₂, 0.4 mM dNTP, 하기 표 16의 각 0.2 pmol/㎕ 프라이머, LA 태그 DNA 폴리머라제 (taq DNA polymerase, TAKARA : cat. No. RR002A) 2.5 유닛, 3차 증류수를 넣어 50 ㎕로 맞춘 후 94℃ 에서 1분간 1회 변성시킨 후, 98℃ 10초, 64℃ 30초, 72℃ 6분간 30 사이클로 반응 후 72℃에서 1분간 연장 반응하여 증폭시켰다 (도 11). (CYP2D6 유전자는 *5, *2N 대립유전자 (allele), 및 그 외 대립유전자용으로 각 세 종류의 1^st PCR 산물을 얻었으며 각 조건은 상기와 동일하다.)

롱 (Long) PCR 프라이머 서열

유전자	프라이머	염기서열 (5’→3’)	서열번호
CYP2D6	cyp505	CACTGGCTCCAAGCATGGCAG	2
CYP2D6	3’2D6	ACTGAGCCCTGGGAGGTAGGTA	3
CYP2D6 *5	CYP2D6_3	ACCTCTCTGGGCCCTCAGGGA	50
CYP2D6 *5	3'2D6 *5	CAGGCATGAGCTAAGGCACCCAGAC	19
CYP2D6 *2N	Dup-F_2	CCTCACCACAGGACTGGCCACC	51
CYP2D6 *2N	Dup-R	CACGTGCAGGGCACCTAGAT	52

2) 다중 (Multiplex) PCR

상기에서 얻은 롱 PCR 산물 0.5 ㎕, 1X amplitaq 완충액, 0.2 mM dNTP, 각 프라이머 0.5 pmol/㎕씩 및 Ampli taq gold (Applied Biosystems : cat. No. N8080242) 0.5 unit에 3차 증류수를 넣어 10 ㎕로 맞춘 후 94℃ 에서 5분간 1회 변성시킨 후, 94℃ 45초, 57℃ 45초, 72℃ 1분간 30 사이클로 반응 후 72℃ 에서 1분간 연장 반응하여 증폭시켰다. 2^nd PCR은 다중 PCR로 수행하고, 아래 표 17의 4개의 세트로 증폭시켰으며, 프라이머 서열은 표 18에 기재된 바와 같다.

다중 PCR 세트

세트	주형	위치	PCR 산물
1	CYP2D6 1st PCR 산물	-1584C>G	502 bp
		100C>T	460 bp
		1611T>A	347 bp
		2850C>T	477 bp
2	CYP2D6 1st PCR 산물	1758G>A	468 bp
		2573insC	495 bp
		4125 4133ins9	484 bp
3	CYP2D6 *5 1st PCR 산물	*5 대립유전자	222 bp
4	CYP2D6 *2N 1st PCR 산물	*2N 대립유전자	222 bp

다중 PCR 프라이머 서열 (게놈 PCR 프라이머)

위치	프라이머명	염기서열 (5’→3’)	서열번호
-1584C>G	-1584 F1	GCTGCCATACAATCCACCTG	81
-1584C>G	-1584 R1	GCTCACTACAACCTTCACCTC	82
100C>T	100 F2	GTCCTGCCTGGTCCTCTG	83
100C>T	100 R2	CTTGCCCTACTCTTCCTTGG	84
1611T>A	5'1611	GTGGGCAGAGACGAGGTG	85
1611T>A	3'1611	CGGAGTGGTTGGCGAAGG	86
2850C>T	1758 F1	CTTCTCCGTGTCCACCTTG	87
2850C>T	1758 R1	TGTCCTTTCCCAAACCCATC	88
1758G>A	5' 2573	GTCCAGGTGAACGCAGAG	89
1758G>A	3' 2573	CGGCAGAGAACAGGTCAG	90
2573insC	5' 2850	CAGAGATGGAGAAGGTGAGAG	91
2573insC	3' 2850	TGGAGGAGGTCAGGCTTAC	92
4125-4133ins9	4125 F2	ACTCATCACCAACCTGTCATC	93
4125-4133ins9	4125 R2	GGAACTACCACATTGCTTTATTG	94
*5 대립유전자	D&D-F 1	ACCTCTCTGGGCCCTCA	95
*5 대립유전자	D&D-R 1	ATGCCACCTCCTCCTTCTC	96
*2N 대립유전자	D&D-F 1	ACCTCTCTGGGCCCTCA	95
*2N 대립유전자	D&D-R 1	ATGCCACCTCCTCCTTCTC	96

3) ASPE (allele specific primer extension) 반응

상기에서 얻은 다중 PCR 산물 각 6 ㎕, 1X amplitaq 완충액, Cy5 dUTP (진켐) 10 μM, 각 ASPE 프라이머 125 nM, AmpliTaq gold (Applied Biosystems : cat. No. N8080242) 1 유닛, 1X Band doctor (솔젠트) 및 3차 증류수를 넣어 20 ㎕로 맞춘 후 94℃에서 5분간 1회 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분간 30회의 사이클로 반응하여 증폭시켰으며 (도 12 참조), ASPE 반응 세트 및 프라이머 서열은 하기 표 19 및 20에 기재된 바와 같다.

ASPE 반응 세트

세트	주형	위치
1	CYP2D6 1 세트의 2nd PCR 산물	-1584C>G
		100C>T
		1611T>A
		2850C>T
		양성 대조군
2	CYP2D6 2 세트의 2nd PCR 산물	1758G>A
		2573insC
		4125 4133ins9
3	CYP2D6 3 세트의 2nd PCR 산물	*5 대립유전자
4	CYP2D6 4 세트의 2nd PCR 산물	*2N 대립유전자

ASPE 프라이머 서열

위치	프라이머명	염기서열 (5’→3’)	서열번호
-1584C>G	-1584(C)zip15	TCAACGTGCCAGCGCCGTCCTGGGAGCTAATTTTGTATTTTTTGTAGAGACCG	97
-1584C>G	-1584(G)zip16	GCGAAGGAACTCGACGTGGACGCCGGCTAATTTTGTATTTTTTGTAGAGACCC	98
100C>T	100(C)Zip27	ACTACGCAACACCGAACGGATACCCCGCTGGGCTGCACGCTACC	99
100C>T	100(T)Zip2	CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGATCGCTGGGCTGCACGCTACT	100
1611T>A	1611(T)zip40	CCCCGGATAGCTGACGAGGCTTACGCCCATAGCGCGCCAGGAA	101
1611T>A	1611(A)zip44	AGCAGCAGTGACAATGCCACCGCCGCCCATAGCGCGCCAGGAT	102
1758G>A	1758(G)Zip101R	ATCTGAACCCCGTCCTATGTGCCGCCTTCTGCCCATCACCCACC	103
1758G>A	1758(A)zip109	AGCACCCCCCGTCTTCATTAGGTTCCCTTCTGCCCATCACCCACT	104
2573insC	2573(G)Zip9	GGCTGGGTCTACAGATCCCCAACTTGTCAGGTCTCGGGGGGGC	105
2573insC	2573(C)Zip41	TCCGGACAGGTTGGGGTGCGTTTGGGTCAGGTCTCGGGGGGGG	106
2850C>T	2850(C)zip61	TCGGCGTACGAGCACCCACACCCAGGAACAGGTCAGCCACCACTATGCG	107
2850C>T	2850(T)Zip31	GAGACAAAGGTCTGCGCCAGCACCAGAACAGGTCAGCCACCACTATGCA	108
4125-4133ins9	4125-4133Zip21	CTGAATCCTCCAACCGGGTTGTCGAGCTTCTCGGTGCCCACTGGA	109
4125-4133ins9	4125-4133insZip22	TTCGGCGCTGGCGTAAAGCTTTTGGGCTTCTCGGTGCCCACTGTG	110
*5 대립유전자	6(A)zip106	GTCAGGTCTACCGCATGGAGAGTGTGCCCTCAGGGATGCTGCTGTA	111
*5 대립유전자	7(C)zip102	CGCACCTCCAGGACCAATCTTGTTCCCCTCAGGGATGCTGCTGTC	112
*2N 대립유전자	7(C)zip32	TGGCCACACTGTCCATTTGCGCGGTCCTCAGGGATGCTGCTGTC	113
*2N 대립유전자	6(A)zip19	CGTGGCGGTGCGGAGTTTCCCCGAACCTCAGGGATGCTGCTGTA	114
양성 대조군	2D6pc-1460(zip14)	CTCGGTGGTGCTGACGGTGCAATCCCCAACATGGTGAAACCCTATCTCTAC	115

4) PCR 정제

ASPE 반응에서 얻은 1 내지 4 세트의 산물을 pooling하여 Qiagen 정제 키트 (Qiagen: ca. no. 28106)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 정제하였으며, 최종 용출 부피는 50 ㎕로 하였다.

정제돤 각 산물을 농축기 (Speed Vacuum concentrator, BioTron사 module 4080C)를 이용하여 부피가 1 내지 2 ㎕ 정도 남을 때까지 건조시켰다.

5) 칩 혼성화

전혼성화 (prehybridization) 완충액 (25% 폼아마이드, 5X SSC, 0.1% SDS, 10mg/ml BSA)을 42℃에서 데운 다음, 칩을 상기 완충액에 담그고 42℃에서 30분 이상 배양하였다. 상기 칩을 증류수로 1분씩 3회 세척한 후, 칩을 코니컬 (conical) 튜브에 넣고 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 건조시켰다.

이후, 혼성화 완충액 (25% 폼아마이드, 5X SSC, 0.1% SDS, 0.5 ㎎/㎖ 폴리 A, 25 ㎍/㎖ Cot-1 DNA, 10% 덱스트란 설페이트)을 미리 42℃에서 데운 후, 상기에서 얻은 건조된 샘플을 여기에 녹였다. 잘 녹인 샘플을 0.5 ㎖ PCR 튜브로 옮긴 후, 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 혼성화 챔버 (chamber)를 준비하여 챔버 공간에 3M 페이퍼 조각을 넣고 3X SSC를 20 ㎕ 정도 떨어뜨렸다. 가열된 샘플을 전혼성화된 칩 위에 로딩한 다음, 챔버에 칩을 넣고 조립한 후, 42℃에서 밤새 혼성화시켰다.

상기 칩을 미리 50℃로 데워진 2X SSC 0.1% SDS 용액에서 10 분 동안 1회 세척한 후, 0.1X SSC 용액으로 1 분씩 상온에서 4회 세척하였다. 세척한 칩을 곧바로 코니컬 튜브에 넣고 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 건조시켰다.

6) 분석

상기와 같이 준비된 칩을 Axon의 GenePix 4100B 스캐너를 사용하여 출력파장은 650nm에 부근에서 스캐닝하였으며, 스캐닝된 이미지는 GenePix Pro 6.0 software를 사용하여 형광신호의 세기를 분석하였고 그 결과를 도 13 및 하기 표 21에 나타내었다.

야생형 스팟	돌연변이 스팟	세기	세기	서열	대립유전자	서열분석 결과
-1584C	-1584G	336	24343	GG	2D6 2/2	2/2
100C	100T	32411	155	CC
1611T	1611A	6753	228	TT
1758G	1758A	3812	370	WW
2573WT	2573insC	5865	842	WW
2850C	2850T	803	13919	TT
4125WT	4125ins9bp	13044	608	WW
del A	del C	18326	381	WW
dup CTG	dup ACA	12457	553	WW
양성 대조군	PC2D6	28948

그 결과, 유전자 분석칩을 이용하여 분석한 CYP2D6 유전자의 변이는 서열분석을 통해 확인된 결과와 동일하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 방법들은 한국인에서 발견되는 CYP2D6 유전자의 변이 유전자 검사를 위해 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 한국인에서 CYP2D6 효소활성의 개인차나 CYP2D6 결핍에 의해 발생가능한 이상징후를 예측하는데도 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 한국인과 유전적 특성이 유사한 기타 아시아권 인종의 CYP2D6 유전형 분석에 활용될 수 있다.

<110> Inje university Industry-academic cooperation foundation <120> htSNP FOR DETERMINING A GENOTYPE OF CYTOCHROME P450 2D6 GENE AND GENOTYPING CHIP USING THEREOF <130> DPP070151KR <160> 115 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6597 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cactggctcc aagcatggca gctgccatac aatccacctg tagagggccc ggtcctcctg 60 tcctcagtgg atgatcccgt agaagtccag agctcggcag ctgccctccc acaaaagaca 120 ggattttgaa agcagcaaga gagaagagac gtatcaggta gtcacagtgg ctcaggcctg 180 taatcccagc actttgggag gcccaggtgg gaggatcgct tcaccccagg aattcaagac 240 cagcctggac aacttggaag aacccggtct ctacaaaaaa tacaaaatta gctgggattg 300 ggtgcggtgg ctcatgccta taatcccagc actttgggag cctgaggtgg gtggatcacc 360 tgaagtcagg agttcaagac tagcctggcc aacatggtga aaccctatct ctactgaaaa 420 tacaaaaagc tagacgtggt ggcacacacc tgtaatccca gctacttagg aggctgaggc 480 aggagaattg cttgaagcct agaggtgaag gttgtagtga gccgagattg catcattgca 540 caatggaggg gagccaccag cctgggcaac aagaggaaat ctccgtctcc aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aagaattagg 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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttctcgt cactggtcag 60 gggtc 65 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_3 <400> 50 acctctctgg gccctcaggg a 21 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dup-F_2 <400> 51 cctcaccaca ggactggcca cc 22 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dup-R <400> 52 cacgtgcagg gcacctagat 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6-5R <400> 53 ctcgtcactg gtcaggggtc 20 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip2 <400> 54 caggccaagt atcttgcgcg gcagctcgtc gaccg 35 <210> 55 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip7 <400> 55 caggccaagt gtggtccatc acaaacaggg agtcg 35 <210> 56 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip8 <400> 56 caggccaagt cttgagcgat gacggacggg aaaag 35 <210> 57 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip9 <400> 57 caggccaagt aagttgggga tctgtagacc cagcc 35 <210> 58 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip14 <400> 58 caggccaagt ggattgcacc gtcagcacca ccgag 35 <210> 59 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip15 <400> 59 caggccaagt tcccaggacg gcgctggcac gttga 35 <210> 60 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip16 <400> 60 caggccaagt cggcgtccac gtcgagttcc ttcgc 35 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip19 <400> 61 caggccaagt ttcggggaaa ctccgcaccg ccacg 35 <210> 62 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip20 <400> 62 caggccaagt taggtttgcc agtgcgttgg atcg 34 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip21 <400> 63 caggccaagt tcgacaaccc ggttggagga ttcag 35 <210> 64 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip22 <400> 64 caggccaagt ccaaaagctt tacgccagcg ccgaa 35 <210> 65 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip24 <400> 65 caggccaagt agatcggtga gcagttcaaa gccgg 35 <210> 66 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip27 <400> 66 caggccaagt gggtatccgt tcggtgttgc gtagt 35 <210> 67 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip31 <400> 67 caggccaagt tggtgctggc gcagaccttt gtctc 35 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip32 <400> 68 caggccaagt accgcgcaaa tggacagtgt ggcca 35 <210> 69 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip33 <400> 69 caggccaagt gaccccaact tgacacgtcg caagg 35 <210> 70 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip40 <400> 70 caggccaagt cgtaagcctc gtcagctatc cgggg 35 <210> 71 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip41 <400> 71 caggccaagt ccaaacgcac cccaacctgt ccgga 35 <210> 72 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip44 <400> 72 caggccaagt cggcggtggc attgtcactg ctgct 35 <210> 73 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip50 <400> 73 caggccaagt gcagttcgtg gccatggtga ccgct 35 <210> 74 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip56 <400> 74 caggccaagt cgttgtggta gcggcactgg tggtg 35 <210> 75 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip61 <400> 75 caggccaagt ctgggtgtgg gtgctcgtac gccga 35 <210> 76 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip101 <400> 76 caggccaagt cggcacatag gacggggttc agata 35 <210> 77 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip102 <400> 77 caggccaagt gaacaagatt ggtcctggag gtgcg 35 <210> 78 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip104 <400> 78 caggccaagt tcggatggcg ttcagtagga gaagg 35 <210> 79 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip106 <400> 79 caggccaagt acactctcca tgcggtagac ctgac 35 <210> 80 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cZip109 <400> 80 caggccaagt gaacctaatg aagacggggg gtgct 35 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> -1584 F1 <400> 81 gctgccatac aatccacctg 20 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> -1584 R1 <400> 82 gctcactaca accttcacct c 21 <210> 83 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 100 F2 <400> 83 gtcctgcctg gtcctctg 18 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 100 R2 <400> 84 cttgccctac tcttccttgg 20 <210> 85 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'1611 <400> 85 gtgggcagag acgaggtg 18 <210> 86 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'1611 <400> 86 cggagtggtt ggcgaagg 18 <210> 87 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1758 F1 <400> 87 cttctccgtg tccaccttg 19 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1758 R1 <400> 88 tgtcctttcc caaacccatc 20 <210> 89 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' 2573 <400> 89 gtccaggtga acgcagag 18 <210> 90 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' 2573 <400> 90 cggcagagaa caggtcag 18 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' 2850 <400> 91 cagagatgga gaaggtgaga g 21 <210> 92 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' 2850 <400> 92 tggaggaggt caggcttac 19 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4125 F2 <400> 93 actcatcacc aacctgtcat c 21 <210> 94 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4125 R2 <400> 94 ggaactacca cattgcttta ttg 23 <210> 95 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D&D-F 1 <400> 95 acctctctgg gccctca 17 <210> 96 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D&D-R 1 <400> 96 atgccacctc ctccttctc 19 <210> 97 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> -1584(C)zip15 <400> 97 tcaacgtgcc agcgccgtcc tgggagctaa ttttgtattt tttgtagaga ccg 53 <210> 98 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> -1584(G)zip16 <400> 98 gcgaaggaac tcgacgtgga cgccggctaa ttttgtattt tttgtagaga ccc 53 <210> 99 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 100(C)Zip27 <400> 99 actacgcaac accgaacgga taccccgctg ggctgcacgc tacc 44 <210> 100 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 100(T)Zip2 <400> 100 cggtcgacga gctgccgcgc aagatcgctg ggctgcacgc tact 44 <210> 101 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1611(T)zip40 <400> 101 ccccggatag ctgacgaggc ttacgcccat agcgcgccag gaa 43 <210> 102 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1611(A)zip44 <400> 102 agcagcagtg acaatgccac cgccgcccat agcgcgccag gat 43 <210> 103 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1758(G)Zip101R <400> 103 atctgaaccc cgtcctatgt gccgccttct gcccatcacc cacc 44 <210> 104 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1758(A)zip109 <400> 104 agcacccccc gtcttcatta ggttcccttc tgcccatcac ccact 45 <210> 105 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2573(G)Zip9 <400> 105 ggctgggtct acagatcccc aacttgtcag gtctcggggg ggc 43 <210> 106 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2573(C)Zip41 <400> 106 tccggacagg ttggggtgcg tttgggtcag gtctcggggg ggg 43 <210> 107 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2850(C)zip61 <400> 107 tcggcgtacg agcacccaca cccaggaaca ggtcagccac cactatgcg 49 <210> 108 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2850(T)Zip31 <400> 108 gagacaaagg tctgcgccag caccagaaca ggtcagccac cactatgca 49 <210> 109 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4125-4133Zip21 <400> 109 ctgaatcctc caaccgggtt gtcgagcttc tcggtgccca ctgga 45 <210> 110 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4125-4133insZip22 <400> 110 ttcggcgctg gcgtaaagct tttgggcttc tcggtgccca ctgtg 45 <210> 111 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6(A)zip106 <400> 111 gtcaggtcta ccgcatggag agtgtgccct cagggatgct gctgta 46 <210> 112 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7(C)zip102 <400> 112 cgcacctcca ggaccaatct tgttcccctc agggatgctg ctgtc 45 <210> 113 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7(C)zip32 <400> 113 tggccacact gtccatttgc gcggtcctca gggatgctgc tgtc 44 <210> 114 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6(A)zip19 <400> 114 cgtggcggtg cggagtttcc ccgaacctca gggatgctgc tgta 44 <210> 115 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2D6pc-1460(zip14) <400> 115 ctcggtggtg ctgacggtgc aatccccaac atggtgaaac cctatctcta c 51

Claims

(a) 한국인 또는 이와 유사한 유전적 특성을 가지는 아시아인으로부터 채취된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 핵산을 주형으로 하고 한국인 또는 이와 유사한 유전적 특성을 가지는 아시아인의 CYP2D6 유전자 또는 이의 단편을 증폭할 수 있는 프라이머로 PCR을 수행하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계에서 얻은 PCR 산물의 염기서열에서 -1584C>G; -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T 로 이루어진 군에서 하나; -1245insGA, -1028T>C, -377A>G , 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; 1661G>C 또는 4180G>C; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; -1235A>G; 1611T>A; 1758G>A; 1887insTA; 2573insC; 2988G>A; 4125-4133insGTGCCCACT; 2D6 결실 (deletion); 및 2D6 중복 (duplication)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 9개의 CYP2D6 유전자 변이의 존재 유무를 조사하는 단계를 포함하는, 인간 CYP2D6 유전자의 유전형을 결정하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (a) 단계의 생물학적 시료가 혈액, 피부 세포, 점막 세포 및 모발로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (b) 단계의 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 17 내지 서열번호 23, 서열번호 25 내지 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 45 및 서열번호 46으로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (c) 단계에서 -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T 로 이루어진 군에서 하나; -1028T>C, -377A>G , 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1758G>A; 1887insTA; 2573insC; 2988G>A; 4125-4133insGTGCCCACT; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 변이의 존재 유무를 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (c) 단계에서 -1584C>G; -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1758G>A; 2573insC; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; -1245insGA, -1028T>C, -377A>G, 3877G>A , 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; 4125-4133insGTGCCCACT; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 변이의 존재 유무를 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (c) 단계에서 -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T 로 이루어진 군에서 하나; -1584C>G; -1028T>C, -377A>G , 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1758G>A; 1887insTA; 2573insC; 4125-4133insGTGCCCACT; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 변이의 존재 유무를 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (c) 단계에서 -1584C>G; -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1758G>A; 2573insC; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; -1245insGA, -1028T>C, -377A>G, 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; 4125-4133insGTGCCCACT; -1235A>G; 1887insTA; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 변이의 존재 유무를 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (c) 단계에서 -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T로 이루어진 군에서 하나; -1028T>C, -377A>G, 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1661G>C 및 4180G>C로 이루어진 군에서 하나; 1758G>A; 1887insTA; 2573insC; 2988G>A; 4125-4133insGTGCCCACT; -1235A>G; 1887insTA; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 변이의 존재 유무를 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (c) 단계에서 -1584C>G; -1426C>T, 100C>T 및 1039C>T로 이루어진 군에서 하나; 1611T>A; 1758G>A; 2573insC; -740C>T, -678G>A, 214G>C, 221C>A, 223C>G, 227T>C, 232G>C, 233A>C, 245A>G 및 2850C>T로 이루어진 군에서 하나; -1245insGA, -1028T>C, -377A>G, 3877G>A, 4388C>T 및 4401C>T로 이루어진 군에서 하나; 1887insTA; 2988G>A; 4125-4133insGTGCCCACT; 2D6 결실; 및 2D6 중복으로 이루어진 변이의 존재 유무를 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (c) 단계에서 변이의 존재 유무 조사는 스냅샷 (SNaPshot) 분석을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서,

상기 스냅샷 분석은 단일염기다형성 위치의 바로 옆 염기가 3′말단이 되고 상기 단일염기다형성 위치의 인접부위에 어닐링되는 서열을 포함하며 5′말단에는 T 염기가 부가된 프라이머를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서,

상기 프라이머는 서열번호 37 내지 서열번호 44, 서열번호 48 및 서열번호 49로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계(b) 이후,

(b1) 다중 PCR을 수행하여 동정하고자 하는 SNP 주변을 포함하는 PCR 산물을 얻는 단계; 및

(b2) 상기 다중 PCR 산물을 주형으로 서열번호 97 내지 115의 프라이머를 이용하여 PCR 산물을 얻는 단계를 더 포함하고, 단계 (c)의 유전자 변이의 존재유무의 조사단계는,

(c1) 상기 (b2)의 반응 산물을 유전자 칩에 혼성화시키는 단계; 및

(c2) 상기 칩을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 CYP2D6 유전자의 유전형을 결정하는 방법.
제 13항에 있어서,

유전자 칩이 서열번호 54 내지 80의 염기서열을 갖는 프로브를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
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