KR101593750B1 - 한국인에서 cyp2d6 유전형을 포함하는 약물반응 유전자들의 유전형 분석을 위한 표준 유전자 불멸화 세포주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간에 존재하는 사이토크롬 P450 2D6 (CYP 2D6) 유전형 분석을 위한 표준 유전자의 불멸화 세포주 제작 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한국인에서 유전형 분석을 위해 인체 전혈로 부터 분리된 휴식기 B 세포에 EBV 바이러스를 이용하여 활성화된 증식 가능한 B 임파구성 세포 (LCL)로 쉽게 변형 시켜 불멸화 세포주로 제작하고 완성된 세포주에서 분리된 genomic DNA를 한국인의 CYP 2D6 유전형 선별을 위한 표준화된 유전물질로 이용함에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면 한국인의 CYP 2D6 유전자의 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism; SNP)을 분석하기 위해 개발된 다양한 분석 방법에서 표준화된 물질로 이용하여 많은 양의 유전물질의 원활한 사용을 통해 시간과 비용에 효율성을 높여 한국인에서 발견되는 CYP 2D6 유전자의 변이형 선발을 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 이러한 유전자의 변이 확인은 발생 가능한 이상 징후를 예측하는데도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

한국인에서 CYP2D6 유전형을 포함하는 약물반응 유전자들의 유전형 분석을 위한 표준 유전자 불멸화 세포주{Immortalizatized standard cell lines for genotyping of drug metabolism genes included human cytochrome P450 2D6 gene}

발명은 한국인에서 제한적으로 발견된 CYP2D6 변이 유전형 및 타 종족에서도 발견되는 CYP2D6 유전자의 변이형을 포함하는 약물대사 유전자의 분석을 위한 불멸화 세포주 제작을 통한 표준물질 구축 및 이의 용도에 관한 것이다.

일반적으로 기본 세포들의 증식은 매우 제한적인 주기로 이루어진다. 그러나 바이러스 감염 또는 oncogene과 같은 외인적 요인에 의해 세포가 무한하게 증식할 수 있게 된다. 특히 Epstein-Barr virus (EBV)는 다양한 암의 유발과 밀접한 관계를 가진다.

한편, 다양한 약물 유전학 연구 중 유전자 다양성 연구에 있어 약물의 체내 대사와 수송에 관여하는 효소계인 사이토크롬 P450 (CYP450)과 약물 수송 단백질 유전자의 일배체형 분석 방법을 통해 변이형을 선별하는 연구가 보편적으로 이루어지고 있다. 인간 사이토크롬 P450은 약물, 발암원 및 독소와 같은 외래 화학물질과 스테로이드, 지방산 및 비타민과 같은 내부 기질의 산화를 촉진하는 헴단백질의 일원이다(Nelson et al., Pharmacogenetics 6:1-42, 1996). 한편, 간을 포함하여 신장, 장관 및 폐와 같은 기관에서 다양한 사이토크롬 P450의 아형이 발견되었다.

이 중에서 인간 사이토크롬 P450 2D6(Cytochrome P450 2D6, 이하 CYP2D6라 함) 유전자는 22번째 염색체에 위치해 있으며 CYP2D6 유전자의 한쪽 면에는 유사 유전자(pseudogenes)인 CYP2D7과 CYP2D8이 위치해 있다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 효소는 정신활성약물(psychoactive drugs), 심혈관계 약물, 모르핀계 약물 등 100여 가지 이상의 임상적으로 중요한 약물들을 대사하는 것으로 알려져 있다.

CYP2D6 유전자에 의해 코딩되는 효소는 간에서 주로 생산되며 사이토크롬 P450 효소의 총량의 약 2%를 차지하지만 30% 정도의 약물 대사에 관여하는 중요한 효소이다. 개체 내에서 상기 효소의 활성은 매우 다양하여 이들은 그 활성 정도에 따라 각각 PM(poor metabolizers), IM(intermediate metabolizers), EM(extensive metabolizers) 및 UM(ultrarapid metaboilzers) 군으로 분류되고 있다. 상기와 같이 효소활성이 각각 다르게 나타나는 것은 CYP2D6의 유전적 다형성에 의한 것이다. 현재, CYP2D6의 유전적 다형성은 약 80여 가지 이상으로 알려져 있으며 (www.imm.ki.se/cypalleles/ cyp2d6 .htm), 종족간의 뚜렷한 차이를 보이고 있다.

한편, 현재까지 상기 CYP2D6 변이 유전자의 분석을 위해 한정적인 주형물질을 이용하여 분석이 수행되어 왔다. 그러나, 상기와 같은 분석을 위한 제공되는 주형은 매우 제한적이며 불안정한 경우가 많아 시간적, 경제적 소비가 크다.

한국 특허 KR 10-2009-0107374는 사이토크롬 P450 유전자형을 검출하기 위한 PNA 프로브, 키트 및 방법을, 한국특허 KR 10-1996-0706274는 인간 사이토크롬 P4502D6 유전자의 다형 검출방법을 개시하고 있다.

이에 본 발명자들은 CYP2D6 변이 유전자의 분석방법을 연구하던 중 불멸화 세포주를 통한 표준물질을 이용하여 CYP2D6 변이 유전자를 다양한 분석 방법을 통해 정확하고 재연성있는 분석할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국특허 10-1996-0706274

이에 본 발명의 목적은 (a) 인간으로부터 채취한 혈액에서 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells)를 분리하는 단계; (b) 상기 말초혈액단핵세포(PBMC)에 EBV 바이러스를 감염시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 배양한 세포로부터 B세포를 분리하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 배양한 세포로 세포 스탁(cell stock)을 만드는 단계를 포함하는, 인간 CYP2D6 유전형 분석을 위한 표준 유전자 불멸화 세포주를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 CYP2D6 변이 유전형 분석을 위한 불멸화된 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 불멸화된 세포주를 표준물질로써 이용하여 아시아인종의 CYP2D6 유전자의 유전형을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 (a) 인간으로부터 채취한 혈액에서 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells)를 분리하는 단계; (b) 상기 말초혈액단핵세포(PBMC)에 EBV 바이러스를 감염시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 배양한 세포로부터 B세포를 분리하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 배양한 세포로 세포 스탁(cell stock)을 만드는 단계를 포함하는, 인간 CYP2D6 유전형 분석을 위한 표준 유전자 불멸화 세포주를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 CYP2D6 변이 유전형 분석을 위한 표준물질로써 불멸화된 세포주를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 불멸화된 세포주는 아시아인종의 유전자형의 95~99%를 커버할 수 있다.

나아가 본 발명은 상기 불멸화된 세포주를 이용하여 CYP2D6 유전자의 유전형을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CYP2D6유전자는 아시아인종의 CYP2D6의 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하면 한국인의 CYP 2D6 유전자의 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism; SNP)을 분석하기 위해 개발된 다양한 분석 방법에서 표준화된 물질로 이용하여 많은 양의 유전물질의 원활한 사용을 통해 시간과 비용에 효율성을 높여 한국인에서 발견되는 CYP 2D6 유전자의 변이형 선발을 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 이러한 유전자의 변이 확인은 발생 가능한 이상 징후를 예측하는데도 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 다량의 혈액 인수가 어려울 경우 genomic DNA를 쉽게 얻을 수 있으며, 이를 이용하여 인간 유전체 연구 및 한국인의 특정 CYP유전자의 유전형 분석 수행 시 표준 유전 물질(DNA)로 사용할 수 있고, 항원/항체 및 단백질 생산 등의 연구목적으로 활용할 수 있다.

도 1은 혈액에서 PBMC를 분리하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 프라이머의 위치와 multiplex SBE를 사용했을 때 검출 된 CYP2D6의 변이형을 나타내는 도면이다.
도 3은 long PCR 프라이머 서열과 CYP2D6 중복과 결실에 대해 선별된 유전자 동정 위치를 나타내는 도면이다.
도 4는 9개 다른 유전형(A-I)의 multiplex와 singleplex SBE에 의한 CYP2D6 지노타이핑(genotyping)의 전기곡선도(electrograms)를 나타내는 도면이다.
도 5는 불멸화 세포주를 이용하여 cDNA 합성한 후 단백질을 발현시켜 실험관내에서 CYP2D6에 의해 대사되는 약물 Metorolol을 사용하여 한국인에서 처음 발견된 CYP2D6의 돌연변이와 야생형의 효소 기능을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 불멸화 세포주를 이용하여 cDNA 합성한 후 단백질을 발현시켜 실험관내에서 CYP2D6에 의해 대사되는 약물인 Dextromethorphan을 사용하여 한국인에서 처음 발견된 CYP2D6의 돌연변이와 야생형의 효소 기능을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 7e는 CYP2D6 유전자의 염기서열에서 1758G>A, 100C>T, 1611T>A, 2573G>insC, 2988G>A, 3877G>A, 4125G>ins9T, 2850C>T, 1887G>insTA, delA>G 및 dupG>A의 CYP2D6 유전자 변이 존재 위치를 나타낸 것이au, 도면에서 파란색 기재는 엑손을 각각 나타낸 것이다.

본 발명의 목적은 다량의 혈액 인수가 어려울 경우 genomic DNA를 쉽게 얻을 수 있으며, 이를 이용하여 인간 유전체 연구 및 한국인의 특정 CYP2D6 유전자의 유전형 분석 수행 시 표준 유전 물질(DNA)로 사용하고자 한다.

본 발명은 한국인에서 제한적으로 발견된 CYP2D6 변이 유전형 및 타 종족에서도 발견되는 CYP2D6 유전자의 변이형 분석을 위한 불멸화 세포주 제작을 통한 표준물질 구축 및 이의 용도에 관한 것으로서, 인간 CYP2D6 유전자의 유전형 변이를 선별하기 위해 B 림프구를 이용하여 제작된 불멸화 세포주의 유전물질을 표준 물질로 하여 한국인을 포함한 아시아 및 타 종족에서 대상 약물유전형 진단 시 및 한국인 특이적 유전체 연구에 중요한 기본 자원으로 제공하고자 한다.

개체간의 유전적 다양성은 약물의 독성 및 효능에 있어서 개체 간 차이를 가져온다. 따라서, 약물 개발의 초기단계에서 이와 같은 약제학적으로 중요한 단백질의 유전적 다양성에 대한 효과를 고려하는 것은 약물 개발의 실패에 대한 위험성을 낮출 수 있는 중요한 요소이다. 이러한 개체 간 유전적 다양성을 측정하는 하나의 조사 집단이 되는 것이 "일배체형 (haplotype)"이다. 일배체형이란 하나의 조사 집단 내에 존재하는 각 유전자 서열의 다형성의 조합을 의미하며, 이것은 개별적인 다형성보다 유전적 다양성에 관한 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 정보를 제공한다.

일반적으로 기본 세포들의 증식은 매우 제한적인 주기로 이루어진다. 그러나 바이러스 감염 또는 oncogene과 같은 외인적 요인에 의해 세포가 무한하게 증식할 수 있게 된다. 특히 Epstein-Barr virus (EBV)는 다양한 암의 유발과 밀접한 관계를 가진다. 불멸화 세포주를 제작하기 위해 인체 전혈로 부터 분리된 휴식기 B 세포에 EBV 바이러스를 이용하여 활성화된 증식 가능한 B 임파구성 세포 (LCL)로 쉽게 변형시킬 수 있다.

불멸화 과정이 성공적으로 이루어져 세포주로 수립된 B림프구는 배양상태에서 무한하게 증식하기 때문에 많은 양의 genomic DNA를 얻을 수 있다. 게다가 제작된 임파구성 세포주는 최근에 개체간의 유전적 다양성이 약물의 독성 및 효능에 있어서 개체 간 차이를 보이는지에 관한 약물유전학에 대한 연구에 이용된다.

특히 염기의 변이에 따른 유전자 발현 및 copy number variation의 효과를 확인하는 유전학 연구에 유용하게 사용되며, Epstein-barr virus와 B림프구 연구뿐만 아니라, 항원/항체 및 단백질 생산 등의 연구 목적으로 활용되고 있다.

CYP2D6의 11가지(*2, *2N, *5, *10B, *14B, *18, *21, *41, *49, *52, *60 ) 유전적 다형성은 아시안에서 제한적으로 발견되는 유전형을 포함하므로 타 종족에서도 발견되는 CYP2D6 유전형 분석을 위한 표준물질로 이용하고자한다.

본 발명은,

(a) 인간으로부터 채취한 혈액에서 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells)를 분리하는 단계;

(b) 상기 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에 EBV 바이러스를 감염시키는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 배양한 세포로부터 B세포를 분리하는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계에서 배양한 세포로 세포 스탁(cell stock)를 만드는 단계를 포함하는, 인간 CYP2D6 유전형 분석을 위한 표준 유전자 불멸화 세포주를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "인간"은 "한국인 또는 이와 유사한 유전적 특성을 가지는 아시아인"을 말한다.

본 발명에서 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 DNA, 보다 바람직하게는 게놈 (genomic) DNA 일 수 있다.

본 명세서에 기재된 변이에 대하여 설명하면 다음과 같다.

예컨대, "-1584C>T" 변이란 인간 CYP2D6 유전자의 염기서열에서 -1584번째 염기가 C에서 T로 치환된 것을 말한다.

"2573insC" 변이란 인간 CYP2D6 유전자의 염기서열에서 2573번째 염기에 C가 삽입(부가)된 것을 말하며, "4125-4133insGTGCCCACT" 변이란 인간 CYP2D6 유전자의 4125번째 염기부터 4133번째 염기 위치에 GTGCCCACT의 9개의 염기가 삽입된 것을 말한다.

또한, "2D6 결실 (deletion)" 변이란 인간 CYP2D6 유전자 전체가 염색체 상에서 결실된 것을 말한다.

나아가, 본 발명에서 "2D6 중복 (duplication)" 변이란 인간 CYP2D6 유전자가 둘 이상 동일 염색체 상에 중복되어 있는 것을 말한다.

본 발명에 따른 "불멸화된", "불멸화된 세포" 및 "불멸화된 세포주"는 불멸에 대한 능력을 부여하는 특정 기능적 DNA 서열에 의해 트랜스펙션된/형질전환된 세포 또는 세포주에 관한 것이다.

또한, 본 발명에 따른 상기 1758G>A, 100C>T, 1611T>A, 2573G>insC, 2988G>A, 3877G>A, 4125G>ins9T, 2850C>T, 1887G>insTA, delA>G 및 dupG>A에 대해서 보다 구체적으로 설명하며, 100C>T는 CYP2D6의 게놈 유전자 서열 중에서 서열번호 1로 표시되는 엑손 1 유전자 서열 중에서 100번째 염기서열인 C가 T로 치환된 것을 말하며, 1611T>A는 서열번호 2로 표시되는 엑손 3의 염기서열에서 6번째 염기서열인 T가 A로 치환된 것이고, 1758G>A는 서열번호 2로 표시되는 엑손 3의 염기서열에서 153번째 염기서열인 G가 A로 치환된 것을 말한다. 또한, 1887G>insTA은 염기서열 3으로 표시되는 엑손 4의 염기서열에서 42번째 염기서열인 G 대신 TA가 삽입된 것을 말하며, 2573G>insC는 서열번호 4로 표시되는 엑손 5의 염기서열에서 132번째의 G염기에 C가 삽입(부가)된 것을 말하며, 2850C>T는 서열번호 5로 표시되는 엑손 6의 염기서열에서 43번째 염기인 C가 T로 치환된 것을 말하며, 2988G>A는 서열번호 5로 표시되는 엑손 6의 염기서열에서 116번째 염기인 G가 A로 치환된 것을 말한다. 또한, 3877G>A은 서열번호 6으로 표시되는 엑손 8의 염기서열에서 79번째 염기인 G가 A로 치환된 것을 말하고, 4125G>ins9T은 서열번호 7로 표시되는 엑손 9 염기서열의 87번째 서열부터 115번째 서열에 기재된 바와 같이 GTGCCCACT의 9개의 염기가 삽입된 것을 말한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 CYP2D6 유전형 분석을 위해 휴식기 B 세포에 EBV 바이러스를 이용하여 활성화된 증식가능한 B 임파구성 세포(LCL)로 쉽게 변형 시켜 불멸화 세포주로 제작하고, 완성된 세포주에서 분리된 genomic DNA를 한국인의 CYP2D6 유전형 선별을 위한 표준화된 유전물질로 이용한다는 점에 특징이 있다.

본 발명에 따른 인간 CYP2D6 유전자의 표준 유전자 불멸화 세포주를 제작하는 방법은 다음의 단계를 포함한다.

(a) 인간으로부터 채취한 혈액에서 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells)를 분리하는 단계;

(b) 상기 말초혈액단핵세포(PBMC)에 EBV 바이러스를 감염시키는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 배양한 세포로부터 B세포를 분리하는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계에서 배양한 세포로 세포 스탁(cell stock)을 만드는 단계.

상기 (a) 단계에서 채취한 혈액으로부터 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하는 방법으로 실시예1-1에 기재하였다. 활성화된 증식 가능한 B 임파구성 세포(LCL) 생성을 위해서 말초혈액을 Ficoll-Hypaque (HISTOPAQUE)에 넣고 제조자의 지시에 따라 원심분리하여 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리할 수 있다.

상기 (b) 단계에서 분리한 말초혈액단핵세포(PBMC)에 EBV 바이러스를 감염시키기 위해 EBV 바이러스 stock을 EBV-형질전환된 B95- 8 마모셋(marmoset) 세포주로부터 얻고, 37°C와 5% 이산화탄소하에서 4~7일 동안 배양한 뒤, 세포와 배지를 필터(0.45μm)한 뒤, -80°C에서 필요시까지 저장한다. 말초혈액 단핵 세포(PBMC)는 10% FBS와 penicillin-streptomycin (100 μg/100 unit)이 첨가된 RPMI-1640 완전배지에서 EBV 바이러스 stock(B95-8)로 감염시킨다.

상기 (c) 단계에서 B 세포를 분리하는 방법으로 37°C에서 2시간 인큐베이션 하고, cyclosporin A(0.5 μg/mL)가 함유된 완전배지 동일 양을 T 림프구를 사멸시키기 위해 첨가했다. 10~20일 동안 EBV-감염된 B세포 무리가 보일 때까지 배양했다. 실시예1-2의 방법을 통해 불멸화 세포를 제작할 수 있다.

또한, 상기 (d) 단계에서 실시예 1-3의 방법을 통해 세포 스탁(cell stock)을 제조할 수 있다.

상기 방법으로 제조된 불멸화 세포주를 이용해 인간 CYP2D6 유전자의 유전형을 분석하는 데 사용할 수 있다.

본 발명의 불멸화 세포주를 이용해 분석할 수 있는 CYP2D6 유전자의 유전형은 CYP2D6*2, CYP2D6*5, CYP2D6*2N, CYP2D6*10B, CYP2D6*14B, CYP2D6*18, CYP2D6*21, CYP2D6*41, CYP2D6*49, CYP2D6*52 및 CYP2D6*60을 포함한다. 예컨대 CYP2D6*1A 유전형은 야생형이고, CYP2D6*2A 유전형은 야생형 CYP2D6 유전자의 염기서열에서 SNP1, SNP 5, SNP 8, SNP 9, SNP 12-SNP 18, SNP 21, SNP 25 및 SNP 28 위치에 변이를 포함하는 유전형이다. 또한, CYP2D6*5 유전형은 2D6 결실 변이를 포함하는 유전형으로서, CYP2D6 유전자가 인간 염색체 상에서 완전 결여된 것으로 효소생산이 전혀 일어나지 않는다. CYP2D6*2N 유전형은 2D6 중복 변이를 포함하는 유전형으로서 CYP2D6 유전자가 두 개 이상 동일 염색체에 존재한다.

본 발명의 방법을 이용하면 한국인의 CYP 2D6 유전자의 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism; SNP)을 분석하기 위해 개발된 다양한 분석 방법의 표준 물질로 이용하여 많은 양의 유전물질의 원활한 사용을 통해 시간과 비용면에 효율성을 높여 한국인에서 발견되는 CYP 2D6 유전자의 변이형 선발을 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 이러한 아시아인의 PXR 활성의 개인차나 PXR 결핍에 의해 발생 가능한 이상 징후를 예측하는데도 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 추가적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

불멸화 세포주의 제작

시약

사람혈액, Ficol-Histopaque(HISTOPAQUE) (Sigma, Cat. No.1077-1), RPMI-1640 배지 (Hyclone, Cat. No.SH30027.01), Fetal Bovine Serum (FBS) (Hyclone, Cat. No.), Penicillin/Streptomycin (Hyclone, Cat. No.SV30010), Cyclosporin A (Sigma, Cat. No. C3662), Minisart filter 0.45μm (Sartorius stedim, Cat. No. 16555).

<1-1> 혈액에서 말초혈액 단핵 세포( PBMC ) 분리

50ml 튜브에 혈액 10ml과 PBS 15ml을 섞어주었다. 새 50ml cornical tube에 Ficol-Histopaque(HISTOPAQUE)을 15ml 분주하였다. Ficol 위로 PBS와 섞은 혈액을 Ficol과 섞이지 않게끔 천천히 분주하였다. 400g에서 30분간 원심 분리하였다 (브레이크 설정 : 0). 원심분리 후, 가장 위(Plasma)층을 조금만 남겨두고 따서 버리고 말초혈액 단핵 세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells)층을 1ml pipet으로 5~6mL 정도 조심스럽게 취하였다 (도 1 참조). 말초혈액 단핵 세포(PBMC)에 RPMI(FBS 0%, PS 무첨가) 배지를 30ml이 되게 넣고, 부유하고, 400g에서 10분간 원심분리하엿다 (브레이크 설정 : 9). 상등액은 버린 후 cell pellet에 RPMI(FBS 20%, PS 첨가) 배지를 2ml 넣고 부유했다. Hemocytometer를 이용하여 cell 개수를 셌다 (최적 : 1X10⁷~2X10⁷,최소 : 5X10⁶). T25 culture flask에 총 배지 6ml이 되도록 넣었다.

<1-2> 말초혈액 단일핵 세포( PBMC ) 불멸화세포 제작

필터(0.45μm)한 EBV 바이러스 2ml을 첨가한 후 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였다. 2시간 뒤에 Cyclosporin A(stock 100ug/ul) 80u를 첨가하여 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였다. 4일째, RPMI(FBS 20%, Penicillin-Streptomycin 첨가) 배지 2mL을 더 첨가하고, 7일째, PBMC를 T75 culture flask로 옮겼다. 세포가 자라는 것을 지켜보며, RPMI(FBS 20%, Penicillin-Streptomycin 첨가) 배지 적당량을 더 첨가했다. 셀이 충분히 모였으면, cell stock을 만들거나 DNA를 뽑았다.

<1-3> 세포 스탁 ( Cell stock ) 제조

2mL cryo tube에 라벨링하고, 50ml 튜브에 셀을 넣고 1,000rpm에서 3분간 원심 분리했다. 배지를 버리고, Cell pellet에 FBS를 넣고 셀을 부유시켰다. 10%의 DMSO를 넣고, 2mL cryo tube에 나누어서 분주하였다. -70℃에서 하룻동안 보관하고, 액체질소 탱크로 옮겨서 보관하였다.

< 실시예 2 내지 7>

불멸화세포주의 DNA 를 이용하여 유전형을 분석하는 방법

< 실시예 2>

htSNP 선별 및 검증

일배체형 태그 SNP (Haplotype tagging SNP, 이하 ‘htSNP’라 함) 조합은 SNP 태거 (SNP tagger) 를 이용해 선별했다. SNP tagger는 758명의 건강한 지원자의 이전 결과에 기초한 대부분의 한국인 일배체형(haplotype)을 포함한다. CYP2D6 유전자와 phenotype의 관계는 이전 연구에서 밝혀졌다. 모든 피험자는 검체 채취 시에 부산 백병원 임상시험심사위원회를 통해 승인받은 연구임을 동의 한 후 수행하도록 하였다. htSNP 선별을 위한 unknown gametic phase의 실제 일배체형을 결정하기 위해 분자 haplotyping을 수행했다. CYP2D6의 *1, *2, *10, *14, *18, *21, *41, *49, *52, *60, 2D6 중복 (duplication) (*1xN, *2xN, *10xN) 및 2D6 결실 (deletion) (*5)로 이루어진 12개 일배체형을 유전자형 분석을 수행했다. 그 중 *1은 screen된 대립유전자가 감지되지 않았을 때 결정되었다. 일배체형 SNP 조합 중 가장 좋은 tagging SNP 조합은 multiplex SBE(single-base extension) assay에서 다이플로타입(diplotype) 유전형을 고려하여 서로 겹치는지를 확인 후 결정했다. 중복 일배체형(duplication haplotype)을 체크하기위해서, singleplex SBE assay를 따로 수행했고, 이는 중복(duplication) 및 결실(deletion) 유전자의 프라이머가 같은 서열이었기 때문에 multiplex SBE assay에서 수행할 수 없었다 (표 1 참조). 도 2에서 CYP2D6의 긴 길이의 PCR 프라이머의 위치와 multiplex와 singleplex SBE 프라이머를 나타냈다.

도 2에서 수평 화살표는 long PCR 과 multiplex SBE의 다른 forward와 reverse 프라이머의 결합 부위를 나타낸다. 롱 PCR 산물 길이는 화살표 위에 나타났다. CYP2D6 유전자 중복과 결실을 포함하는 다형(polymorphism)의 위치는 밑줄로 표시했다. 숫자가 적힌 작은 네모는 exon을 의미한다. CYP2D6 유전자 중복과 결실의 염색체 위치는 Golden path(hg19) 기준으로 위치를 표시하였다.

< 실시예 3>

롱 ( Long ) PCR

전체(total) CYP2D6 유전자는 9개 엑손(exon)과 5‘-UTR의 1650개 bp를 포함하고 있다. 전체(total) CYP2D6 유전자를 증폭하기 위해서, CYP2D6-4F (5′-GTA TCA GGT AGT CAC AGT GGC TC-3′) 와 3′2D6 (5′-ACT GAG CCC TGG GAG GTA GGT A-3′) 프라이머를 이용해 long and accurate PCR(LAPCR) (TaKaRa LA-PCR kit; TaKaRa Shuzo, Shiga, Japan)로 증폭하였다. Genomic DNA(60120 ng)은 2.5 mmol/L MgCl2, 0.4μmol/L 프라이머, 1.6 mmol/L dNTPs, 및 1 U LA-Taq Polymerase를 포함한 LA-PCR 버퍼에 용해시켰다. PCR을 20 μL의 부피로 맞춘 후 수행하였다. 94 °C에서 1분간 1회 변성시킨 후, 98 °C 20초, 64 °C 30초, 72°C 7분간 30사이클로 반응 후 72 °C에서 10분간 연장 반응하여 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물(6400개 bp)의 사이즈는 0.7% 아가로즈 젤을 이용한 전기영동으로 확인하였다.

CYP2D6 유전자 중에서 중복(duplication) 및 결실(deletion) 유전자를 검출하기 위해서, 두 번의 롱(long) PCR을 수행하였다.

CYP2D6 중복(duplication) 유전자 allele을 분석하기 위해서, CYP2D6 유전자가 2번 반복되는(CYP2D6CYP2D6) 사이에 위치한 2.8-kb의 direct repeat element (CYP-REP)를 증폭하였다. CYP2D6의 중복 유전자를 증폭하기 위해서, Dup-F_2 (5′-CCT CAC CAC AGG ACT GGC CAC C-3′) 와 Dup_R (5′-CAC GTG CAG GGC ACC TAG AT-3′) 프라이머를 이용해 증폭하였다 (도 2 참조). 증폭된 PCR 산물(3238개 bp)의 사이즈는 0.7% 아가로즈 젤을 이용한 전기영동으로 확인하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, CYP2D6 중복 CYP-REP와 CYP2D7의 CYP-REP가 같이 증폭되므로, 이를 구별하기 위해서 중복-특이적인 SNP의 확인을 위해 genotype하였다 (도 3 참조).

CYP2D6 결실(deletion)을 분석하기 위해서, CYP2D6 결실 CYP-REP를 증폭하였다 (도 3 참조). CYP2D6 결실을 증폭하기 위해서, CYP2D6_3 (5′-ACC TCT CTG GGC CCT CAG GGA-3′)와 3′ CYP2D6*5 (5′-CAG GCA TGA GCT AAG GCA CCC AGA C-3′) 프라이머를 이용해 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물(2926개 bp)의 사이즈는 0.7% 아가로즈 젤을 이용한 전기영동으로 확인하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, CYP2D6 결실의 CYP-REP와 CYP2D6의 CYP-REP가 함께 증폭되므로, 이를 구별하기 위해서 결실-특이적인 SNP의 확인을 위해 genotype하였다 (도 3 참조).

도 3에서 파란색 네모는 CYP2D6, CYP2D7, CYP2D6 중복(duplication), CYP2D6 결실(deletion) 대립유전자와 CYP2D6 중복과 결실의 동정 위치의 특이적인 CYP-REP 서열을 나타낸다. 염색체 위치는 Golden path(hg19) 기준으로 위치를 표시하였다. CYP2D6 중복과 결실 대립유전자는 재조합 영역의 특이적인 SNP에 의해 구별될 수 있다 (표 1, 도 3 참조). CYP2D6 중복과 결실의 PCR 수행조건은 Genomic DNA (4080ng)는 2.5mmol/L MgCl2, 0.4μmol/L 프라이머, 1.6mmol/L dNTPs, 1 U LA-Taq polymerase를 포함한 LA-PCR buffer에 용해시키고, 전체 부피를 20μL로 맞췄다. 9700 Thermal Cycler (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용해 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행했다; 94 °C에서 1분간 1회 변성시킨 후, 98 °C 20초, 64 °C 30초, 72°C 3분 30초간 30사이클로 반응 후 72 °C에서 10분간 연장 반응하여 증폭시켰다. PCR 산물은 PCR 5μL 당 ExoSAP-IT2μL를 37 °C에서 30분 동안 처리하고, 효소를 불활성화 시키기 위해 80 °C에서 15분동안 인큐베이션하였다. 전체 PCR 산물과 ExoSAP-IT에 의해 정제된 결실(deletion) 유전자는 CYP2D6 유전자의 10개 다형의 위치를 검출하기 위한 multiplex SBE에서 template로 사용하였다 (표 1 참조). 표 1에 나타난 바와 같이 프라이머 길이는 peak 신호가 겹쳐지는 것을 막기 위해 디자인 하였고, 각 프라이머의 길이는 5′ poly (dT) tail을 첨가하여서 약 5bp의 차이가 나도록 조절하였다. ExoSAP-IT에 의해 정제된 중복(duplication) 유전자의 PCR 산물은 singleplex SBE에서 중복 유전자를 검출하기 위한 template로 사용하였다 (표 1 참조). 표 1에서 프라이머 길이는 P 다음 삽입어구 안에 기재했고, 상대적으로 F와 R은 forward와 reverse primer를 나타낸다. a 는 분리된 well에서 duplication을 검출하기 위한 singleplex SBE reaction을 나타낸다.

<실시예 4>

SNaPshot 분석

SNaPshot을 이용해 제조자의 프로토콜에 따라 Multiplex와 singleplex SBE를 수행하였다. 형광 표지되지 않은 oligonucleotide 프라이머를 단일 형광 표지된 dideoxynucleotide triphosphate를 이용해서 annealing 하여, nucleotide에 따라 4개 다른 색을 나타냄으로써 SNP를 탐지하였다 (Applied Biosystems). 정제된 PCR 산물의 상등액 3μL와 스냅샷 멀티플렉스 레디 리액션 믹스(SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix) 1 μL와 1/2 텀(term) 완충액(200 mmol/L TrisHCl, 5 mmol/L MgCl₂, pH 9) 4 μL 및 multiplex SBE를 위한 pooled detection 프라이머 또는 singleplex SBE를 위한 프라이머(표 1 참조)를 넣어 전체 반응물의 양을 10 μL로 맞추었다. 96 °C에서 10초, 50 °C에서 5초, 60 °C에서 30초간 40 사이클을 반복하여 반응을 수행하였다.

반응이 끝난 후 반응물을 37°C에서 1시간 shrimp alkaline phosphatase 1U로 처리하고, 65°C에서 15분간 인큐베이션하여 효소를 불활성화했다. SNaPshot 산물은 SNaPshot 산물 0.5 μL, Hi-Di formamide 9.3 μL, Genescan-120 LIZ™size marker 0.2 μL를 혼합하여 최종적으로 모세관 전기이동(capillary electrophoresis)으로 분석하였다. 샘플들을 95°C에서 5분간 변성시키고, 36-cm capillary array 와 POP-7 polymer를 사용해 ABI-Prism 3100 유전자 분석기로 분석하였다. 분석은 GeneMapper (ver. 3.7) 소프트웨어를 사용하였다.

SNaPshot 중복 시험에서 두 개의 피크가 있고, 유전자형이 *1, *2 및 *10의 조합의 두 개의 중복 후보물질로 구성되어 있다면, 공지된 방법으로 중복의 origin을 시험하였다. 이전 결과에 기초하여 중복 대립유전자를 검출하기위해 주로 *1, *2 및 *10에 집중하였다.

그 결과 도 4에 9개 다른 genotype을 전기곡선도(electrogram)로 나타냈다. 중복 일배체형(duplication haplotype) 경우는 (CYP2D6*2xN/*10) 공지된 방법으로 확인하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 많은 경우에서 중복의 origin은 중복이 아닌 경우와 비교해 다형성(polymorphism) 위치의 피크 높이 비율에 의해 분석하였다. 그러나 758개 샘플 중 두 개의 중복 대립유전자를 가진 유전형은 없었다. 표 2에서 나타난 바와 같이, Sistonen et al의 결과와 비교해 선택된 일배체형 마커 단일염기변이(htSNP)의 조합이 아시아인 유전자를 커버할 수 있는지 결정하기 위해 평가했다. 본 발명자의 발명이 보고된 결과에 기초에 중국인과 일본인의 유전자를 더 잘 커버하였다. AmpliChip, DrugMEt™ 과 Sistonen et al사의 것을 이용한 본 발명자의 방법으로 분석한 것은 한국인의 공통되거나 중요한 일배체형(haplotype)을 완벽하게 커버하지 않았다.

도 4에서 감지된 다형성은 피크 위에 나타냈고, 각각의 유전형은 왼쪽에 표시했다. 각 다형(polymorphism)은 하나(wild-type or mutant) 또는 두 개(wild-type 과 mutant 함께)의 피크를 가졌다. 왼쪽 피크는 CYP2D6 결실을 제외한 wild-type intensity를 나타낸다. 그러나 두 개의 중복 대립 유전자를 가진 유전형은 CYP2D7에서 CYP-REP를 증폭하기 위해 두 개의 피크를 가질 것이고, 본 발명자의 샘플에서는 발견되지 않았다. 각 피크 색깔은 뉴클레오타이드에 기초해 다르게 나타냈다. 중복의 경우(G), *2xN/*10이 더 많은 분석으로 확인됐고, 왼쪽 피크의 높이(wild-type)는 오른쪽 피크(mutant)와 비교해서 상대적으로 *10을 감지하기 위해 100C>T에서 높고, *2를 감지하기 위해 2850C>T에서 낮다.

< 실시예 5>

타당성 검사( validation )

56개 샘플에 대하여 타당성 검사(validation)를 수행한 결과, SBE assay와 시퀀싱 방법 사이에 100% 일치하는 결과를 얻었다. CYP2D6*1/*1을 포함하는 14개 유전형을 각 유전형별로 1-13 샘플에 대해 분석하였는데, 모든 12개 타겟 일배체형(haplotype)을 포함했다.

CYP2D6*1/*1을 포함하는 14개 유전형을 12개의 목적 일배체형(haplotype)을 포함하는 각각의 유전형의 1-13 샘플로 분석했다. Inter-assay variation을 시험하기 위해, 56개의 다른 개인의 SBE genotyping은 두 번 수행했고, 차이점이 발견되지 않았다. 나머지 샘플의 genotyping 결과는 이전 연구 결과와 같은 결과로 나왔다. 다른 중국인, 베트남인인 다른 아시아인의 genotyping 결과는 표 2에 나타냈고, 공지된 것 외에 *14, *21, *41, *49 및 최근 발견한 대립유전자인 *52를 포함했다. 표3에서 ND는 not detected를 의미한다.

한국인, 중국인, 베트남인에서 multiplex SBE를 사용한 CYP2D6 일배체형(haplotype)의 빈도

Allele	Frequency(%)
	Korean(n=758)	Chinese(n=89)	Vietnamese(n=122)
*1	32.3	27.5	24.6
*2	10.1	13.5	7.8
*5	5.6	9.6	6.1
*10	45.6	43.8	57
*14	0.3	1.1	1.2
*18	0.3	ND	ND
*21	0.3	1.1	ND
*41	2.2	2.2	2.9
*49	1.4	0.6	0.4
*52	0.3	0.6	ND
*60	0.1	ND	ND
Duplication	1.5	ND	ND

< 실시예 6>

유전자 지노타이핑( genotyping )

본 발명자의 방법을 사용하여 genotyping 하기위해 본 발명자의 이전의 CYP2D6 연구에서 758개 샘플을 사용 했다. 확인을 위해서, 새로운 방법과 비교해 full-length CYP2D6 유전자의 direct sequencing으로 56개의 DNA 샘플을 분석하였다. 나머지는 이전 연구에 의해 설명된 방법으로 수행하였다.

89명 중국인과 122명 베트남사람을 genotype 하기 위해서, 인제대학교 DNA Repository of the Pharmacogenomics Research Center(PGRC) DNA 샘플을 사용했다. 중국인 인종적 배경은 Han 이었다. 모든 베트남사람은 베트남의 주된 인구 그룹인 Viet Kinh이었다. 중국인과 베트남사람 샘플은 지역 임상시험심사위원회(IRB)에 의해서 승인된 서면으로 작성된 동의 하에 해당 지역에서 수집되었다.

인간 CYP2D6 지노타이핑(genotyping)은 치료 초기단계에서 용량을 결정하는데 도움이 된다. 이전의 몇가지 방법은 CYP2D6*18, *21, *49, *52, 및 *60과 같은 한국인 또는 아시아인의 대립유전자의 공통되고 중요한 유전자를 커버하지 못했다 (표 3 참조). 그러나 CYP2D6*3, *6, 및 *17같은 한국인 또는 아시아인에게서 발견되지 않는 많은 대립유전자는 커버했다. 따라서, 한국인 뿐만 아니라 아시아인을 위한 SBE 반응을 이용한 비용 효율이 높고, 빠르고 정확한 CYP2D6 genotyping 방법을 개발했다.

Genotyping 방법을 이용해 한국인에게 공통적이고 드문 다형성(polymorphism)인 *2, *5, *10, *14, *18, *21, *41, *49, *52, *60, 및 중복(duplication)을 결정했다. 이들 대립유전자는 다른 아시아인종에 대해 98% 이상을 커버할 수 있다 (표 3 참조). 표 3에서 각 방법에서 보고된 allele 빈도와 일치하는 allele에 기초해 coverage를 계산했다. 표 3에서 n/d는 not determined를 의미하고, a는 본발명자가 (Pharmaconomics Research Center, PGRC) 개발한 방법을 의미한다. 본 발명자는 최근 밝혀진 기능적 일배체형의 존재를 확인하기 위해 중국인과 베트남인에 대해 genotype했다. 알려진 일배체형 (haplotype)뿐 아니라 4.5%의 중국인에게서 *21, *41, *49 및 *52를, 4.5%의 베트남인에게서 *14, *41 및 *49를 발견했다. 이를 통해 아시아인은 서로 비슷하고, 본 발명자의 방법은 다른 방법에 비교할 때 아시아인과 관련된 대립유전자 포함 범위가 우세하다는 것을 알 수 있었다. 이러한 방법은 CYP2D6*44를 포함해 알려진 기능의 드문 아시아인 대립유전자와 같은 더 많은 대립유전자를 분석할 때 microarry 방법보다 더 편리하다.

다른 방법과 유전자 일치 빈도의 비교

Allele	Frequency(%)
	Korean(n=758)				Japanese(n=286)		Chinese(n=223)
*1	32.3	32.3	32.3	32.3	42.7	42.7	23.6	23.6
*2	10.1	10.1	10.1	10.1	11.4	11.4	15.5	15.5
*5	5.6	5.6	5.6	5.6	7.2	7.2	7.2	7.2
*10	45.6	45.6	45.6	45.6	36.2	36.2	51.6	51.6
*14	0.3	0.3	n/d	0.3	n/d	n/d	2	n/d
*18	n/d	n/d	n/d	0.3	n/d	n/d	n/d	n/d
*21	0.3	n/d	n/d	0.3	0.7	n/d	n/d	n/d
*41	2.2	n/d	2.2	2.2	n/d	n/d	n/d	n/d
*49	n/d	n/d	n/d	1.4	0.3	n/d	n/d	n/d
*52	n/d	n/d	n/d	0.3	n/d	n/d	n/d	n/d
*60	n/d	n/d	n/d	0.1	n/d	n/d	n/d	n/d
Duplication	1.5	1.5	n/d	1.5	n/d	n/d	n/d	n/d
Allele coverage	97.9	95.4	95.8	100	98.5	97.5	99.9	97.9
Method	AmpliChip	DrugMEt™	Sistonen	PGRCa	PGRCa	Sistonen	PGRCa	Sistonen

기재된 방법은 한국인을 위해 최적으로 선택된 tagging SNP를 사용했고, tagging SNP 조합에서 이배체형(diplotype)을 번역(interpret)하기 위해 이배체형의 overlap을 확인하였다. 이는 genotyping 결과에서 해석을 명확히 할 수 있다. 본 발명자의 결과에 의하면 genotyping에 대해 11 다형성 마커를 포함하는데, CYP2D6의 결실과 중복 유전자를 포함한다. 이전 연구에서 사용된 방법은 CYP2D6의 결실과 중복을 검출하기 위해 롱(long) PCR과 전기영동(electrophoresis) 두 단계를 포함했는데, 모두 시간 소모적이고, 힘든 방법이다. 본 발명에 이용된 방법은 이러한 단계가 SBE로 대체되었고, 더 정확하고 빠른 유전형 결정이 가능하다. SBE-based 방법의 이점은 비용 효율이 높다는 점이다. 한 개의 샘플을 지노타이핑(genotyping) 하는데 한국에서 약 $100정도의 직접 시퀀싱 방법보다 1/5 이하의 비용이 든다. 또한 새로운 대립유전자를 추가하는데 관련하여 유연한 이점이 있다. SBE 반응 혼합물에 대한 단순한 새로운 시퀀싱 프라이머의 추가는 새로운 대립유전자의 genotyping을 가능하게 한다. chip-based genotyping platform에 새로운 대립유전자를 추가하는 것이 어려운 것이 일반적이다.

본 발명자가 규명한 CYP2D6를 종족별로 비교하였을 때, 동아시아 종족을 약 99% 내외로 커버할 수 있다.

< 실시예 7>

유전자 일치 확인

표 4에 나타난 바와 같이, 불멸화 세포와 정상피험자 혈액에서 CYP2D6 변이형이 일치한 것을 확인할 수 있었다. W는 야생형(wild-type) M은 변이형(mutant-type)을 나타낸다.

불멸화 세포주와 정상피험자에서 CYP2D6 변이형의 빈도

				불멸화세포					정상피험자 혈액
detected polymorphism	WW	WM	MM	N	F (%)	WW	WM	MM	N	F (%)
1758G>A	130	2	0	132	0.76	1401	11	2	1414	0.53
100C>T	28	78	26	132	49.24	446	727	410	1583	48.86
1611T>A	128	2	0	130	0.77	1388	37	1	1426	1.37
2573G>insC	131	1	0	132	0.38	1416	5	0	1421	0.18
2988G>A	127	5	0	132	1.89	1355	54	3	1412	2.12
3877G>A	130	1	0	131	0.38	1406	9	0	1415	0.32
4125G>ins9T	131	1	0	132	0.38	1420	4	0	1424	0.14
2850C>T	102	25	5	132	13.26	1028	338	49	1415	15.41
1887G>insTA	131	0	0	131	0.00	1422	1	0	1423	0.04
delA>G	114	11	2	127	5.91	1452	161	9	1622	5.52
dupG>A	130	2	1	133	1.50	1584	37	0	1621	1.14

표 5, 6 및 7은 PARAGON사에서 분석한 CYP2D6 SNP와 본 발명자들(PGRC)의 방법으로 분석한 CYP2D6 SNP를 비교한 것이다. PARAGON의 방법은 아프리카, 백인의 약90% 이상을 커버할 수 있지만, 동아시아(일본, 중국, 한국) 종족은 약50% 내외만을 커버한다. Diplotype과 haplotype을 비교한 결과 본 발명자의 세포주로는 동아시아 종족을 약 99% 내외로 커버할 수 있다. (표 5, 6 및 7 참조)

하기 표 8은 이전에 공지된 불멸화된 세포주에는 존재하지 않고, 본 발명의 불멸화된 세포주에만 존재하는 유전형을 나타낸 것이다. 표 8에 기재된 유전형은 서양인에서는 5% 내외의 빈도로 나타나는 반면에 한국인 및 아시아인에서는 40~50%의 빈도로 나타나므로, 하기 표 8에 기재된 17개의 유전형이 추가된 본 발명의 불멸화된 세포주는 아시아인의 95~99%를 커버할 수 있었다.

< 실시예 8>

재조합 야생형 및 돌연변이형 CYP2D6 의 발현

CYP2D6 및 NADPH-CYP (P450) 산화환원효소(oxidoreductase) (CPR) 유전자는 CYP2D6*10B, CYP2D6*49 및 CYP2D6*52의 유전형을 갖는 불멸화 세포주의 RNA로부터 제조된 cDNA를 이용한 PCR 방법으로 클로닝 되었다. CYP2D6의 증폭을 위해 사용한 프라이머로는 5`-GTCGACATGGGGCTAGAAGCACTG-3`(정방향) 및5`-GAATTCCTAGCGGGGCACAGC-3‘(역방향)를 사용하였고, CPR 증폭을 위한 프라이머로는 5`-CTCGAGATGGGAGACTCCCAC-3`(정방향) 및 5`-GGTACCCTAGCTCCACACGTC-3`(역방향)을 사용하였다. 이후 PCR 산물들은 pGEM T-Easy vector(Promega, Madison, WI) 내로 삽입되었고 삽입된 클론의 완성된 오픈 리딩 프레임은 시퀀싱을 통해 확인하였다.

야생형(wild-type)과 돌연변이형의 CYP2D6 cDNAs 및 CPR cDNA은 pFastBac dual vector (Invitrogen, Carlsbad, CA)내로 서브 클로닝하였고, Sf9 세포들은 hemin chloride (2.5 /ml) 존재하에서 5~6의 감염다중도(multiplicity of infection)로 바이러스로 감염시켰다. CYP2D6 함량은 차등 분광법(Omura and Sato, 1964)을 이용하여 측정하였다.

< 실시예 9>

효소 반응속도론 분석( Enzyme Kinetics )

야생형 및 돌연변이형 CYP2D6 단백질의 효소 활성 분석은 덱스트로메트로판(dextromethorphan) 및 메토프롤롤(metoprolol)을 기질로 사용하여 분석하였다. 반응 혼합물(0.25ml)은 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7.4)에 5 pmol의 사이토크롬 P450이 용해된 용액을 사용하였고, 효소 활성 분석을 위한 덱스트로메트로판(dextromethorphan) 및 메토프롤롤(metoprolol)의 농도 범위는 0.5 to 25 μM하에서 수행하였다. 상기 반응물을 37℃의 온도에서 5분 동안 전배양시킨 후, NADPH 발생 시스템 (3.3 mM glucose 6-phosphate, 1.3 mM β-NADP^＋, 3.3 mM MgCl2, 1U/ml glucose-6-phosphate dehydrogenase)을 첨가하여 반응을 개시하였고, 이후 37℃에서 30분동안 반응시켰다. 반응은 얼음 상에 반응 튜브를 옮기고, 100μl 의 차가운 아세토니트릴 용액을 첨가함으로써 정지시켰다. 이후 반응 혼합물은 20,000g의 속도로 4℃의 온도에서 10분간 원심 분리시켰다.

원심분리 후 5μl의 상등액을 Agilent 1100 series HPLC (Agilent, Wilmington, DE) 및 the API 3000 tandem mass spectrometer (Applied Biosystems)가 장착된 API 3000 LC-MS/MS system (Applied Biosystems)에 주입시키고, Luna C18 column (2 × 50 mm, 3um ; Phenomenex, Torrance, CA)을 아세토니트릴 및 물(3:7, V/V)의 isocratic 이동상 용매를 사용하여 0.2 ml/min의 유속으로 매스 크마토그램을 수득하였다. dextromethorphan O-demethylation 및 metoprolol α-hydroxylation의 검출은 m/z 342에서 203로의 전이 상태를 모니터링하면서 분석하였다.

dextromethorphan O-demethylation 및 metoprolol α-hydroxylation의 효소 반응 측정 파라미터들은 one-enzyme Michaelis-Menten equation (Win-Nonlin; Pharsight, Mountain View, CA)에 대한 unweighted kinetic data를 부합시켜 측정하였다. dextromethorphan O-demethylation and metoprolol α-hydroxylation에 대한 효소 속도론은 Michaelis-Menten equation에 가장 잘 부합하는 결과를 나타내었으며, 이들 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다. 또한 모든 결과들은 mean ± S.D.으로 나타내었다.

나아가 본 발명자들은 본 발명에 따른 불멸화 세포주에서 적용 가능한 약물대사효소와 수송체의 유전형 및 빈도를 분석한 결과 아래 표 9와 같은 결과를 얻을 수 있었다.

결론적으로, 이상과 같은 실험을 통해 본 발명자는 EBV 바이러스와 B 림프구로부터 CYP2D6 유전형 분석을 위한 표준 유전자 불멸화 세포주를 제작하였다. 본 발명의 불멸화 세포주를 이용하여 한국인 전체 유전자의 결실과 중복을 포함한 multiplex와 singleplex SBE를 사용한 임상적으로 적용가능한 CYP2D6 genotyping 방법을 사용해 유전형을 분석했다. 이러한 방법은 일본인과 중국인을 비롯한 다른 아시아인종에게 적용가능하고, CYP2D6 유전형의 98% 이상을 커버할 수 있다. 약물유전체학(pharmacogenomics)에서, 유전형에 기초한 치료 약물 모니터링은 개인별 약물을 처방하는데 한 가지 방법이 될 수 있고, 임상 적용을 위한 비용효율이 높고 빠르고 정확한 방법을 개발할 가치가 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Inje University <120> Immortalizatized standard cell lines for genotyping of drug metabolism genes included human cytochrome P450 2D6 gene <130> pn1204-167 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 exon1 sequence <400> 1 atggggctag aagcactggt gcccctggcc gtgatagtgg ccatcttcct gctcctggtg 60 gacctgatgc accggcgcca acgctgggct gcacgctacc caccaggccc cctgccactg 120 cccgggctgg gcaacctgct gcatgtggac ttccagaaca caccatactg cttcgaccag 180 180 <210> 2 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 exon3 sequence <400> 2 gggtgttcct ggcgcgctat gggcccgcgt ggcgcgagca gaggcgcttc tccgtgtcca 60 ccttgcgcaa cttgggcctg ggcaagaagt cgctggagca gtgggtgacc gaggaggccg 120 cctgcctttg tgccgccttc gccaaccact ccg 153 <210> 3 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 exon4 sequence <400> 3 ggacgcccct ttcgccccaa cggtctcttg gacaaagccg tgagcaacgt gatcgcctcc 60 ctcacctgcg ggcgccgctt cgagtacgac gaccctcgct tcctcaggct gctggaccta 120 gctcaggagg gactgaagga ggagtcgggc tttctgcgcg agtgc 165 <210> 4 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 exon5 sequence <400> 4 gtgctgaatg ctgtccccgt cctcctgcat atcccagcgc tggctggcaa ggtcctacgc 60 ttccaaaagg ctttcctgac ccagctggat gagctgctaa ctgagcacag gatgacctgg 120 gacccagccc agcccccccg agacctgact gaggccttcc tggcagagat ggagaag 177 <210> 5 <211> 194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 exon6 sequence <400> 5 gccaagggga accctgagag cagcttcaat gatgagaacc tgcgcatagt ggtggctgac 60 ctgttctctg ccgggatggt gaccacctcg accacgctgg cctggggcct cctgctcatg 120 atcctacatc cggatgtgca gcgtgagccc atctgggaaa cagtgcaggg gccgagggag 180 gaagggtaca ggcg 194 <210> 6 <211> 142 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 exon8 sequence <400> 6 ggaacgacac tcatcaccaa cctgtcatcg gtgctgaagg atgaggccgt ctgggagaag 60 cccttccgct tccaccccga acacttcctg gatgcccagg gccactttgt gaagccggag 120 gccttcctgc ctttctcagc ag 142 <210> 7 <211> 179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP2D6 exon9 sequence <400> 7 gccgccgtgc atgcctcggg gagcccctgg cccgcatgga gctcttcctc ttcttcacct 60 ccctgctgca gcacttcagc ttctcggtgc ccactggaca gccccggccc agccaccatg 120 gtgtctttgc tttcctggtg agcccatccc cctatgagct ttgtgctgtg ccccgctag 179

Claims (8)

1. (a) 아시아인으로부터 채취한 혈액에서 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells)를 분리하는 단계;
   (b) 상기 말초혈액단핵세포(PBMC)에 EBV 바이러스를 감염시키는 단계;
   (c) 상기 (b) 단계에서 EBV 바이러스로 감염된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 37℃의 온도에서 2시간 배양 후, 사이클로스포린 A(cyclosporin A)를 첨가하여 T 림프구를 사멸시킨 후, EBV 바이러스로 감염된 B세포만을 분리하는 단계; 및
   (d) 상기 (c) 단계에서 분리한, EBV 바이러스로 감염된 B세포로 세포 스탁(cell stock)을 만드는 단계를 포함하는,
   아시아인의 CYP2D6 유전형 분석을 위한 표준 유전자 불멸화 세포주를 제조하는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서,
   상기 불멸화된 세포주는 CYP2D6 *1/*2, *1/*10B, *1/*41, *1/*60 *2/*5, *2/*10B, *2/*14B, *2/*18, *2/*41, *5/*10B, *10B/*10B, *10B/*14B, *10B/*41, *10B/*49, *10B/*52, *21B/*49, *1/*2N, *1/*10BN 변이 유전형을 포함하는 것을 특징으로 하는 아시아인의 CYP2D6 유전형 분석을 위한 표준 유전자 불멸화 세포주를 제조하는 방법.
5. 제1항의 방법으로 제조되고, CYP2D6 *1/*2, *1/*10B, *1/*41, *1/*60 *2/*5, *2/*10B, *2/*14B, *2/*18, *2/*41, *5/*10B, *10B/*10B, *10B/*14B, *10B/*41, *10B/*49, *10B/*52, *21B/*49, *1/*2N, *1/*10BN 유전형을 포함하는, 아시아인의 CYP2D6 유전형 분석을 위한 표준 유전자 불멸화 세포주.
6. 제 5항의 불멸화된 세포주를 표준물질로 이용하여 CYP2D6 유전자의 염기서열에서 1758G>A, 100C>T, 1611T>A, 2573G>insC, 2988G>A, 3877G>A, 4125G>ins9T, 2850C>T, 1887G>insTA, delA>G 및 dupG>A로 이루어진 군에서 선택되는 CYP2D6 유전자 변이의 존재 유무를 분석하는 것을 특징으로 하는 CYP2D6 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
7. 삭제
8. 삭제

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