JP2001137000A - 遺伝子変異の判別方法 - Google Patents
遺伝子変異の判別方法Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子上の核酸の変異を安価かつ迅速に行う
方法を提供する。 【解決手段】 変異核酸に対応する核酸を３’末端に有
するプライマーＤＮＡ、正常核酸に対応する核酸を３’
末端に有するプライマーＤＮＡ、及びそれぞれに対峙す
る２種のプライマーＤＮＡを含む４種のプライマーＤＮ
Ａを使用するＰＣＲ反応で生ずるＤＮＡ断片のサイズを
確認することにより、所定の遺伝子変異の有無を判別す
る方法。
方法を提供する。 【解決手段】 変異核酸に対応する核酸を３’末端に有
するプライマーＤＮＡ、正常核酸に対応する核酸を３’
末端に有するプライマーＤＮＡ、及びそれぞれに対峙す
る２種のプライマーＤＮＡを含む４種のプライマーＤＮ
Ａを使用するＰＣＲ反応で生ずるＤＮＡ断片のサイズを
確認することにより、所定の遺伝子変異の有無を判別す
る方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、予め想定される染
色体上の遺伝子変異について、この有無ならびに対立遺
伝子上の型を簡便に判別する方法に関する
色体上の遺伝子変異について、この有無ならびに対立遺
伝子上の型を簡便に判別する方法に関する
【従来の技術】従来、一定の疾病に罹患し易い体質を呈
する集団や、一定の薬効が発揮されない体質を呈する集
団などの存在が知られていた。近年のゲノム解析手法な
らびにヒトゲノム解析の急激な進展により、これらの現
象の多くが、特定遺伝子の塩基配列上に通常１塩基置換
であることの多いわずかな変異（Single Nucleotide Po
lymorphisms, SNPs)によるものであるという知見が多く
蓄積されるに至った。現在もこのようなSNPｓの解析が
精力的に行われている。また、疾病の発症がある遺伝子
の塩基配列の変異に起因すると言う事実も古くから知ら
れていたが、先に述べたゲノム解析の進展は、疾病の原
因となる遺伝子上の変異の特定についても、新たな知見
を急速に増加させつつある。
する集団や、一定の薬効が発揮されない体質を呈する集
団などの存在が知られていた。近年のゲノム解析手法な
らびにヒトゲノム解析の急激な進展により、これらの現
象の多くが、特定遺伝子の塩基配列上に通常１塩基置換
であることの多いわずかな変異（Single Nucleotide Po
lymorphisms, SNPs)によるものであるという知見が多く
蓄積されるに至った。現在もこのようなSNPｓの解析が
精力的に行われている。また、疾病の発症がある遺伝子
の塩基配列の変異に起因すると言う事実も古くから知ら
れていたが、先に述べたゲノム解析の進展は、疾病の原
因となる遺伝子上の変異の特定についても、新たな知見
を急速に増加させつつある。
【０００２】ゲノム研究を臨床的な観点から考察すれ
ば、ある個体が特定の遺伝子上に変異を有しているか否
かを迅速に判別することは大変に重要な問題である。こ
の判別によってある個体が罹患し易い疾病を事前に知る
ことができれば、その疾病に対する有効な予防計画が可
能となると予想される。また、この様な遺伝子変異を有
する者とその者に対して効果的な医薬品との相関データ
が蓄積されれば、係る変異を有する個体に対してより適
切な医薬品あるいは治療法の開発が可能になり、また疾
病原因の早期発見につながるなど、臨床医療にもたらす
利点は大きいものがある。
ば、ある個体が特定の遺伝子上に変異を有しているか否
かを迅速に判別することは大変に重要な問題である。こ
の判別によってある個体が罹患し易い疾病を事前に知る
ことができれば、その疾病に対する有効な予防計画が可
能となると予想される。また、この様な遺伝子変異を有
する者とその者に対して効果的な医薬品との相関データ
が蓄積されれば、係る変異を有する個体に対してより適
切な医薬品あるいは治療法の開発が可能になり、また疾
病原因の早期発見につながるなど、臨床医療にもたらす
利点は大きいものがある。
【０００３】遺伝子上の変異の有無を判別する方法とし
て、これまでにも幾つかの方法が開発されている。ポリ
メラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法と制限酵素
による切断とを組合わせたＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｅｒｌｉ
ｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２，１６４３頁、１９９
１年）はその代表例である。また、ごく最近になってＤ
ＮＡマイクロアレー法も開発された（Ｂｒｏｗｎら、Ｎ
ａｔ．Ｇｅｎｔ．、２１、３３頁、１９９９年）。
て、これまでにも幾つかの方法が開発されている。ポリ
メラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法と制限酵素
による切断とを組合わせたＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｅｒｌｉ
ｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２，１６４３頁、１９９
１年）はその代表例である。また、ごく最近になってＤ
ＮＡマイクロアレー法も開発された（Ｂｒｏｗｎら、Ｎ
ａｔ．Ｇｅｎｔ．、２１、３３頁、１９９９年）。
【０００４】しかし、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、検査工程
に３〜２４時間もの制限酵素処理を含むために、迅速な
方法とは言い難い。また、ＤＮＡマイクロアレー法はそ
の実施コストが極めて高く、大量の検体を処理する上で
コスト的に大変不利であった。従って、大量の検体を迅
速かつ安価に処理することの出来る新しい遺伝子変異の
判別方法の開発が望まれていた。
に３〜２４時間もの制限酵素処理を含むために、迅速な
方法とは言い難い。また、ＤＮＡマイクロアレー法はそ
の実施コストが極めて高く、大量の検体を処理する上で
コスト的に大変不利であった。従って、大量の検体を迅
速かつ安価に処理することの出来る新しい遺伝子変異の
判別方法の開発が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＰＣＲ法
の利点をそのまま活用し、更にＰＣＲ法の実施時に留意
すべきプライマーＤＮＡ配列設計上の制限を逆に利用す
ることで、大量の検体を迅速かつ安価に処理することの
出来る新しい遺伝子変異の識別方法（Confronting two-
pair primers PCR）を開発した。
の利点をそのまま活用し、更にＰＣＲ法の実施時に留意
すべきプライマーＤＮＡ配列設計上の制限を逆に利用す
ることで、大量の検体を迅速かつ安価に処理することの
出来る新しい遺伝子変異の識別方法（Confronting two-
pair primers PCR）を開発した。
【０００６】即ち、本発明は、変異核酸に対応する核酸
を３’末端に有するプライマーＤＮＡ、正常核酸に対応
する核酸を３’末端に有するプライマーＤＮＡ、及びそ
れぞれに対峙する２種のプライマーＤＮＡを含む４種の
プライマーＤＮＡを使用するＰＣＲ反応で生ずるＤＮＡ
断片のサイズを確認することにより、所定の遺伝子変異
の有無を判別する方法である。
を３’末端に有するプライマーＤＮＡ、正常核酸に対応
する核酸を３’末端に有するプライマーＤＮＡ、及びそ
れぞれに対峙する２種のプライマーＤＮＡを含む４種の
プライマーＤＮＡを使用するＰＣＲ反応で生ずるＤＮＡ
断片のサイズを確認することにより、所定の遺伝子変異
の有無を判別する方法である。
【０００７】本発明は、予め所望の塩基配列を有するよ
うに設計された少なくとも２組のプライマーＤＮＡ配列
を利用するものである。本発明の概略を、変異の有無を
判別しようとする対象遺伝子の対立遺伝子Ｘ上の塩基が
Ｘ、対立遺伝子Ｙ上の塩基Ｘに相当する核酸がＹと仮定
したSNPsを例に、図１を用いて説明する。
うに設計された少なくとも２組のプライマーＤＮＡ配列
を利用するものである。本発明の概略を、変異の有無を
判別しようとする対象遺伝子の対立遺伝子Ｘ上の塩基が
Ｘ、対立遺伝子Ｙ上の塩基Ｘに相当する核酸がＹと仮定
したSNPsを例に、図１を用いて説明する。
【０００８】まず、４種のプライマーＤＮＡとして、相
対する２組のプライマーＤＮＡを設計する。１組は対立
遺伝子Ｘを増幅対象とする組であり、もう１組は対立遺
伝子Ｙを増幅対象とする組である。対立遺伝子Ｘ用の組
のうち、１つのプライマーＤＮＡ（アンチセンスプライ
マー１Ｒ）の３’末端を核酸Ｘに相補する核酸Ｘ’とし
て合成し、これと相対するセンスプライマー１Ｆを合成
して、これらを１つの組合わせとする。一方、対立遺伝
子Ｙ用としてその３’末端が核酸Ｙであるセンスプライ
マーＤＮＡ（プライマー２Ｆ）を合成し、このプライマ
ー２Ｆよりさらに下流に相対して位置するアンチセンス
プライマーＤＮＡ（プライマー２Ｒ）を合成して、これ
らをもう１つの組合わせとする。
対する２組のプライマーＤＮＡを設計する。１組は対立
遺伝子Ｘを増幅対象とする組であり、もう１組は対立遺
伝子Ｙを増幅対象とする組である。対立遺伝子Ｘ用の組
のうち、１つのプライマーＤＮＡ（アンチセンスプライ
マー１Ｒ）の３’末端を核酸Ｘに相補する核酸Ｘ’とし
て合成し、これと相対するセンスプライマー１Ｆを合成
して、これらを１つの組合わせとする。一方、対立遺伝
子Ｙ用としてその３’末端が核酸Ｙであるセンスプライ
マーＤＮＡ（プライマー２Ｆ）を合成し、このプライマ
ー２Ｆよりさらに下流に相対して位置するアンチセンス
プライマーＤＮＡ（プライマー２Ｒ）を合成して、これ
らをもう１つの組合わせとする。
【０００９】仮に、上述の条件の下、各組のみを単独の
プライマーＤＮＡとしてＰＣＲ反応を行えば、各反応後
に認められる特異的なＤＮＡ増幅物のサイズは、それぞ
れａ塩基対（サイズａ）、ｂ塩基対（サイズｂ）とな
る。ここで、サイズａとサイズｂはゲル電気泳動などの
適当な方法により分子量的に区別される必要があるが、
これは所望のサイズ差が与えられるよう、任意に対象遺
伝子上のプライマーＤＮＡの位置を調節すればよい。
プライマーＤＮＡとしてＰＣＲ反応を行えば、各反応後
に認められる特異的なＤＮＡ増幅物のサイズは、それぞ
れａ塩基対（サイズａ）、ｂ塩基対（サイズｂ）とな
る。ここで、サイズａとサイズｂはゲル電気泳動などの
適当な方法により分子量的に区別される必要があるが、
これは所望のサイズ差が与えられるよう、任意に対象遺
伝子上のプライマーＤＮＡの位置を調節すればよい。
【００１０】本発明によれば、変異が疑われる遺伝子に
対して、上述の２組のプライマーＤＮＡを同時に使用し
てＰＣＲ反応を行い、そのＰＣＲ産物のサイズを確認す
ることで、極めて簡便に変異の有無及び対立遺伝子間の
変異型を判別することができる。
対して、上述の２組のプライマーＤＮＡを同時に使用し
てＰＣＲ反応を行い、そのＰＣＲ産物のサイズを確認す
ることで、極めて簡便に変異の有無及び対立遺伝子間の
変異型を判別することができる。
【００１１】両対立遺伝子上で問題となる塩基がＸＸ型
の場合、プライマー１Ｆとアンチセンスプライマー１Ｒ
との間のＤＮＡは問題なく増幅され、サイズａのバンド
が確認される。一方、プライマー２Ｆの３’末端塩基が
Ｙであるために対立遺伝子Ｙにハイブリしたプライマー
２Ｆからはポリメラーゼ反応は進まず、その結果プライ
マー２Ｆとプライマー２Ｒ間は増幅されない。プライマ
ー１Ｆとプライマー２Ｒ間は問題なくＰＣＲ反応により
ｃ塩基対（サイズｃ）のＤＮＡが増幅されるから、結局
ＰＣＲ反応後に確認される増幅バンドの大きさは、サイ
ズａとサイズｃとなる。換言すれば、本発明によるＰＣ
Ｒ反応によってサイズａ及びサイズｃの両バンドが特異
的に増幅されるときは、遺伝子上の問題となる塩基は両
対立遺伝子ともにＸであると判別することができる。両
対立遺伝子上で問題となる塩基がＹＹ型では、上記と同
様の理論から、ＰＣＲ反応後に確認されるバンドの大き
さは、サイズｂとサイズｃのバンドとなり、このことは
サイズｂとサイズｃのバンドが特異的に増幅されるとき
は、遺伝子上の問題となる塩基は両対立遺伝子ともにＹ
であると判別できることを意味する。もし、ＰＣＲ反応
後にサイズａ、サイズｂ、サイズｃの３種のバンドが観
察されることになれば、上述と同様の原理から、対立遺
伝子Ｘ上の塩基がＸで対立遺伝子Ｙ上の塩基がＹのヘテ
ロ接合体であると判別することができる。ここで、ｃ＝
ａ＋ｂ−（ｄ−１）である。
の場合、プライマー１Ｆとアンチセンスプライマー１Ｒ
との間のＤＮＡは問題なく増幅され、サイズａのバンド
が確認される。一方、プライマー２Ｆの３’末端塩基が
Ｙであるために対立遺伝子Ｙにハイブリしたプライマー
２Ｆからはポリメラーゼ反応は進まず、その結果プライ
マー２Ｆとプライマー２Ｒ間は増幅されない。プライマ
ー１Ｆとプライマー２Ｒ間は問題なくＰＣＲ反応により
ｃ塩基対（サイズｃ）のＤＮＡが増幅されるから、結局
ＰＣＲ反応後に確認される増幅バンドの大きさは、サイ
ズａとサイズｃとなる。換言すれば、本発明によるＰＣ
Ｒ反応によってサイズａ及びサイズｃの両バンドが特異
的に増幅されるときは、遺伝子上の問題となる塩基は両
対立遺伝子ともにＸであると判別することができる。両
対立遺伝子上で問題となる塩基がＹＹ型では、上記と同
様の理論から、ＰＣＲ反応後に確認されるバンドの大き
さは、サイズｂとサイズｃのバンドとなり、このことは
サイズｂとサイズｃのバンドが特異的に増幅されるとき
は、遺伝子上の問題となる塩基は両対立遺伝子ともにＹ
であると判別できることを意味する。もし、ＰＣＲ反応
後にサイズａ、サイズｂ、サイズｃの３種のバンドが観
察されることになれば、上述と同様の原理から、対立遺
伝子Ｘ上の塩基がＸで対立遺伝子Ｙ上の塩基がＹのヘテ
ロ接合体であると判別することができる。ここで、ｃ＝
ａ＋ｂ−（ｄ−１）である。
【００１２】ここで、対立遺伝子Ｘ用として、核酸Ｘ’
を３’末端に有するアンチセンスプライマー１Ｒの代わ
りに核酸Ｘを３’末端に有するセンスプライマー２Ｆと
アンチセンスプライマー２Ｒとを組合わせ、更に対立遺
伝子Ｙ用として、核酸Ｙを３’末端に有するセンスプラ
イマー２Ｆの代わりに核酸Ｙ’を３’末端に有するアン
チプライマー１Ｒとセンスプライマー１Ｆとを組合わせ
て、これらの共存下にＰＣＲ反応を行っても、本発明を
実施することが出来る。この場合の転写産物の大きさ
も、サイズａ、サイズｂ、サイズｃとなるが、ＸＸ型の
ときはサイズｂとサイズｃが、ＹＹ型のときはサイズａ
とサイズｃが、それぞれ確認されることになる。本発明
にいう変異核酸に対応する核酸及び正常核酸に対応する
核酸とは、上述の２例の様に変異核酸及び正常核酸また
はそれらに相補する核酸を意味するものである。
を３’末端に有するアンチセンスプライマー１Ｒの代わ
りに核酸Ｘを３’末端に有するセンスプライマー２Ｆと
アンチセンスプライマー２Ｒとを組合わせ、更に対立遺
伝子Ｙ用として、核酸Ｙを３’末端に有するセンスプラ
イマー２Ｆの代わりに核酸Ｙ’を３’末端に有するアン
チプライマー１Ｒとセンスプライマー１Ｆとを組合わせ
て、これらの共存下にＰＣＲ反応を行っても、本発明を
実施することが出来る。この場合の転写産物の大きさ
も、サイズａ、サイズｂ、サイズｃとなるが、ＸＸ型の
ときはサイズｂとサイズｃが、ＹＹ型のときはサイズａ
とサイズｃが、それぞれ確認されることになる。本発明
にいう変異核酸に対応する核酸及び正常核酸に対応する
核酸とは、上述の２例の様に変異核酸及び正常核酸また
はそれらに相補する核酸を意味するものである。
【００１３】本発明のＰＣＲ−ＣＴＰＰ法では、上述の
様にＰＣＲ反応とＰＣＲ産物の分子量の確認すると言う
２段階の作業で終了するものであり、ＰＣＲ産物を数時
間以上かけて制限酵素処理しなければならないＰＣＲ−
ＲＦＬＰ法に比べて、判別に要する時間を著しく短縮す
ることができる。また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では、制限
酵素処理後の分画に必要とされる分子量差を有する断片
が生じるよう、予め制限酵素部位を設計しなければなら
ないという制約があり、このため、対象となる遺伝子の
塩基配列によっては適切なプライマーＤＮＡの設計が困
難を伴うことがあるが、本発明のＰＣＲ−ＣＴＰＰ法は
係る制約が全くないので、プライマーＤＮＡ設計の自由
度においても優位である。さらに本発明の方法では、仮
にプライマー１Ｆとプライマー２Ｒとを反応液に加え損
なうなどの人為的ミスがあるとｃ−ｂｐの大きさのバン
ドは観察されないので、試験者は操作ミスを容易に知る
ことができる。さらには、本発明は制限酵素によるＰＣ
Ｒ産物の切断を必要としないので、制限酵素処理に起因
する種々の人為的副産物の影響を受けることがなく、判
別を確実に行うことが出来る。
様にＰＣＲ反応とＰＣＲ産物の分子量の確認すると言う
２段階の作業で終了するものであり、ＰＣＲ産物を数時
間以上かけて制限酵素処理しなければならないＰＣＲ−
ＲＦＬＰ法に比べて、判別に要する時間を著しく短縮す
ることができる。また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では、制限
酵素処理後の分画に必要とされる分子量差を有する断片
が生じるよう、予め制限酵素部位を設計しなければなら
ないという制約があり、このため、対象となる遺伝子の
塩基配列によっては適切なプライマーＤＮＡの設計が困
難を伴うことがあるが、本発明のＰＣＲ−ＣＴＰＰ法は
係る制約が全くないので、プライマーＤＮＡ設計の自由
度においても優位である。さらに本発明の方法では、仮
にプライマー１Ｆとプライマー２Ｒとを反応液に加え損
なうなどの人為的ミスがあるとｃ−ｂｐの大きさのバン
ドは観察されないので、試験者は操作ミスを容易に知る
ことができる。さらには、本発明は制限酵素によるＰＣ
Ｒ産物の切断を必要としないので、制限酵素処理に起因
する種々の人為的副産物の影響を受けることがなく、判
別を確実に行うことが出来る。
【００１４】本発明のＰＣＲ−ＣＴＰＰ法は、ＤＮＡマ
イクロアレー法に対比しても利点を有する。すなわち、
特殊な機器を必要とせず、また検体を大量処理するとき
コスト差はＤＮＡマイクロアレー法に比べて著しく安価
に済む。
イクロアレー法に対比しても利点を有する。すなわち、
特殊な機器を必要とせず、また検体を大量処理するとき
コスト差はＤＮＡマイクロアレー法に比べて著しく安価
に済む。
【００１５】本発明は、いわゆる遺伝子多形（polymorp
hism）の判別に有用であるが、特定疾病の原因遺伝子や
がん遺伝子の判別にも利用可能であり、また変異は置
換、付加、欠失の何れであっても適用可能である。
hism）の判別に有用であるが、特定疾病の原因遺伝子や
がん遺伝子の判別にも利用可能であり、また変異は置
換、付加、欠失の何れであっても適用可能である。
【００１６】
【発明の実施の形態】判別しようとする対象遺伝子を含
むＤＮＡは、患者あるいは健常人より採取した血液その
他の組織から、本発明の属する分野における一般当業者
が汎用する方法によってＰＣＲ反応を行い得る程度のＤ
ＮＡとして調製すればよく、これを試料として本発明を
実施することができる。
むＤＮＡは、患者あるいは健常人より採取した血液その
他の組織から、本発明の属する分野における一般当業者
が汎用する方法によってＰＣＲ反応を行い得る程度のＤ
ＮＡとして調製すればよく、これを試料として本発明を
実施することができる。
【００１７】本発明の方法で用いるプライマーＤＮＡの
設計は、３’末端における核酸の決定と、そのプライマ
ーＤＮＡを用いたときに増幅されるＤＮＡ産物の分子量
（塩基対数）およびＰＣＲ産物間の差が適当な大きさと
なるよう留意すること以外には、各別の制約はない。Ｄ
ＮＡ産物のサイズ及びＰＣＲ産物間のサイズ差は増幅物
の検出方法の感度によって適当に定める事ができるが、
概ね数十から数百塩基対もあれば十分であり、キャピラ
リー電気泳動法のような高感度の検出方法を用いる場合
には、数塩基対の差であってもよい。このようなプライ
マーＤＮＡ設計は、本発明の属する分野における一般当
業者であれば、判別しようとする遺伝子の塩基配列と変
異の位置を基に何ら問題なく行うことができるものであ
る。また、プライマーＤＮＡの調製自体は、いわゆるＤ
ＮＡ自動合成機その他の汎用機器や合成手法により簡便
に行うことができる。
設計は、３’末端における核酸の決定と、そのプライマ
ーＤＮＡを用いたときに増幅されるＤＮＡ産物の分子量
（塩基対数）およびＰＣＲ産物間の差が適当な大きさと
なるよう留意すること以外には、各別の制約はない。Ｄ
ＮＡ産物のサイズ及びＰＣＲ産物間のサイズ差は増幅物
の検出方法の感度によって適当に定める事ができるが、
概ね数十から数百塩基対もあれば十分であり、キャピラ
リー電気泳動法のような高感度の検出方法を用いる場合
には、数塩基対の差であってもよい。このようなプライ
マーＤＮＡ設計は、本発明の属する分野における一般当
業者であれば、判別しようとする遺伝子の塩基配列と変
異の位置を基に何ら問題なく行うことができるものであ
る。また、プライマーＤＮＡの調製自体は、いわゆるＤ
ＮＡ自動合成機その他の汎用機器や合成手法により簡便
に行うことができる。
【００１８】本発明におけるＰＣＲ反応も、特別な試薬
や反応段階を含まない一般的な反応条件下で行うことが
でき、市販されているＰＣＲ反応キットやサーマルサイ
クラーなどの汎用機器を利用することができる。また、
ＰＣＲ反応は使用するプライマーＤＮＡを全て同時に反
応系に添加して行うことが好ましく、効率は低下するも
のの、プライマ−が共存する限り各プライマー組毎に段
階的にＰＣＲ反応を行うことも可能である。
や反応段階を含まない一般的な反応条件下で行うことが
でき、市販されているＰＣＲ反応キットやサーマルサイ
クラーなどの汎用機器を利用することができる。また、
ＰＣＲ反応は使用するプライマーＤＮＡを全て同時に反
応系に添加して行うことが好ましく、効率は低下するも
のの、プライマ−が共存する限り各プライマー組毎に段
階的にＰＣＲ反応を行うことも可能である。
【００１９】ＰＣＲ産物の検出方法は、当業者が利用可
能な如何なる方法でもよく、アガロースゲル電気泳動、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動あるいはキャピラリー
電気泳動などの電気泳動法、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）あるいはガスクロマトグラフィーなどの
クロマトグラフィー法、質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）など
を用いることができる。より簡便な方法としてゲル電気
泳動法が好ましい。
能な如何なる方法でもよく、アガロースゲル電気泳動、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動あるいはキャピラリー
電気泳動などの電気泳動法、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）あるいはガスクロマトグラフィーなどの
クロマトグラフィー法、質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）など
を用いることができる。より簡便な方法としてゲル電気
泳動法が好ましい。
【００２０】以下、実施例により本発明を更に詳しく説
明するが、本発明が実施例に記載されるものに制限され
ないことはいうまでもない。
明するが、本発明が実施例に記載されるものに制限され
ないことはいうまでもない。
【００２１】
【実施例】実施例１ βアドレノリセプター２（ＢＡＲ
−２）多形の検査 肥満及び／又は代謝不全に関与すると報告されているβ
アドレノリセプター２（ＢＡＲ−２）の多形に関する検
査を行った。この多形は、核酸塩基がＣからＧへと変異
することにより、同リセプター蛋白質の27番目のグルタ
ミンがグルタミン酸へと変異しているものである。
−２）多形の検査 肥満及び／又は代謝不全に関与すると報告されているβ
アドレノリセプター２（ＢＡＲ−２）の多形に関する検
査を行った。この多形は、核酸塩基がＣからＧへと変異
することにより、同リセプター蛋白質の27番目のグルタ
ミンがグルタミン酸へと変異しているものである。
【００２２】書面をもって同意を得た２０人の患者から
末梢血サンプル７ｍｌを用意した。キアゲン社製QIAamp
DNA Blood Mini Kitを用いて、バッフィーコート（buff
y coat）画分から染色体ＤＮＡを抽出して、染色体ＤＮ
Ａとして以下の検査に使用した。
末梢血サンプル７ｍｌを用意した。キアゲン社製QIAamp
DNA Blood Mini Kitを用いて、バッフィーコート（buff
y coat）画分から染色体ＤＮＡを抽出して、染色体ＤＮ
Ａとして以下の検査に使用した。
【００２３】正常核酸Ｃの対立遺伝子用センスプライマ
ーＤＮＡとして配列番号１のプライマーＤＮＡを、アン
チセンスプライマーＤＮＡとして配列番号２のプライマ
ーＤＮＡを合成した。また、変異核酸Ｇの対立遺伝子用
センスプライマーＤＮＡとして配列番号３のプライマー
ＤＮＡを、アンチセンスプライマーＤＮＡとして配列番
号４のプライマーＤＮＡを合成した。先に調製した染色
体ＤＮＡ３０ｎｇ〜１００ｎｇを、０．１５ｍＭのｄＮ
ＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーＤＮＡ、０．５ユニ
ットのタカラ酒造製Ｔａｑ（登録商標）酵素、１５ｍＭ
のＭｇＣｌ２を含む２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、
及び１μｌのグリセロールを含む２５μｌの反応液に加
えてＰＣＲ反応を行った。反応条件は、９４℃で５分間
変性させ、続いて９４℃で３０秒、５９℃で３０秒、７
２℃で３０秒のサイクルを３０回行い、最後は７２℃で
５分間の最終延長反応を行わせるというものである。Ｐ
ＣＲ産物は２％アガロースゲルとエチジウムブロマイド
染色によって可視化した。結果を図２に示す。
ーＤＮＡとして配列番号１のプライマーＤＮＡを、アン
チセンスプライマーＤＮＡとして配列番号２のプライマ
ーＤＮＡを合成した。また、変異核酸Ｇの対立遺伝子用
センスプライマーＤＮＡとして配列番号３のプライマー
ＤＮＡを、アンチセンスプライマーＤＮＡとして配列番
号４のプライマーＤＮＡを合成した。先に調製した染色
体ＤＮＡ３０ｎｇ〜１００ｎｇを、０．１５ｍＭのｄＮ
ＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーＤＮＡ、０．５ユニ
ットのタカラ酒造製Ｔａｑ（登録商標）酵素、１５ｍＭ
のＭｇＣｌ２を含む２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、
及び１μｌのグリセロールを含む２５μｌの反応液に加
えてＰＣＲ反応を行った。反応条件は、９４℃で５分間
変性させ、続いて９４℃で３０秒、５９℃で３０秒、７
２℃で３０秒のサイクルを３０回行い、最後は７２℃で
５分間の最終延長反応を行わせるというものである。Ｐ
ＣＲ産物は２％アガロースゲルとエチジウムブロマイド
染色によって可視化した。結果を図２に示す。
【００２４】この方法により、２７９塩基対と２０４塩
基対の２種類のＰＣＲ産物が観察される正常ホモ型（Ｃ
Ｃ型）と、２７９塩基対、２０４塩基対、１１０塩基対
の３種類のＰＣＲ産物が観察されるヘテロ型（ＣＧ型）
と、２７９塩基対と１１０塩基対の２種類のＰＣＲ産物
が観察される変異ホモ型（ＧＧ型）とを、それぞれ判別
することが出来た。
基対の２種類のＰＣＲ産物が観察される正常ホモ型（Ｃ
Ｃ型）と、２７９塩基対、２０４塩基対、１１０塩基対
の３種類のＰＣＲ産物が観察されるヘテロ型（ＣＧ型）
と、２７９塩基対と１１０塩基対の２種類のＰＣＲ産物
が観察される変異ホモ型（ＧＧ型）とを、それぞれ判別
することが出来た。
【００２５】実施例２ インターロイキン１Ｂ（ＩＬ−
１Ｂ）多形の検査 ＩＬ−１Ｂの−３１番目の核酸がＣからＴに変化してい
る多形に関する検査を行った。この多形型のＩＬ−１Ｂ
は胃がんの危険性を高めるといわれている。
１Ｂ）多形の検査 ＩＬ−１Ｂの−３１番目の核酸がＣからＴに変化してい
る多形に関する検査を行った。この多形型のＩＬ−１Ｂ
は胃がんの危険性を高めるといわれている。
【００２６】正常核酸Ｃの対立遺伝子用センスプライマ
ーＤＮＡとして配列番号５のプライマーＤＮＡを、アン
チセンスプライマーＤＮＡとして配列番号６のプライマ
ーＤＮＡを合成した。また、変異核酸Ｔの対立遺伝子用
センスプライマーＤＮＡとして配列番号７のプライマー
ＤＮＡを、アンチセンスプライマーＤＮＡとして配列番
号８のプライマーＤＮＡを合成した。実施例１で調製し
た染色体ＤＮＡ３０ｎｇ〜１００ｎｇを、０．１５ｍＭ
のｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーＤＮＡ、０．
５ユニットのタカラ酒造製Ｔａｑ（登録商標）酵素、１
５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩
衝液を含む２５μｌの反応液に加えてＰＣＲ反応を行っ
た。反応条件は、９４℃で５分間変性させ、続いて９４
℃で６０秒、５４℃で６０秒、７２℃で６０秒のサイク
ルを２５回行い、最後は７２℃で５分間の最終延長反応
を行わせるというものである。ＰＣＲ産物は２％アガロ
ースゲルとエチジウムブロマイド染色によって可視化し
た。この結果を図３に示す。
ーＤＮＡとして配列番号５のプライマーＤＮＡを、アン
チセンスプライマーＤＮＡとして配列番号６のプライマ
ーＤＮＡを合成した。また、変異核酸Ｔの対立遺伝子用
センスプライマーＤＮＡとして配列番号７のプライマー
ＤＮＡを、アンチセンスプライマーＤＮＡとして配列番
号８のプライマーＤＮＡを合成した。実施例１で調製し
た染色体ＤＮＡ３０ｎｇ〜１００ｎｇを、０．１５ｍＭ
のｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーＤＮＡ、０．
５ユニットのタカラ酒造製Ｔａｑ（登録商標）酵素、１
５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩
衝液を含む２５μｌの反応液に加えてＰＣＲ反応を行っ
た。反応条件は、９４℃で５分間変性させ、続いて９４
℃で６０秒、５４℃で６０秒、７２℃で６０秒のサイク
ルを２５回行い、最後は７２℃で５分間の最終延長反応
を行わせるというものである。ＰＣＲ産物は２％アガロ
ースゲルとエチジウムブロマイド染色によって可視化し
た。この結果を図３に示す。
【００２７】この方法により、２４０塩基対と１５５塩
基対の２種類のＰＣＲ産物が観察される正常ホモ型（Ｃ
Ｃ型）と、２４０塩基対、１５５塩基対、１２２塩基対
の３種類のＰＣＲ産物が観察されるヘテロ型（ＣＴ型）
と、２４０塩基対と１２２塩基対の２種類のＰＣＲ産物
が観察される変異ホモ型（ＴＴ型）とを、それぞれ判別
することが出来た。
基対の２種類のＰＣＲ産物が観察される正常ホモ型（Ｃ
Ｃ型）と、２４０塩基対、１５５塩基対、１２２塩基対
の３種類のＰＣＲ産物が観察されるヘテロ型（ＣＴ型）
と、２４０塩基対と１２２塩基対の２種類のＰＣＲ産物
が観察される変異ホモ型（ＴＴ型）とを、それぞれ判別
することが出来た。
【００２８】
<110> Hamajima Nobuyuki <120> Method for the determination of genotyping <130> 44319 <140> Japan <141> 2000-09-00 <160> 8 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapience <400> ccgctgaatg aggcttcc <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapience <400> ccacacctcg tccctttg <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapience <400> accacgacgt cacgcagg <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapience <400> ggctgtgatg accagcac <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapience <400> acttctgctt ttgaaggcc <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapience <400> tagcacctag ttgtaagga <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapience <400> agaagcttcc accaatact <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapience <400> ctccctcgct gtttttata
【図１】図１は、本発明の方法の原理及びスキームを模
式的に表した図である。
式的に表した図である。
【図２】図２は、実施例１で行ったＰＣＲ反応産物の電
気泳動写真である。レーンＭは１００塩基対のサイズマ
ーカー、レーン２、４、６、７、９、１１、１２、１
５、１７、２０が正常へテロ型（ＣＣ型）、レーン１、
５、８、１３、１４、１８、１９がヘテロ型（ＣＧ
型）、レーン３、１０、１６が変異ホモ型（ＧＧ型）で
ある。
気泳動写真である。レーンＭは１００塩基対のサイズマ
ーカー、レーン２、４、６、７、９、１１、１２、１
５、１７、２０が正常へテロ型（ＣＣ型）、レーン１、
５、８、１３、１４、１８、１９がヘテロ型（ＣＧ
型）、レーン３、１０、１６が変異ホモ型（ＧＧ型）で
ある。
【図３】図３は、実施例２で行ったＰＣＲ反応産物の電
気泳動写真である。レーンＭは１００塩基対のサイズマ
ーカー、レーン１３、１５、１８が正常へテロ型（ＣＣ
型）、レーン１、２、４、５、７、９、１０、１４がヘ
テロ型（ＣＴ型）、レーン３、６、８、１１、１２、１
６、１７、１９、２０が変異ホモ型（ＴＴ型）である。
気泳動写真である。レーンＭは１００塩基対のサイズマ
ーカー、レーン１３、１５、１８が正常へテロ型（ＣＣ
型）、レーン１、２、４、５、７、９、１０、１４がヘ
テロ型（ＣＴ型）、レーン３、６、８、１１、１２、１
６、１７、１９、２０が変異ホモ型（ＴＴ型）である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年９月２７日（２０００．９．２
７）
７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
Claims (3)
- 【請求項１】 少なくとも２組のプライマーＤＮＡの共
存下にＰＣＲ反応を行って生ずるＤＮＡ断片のサイズを
確認することにより所定の遺伝子変異の有無を判別する
方法であって、該プライマーＤＮＡの１組は３’末端に
変異核酸に対応する核酸を有するプライマーＤＮＡとこ
れの対峙プライマーＤＮＡからなり、他方の１組は３’
末端に正常核酸に対応する核酸を有するプライマーＤＮ
Ａとこれの対峙プライマーＤＮＡからなる、遺伝子変異
の有無を判別する方法。 - 【請求項２】 各組の対峙プライマーＤＮＡ同士も対峙
したプライマーＤＮＡの組を構成する、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項３】 ＰＣＲ反応で生ずるＤＮＡ断片のサイズ
が、互いに識別可能なサイズ差を有する請求項１又は請
求項２に記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000283996A JP2001137000A (ja) | 2000-09-19 | 2000-09-19 | 遺伝子変異の判別方法 |
| AU2001286218A AU2001286218A1 (en) | 2000-09-19 | 2001-09-13 | Method of judging gene mutation |
| PCT/JP2001/007942 WO2002024905A1 (fr) | 2000-09-19 | 2001-09-13 | Procede permettant de determiner la mutation genetique |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000283996A JP2001137000A (ja) | 2000-09-19 | 2000-09-19 | 遺伝子変異の判別方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001137000A true JP2001137000A (ja) | 2001-05-22 |
Family
ID=18768281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000283996A Pending JP2001137000A (ja) | 2000-09-19 | 2000-09-19 | 遺伝子変異の判別方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001137000A (ja) |
| AU (1) | AU2001286218A1 (ja) |
| WO (1) | WO2002024905A1 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002024905A1 (fr) * | 2000-09-19 | 2002-03-28 | Nobuyuki Hamajima | Procede permettant de determiner la mutation genetique |
| JP2005323565A (ja) * | 2004-05-17 | 2005-11-24 | Nippon Flour Mills Co Ltd | 標的ｄｎａ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法及びキット |
| WO2006030872A1 (ja) * | 2004-09-15 | 2006-03-23 | Celltec Projet Management Co., Ltd. | 突然変異率計測方法及び装置 |
| WO2006112141A1 (ja) * | 2005-03-30 | 2006-10-26 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 塩基判定方法及び塩基判定用キット |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5279492B2 (ja) * | 2006-11-30 | 2013-09-04 | アークレイ株式会社 | 肥満遺伝子増幅用プライマーセット、それを含む肥満遺伝子増幅用試薬およびその用途 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4129653A1 (de) * | 1991-09-06 | 1993-03-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis aehnlicher nukleinsaeuren |
| JPH06167492A (ja) * | 1992-11-30 | 1994-06-14 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 変異癌遺伝子の検出測定方法 |
| JPH0889297A (ja) * | 1994-09-26 | 1996-04-09 | S R L:Kk | Ｄｎａ点突然変異の検出方法及び試薬 |
| JPH10276779A (ja) * | 1997-04-01 | 1998-10-20 | Sumitomo Metal Ind Ltd | 遺伝子プローブとｄｎａポリメラーゼを用いた変異検出方法 |
| JP2001137000A (ja) * | 2000-09-19 | 2001-05-22 | Nobuyuki Hamashima | 遺伝子変異の判別方法 |
-
2000
- 2000-09-19 JP JP2000283996A patent/JP2001137000A/ja active Pending
-
2001
- 2001-09-13 WO PCT/JP2001/007942 patent/WO2002024905A1/ja active Application Filing
- 2001-09-13 AU AU2001286218A patent/AU2001286218A1/en not_active Abandoned
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| JP4491276B2 (ja) * | 2004-05-17 | 2010-06-30 | 日本製粉株式会社 | 標的ｄｎａ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法及びキット |
| WO2006030872A1 (ja) * | 2004-09-15 | 2006-03-23 | Celltec Projet Management Co., Ltd. | 突然変異率計測方法及び装置 |
| WO2006112141A1 (ja) * | 2005-03-30 | 2006-10-26 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 塩基判定方法及び塩基判定用キット |
| JPWO2006112141A1 (ja) * | 2005-03-30 | 2008-12-04 | 東洋紡績株式会社 | 塩基判定方法及び塩基判定用キット |
| JP4650420B2 (ja) * | 2005-03-30 | 2011-03-16 | 東洋紡績株式会社 | 塩基判定方法及び塩基判定用キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002024905A1 (fr) | 2002-03-28 |
| AU2001286218A1 (en) | 2002-04-02 |
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