KR20190041138A - 약물 부작용과 관련된 대립유전자 및 이의 검출 방법 - Google Patents

약물 부작용과 관련된 대립유전자 및 이의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 CYP2D6, CYP2C19, DRD2, ANNK1 및 GRIK4에 존재하는 변이를 고속으로 검출함으로써 항정신병 약물의 부작용의 발생 위험도를 예측하는 방법에 대한 것으로, 약물 부작용과 관련된 유전자 CYP2D6, CYP2C19, DRD2, ANKK1 및 GRIK4의 특정 대립유전자를 보다 빠르고 저렴하게 확인할 수 있으며, 높은 정확성을 나타내므로, 약물성 과민 반응을 사전에 예방하고 대체 약물투여로 치료의 효과 및 성공률을 높이는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

약물 부작용과 관련된 대립유전자 및 이의 검출 방법{ALLELES ASSOCIATED WITH ADVERSE DRUG REACTION AND DETECTING METHOD THEREOF}
본 발명은 약물 부작용과 관련된 대립유전자의 용도에 대한 것으로, 구체적으로, 유전자 CYP2D6, CYP2C19, DRD2, ANNK1 및 GRIK4에 존재하는 변이를 고속으로 검출함으로써 항정신병 약물의 부작용의 발생 위험도를 예측하는 방법에 대한 것이다.
인간유전체 지도의 완성과 차세대 염기서열분석 (Next Generation Sequencing, NGS) 등 유전체 기반 기술과, 중개·임상 연구로 이어지는 기초 및 임상 연구 기반 기술의 발전으로, 맞춤의료의 구현이 현실화되고 있다. 특히, 약물유전체연구 (pharmacogenomics)는 각 개인의 유전적/환경적 요인에 근거하여 약물반응을 예측함으로써, 효과적이며 안전한 맞춤약물치료를 가능하게 하는 핵심 연구분야이다 (Shastry BS. Pharmacogenetics and the concept of individualized medicine. Pharmacogenomics J 2006;6(1):16-21).
약물유전체연구의 성장으로 다수의 약물유전체바이오마커가 많은 연구를 통해 임상적으로 검증되고 있으며, 미국 또는 유럽의 식약처에서는 “검증된 약물유전체바이오마커 (valid pharmacogenomics biomarker)”내용을 의약품 설명서 (2016년 2월, 136개 약물, 54개의 바이오마커 포함)에 포함시켜 약물반응의 다양성을 설명하거나 치료실패/약물이상반응을 경고하고 있다 (Table of Pharmacogenomic Biomarkers in Drug Labeling. US Food and Drug Administration. Available at http://www.fda.gov/Drugs (last accessed 2 February 2016)). 이 중, 약품설명서에 바이오마커관련 내용을 가장 많이 포함하고 있는 약물이 항암제이며, 두 번째가 항우울제 또는 항조현병제 약물로서, 이들 약물 투여 시 약물유전체바이오마커에 따른 약물요량조절을 권고하고 있다.
개체간의 유전적 다양성은 약물의 독성 및 효능에 있어서 개체간 차이를 가져온다. 따라서, 약물 개발의 초기 단계에서 이와 같은 약제학적으로 중요한 단백질의 유전적 다양성에 대한 효과를 고려하는 것은 약물 개발의 실패에 대한 위험성을 낮출 수 있는 중요한 요소이다. 이러한 개체간 유전적 다양성을 측정하는 하나의 조사 집단이 되는 것이 "일배체형 (haplotype)"이다. 일배체형이란 하나의 조사 집단 내에 존재하는 각 유전자 서열의 다형성의 조합을 의미하며, 이것은 개별적인 다형성보다 유전적 다양성에 관한 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 정보를 제공한다.
항우울증 항조현병등 항정신병 약물은 대부분 뇌내의 도파민과 세레토닌의 활성을 억제하는 약물들로 chlorpromazine, perphenazine, loxapine, trifluoperazine , haloperidol, bromperidol, pimozide, sulpiride clozapine, risperidone, olanzapine, quetiapine등이 주로 사용되며 긴장, 과다활동, 투쟁성, 적개심, 거부증, 환각, 급성 망상, 불면, 지나친 금식, 위축및 폐쇄등 다양한 약물 부작용이 발생한다. 이러한 작고 큰 부작용은 환자의 약물 복용을 중단시키는 원인이 되어 지며 이는 약물 치료의 실패로 이르게 된다.
최근 검증된 약물-유전체바이오마커 쌍에 대해 미국 등 외국의 주요 대형병원 (StJude Children's Research Hospital, Mayo Clinic, Vanderbilt University Medical Center 등) 에서는 약물 치료 전에 환자 Preemptive genotype service를 통해, 약물유전체연구와 맞춤치료 진료를 동시에 수행하고 있다. 가장 대표적인 예가 Mayo clinic의 RIGHT (Right Drug, Right Dose, Right Time-Using Genomic Data to Individualize Treatment) 프로그램으로, 유전형결과의 임상적용을 통해 환자의 약물치료결과를 개선하기 위한 최적의 방법을 창출하는 것을 목적으로 한다 (Bielinski SJ, Olson JE, Pathak J, Weinshilboum RM, Wang L, Lyke KJ, et al. Preemptive genotyping for personalized medicine: design of the right drug, right dose, right time-using genomic data to individualize treatment protocol. Mayo Clin Proc 2014;89(1):25-33)).
인종, 식이, 환경에 따라서 다르게 표현될 수 있으나, 한국에서 항우울제 또는 항조현병제관련 약물유전체바이오마커 기반의 적정 약물 선별 및 약물용량 예측 맞춤치료 연구 및 임상적용사례는 거의 전무하며, 현재 약물 부작용 관련 유전자 분석을 위해 일반적으로 사용되는 방법인 풀 시퀀싱 (full sequencing)은 시간이 많이 소요되어 임상적 치료를 시작하기 전 이용하기에는 시간상으로 적절하지 않으며, RT-PCR (real time PCR) 방법 및 대립 유전자 특이적 (allele specific PCR) 방법 등이 사용되고 있지만 이는 위양성 (false positive) 결과를 도출하는 위험성도 가지고 있는 문제가 있어왔다.
본 발명에서는 한국인을 포함한 아시아인에게서 약물 부작용과 관련된 특정 대립유전자와 이의 존재 여부를 신속하게 결정함으로써 항우울제 또는 항조현병제로 인한 약물 부작용을 예측하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 약물 부작용 예측 또는 진단을 위한 마커용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약물 부작용 예측 또는 진단용 분석 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 약물 부작용, 약동학, 약물 치료 효과의 예측을 위한 약물유전형 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 약물 부작용 유발 약물을 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 약물 부작용과 관련된 유전자 CYP2D6, CYP2C19, DRD2, ANKK1 및 GRIK4의 특정 대립유전자의 변이를 보다 빠르고 저렴하게 확인할 수 있으며, 높은 정확성을 나타내므로, 약물성 과민 반응을 사전에 예방하고 대체 약물투여로 치료의 효과 및 성공률을 높이는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1는 본 발명의 방법에 따른 CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10B, CYP2D6*14, CYP2D6*18, CYP2D6*21, CYP2D6*41, CYP2D6*49, CYP2D6*52, CYP2D6*60, CYP2D62D6 중복(duplication) (*1xN, *2xN, *10xN), 즉, CYP2D6 유전자의 1758G>T, 100C>T, 1611T>A, 2573>C 삽입, 2988G>A, 3877G>A, 4125>중복 (GTGCCCACT 삽입), 2850C>T, 1887>TA 삽입, 결실 및 1846G>A을 확인한 도이다.
도 2는 CYP2C19*2(NC_000010.10:g.96541616G>A), CYP2C19*3(NC_000010.10:g.96540410G>A), CYP2C19*17(NC_000010.10:g.96521657C>A), DRD2 rs1799732 (NC_000011.10 g.-50978A>G), DRD2 rs1799978(NC_000011.10 g.-50878insC), DRD2 rs1801028g.(NC_000011.10 11890C>G), ANKK1 rs1800497(NC_000011.10 g.24546C>T) 및 GRIK4 rs1954787(NC_000011.10 g.120792654T>C), 즉, 인간 CYP2C19 유전자의 96541616G>A(*2), 96540410G>A(*3) 및 96521657C>A(*17), 인간 DRD2 유전자의 -50978A>G (rs1799732), -50878>C 삽입 (rs1799978) 및 11890C>G (rs1801028), 인간 ANKK1 유전자의 24546C>T (rs1800497), 및 인간 GRIK4 유전자의 120792654T>C (rs1954787)을 동시에 분석하여 검출한 결과이다.
본 발명을 보다 충분히 이해할 수 있도록 하기 위하여 하기의 상세한 설명을 기재한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 용어와 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 보편적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다.
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 하기와 같다.
‘유전적 다형성 (genetic polymorphism)'은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말하며, 이 중 DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 이라고 한다.
‘다형성'이라는 용어는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 "대립유전자"로 구성된다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, 이 예에서, CC, CT 또는 TT). 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NCBI 웹사이트 상에서 이용가능한 뉴클레오티드 염기 변이의 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스(Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation)에서 사용되는 것인, 지정된 독특한 식별자 ("기준 SNP", "refSNP" 또는 "rs#"이다.
‘유전자형'이라는 용어는 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특이적 대립유전자를 지칭한다.
‘표현형'은 유전형에 의해서 결정되는 개체의 형태학적, 생리학적, 또는 생화학적 특징을 표현형이라 한다. 유전형이란 표현형과 구별되는 것으로, 개인의 유전자 구성을 뜻하며, 보다 좁은 의미로는 한 유전자 위에 존재하는 대립 유전자들(alleles)을 말한다.
‘대립 인자' 또는 ‘대립 유전자'란 같은 염색체 위치 (same chromosomallocus)를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태 (alternative forms) 중 하나를 뜻한다.
‘대립유전자 빈도'는 대립유전자가 개체 내, 계통 내, 또는 계통의 집단 내에 존재하는 빈도 (비율 또는 백분율)을 지칭한다. 계통 또는 집단 내에서의 대립유전자 빈도를, 계통 또는 집단으로부터의 개체들의 샘플의 대립유전자 빈도를 평균화함으로써 추정할 수 있다.
‘위험'은 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않은 개체의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비교하여, 특정 다형성 대립유전자를 보유한 개체에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도가 통계적으로 높음을 나타낸다.
‘핵산'은 데옥시리보핵산 (DNA), 및 적절하다면 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이 용어는 또한, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체 (예, 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및, 서술된 구체예에 적용된 대로, 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중나선 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서는 ‘핵산'이라는 용어와 ‘뉴클레오티드'가 병용하여 쓰이고 있다.
‘프라이머'는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.
“기능적 등가물"이라는 용어는 예를 들어, 기준(reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준 서열과 실험(subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과(net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가진다. 본 발명의 목적을 위해서는, 실질적으로 등가적인 생물학적 활성과 실질적으로 등가적인 합성 특징을 가지는 서열들은 실질적 등가물로 취급된다.
‘대상' 또는 '환자'는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.
‘조직 또는 세포 샘플(시료)'은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 인간 CYP2D6(Cytochrome P450 2D6) 유전자의 1758G>T, 100C>T, 1611T>A, 2573>C 삽입, 2988G>A, 3877G>A, 4125>중복 (GTGCCCACT 삽입), 2850C>T, 1887>TA 삽입, 결실 및 1846G>A, 인간 CYP2C19(Cytochrome P450 2C19) 유전자의 96541616G>A(*2), 96540410G>A(*3) 및 96521657C>A(*17), 인간 DRD2(Dopamine receptor D2) 유전자의 -50978A>G (rs1799732), -50878>C 삽입 (rs1799978) 및 11890C>G (rs1801028), 인간 ANKK1(Ankyrin repeat and kinase domain containing 1) 유전자의 24546C>T (rs1800497), 및 인간 GRIK4(Glutamate Ionotropic Receptor Kainate Type Subunit 4) 유전자의 120792654T>C (rs1954787)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자 변이를 포함하는, 약물 부작용 예측 또는 진단을 위한 마커용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 CYP2C19, CYP2D6, DRD2, ANKK1 및 GRIK4의 특정 대립유전자는 각각 별도로, 혹은 함께 검출될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 약물 부작용 예측 또는 진단을 위한 마커용 조성물은 서열번호 23 내지 42의 다중 단일염기 프라이머들 중 어느 하나를 포함일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 약물 부작용은 항우울제 또는 항조현병제로 인한 약물 부작용일 수 있으며, 상기 약물은 아미트리프틸린, 클로미프라민, 독세핀, 이미프라민, 아목사핀, 노르트립틸린, 시탈로프람, 에스시탈로프람, 플루옥세틴, 플루복사민, 밀나시프란, 파록세틴, 설트랄린, 벤라팍신, 아토목세틴, 부프로피온, 듀록세틴, 미르타자핀, 트라조돈, 셀레길린, 클로르프로마진, 페르페나진, 몰린돈, 할로페리돌, 아리피프라졸, 클로자핀, 올란자핀, 팔리페리돈, 쿠에티아핀, 리스페리돈, 설피리드, 지프라시돈 및 죠테핀으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 이로 인한 부작용은 백내장, 점막건조, 동공산대와 모양근 마비, 안내압증가, 고열, 변비, 무력성 장폐색증, 뇨저류, 배뇨지연, 요로 확장, 위약, 기면, 피로, 흥분, 동요, 악몽, 불안, 불면증, 혼돈, 집중곤란, 방향상실, 망상, 환각, 발작, 추체외로 증상, 말초신경통, 어지러움, 이명, 운동실조, 무감각, 쑤심, 이상감각, 조화불능, 운동실조, 불안정, 기절, 부정맥, 고혈압, 혈전증, 울혈성 심질환, 간손상, 황달, 간염, 홍반, 점상출혈, 담마진 , 소양증, 호산성구증가, 부종, 광과민증, 알러지, 식욕감퇴, 구토, 설사, 복부 경련, 성욕감퇴, 발기부전, 유즙분비과다, 미각소실, 빈뇨, 야뇨, 코충혈, 두통, 탈모, 홍조, 식욕증진, 체중증가 또는 감소, 간질성 폐렴, 오한, 발한, 당뇨병, 약물금단증후군, 자살사고 및 심근염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 CYP2C19, CYP2D6, DRD2, ANKK1 및 GRIK4 유전자는 약물 부작용(Adverse Drug Reaction, ADR)과 관련되어 있으며, 본 발명의 조성물은 특히, CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10B, CYP2D6*14, CYP2D6*18, CYP2D6*21, CYP2D6*41, CYP2D6*49, CYP2D6*52, CYP2D6*60, CYP2D62D6 중복(duplication) (*1xN, *2xN, *10xN), CYP2C19*2(NC_000010.10:g.96541616G>A), CYP2C19*3(NC_000010.10:g.96540410G>A), CYP2C19*17(NC_000010.10:g.96521657C>A), DRD2 rs1799732 (NC_000011.10 g.-50978A>G), DRD2 rs1799978(NC_000011.10 g.-50878insC), DRD2 rs1801028g.(NC_000011.10 11890C>G), ANKK1 rs1800497(NC_000011.10 g.24546C>T) 및 GRIK4 rs1954787(NC_000011.10 g.120792654T>C)을 동시에 분석하여 각각의 유전자의 변이, 즉, 인간 CYP2D6 유전자의 1758G>T, 100C>T, 1611T>A, 2573>C 삽입, 2988G>A, 3877G>A, 4125>중복 (GTGCCCACT 삽입), 2850C>T, 1887>TA 삽입, 결실 및 1846G>A, 인간 CYP2C19 유전자의 96541616G>A(*2), 96540410G>A(*3) 및 96521657C>A(*17), 인간 DRD2 유전자의 -50978A>G (rs1799732), -50878>C 삽입 (rs1799978) 및 11890C>G (rs1801028), 인간 ANKK1 유전자의 24546C>T (rs1800497), 및 인간 GRIK4 유전자의 120792654T>C (rs1954787)를 검출할 수 있는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, CYP2C19은 유전적 다형성에 따라 각각 PM (poor metabolizers), IM (intermediate metabolizers), EM (extensive metabolizers) UM (ultrarapid metaboilzers) 군으로 분류되며, 이러한 표현형에 따라, 아미트리프틸린, 클로미프라민, 독세핀, 이미프라민, 시탈로프람, 에스시탈로프람, 설트랄린 복용시 주의가 필요하다.
또한, CYP2D6는 유전적 다형성에 따라 각각 PM (poor metabolizers), IM (intermediate metabolizers), EM (extensive metabolizers) UM (ultrarapid metaboilzers) 군으로 분류된다. 이러한 표현형 (phenotype)에 따라, 아미트리프틸린, 클로미프라민, 독세핀, 이미프라민, 노르트립틸린, 플루복사민, 파록세틴, 벤라팍신, 아토목세틴, 페르페나진, 할로페리돌, 아리피프라졸, 클로자핀, 리스페리돈 복용시 주의가 필요하다. CYP2D6 유전자의 대립인자는 하기 표 1과 같으며, 각 유전형의 변이를 하기 표 2에 기재하였다 (대한민국등록특허 제10-0973049호 참조). 또한, 유전형에 따른 표현형을 표 3에 기재하였다.
Figure pat00001
*Normal은 정상 수준, Incr는 증가함, Decr는 감소함, None은 활성 없음을 각각 나타낸다. 또한, 괄호안의 표기는 분석에 사용한 표지약물의 약자이다: b, bufuralol; d, debrisoquine; dx, dextromethorphan; s, sparteine.
Figure pat00002
*'1'은 야생형을, '2'는 변이형을 각각 나타낸다.
Gene Activity Score Allele_1 Allele_2 phenotype_CPIC
CYP2D6 4 *1XN, *2XN *1XN, *2XN UM
CYP2D6 3 *1XN, *2XN *1, *2 UM
CYP2D6 2.5 *1XN *41,*49,*52, *10XN UM
CYP2D6 2.25 *1XN, *2XN *10 UM
CYP2D6 2 *1XN, *2XN *4, *5, *14, *18, *21, *60 NM
CYP2D6 2 *1, *2 *1, *2 NM
CYP2D6 1.5 *1, *2 *41, *49, *52, *10XN NM
CYP2D6 1.25 *1, *2 *10 NM
CYP2D6 1 *1, *2 *4, *5, *14, *18, *21, *60 NM
CYP2D6 1 *41,*49, *52, *10XN *41, *49, *52, *10XN NM
CYP2D6 0.75 *10 *41, *49, *52, *10XN -
CYP2D6 0.5 *4, *5, *14, *18, *21, *60 *41, *49, *52, *10XN IM
CYP2D6 0.5 *10 *10 IM
CYP2D6 0.25 *4, *5, *14, *18, *21, *60 *10 -
CYP2D6 0 *4, *5, *14, *18, *21, *60 *4, *5, *14, *18, *21, *60 PM
또한, DRD2의 rs1799732, rs1799978 및 rs1801028은 각 유전형에 따라, 클로르프로마진, 아리피프라졸, 클로자핀, 올란자핀, 리스페리돈, 복용시 주의가 필요하다.
또한, ANKK1의 rs1800497에 있어, CT 또는 TT 유전형의 환자는 CC 유전형의 환자와 비교하여, 고프로락틴 혈증 및 체중 증가를 포함한 부작용 위험이 증가 할 수 있으나, 항정신병제 치료중 지연성 운동장애의 위험이 감소할 가능성이 있다고 보고 되며 (클로자핀, 올란자핀, 리스페리돈), TT 유전형 환자는 CC 유전형 환자에 비해 증상이 개선될 가능성이 있다 (아리피프라졸, 리스페리돈).
아울러, GRIK4의 rs1954787에 있어, TT 또는 TC 유전형을 가진 우울장애 또는 우울증 환자는 CC 유전형 환자에 비해 낮은 항우울제 (아미트리프틸린, 클로미프라민, 독세핀, 이미프라민, 아목사핀, 노르트립틸린, 시탈로프람, 에스시탈로프람, 플루옥세틴, 플루복사민, 밀나시프란, 파록세틴, 설트랄린, 벤라팍신, 아토목세틴, 부프로피온, 듀록세틴, 미르타자핀, 트라조돈, 셀레길린) 치료 반응을 나타낸다.
본 발명의 인간 CYP2D6 유전자의 1758G>T, 100C>T, 1611T>A, 2573insC, 2988G>A, 3877G>A, 4125>중복 (GTGCCCACT 삽입), 2850C>T, 1887>TA 삽입, 결실 및 1846G>A, 인간 CYP2C19 유전자의 96541616G>A(*2), 96540410G>A(*3) 및 96521657C>A(*17), 인간 DRD2 유전자의 -50978A>G (rs1799732), -50878>C 삽입 (rs1799978) 및 11890C>G (rs1801028), 인간 ANKK1 유전자의 24546C>T (rs1800497), 및 인간 GRIK4 유전자의 120792654T>C (rs1954787)는 아미트리프틸린, 클로미프라민, 독세핀, 이미프라민, 아목사핀, 노르트립틸린, 시탈로프람, 에스시탈로프람, 플루옥세틴, 플루복사민, 밀나시프란, 파록세틴, 설트랄린, 벤라팍신, 아토목세틴, 부프로피온, 듀록세틴, 미르타자핀, 트라조돈, 셀레길린, 클로르프로마진, 페르페나진, 몰린돈, 할로페리돌, 아리피프라졸, 클로자핀, 올란자핀, 팔리페리돈, 쿠에티아핀, 리스페리돈, 설피리드, 지프라시돈 및 죠테핀 등의 약물 관련 부작용과 밀접한 관련을 나타내는 마커로서 기능하기 때문에, 상기 약물들의 부작용 위험을 평가할 수 있는 지표로 사용할 수 있다. 예를 들어, CYP2D6 PM은 아미트리프틸린 복용시 백내장, 점막건조, 동공산대와 모양근 마비, 안내압증가, 고열, 변비, 무력성 장폐색증, 뇨저류, 배뇨지연, 요로 확장, 위약, 기면, 피로, 흥분, 동요, 악몽, 불안, 불면증, 혼돈, 집중곤란, 방향상실, 망상, 환각, 발작, 추체외로 증상, 말초신경통, 어지러움, 이명, 운동실조, 무감각, 쑤심, 이상감각, 조화불능, 운동실조, 불안정, 기절, 부정맥, 고혈압, 혈전증, 울혈성 심질환, 간손상, 황달, 간염, 홍반, 점상출혈, 담마진 , 소양증, 호산성구증가, 부종, 광과민증, 알러지, 식욕감퇴, 구토, 설사, 복부 경련, 성욕감퇴, 발기부전, 유즙분비과다, 미각소실, 빈뇨, 야뇨, 코충혈, 두통, 탈모, 홍조, 식욕증진, 체중증가 또는 감소, 간질성 폐렴, 오한, 발한 등과 같은 약물 부작용이 일어날 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는, 약물 부작용 예측 또는 진단용 분석 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10B, CYP2D6*14, CYP2D6*18, CYP2D6*21, CYP2D6*41, CYP2D6*49, CYP2D6*52, CYP2D6*60, CYP2D62D6 중복(duplication) (*1xN, *2xN, *10xN), CYP2C19*2(NC_000010.10:g.96541616G>A), CYP2C19*3(NC_000010.10:g.96540410G>A), CYP2C19*17(NC_000010.10:g.96521657C>A), DRD2 rs1799732 (NC_000011.10 g.-50978A>G), DRD2 rs1799978(NC_000011.10 g.-50878insC), DRD2 rs1801028g.(NC_000011.10 11890C>G), ANKK1 rs1800497(NC_000011.10 g.24546C>T) 및 GRIK4 rs1954787(NC_000011.10 g.120792654T>C)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 대립유전자 검출을 위한 프로브를 포함한다.
일 구현예에서, 프로브는 본원에서 다른 물질을 검출하는데 유용한 임의의 물질을 의미한다. 따라서, 프로브는 관심 대상의 대립유전자 내의 특정 영역에 특이적으로 부합화 (hybridize)하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
상기 키트는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다.
특히, 본 발명에서는 CYP2C19, CYP2D6, DRD2, ANKK1 및 GRIK4의 특정 유전자 변이, 구체적으로, 인간 CYP2D6 유전자의 1758G>T, 100C>T, 1611T>A, 2573insC, 2988G>A, 3877G>A, 4125>중복 (GTGCCCACT 삽입), 2850C>T, 1887>TA 삽입, 결실 및 1846G>A, 인간 CYP2C19 유전자의 96541616G>A(*2), 96540410G>A(*3) 및 96521657C>A(*17), 인간 DRD2 유전자의 -50978A>G (rs1799732), -50878>C 삽입 (rs1799978) 및 11890C>G (rs1801028), 인간 ANKK1 유전자의 24546C>T (rs1800497), 및 인간 GRIK4 유전자의 120792654T>C (rs1954787)를 검출을 위한 다양한 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하며, 각각의 단일 염기 다형성(SNP) 영역 증폭을 위한 프라이머 세트, 예를 들어 서열번호 1 내지 22로 표시되는 프라이머 세트; 및 스냅샷 분석을 위한 다중 단일염기 프라이머, 예를 들어 서열번호 23 내지 42로 표시되는 다중 단일염기 프라이머를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 키트는 DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP), 형광물질 등의 표지 물질을 추가로 더 함유할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 (a) 인간으로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 채취된 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 핵산을 주형으로 하고 인간 CYP2D6 유전자, CYP2C19 유전자, 인간 DRD2 유전자, 인간 ANKK1 유전자 및 인간 GRIK4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이의 단편을 증폭할 수 있는 프라이머로 PCR을 수행하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 얻은 PCR 산물의 염기서열에서 유전자 변이 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 약물유전형에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 약물유전형은 약동학, 약물치료효과 및 약물유해반응을 예측하고 이를 고려하여 개인별 맞춤약물치료 요법을 시행하기 위한 정보를 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 CYP2C19, CYP2D6, DRD2, ANKK1 및 GRIK4에서 특정 대립유전자가 존재할 때 약물 부작용 위험이 있는 것으로 판단될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료가 혈액, 피부 세포, 점막 세포 및 모발로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (c) 단계의 프라이머는 서열번호 1 내지 22으로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 변이 포함 영역 증폭을 위한 프라이머 세트일 수 있으며, PCR은 다중 중합효소연쇄반응 (multiplex polymerase chine reaction, multiplex PCR)일 수 있다. 유전자 변이 포함 영역을 PCR 증폭으로부터 얻은 DNA 산물은 예를 들면, 가수분해 프로브(TaqMan, Beacons, Scorpions), 부합화 프로브와 같은 서열 특이적 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 이들 프로브는 예를 들면 CYP2C19*2의 관심 대상의 영역에 결합하도록 설계된다. 상기 PCR 산물은 DNA-결합제에 의해서도 검출될 수 있다.
일 구현예에서, 유전자 변이는 인간 CYP2D6 유전자의 1758G>T, 100C>T, 1611T>A, 2573insC, 2988G>A, 3877G>A, 4125>중복 (GTGCCCACT 삽입), 2850C>T, 1887>TA 삽입, 결실 및 1846G>A, 인간 CYP2C19 유전자의96541616G>A(*2), 96540410G>A(*3) 및 96521657C>A(*17), 인간 DRD2 유전자의 -50978A>G (rs1799732), -50878>C 삽입 (rs1799978) 및 11890C>G (rs1801028), 인간 ANKK1 유전자의 24546C>T (rs1800497), 및 인간 GRIK4 유전자의 120792654T>C (rs1954787)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (d) 단계의 유전자 변이 존재 유무는 서열번호 23 내지 42의 다중 단일염기 프라이머를 이용한 스냅샷 (SNaPshot) 분석을 통해 확인될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 단계 (c)에서 증폭한 유전자 변이 포함 영역의 증폭 산물과 상기 다중 단일염기 프라이머를 이용하여 SNaPshot 분석법으로 유전자 변이 (SNP)를 분석하고, 생성 산물에 대한 단일 염기 다형성(SNP)에 대한 최고점을 분석하여 유전형을 확인하였다.
일 구현예에서, 본 발명의 CYP2C19, CYP2D6, DRD2, ANKK1 및 GRIK4의 대립유전자 등의 유전 표지의 존재는 그 내부의 표지 또는 특정 영역의 직접적인 검출에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면, Real time PCR 시스템을 이용하여 SNP 분석을 수행하거나, 디데옥시법에 의해 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통해 수행할 수 있으며, 또는 SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하거나, 대립형질 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립형질 특이적 증폭 방법(allelespecific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘에세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 에세이법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis) 및 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism) 등을 이용하여 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 약물 부작용(ADR)은 CYP2C19, CYP2D6, DRD2, ANKK1, GRIK4 유전형 및 표현형에 따른 환자 개인별 약물에 대한 부작용의 발병 위험 여부를 통해 판단될 수 있다.
일 구현예에서, 환자의 ADR 발병 확률은 일반집단 (general population)의 발병 확률의 약 1.5배에서 약 10배이며, 확률은 위험 인자의 발생률 (incidence)을 이용하는 등의, 기술분야에 알려진 어떤 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
일 구현예에서, ADR을 예측하기 위한 위험 인자의 “감도 (sensitivity)"는 그 위험 인자를 보유한 ADR 환자의 백분율이다. 예를 들어, 만일 모든 조현병 환자가 대립유전자 A를 가지면, 조현병을 예측하기 위한 그 대립유전자 A의 감도는 100%이다. 만일 40명의 조현병 환자 중 20명이 대립유전자 B를 갖는다면, 그때의 조현병을 예측하기 위한 그 대립유전자 B의 감도는 50%이다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간 CYP2D6 유전자의 1758G>T, 100C>T, 1611T>A, 2573insC, 2988G>A, 3877G>A, 4125>중복 (GTGCCCACT 삽입), 2850C>T, 1887>TA 삽입, 결실 및 1846G>A, 인간 CYP2C19 유전자의 96541616G>A(*2), 96540410G>A(*3) 및 96521657C>A(*17), 인간 DRD2 유전자의 -50978A>G (rs1799732), -50878>C 삽입 (rs1799978) 및 11890C>G (rs1801028), 인간 ANKK1 유전자의 24546C>T (rs1800497), 및 인간 GRIK4 유전자의 120792654T>C (rs1954787)는 약물 부작용 발병 위험 인자로 사용될 수 있으며, 그 위험 인자의 감도는 적어도 약 50%에서 95%이다.
일 측면에서, 본 발명은 (a) 약물을 시료에 처리하는 단계; (b) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 핵산을 주형으로 하고 인간 CYP2D6 유전자, CYP2C19 유전자, 인간 DRD2 유전자, 인간 ANKK1 유전자 및 인간 GRIK4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이의 단편을 증폭할 수 있는 프라이머로 PCR을 수행하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 얻은 PCR 산물의 염기서열에서 일염기다형성을 포함한 유전자 변이 여부를 확인하는 단계; 및 (e) 유전자 변이가 존재하면 상기 단계 (a)에서 처리한 약물이 부작용을 유발할 위험이 있는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 약물 부작용 유발 약물을 동정하는 방법에 관한 것이다.
특정 대립유전자가 존재할 때 약물 부작용 위험이 있는 것으로 결정하는 단계
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 다중 중합효소연쇄반응 (multiplex polymerase chine reaction, multiplex PCR)을 이용한 SNP 포함 PCR 산물 제작
CYP2C19, CYP2D6, DRD2, ANKK1, GRIK4 각각의 약물 부작용 관련 SNP를 포함하는 특정 단편을 증폭하기 위하여, ABI 9700 (Applied Biosystems, Foster, USA)를 이용하여, 하기 표 4에 기재된 프라이머 세트로 각각의 PCR 조건으로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 구체적으로, CYP2C19 (CYP2C19*2*3*17)와 GRIK4 (GRIK4 rs1954787)는 의뢰검체 100 ng, 10X d-Taq PCR 버퍼 3㎕, dNTP mixture 3 ㎕, 각각의 프라이머 세트 (10 pmol) 0.4 ㎕씩, d-Taq DNA polymerase (2 U/㎕) 0.2 ㎕, D.W 20.6-X㎕를 포함한 총 30 ㎕의 반응액으로 구성하였다. 중합효소연쇄반응은 94℃에서 5분간 처리한 후에, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 30분씩 35회 반응시켰고, 최종연장반응은 72℃에서 5분간 시행하였다. 또한, CYP2D6 Duplication은 의뢰검체 100 ng, 110X LA Taq PCR 버퍼 2 ㎕, dNTP mixture 2 ㎕, 25mM MgCl2 2 ㎕, 5X Band doctor 2 ㎕, 서열번호 7에서 8번 프라이머 (10 pmol) 각 0.5 ㎕씩, LATaq DNA polymerase (5 U/ul) 0.2 ㎕, D.W 10.8-X㎕를 포함한 총 20 ㎕의 반응액으로 구성하였다. 94℃에서 5분간 처리한 후에, 98℃에서 20초, 64℃에서 30초, 72℃에서 3분씩 35회 반응시켰고, 최종연장반응은 72℃에서 5분간 시행하였다. DRD2는 의뢰검체 150 ng, 10X d-Taq PCR 버퍼 3 ㎕, dNTP mixture 1 ㎕, 서열번호 11 내지 14의 프라이머 세트 (10 pmol) 1.5 ㎕씩, d-Taq DNA polymerase (2 U/㎕) 0.2 ㎕, D.W 21.2-X㎕를 포함한 총 30 ㎕의 반응액으로 구성하였다. 94℃에서 5분간 처리한 후에, 94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 30분씩 35회 반응시켰고, 최종연장반응은 72℃에서 5분간 시행하였다. ANKK1은 의뢰검체 100 ng, 110X LA Taq PCR 버퍼 2 ㎕, dNTP mixture 2 ㎕, 25mM MgCl2 2 ㎕, 5X Band doctor 2 ㎕, 서열번호 15 내지 16의 프라이머 (10 pmol) 각 0.5 ㎕씩, LATaq DNA polymerase (5 U/ul) 0.2 ㎕, D.W 10.8-X㎕를 포함한 총 20 ㎕의 반응액으로 구성하였다. 94℃에서 5분간 처리한 후에, 98℃에서 20초, 64℃에서 30초, 72℃에서 3분씩 35회 반응시켰고, 최종연장반응은 72℃에서 5분간 시행하였다. CYP2D6 midi는 의뢰검체 100 ng, 10X EF Taq PCR 버퍼 2 ㎕, dNTP mixture 2 ㎕, 5X Band doctor 2 ㎕, 서열번호 17 내지 22의 프라이머 (10 pmol) 각 1 ㎕씩, EF Taq DNA polymerase (5 U/㎕) 0.25 ㎕, D.W 9.75-X㎕를 포함한 총 20 ㎕의 반응액으로 구성하였다. 94℃에서 5분간 처리한 후에, 98℃에서 20초, 64℃에서 30초, 72℃에서 3분씩 35회 반응시켰고, 최종연장반응은 72℃에서 5분간 시행하였다.
Gene 다중 중합효소연쇄반응 프라이머명 서열(5'-3') 서열번호 크기
(bp)		 PCR 조건
(Annealing 온도,
Extension 시간)
CYP2C19
*2		 CYP2C19*2F AATTACAACCAGAGCTTGGC 1 169 57℃, 30s
CYP2C19*2R TATCACTTTCCATAAAAGCAAG 2
CYP2C19
*3		 CYP2C19*3F CCAATCATTTAGCTTCACCC 3 262 57℃, 30s
CYP2C19*3R ACTTCAGGGCTTGGTCAATA 4
CYP2C19
*17		 CYP2C19*17F GCCCTTAGCACCAAATTCTCT 5 483 57℃, 30s
CYP2C19*17R CACCTTTACCATTTAACCCC 6
CYP2D6
duplication		 CYP2D6_dup F CCTCACCACAGGACTGGCCACC 7 3238 64℃, 3m
CYP2D6_dup R CACGTGCAGGGCACCTAGAT 8
GRIK4 rs1954787 GRIK4 rs1954787 F GATGAAAGGACCGAAGTAGG 9 356 57℃, 30s
GRIK4 rs1954787 R CTCTTCTTGTCATCCTCCCA 10
DRD2 Promoter DRD2 Promoter F TCCATGTCAGGTCAACTCCA 11 375 59℃, 30s
DRD2 Promoter R CCCCACCAAAGGAGCTGTA 12
DRD2 rs1801028 DRD2 rs1801028 F TGGCTTAGAACCACCCAGAG 13 566 59℃, 30s
DRD2 rs1801028 R GGAGCACCTTCCTGAGTGTC 14
ANKK1 rs1800497 ANKK1 rs1800497 F CTGATGCCTGGGAACTTGTC 15 272 59℃, 30s
ANKK1 rs1800497 R GCCCATCTGTAAAGTGAGCAC 16
CYP2D6
midi 1		 CYP2D6_2850C/T F TGGGGCCTGAGACTTGTCCAGG 17 2379 64℃, 3m
CYP2D6_6.4kb R ACTGAGCCCTGGGAGGTAGGTA 18
CYP2D6
midi 2		 CYP2D6_100C/T F CCATTTGGTAGTGAGGCAGGT 19 2062 64℃, 3m
CYP2D6_1887G/insTA R CCTGCAGAGACTCCTCGGTCT 20
CYP2D6
deletion		 CYP2D6_del F ACCTCTCTGGGCCCTCAGGGA 21 2926 64℃, 3m
CYP2D6_del R CAGGCATGAGCTAAGGCACCCAGAC 22
중합효소 연쇄반응이 끝난 산물을 아이스 버킷(Ice bucket)에 옮긴 후, 파라필름(parafilm)위에 PCR 산물 2 ㎕, 6X 로딩 버퍼 1 ㎕, 1~2% 아가로오스 겔, 100 bp Mixed DNA ladder 2 ㎕, 0.5X TBE 버퍼를 섞어서 100V, 30분간 전기영동 러닝을 하였다. 이후, 1% 아가로오스 겔을 형광 물질을 함유한 겔 레드(gel red)로 염색하여 DNA 크기를 확인하였다 (도 1). PCR 산물 크기를 확인 후 샘플 내 PCR 반응을 하지 않은 프라이머와 dNTP의 제거를 위해, CYP2C19*2*3*17, GRIK4 rs1954787 PCR 산물 1.6 ul, CYP2D6 Duplication PCR 산물 0.8 ul 및 DRD2 PCR 산물 1.6 ㎕을 ExoSAP-IT (USB corp., Cleveland, USA) 1.8 ㎕와 혼합하였고, CYP2D6 midi PCR 산물 3 ㎕ 및 CYP2D6 deletion PCR 산물3 ㎕을 ExoSAP-IT 3 ㎕과 혼합하여 모두 37℃ 30분, 80℃ 15분간 반응시켜 남아 있는 효소를 비 활성화시켰다. 상기 반응을 통해 제작된 중합효소 연쇄반응 산물을 이후의 SNaPshot 분석을 위한 주형으로 이용하였다.
실시예 2 :다중 단일염기 프라이머 확장 반응 (multiplex single based primer extension, SNaPshot assay)을 이용한 SNP 존재 유무 확인
2-1. SNP별 프라이머 설계
다중 단일염기 프라이머 확장반응 (multiplex single based primer extension, SNaPshot assay)을 위한 유형별 프라이머는 표 5와 같다. 프라이머들의 3' 말단은 각 유전자 SNP의 직전 뉴클레오티드와 정렬되도록 설계하였다 (표 5).
서열번호 다중 단일염기 프라이머명 서열(5'-3') 반응 농도 (pmol)
23 CYP2C19*2 seqF(T20) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACTATCATTGATTATTTCCC 8
24 CYP2C19*3 seqR(T28) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAAAAAACTTGGCCTTACCTGGAT 2
25 CYP2C19*17seqF(T0) TTTCAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAG 1
26 GRIK4 rs1954787 seqF(T32) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGCAATTGGAGACTGGTTAT 2
27 CYP2D6 Duplication seqR(T45) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCGTCACTGGTCAGGGGTC 20
28 DRD2_ANKK1 rs1800497 seqR(T3) TTTAGCCATCCTCAAAGTGCTGGTC 4
29 DRD2_rs1799732 seqR(T26) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCGGCGATCCCCGGCCTG 8
30 DRD2_rs1799978 seqF(T14) TTTTTTTTTTTTTTGACCCAGCCTGCAATCACAGCTT 8
31 DRD2_rs1801028 seqF(T34) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACCAGCTGACTCTCCCCGACCCGT 4
32 CYP2D6_1758G/TseqF(T0) CGCCTTCGCCAACCACTCC 28
33 CYP2D6_100C/TseqF(T0) CAACGCTGGGCTGCACGCTAC 15
34 CYP2D6_1611T/AseqR(T10) TTTTTTTTTTGGGCCCATAGCGCGCCAGGA 1
35 CYP2D6_2573insCseqF(T16) TTTTTTTTTTTTTTTTTGGGACCCAGCCCAGCCCCCCC 3
36 CYP2D6_2988G/AseqF(T20) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTGCAGGGGCCGAGGGAG 4
37 CYP2D6_3877G/AseqR(T25) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGGGCATCCAGGAAGTGTT 20
38 CYP2D6_4125DupseqF(T28) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTTCTCGGTGCCCACTG 3
39 CYP2D6_2850C/TseqR(T35) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGTCAGCCACCACTATGC 2.5
40 CYP2D6_1887insTAseqR(T40) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGGAGGCGATCACGTTGCT 8
41 CYP2D6_deletion_seqR(T45) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCGTCACTGGTCAGGGGTC 8
42 CYP2D6_1846G/AseqF(T50) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCGCATCTCCCACCCCCA 4
2-2. SNaPshot 분석
상기 실시예 1에서 제작한 중합효소 연쇄반응 산물을 주형으로 이용하여, 단일염기다형성 부위에 대해 길이를 다르게 설계한 상기 표 5의 프라이머를 이용하여 다중 단일염기 프라이머 확장반응과 SNaPshot 분석을 수행하였다. 구체적으로, 실시예 1의 각각의 반응산물은 SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix 1 ㎕, 1/2 buffer 4 ㎕ 및 SNaPshot 프라이머 혼합액 1 ㎕를 혼합하여, 96 ℃ 10 초 50 ℃ 5 초, 60 ℃ 30초를 40 회 반응시켰다. 그 후, SAP 1 unit (1 ㎕)을 첨가하여 37℃ 60분, 65℃ 15분 반응시켜 남아있는 ddNTP 제거하였다. 이 후 반응 산물 1㎕에 GeneScan-120 LIZ size standard 0.25㎕와 Hi-Di formamide 8.75㎕를 넣어 ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster, USA)를 이용하여 분석하였다.
2-3. 단일 염기 다형성(SNP) 분석
각 단일염기 다형성 위치에 상보적인 형광을 붙인 ddNTP가 각 프라이머 3' 끝에 오도록 조합한 확장반응 산물을 얻은 후, 각 SNP에 대한 각각의 최고점을 분석하였다. 소프트웨어는 GeneMapper v4.0 (Applied Biosystems, Foster, USA)을 이용하였으며 분석결과에 따라 CYP2D6*2, *4, *5, *10B, *14, *18, *21, *41, *49, *52, *60, 2D6 중복 (duplication) (*1xN, *2xN, *10xN), CYP2C19*2(NC_000010.10:g.96541616G>A), *3(NC_000010.10:g.96540410G>A), *17(NC_000010.10:g.96521657C>A), DRD2 rs1799732 (NC_000011.10 g.-50978A>G), rs1799978(NC_000011.10 g.-50878insC), rs1801028g.(NC_000011.10 11890C>G), ANKK1 rs1800497(NC_000011.10 g.24546C>T) 및 GRIK4 rs1954787(NC_000011.10 g.120792654T>C)의 유전형을 확인하였다 (도 2 및 3). 또한, 상기 결과를 표준검사법 (gold standard)으로 얻어진 유전자 서열 정보 (sequencing data)와 비교하였다.
이러한 결과를 통해, CYP2D6*2, *4, *5, *10B, *14, *18, *21, *41, *49, *52, *60, 2D6 중복 (duplication) (*1xN, *2xN, *10xN), CYP2C19*2(NC_000010.10:g.96541616G>A), *3(NC_000010.10:g.96540410G>A), *17(NC_000010.10:g.96521657C>A), DRD2 rs1799732 (NC_000011.10 g.-50978A>G), rs1799978(NC_000011.10 g.-50878insC), rs1801028g.(NC_000011.10 11890C>G), ANKK1 rs1800497(NC_000011.10 g.24546C>T) 및 GRIK4 rs1954787(NC_000011.10 g.120792654T>C)에서 약물 부작용 (ADR) 관련된 유전형 (표 6의 SNP들)을 빠르고 정확하게 확인할 수 있음을 알 수 있었다.
유전자 SNP
CYP2D6 1758G>T
100C>T
1611T>A
2573insC
2988G>A
3877G>A
4125Dup (insGTGCCCACT)
2850C>T
1887insTA
deletion
1846G>A
CYP2C19 96541616G>A
96540410G>A
96521657C>A
DRD2 -50978A>G
-50878insC
11890C>G
ANKK1 24546C>T
GRIK4 120792654T>C
따라서, 본 발명을 이용하여 CYP2C19, CYP2D6, DRD2, ANKK1, GRIK4의 특정 대립유전자의 유전형을 고속으로 검출하여 약물 부작용과 관련된 위험도 예측 및 진단 방법에 효과적으로 활용할 수 있을 것이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> inje university industry-academic cooperation foundation <120> ALLELES ASSOCIATED WITH ADVERSE DRUG REACTION AND DETECTING METHOD THEREOF <130> P20170096KR-00 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*2 forward primer <400> 1 aattacaacc agagcttggc 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*2 reverse primer <400> 2 tatcactttc cataaaagca ag 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*3 forward primer <400> 3 ccaatcattt agcttcaccc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*3 reverse primer <400> 4 acttcagggc ttggtcaata 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*17 forward primer <400> 5 gcccttagca ccaaattctc t 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*17 reverse primer <400> 6 cacctttacc atttaacccc 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_dup forward primer <400> 7 cctcaccaca ggactggcca cc 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_dup reverse primer <400> 8 cacgtgcagg gcacctagat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIK4 rs1954787 forward primer <400> 9 gatgaaagga ccgaagtagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIK4 rs1954787 reverse primer <400> 10 ctcttcttgt catcctccca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRD2 Promoter forward primer <400> 11 tccatgtcag gtcaactcca 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRD2 Promoter reverse primer <400> 12 ccccaccaaa ggagctgta 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRD2 rs1801028 forward primer <400> 13 tggcttagaa ccacccagag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRD2 rs1801028 reverse primer <400> 14 ggagcacctt cctgagtgtc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANKK1 rs1800497 forward primer <400> 15 ctgatgcctg ggaacttgtc 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANKK1 rs1800497 reverse primer <400> 16 gcccatctgt aaagtgagca c 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_2850C/T primer <400> 17 tggggcctga gacttgtcca gg 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_6.4kb primer <400> 18 actgagccct gggaggtagg ta 22 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_100C/T primer <400> 19 ccatttggta gtgaggcagg t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_1887G/insTA primer <400> 20 cctgcagaga ctcctcggtc t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_del forward primer <400> 21 acctctctgg gccctcaggg a 21 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_del reverse primer <400> 22 caggcatgag ctaaggcacc cagac 25 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*2 seqF(T20) primer <400> 23 tttttttttt tttttttttt cactatcatt gattatttcc c 41 <210> 24 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*3 seqR(T28) primer <400> 24 tttttttttt tttttttttt ttttttttca aaaaacttgg ccttacctgg at 52 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2C19*17seqF(T0) primer <400> 25 tttcaaattt gtgtcttctg ttctcaaag 29 <210> 26 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIK4 rs1954787 seqF(T32) primer <400> 26 tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttaagcaatt ggagactggt tat 53 <210> 27 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 Duplication seqR(T45) primer <400> 27 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttctcgt cactggtcag 60 gggtc 65 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRD2_ANKK1 rs1800497 seqR(T3) primer <400> 28 tttagccatc ctcaaagtgc tggtc 25 <210> 29 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRD2_rs1799732 seqR(T26) primer <400> 29 tttttttttt tttttttttt tttttttcct cggcgatccc cggcctg 47 <210> 30 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRD2_rs1799978 seqF(T14) primer <400> 30 tttttttttt ttttgaccca gcctgcaatc acagctt 37 <210> 31 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DRD2_rs1801028 seqF(T34) primer <400> 31 tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttcaccag ctgactctcc ccgacccgt 59 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_1758G/TseqF(T0) primer <400> 32 cgccttcgcc aaccactcc 19 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_100C/TseqF(T0) primer <400> 33 caacgctggg ctgcacgcta c 21 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_1611T/AseqR(T10) primer <400> 34 tttttttttt gggcccatag cgcgccagga 30 <210> 35 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_2573insCseqF(T16) primer <400> 35 tttttttttt tttttttggg acccagccca gccccccc 38 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_2988G/AseqF(T20) primer <400> 36 tttttttttt tttttttttt agtgcagggg ccgagggag 39 <210> 37 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_3877G/AseqR(T25) primer <400> 37 tttttttttt tttttttttt tttttctggg catccaggaa gtgtt 45 <210> 38 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_4125DupseqF(T28) primer <400> 38 tttttttttt tttttttttt tttttttttt cagcttctcg gtgcccactg 50 <210> 39 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_2850C/TseqR(T35) primer <400> 39 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttcaggt cagccaccac tatgc 55 <210> 40 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_1887insTAseqR(T40) primer <400> 40 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt agggaggcga tcacgttgct 60 60 <210> 41 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_deletion_seqR(T45) primer <400> 41 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttctcgt cactggtcag 60 gggtc 65 <210> 42 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6_1846G/AseqF(T50) primer <400> 42 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt acccgcatct 60 cccaccccca 70

Claims (13)

  1. 인간 CYP2D6(Cytochrome P450 2D6) 유전자의 1758G>T, 100C>T, 1611T>A, 2573>C 삽입, 2988G>A, 3877G>A, 4125>중복 (GTGCCCACT 삽입), 2850C>T, 1887>TA 삽입, 결실 및 1846G>A, 인간 CYP2C19(Cytochrome P450 2C19) 유전자의 96541616G>A(*2), 96540410G>A(*3) 및 96521657C>A(*17), 인간 DRD2(Dopamine receptor D2) 유전자의 -50978A>G (rs1799732), -50878>C 삽입 (rs1799978) 및 11890C>G (rs1801028), 인간 ANKK1(Ankyrin repeat and kinase domain containing 1) 유전자의 24546C>T (rs1800497), 및 인간 GRIK4(Glutamate Ionotropic Receptor Kainate Type Subunit 4) 유전자의 120792654T>C (rs1954787)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자 변이를 포함하는, 약물 부작용 예측 또는 진단을 위한 마커용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호 23 내지 42의 다중 단일염기 프라이머들 중 어느 하나를 포함하는, 약물 부작용 예측 또는 진단을 위한 마커용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 항우울제 또는 항조현병제로 인한 약물 부작용인, 약물 부작용 예측 또는 진단을 위한 마커용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 약물은 아미트리프틸린, 클로미프라민, 독세핀, 이미프라민, 아목사핀, 노르트립틸린, 시탈로프람, 에스시탈로프람, 플루옥세틴, 플루복사민, 밀나시프란, 파록세틴, 설트랄린, 벤라팍신, 아토목세틴, 부프로피온, 듀록세틴, 미르타자핀, 트라조돈, 셀레길린, 클로르프로마진, 페르페나진, 몰린돈, 할로페리돌, 아리피프라졸, 클로자핀, 올란자핀, 팔리페리돈, 쿠에티아핀, 리스페리돈, 설피리드, 지프라시돈 및 죠테핀로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약물 부작용 예측 또는 진단을 위한 마커용 조성물.
  5. 제 1항에 따른 조성물을 포함하는, 약물 부작용 예측 또는 진단용 분석 키트.
  6. (a) 인간으로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 채취된 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 핵산을 주형으로 하고 인간 CYP2D6 유전자, CYP2C19 유전자, 인간 DRD2 유전자, 인간 ANKK1 유전자 및 인간 GRIK4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이의 단편을 증폭할 수 있는 프라이머로 PCR을 수행하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 얻은 PCR 산물의 염기서열에서 유전자 변이 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 약동학, 약물치료효과, 약물유해반응 예측 및 이를 고려한 개인별 맞춤약물치료 요법 시행을 위한 약물유전형 정보를 제공하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료가 혈액, 피부 세포, 점막 세포 및 모발로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약물유전형 정보를 제공하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 (c) 단계의 프라이머는 서열번호 1 내지 22으로 이루어진 군에서 선택되는 유전자 변이 포함 영역 증폭을 위한 프라이머 세트인, 약물유전형 정보를 제공하는 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 (d) 단계의 유전자 변이는 인간 CYP2D6 유전자의 1758G>T, 100C>T, 1611T>A, 2573>C 삽입, 2988G>A, 3877G>A, 4125>중복 (GTGCCCACT 삽입), 2850C>T, 1887>TA 삽입, 결실 및 1846G>A, 인간 CYP2C19 유전자의 96541616G>A(*2), 96540410G>A(*3) 및 96521657C>A(*17), 인간 DRD2 유전자의 -50978A>G (rs1799732), -50878>C 삽입 (rs1799978) 및 11890C>G (rs1801028), 인간 ANKK1 유전자의 24546C>T (rs1800497), 및 인간 GRIK4 유전자의 120792654T>C (rs1954787)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약물유전형 정보를 제공하는 방법.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 (d) 단계의 유전자 변이 존재 유무는 서열번호 23 내지 42의 다중 단일염기 프라이머를 이용한 스냅샷 (SNaPshot) 분석을 통해 확인하는, 약물유전형 정보를 제공하는 방법.
  11. (a) 약물을 시료에 처리하는 단계;
    (b) 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 핵산을 주형으로 하고 인간 CYP2D6 유전자, CYP2C19 유전자, 인간 DRD2 유전자, 인간 ANKK1 유전자 및 인간 GRIK4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이의 단편을 증폭할 수 있는 프라이머로 PCR을 수행하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 얻은 PCR 산물의 염기서열에서 유전자 변이 여부를 확인하는 단계; 및
    (e) 유전자 변이가 존재하면 상기 단계 (a)에서 처리한 약물이 부작용을 유발하는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 약물 부작용 유발 약물을 동정하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 단계 (c)의 프라이머는 서열번호 1 내지 22으로 이루어진 군에서 선택되는, 약물 부작용 유발 약물을 동정하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 단계 (d)의 유전자 변이 여부는 서열번호 23 내지 42의 다중 단일염기 프라이머를 이용한 스냅샷 (SNaPshot) 분석을 통해 확인하는, 약물 부작용 유발 약물을 동정하는 방법.
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