JP5279492B2 - 肥満遺伝子増幅用プライマーセット、それを含む肥満遺伝子増幅用試薬およびその用途 - Google Patents

肥満遺伝子増幅用プライマーセット、それを含む肥満遺伝子増幅用試薬およびその用途 Download PDF

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Description

本発明は、肥満遺伝子であるβ２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子を増幅するためのプライマーセット、それを含む肥満遺伝子増幅用試薬およびその用途に関する。
肥満に関与する遺伝子多型として、β−２アドレナリン受容体（β２ＡＲ）をコードする遺伝子（β２ＡＲ遺伝子）、β−３アドレナリン受容体（Ｂ３ＡＲ）をコードする遺伝子（β３ＡＲ遺伝子）および脱共役タンパク質（ＵＣＰ）をコードする遺伝子（ＵＣＰ１遺伝子）の多型が知られている。β２ＡＲは、主に心臓、気管支平滑筋等に分布しているが、その他に脂肪組織においても存在し、脂肪分解に関与している。そして、これをコードするβ２ＡＲ遺伝子には、アミノ酸１６位のアルギニン（Ａｒｇ）がグリシン（Ｇｌｙ）となる多型（Ａｒｇ１６Ｇｌｙ）がある。この多型を持つ被検者（日本人には１６％存在）は、前記多型を有さない被検者と比較して、安静時における代謝量が亢進していることが報告されている。また、β３ＡＲは、褐色脂肪細胞組織と白色脂肪細胞組織とに存在し、ノルアドレナリンの結合によって、褐色脂肪細胞組織では熱産生が、白色脂肪細胞組織では脂肪分解が開始される。これをコードするβ３ＡＲ遺伝子には、アミノ酸６４位のトリプトファン（Ｔｒｐ）がアルギニン（Ａｒｇ）となる多型（Ｔｒｐ６４Ａｒｇ）がある。この多型を持つ被検者（日本人には３４％存在）は、前記多型を有さない被検者と比較して、安静時の代謝量が減少していることが報告されている。また、ＵＣＰ１は、交換神経が興奮状態にある際、褐色脂肪組織における熱産生の中心的な役割を果たすタンパク質である。そして、これをコードするＵＣＰ１遺伝子には、ｍＲＮＡの−３８２６位（ゲノム配列におけるＵＣＰ１遺伝子の翻訳開始点の上流３８２６位）のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）となる多型がある。この多型を持つ被検者（日本人肥満女性には２４％存在）は、前記多型を持たない被検者に比べて、全身の代謝量が減少していることが報告されている。以上のような各遺伝子の多型と代謝量との関係から、これらの遺伝子の多型を解析し、解析結果を被検者の肥満治療や予防に利用することが、実際に行われている。
他方、あらゆる疾患の原因や、個体間の疾患易罹患性（疾患のかかり易さ）、個体間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が広く行われている。点突然変異の一般的な検出方法としては、（１）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅させ、その全遺伝子配列を解析するＤｉｒｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、（２）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲにより増幅させ、前記検出対象配列における目的の変異の有無により切断作用が異なる制限酵素によってその増幅産物を切断し、電気泳動することでタイピングを行うＲＦＬＰ解析、（３）３’末端領域に目的の変異が位置するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無によって変異を判断するＡＳＰ−ＰＣＲ法等があげられる。
しかしなら、これらの方法は、例えば、試料から抽出したＤＮＡの精製、電気泳動、制限酵素処理等が必須であるため、手間やコストがかかってしまう。また、ＰＣＲを行った後、反応容器を一旦開封する必要があるため、前記増幅産物が次の反応系に混入し、解析精度が低下するおそれがある。さらに、自動化が困難であるため、大量のサンプルを解析することができない。また、前記（３）のＡＳＰ−ＰＣＲ法については、特異性が低いという問題もある。
このような問題から、近年、点突然変異の検出方法として、標的核酸とプローブとから形成される二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ：ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を解析する方法が実用化されている。このような方法は、例えば、Ｔｍ解析、または、前記二本鎖の融解曲線の解析により行われることから、融解曲線解析と呼ばれている。これは、以下のような方法である。すなわち、まず、検出目的の点突然変異を含む検出対象配列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させる。続いて、このハイブリッド形成体に加熱処理を施し、温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を、吸光度等のシグナルの変動によって検出する。そして、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することにより、点突然変異の有無を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、点突然変異を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定する。前記測定値が評価基準値と同程度であれば、マッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在すると判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在しないと判断できる。そして、この方法によれば、自動化も可能である。
しかしながら、このようなＴｍ解析を利用した検出方法についても、ＰＣＲにおいて、検出目的部位を含む領域を特異的且つ効率的に増幅できなければならないという問題がある。特に、肥満遺伝子の中でも重要視されているβ２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子には、それぞれ多くのアイソザイムが存在し、それらをコードする配列も極めて類似している。このため、ＰＣＲにおいて、目的とするこれらの遺伝子以外に、アイソザイムのコード遺伝子までもが増幅されるおそれがある。また、このように他のアイソザイムのコード遺伝子までも増幅された場合、例えば、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子の各多型の解析（非特許文献１〜３）において、解析結果の信頼性を低下させる原因にもなる。そして、このように、１つのサンプルを解析するにも多大な労力を伴うため、大量のサンプルを解析することは実用的ではないという問題もある。
ＰＭＩＤ：９３９９９６６ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９７ Ｄｅｃ １５；１００（１２）：３１８４−８． ＰＭＩＤ：９０４９４８１ Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ． １９９７ Ｆｅｂ；４０（２）：２００−４． ＰＭＩＤ：９５４１１７８ Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ． １９９８ Ｍａｒ；４１（３）：３５７−６１．
そこで、本発明は、遺伝子増幅法により、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの肥満遺伝子の目的領域を特異的に増幅するためのプライマーセットの提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明のプライマーセットは、遺伝子増幅法により肥満遺伝子を増幅するためのプライマーセットであって、前記肥満遺伝子が、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子であり、下記プライマーセット（１）〜（３）からなる群から選択された少なくとも１つのプライマーセットを含むことを特徴とする。
プライマーセット（１）
下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
（Ｆ１）配列番号１の塩基配列における４２４８番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として５’方向に向かって１８〜２５塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記チミン塩基（Ｔ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
配列番号１の塩基配列における４２５０番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として５’方向に向かって１８〜２６塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記チミン塩基（Ｔ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）配列番号１の塩基配列における４２９２番目のアデニン塩基（Ａ）を１塩基目として３’方向に向かって２１〜３１塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記４２９２番目のアデニン塩基（Ａ）に相補的なチミン塩基（Ｔ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
配列番号１の塩基配列における４３０１番目のアデニン塩基（Ａ）を１塩基目として３’方向に向かって１８〜２７塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記４３０１番目のアデニン塩基（Ａ）に相補的なチミン塩基（Ｔ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
プライマーセット（２）
下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
（Ｆ２）配列番号２の塩基配列における４１１０番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として５’方向に向かって１６〜２０塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（Ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ２）配列番号２の塩基配列における４１７２番目のグアニン塩基（Ｇ）を１塩基目として３’方向に向かって１５〜１９塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記４１７２番目のグアニン塩基（Ｇ）に相補的なシトシン塩基（Ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
プライマーセット（３）
下記（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ３）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
（Ｆ３）配列番号３の塩基配列における２８０番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として５’方向に向かって２５〜４４塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（Ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ３）配列番号３の塩基配列における３５０番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として３’方向に向かって２３〜３８塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記３５０番目のシトシン塩基（Ｃ）に相補的なグアニン塩基（Ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
また、本発明の遺伝子増幅用試薬は、遺伝子増幅法により肥満遺伝子を増幅するための試薬であって、前記肥満遺伝子が、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子であり、前記本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする。
本発明の増幅産物の製造方法は、遺伝子増幅法により肥満遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、前記肥満遺伝子が、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子であり、下記（Ｉ）工程を含むことを特徴とする。
（Ｉ）試料中の核酸を鋳型として、本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、反応液中で、前記β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子の増幅を行う工程
本発明の多型解析方法は、肥満遺伝子における検出対象部位の多型を解析する方法であって、前記肥満遺伝子が、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子であり、下記（ｉ）〜（iv）工程を含むことを特徴とする。
（ｉ）本発明の増幅産物の製造方法により、前記β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子における検出対象部位を含む領域を反応液中で増幅させる工程
（ii）前記（ｉ）工程における増幅産物と、前記β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子における検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブとを含む反応液を準備する工程
（iii）前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（iv）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子における検出対象部位の多型を決定する工程
本発明のプライマーセットによれば、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの肥満遺伝子における検出目的の多型が発生する部位を含む目的領域を、反応液中で、特異的且つ高効率で増幅することができる。このため、前述のような従来法とは異なり、手間やコストを低減することが可能となる。また、このように、前記肥満遺伝子の特定の多型が発生する検出対象部位を含む領域を特異的に増幅できることから、例えば、さらに、検出対象部位を含む検出対象配列に相補的なプローブを使用することで、前記反応液を用いてそのままＴｍ解析を行い、前記多型をタイピングすることが可能となる。また、１つの反応液で増幅やタイピングが可能であることから、操作の自動化も可能になる。さらに、本発明のプライマーセットを用いれば、例えば、夾雑物が含まれる試料（例えば、全血や口腔粘膜等）であっても、前処理を省略できるため、より迅速且つ簡便に増幅反応を行うことができる。また、本発明のプライマーセットを用いれば、従来よりも優れた増幅効率で増幅反応が行えるため、増幅反応も短縮化が可能である。したがって、本発明のプライマーセットやこれを含む試薬、ならびにこれらを用いた増幅産物の製造方法および多型解析方法によれば、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの肥満遺伝子の多型を迅速かつ簡便に解析できることから、医療分野においてきわめて有効といえる。
図１は、本発明の実施例１におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図２は、本発明の前記実施例１におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図３は、本発明の前記実施例１におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図４は、本発明の実施例２におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図５は、本発明の実施例３におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図６は、比較例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図７は、本発明の実施例４におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
＜肥満遺伝子増幅用プライマーセット＞
本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットは、前述のように、前記プライマーセット（１）〜（３）からなる群から選択された少なくとも１つのプライマーセットを含むことを特徴とする。少なくともいずれかのプライマーセットを含むことによって、例えば、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの肥満遺伝子における特定の目的領域を特異的に増幅することが可能である。
本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットは、例えば、前記プライマーセット（１）〜（３）のうちいずれか１種類のみを含んでもよいし、いずれか２種類、または、プライマーセット（１）〜（３）の全てを含んでもよい。後述するが、プライマーセット（１）により特異的に増幅し得る目的領域は、β２ＡＲ遺伝子の特定の多型が発生する部位（配列番号１における４２６５番目）を含む領域であり、プライマーセット（２）により特異的に増幅し得る目的領域は、β３ＡＲ遺伝子の特定の多型が発生する部位（配列番号２における４１３４番目）を含む領域であり、プライマーセット（３）により特異的に増幅し得る目的領域は、ＵＣＰ１遺伝子の特定の多型が発生する部位（配列番号３における２９２番目）を含む領域である。
前述のように、肥満遺伝子であるβ２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子のそれぞれの特定の多型は、全て代謝に影響を与える多型として知られている。このため、いずれか１種類の遺伝子の多型だけでなく、いずれか２種類の遺伝子もしくは３種類全ての遺伝子の多型を調べることが重要視されている。しかしながら、従来法では、１つの反応系において複数の配列を解析することができないという問題がある。これは、前述のように、前記各肥満遺伝子には多くのアイソザイムが存在するため、ＰＣＲにおいて、前記各遺伝子以外のアイソザイムのコード遺伝子までもが増幅されることが原因と考えられる。このため、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子のうち、２種類の遺伝子の多型または３種類全ての遺伝子の多型を調べるには、それぞれの多型が生じる部位を含む領域を、別個の反応系において各々増幅させ、得られた増幅産物を別個に解析する必要がある。このように、従来の方法では、肥満遺伝子の中でも、前述の特定の遺伝子のみを鋳型とし、且つ、各遺伝子における前記多型が生じる部位をそれぞれ含む２種類または３種類の目的領域のみを特異的に増幅させることは極めて困難である。そして、このように、１つのサンプルを解析するにも多大な労力を伴うため、大量のサンプルを解析することは実用的ではないという問題がある。これに対して、本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットによれば、前記プライマーセット（１）〜（３）のうちいずれか２種類または３種類全てを含む場合であっても、それぞれの目的領域を、同一反応液において同時に且つ特異的に増幅することができる。このため、前述の従来法とは異なり、手間やコストを低減することが可能となる。また、このように同一反応液において２つまたは３つの目的領域が特異的に増幅されることから、例えば、それぞれの目的領域における検出対象配列に相補的なプローブを使用することで、前記反応液を用いてそのままＴｍ解析を行い、前記２種類または３種類の多型をそれぞれタイピングすることが可能となる。このように、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子のうち、２種類もしくは３種類の遺伝子における特定の多型を同一反応液で解析することが可能となることから、本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットは、例えば、プライマーセット（１）〜（３）のいずれか１種類を含む場合はもちろんのこと、いずれか２種類もしくは３種類を含むことも好ましい。このような肥満遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、１つの目的領域はもちろんのこと、２つまたは３つの目的領域を同時に増幅すれば、従来よりも効率よく、前記肥満遺伝子の多型解析を行うことができる。
なお、以下、フォワードプライマーをＦプライマー、リバースプライマーをＲプライマーということがある。
まず、β２ＡＲ遺伝子を増幅するためのプライマーセット（１）について説明する。プライマーセット（１）は、前述のように、下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセットである。
（Ｆ１）配列番号１の塩基配列における４２５０番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として５’方向に向かって１８〜２５塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記チミン塩基（Ｔ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
配列番号１の塩基配列における４２４７番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として５’方向に向かって１８〜２６塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記チミン塩基（Ｔ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）配列番号１の塩基配列における４２９２番目のアデニン塩基（Ａ）を１塩基目として３’方向に向かって２１〜３１塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記４２９２番目のアデニン塩基（Ａ）に相補的なチミン塩基（Ｔ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
配列番号１の塩基配列における４３０１番目のアデニン塩基（Ａ）を１塩基目として３’方向に向かって１８〜２７塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記４３０１番目のアデニン塩基（Ａ）に相補的なチミン塩基（Ｔ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
配列番号１に示す塩基配列は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来β２アドレナリン受容体タンパク質（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ， ｂｅｔａ−２−，ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｓｕｒｆａｃｅ；ＡＤＲβ２（β２ＡＲ））をコードするＡＤＲβ２遺伝子の完全長配列であり、例えば、ＮＣＢＩアクセッション：Ｎｏ．ＤＱ０９４８４５に登録されている。
以下、このプライマーセット（１）を「β２ＡＲ遺伝子用プライマーセット」ともいう。前記β２ＡＲ遺伝子用プライマーセットは、配列番号１における４２４９番目〜４２９１番目の領域、４２４９番目〜４３００番目の領域、４２５１番目〜４２９１番目の領域、または、４２５１〜４３００番目の領域を含むＤＮＡ鎖ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。この領域内の４２６５番目の塩基（配列番号１における４２６５番目の塩基）は、点突然変異の存在が知られている（４２６５Ａ、４２６５Ｇ）。４２６５番目の塩基がＡであれば、β２ＡＲ遺伝子がタンパク質に翻訳された際、アミノ酸１６位はアルギニン（Ａｒｇ）となり、４２６５番目の塩基がＧに変異した場合、アミノ酸１６位はグリシン（Ｇｌｙ）となる多型を示す。なお、これらの多型は、ホモ接合体の場合は、４２６５Ａ／４２６５Ａ、４２６５Ｇ／４２６５Ｇ、ヘテロ接合体の場合は、４２６５Ａ／４２６５Ｇで表すことができる。また、アミノ酸に置き換えた場合、４２６５Ａ／４２６５Ａは、Ａｒｇ−１６／Ａｒｇ−１６、４２６５Ｇ／４２６５Ｇは、Ｇｌｙ−１６／Ｇｌｙ−１６、４２６５Ａ／４２６５Ｇは、Ａｒｇ−１６／Ｇｌｙ−１６で表すことができ、このアミノ酸による表記が、目的とするβ２ＡＲ遺伝子の多型の一般的な表記である。なお、β２ＡＲ遺伝子の前記多型のみを解析する場合には、β２ＡＲ遺伝子用プライマーセットのみを使用すればよい。
本発明において、β２ＡＲ遺伝子用プライマーセットのＦ１プライマーおよびＲ１プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす３’末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このように各プライマーの３’末端の塩基を固定することによって、β２ＡＲ遺伝子用プライマーセットが、例えば、類似する他のアイソザイムの遺伝子（例えば、β１ＡＲ遺伝子等）に結合することを十分に防止することができる。
このように、Ｆ１プライマーおよびＲ１プライマーは、その３’末端の塩基が固定されていればよいことから、各プライマーの長さ自体は特に制限されず、一般的な長さに適宜調整することができる。プライマーの長さの一例としては、例えば、１３〜５０ｍｅｒの範囲であり、好ましくは１４〜４５ｍｅｒであり、より好ましくは１５〜４０ｍｅｒである。具体例として、前記Ｆ１プライマーは、配列番号１の塩基配列における４２４８番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として５’方向に向かって１８〜２５塩基目（好ましくは、１９〜２４塩基目、より好ましくは１９〜２３塩基目）までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、または、配列番号１の塩基配列における４２５０番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として５’方向に向かって１８〜２６塩基目（好ましくは、１９〜２４塩基目、より好ましくは１９〜２２塩基目）までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記Ｒ１プライマーは、配列番号１の塩基配列における４２９２番目のアデニン塩基（Ａ）を１塩基目として３’方向に向かって２１〜３１塩基目（好ましくは、２２〜３０塩基目、より好ましくは２３〜２８塩基目）までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。なお、Ｆ１プライマーとＲ１プライマーの３’末端が固定されていることから、プライマーから伸長する領域は、例えば、前述のように配列番号１における４２４９番目〜４２９１番目の領域、４２４９番目〜４３００番目の領域、４２５１番目〜４２９１番目の領域、または、４２５１〜４３００番目の領域となるが、得られる増幅産物の全体の長さは、使用するプライマーの長さに応じて変化する。
また、Ｒ１プライマーは、配列番号１に示す塩基配列に対して、Ｆ１プライマーは、前記塩基配列に対して、それぞれ完全に相補なオリゴヌクレオチドでなくともよい。すなわち、各プライマーにおける３’末端の塩基を除く部分において、完全に相補なオリゴヌクレオチドと１個〜５個の塩基が異なっていてもよい。
Ｒ１プライマーを構成するオリゴヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列における４２９８番目に相補的な塩基が、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）のいずれであってもよい。より好ましくは、Ｒ１プライマーとして、４２９８番目に相補的な塩基がシトシンであるオリゴヌクレオチドと４２９８番目に相補的な塩基がグアニンであるオリゴヌクレオチドの両方を同時に使用することが好ましい。配列番号１の塩基配列における４２９８番目の塩基については、多型（４２９８Ｃ、４２９８Ｇ）が知られているが、本発明は、この部分における多型を検出目的とするものではない。このため、前記両方のオリゴヌクレオチドをＲ１プライマーとして使用することにより、４２９８Ｃおよび４２９８Ｇのいずれであっても前記プライマーによる遺伝子増幅を行うことができ、検出目的以外の多型によって、目的領域の増幅が影響を受けることを十分に回避できる。４２９８番目に相補的な塩基がシトシンであるオリゴヌクレオチドと４２９８番目に相補的な塩基がグアニンであるオリゴヌクレオチドの割合は、特に制限されないが、例えば、モル比１：１０〜１０：１が好ましい。
以下に、Ｆ１プライマーとＲ１プライマーの具体例を示すが、本発明は、これには限定されない。なお、配列番号１２〜２２の塩基配列における「ｓ」は、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）を示し、配列番号１の４２９８番目に相補的な塩基にあたる。また、これらのＦ１プライマーとＲ１プライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号９または配列番号１０９のオリゴヌクレオチドからなるＦ１’プライマーと、配列番号１２、配列番号１８または配列番号１３４のオリゴヌクレオチドからなるＲ１’プライマーとを含むプライマーセット（１’）が特に好ましい。なお、配列番号１２および配列番号１８のオリゴヌクレオチドからなるＲ１’プライマーは、前述のように、「ｓ」がシトシンであるオリゴヌクレオチドと、「ｓ」がグアニンであるオリゴヌクレオチドの両方を含むことが好ましい。下記表における「Ｔｍ（℃）」は、下記表の配列と完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合のＴｍ（℃）であり、ＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）により、パラメーターをオリゴヌクレオチド濃度０．２μＭ、ナトリウム当量（Ｎａ ｅｑ．）５０ｍＭとして算出した値である（以下、同様）。前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）等により算出でき、また、隣接法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）によって決定することもできる（以下、同様）。下記表には、Ｒ１プライマーの一例として、配列番号１の４２９８番目の塩基に相補的な塩基「ｓ」をグアニンとした場合のＴｍ値を記載する。
Figure 0005279492
つぎに、β３ＡＲ遺伝子を増幅するためのプライマーセット（２）について説明する。前記プライマーセット（２）は、前述のように、下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセットである。
（Ｆ２）配列番号２の塩基配列における４１１０番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として５’方向に向かって１６〜２０塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（Ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ２）配列番号２の塩基配列における４１７２番目のグアニン塩基（Ｇ）を１塩基目として３’方向に向かって１５〜１９塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記４１７２番目のグアニン塩基（Ｇ）に相補的なシトシン塩基（Ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
配列番号２に示す塩基配列は、ヒト由来β３アドレナリン受容体タンパク質（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ，ｂｅｔａ−３−，ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＡＤＲβ３（β３ＡＲ））をコードするＡＤＲβ２遺伝子の完全長配列であり、例えば、ＮＣＢＩアクセッション：Ｎｏ．ＤＱ１０４４４１に登録されている。
以下、このプライマーセット（２）を「β３ＡＲ遺伝子用プライマーセット」ともいう。前記β３ＡＲ遺伝子用プライマーセットは、配列番号２における４１１１〜４１７１番目の領域を含むＤＮＡ鎖ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。この領域内の４１３４番目の塩基（配列番号２における４１３４番目の塩基）は、点突然変異の存在が知られている（４１３４Ｔ、４１３４Ｃ）。そして、４１３４番目の塩基がＴであれば、β２ＡＲ遺伝子がタンパク質に翻訳された際、アミノ酸６４位はトリプトファン（Ｔｒｐ）となり、４１３４番目の塩基がＣに変異した場合、アミノ酸６４位はアルギニン（Ａｒｇ）となる多型を示す。なお、これらの多型は、ホモ接合体の場合、４１３４Ｔ／４１３４Ｔまたは４１３４Ｃ／４１３４Ｃ、ヘテロ接合体の場合、４１３４Ｔ／４１３４Ｃで表すことができる。また、アミノ酸に置き換えた場合、４１３４Ｔ／４１３４Ｔは、Ｔｒｐ−６４／Ｔｒｐ−６４、４１３４Ｃ／４３１４Ｃは、Ａｒｇ−６４／Ａｒｇ−６４、４１３４Ｔ／４１３４Ｃは、Ｔｒｐ−６４／Ａｒｇ−６４で表すことができ、このアミノ酸による表記が、目的とするβ３ＡＲ遺伝子の多型の一般的な表記である。なお、β３ＡＲ遺伝子の多型のみを解析する場合には、β３ＡＲ遺伝子用プライマーセットのみを使用すればよい。
β３ＡＲ遺伝子用プライマーセットのＦ２プライマーおよびＲ２プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす３’末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このように各プライマーの３’末端の塩基を固定することによって、β３ＡＲ遺伝子用プライマーセットが、例えば、類似する他のアイソザイムの遺伝子（例えば、β１ＡＲ遺伝子等）に結合することを十分に防止することができる。
Ｆ２プライマーおよびＲ２プライマーは、前記β２ＡＲ遺伝子用プライマーセットと同様の理由から、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす３’末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このため、Ｆ２プライマーおよびＲ２プライマーの長さ自体は特に制限されず、前述と同様の長さが例示できる。具体例として、前記Ｆ２プライマーは、配列番号２の塩基配列における４１１０番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として５’方向に向かって１６〜２０塩基目（好ましくは、１７〜２０塩基目、より好ましくは１７〜１９塩基目）までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記Ｒ２プライマーは、配列番号２の塩基配列における４１７２番目のグアニン塩基（Ｇ）を１塩基目として３’方向に向かって１５〜１９塩基目（好ましくは、１６〜１９塩基目、より好ましくは１６〜１８塩基目）までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。なお、Ｆ２プライマーとＲ２プライマーの３’末端が固定されていることから、プライマーから伸長する領域は、例えば、前述のように配列番号２における４１１１〜４１７１番目の領域であるが、得られる増幅産物の全体の長さは、使用するプライマーの長さに応じて変化する。
また、Ｒ２プライマーは、配列番号２に示す塩基配列に対して、Ｆ２プライマーは、前記塩基配列に対して、それぞれ完全に相補なオリゴヌクレオチドでなくともよい。すなわち、各プライマーにおける３’末端の塩基を除く部分において、完全に相補なオリゴヌクレオチドと１個〜５個の塩基が異なっていてもよい。
以下に、Ｆ２プライマーとＲ２プライマーの具体例を示すが、本発明は、これには限定されない。また、これらのＦ２プライマーとＲ２プライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号２４または配列番号２５のオリゴヌクレオチドからなるＦ２’プライマーと配列番号２８または配列番号３０のオリゴヌクレオチドからなるＲ２’プライマーとを含むプライマーセット（２’）が特に好ましい。
Figure 0005279492
つぎに、ＵＣＰ１遺伝子を増幅するためのプライマーセット（３）について説明する。前記プライマーセット（３）は、前述のように、下記（Ｆ３）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ３）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセットである。
（Ｆ３）配列番号３の塩基配列における２８０番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として５’方向に向かって２５〜４４塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（Ｃ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ３）配列番号３の塩基配列における３５０番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として３’方向に向かって２３〜３８塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記３５０番目のシトシン塩基（Ｃ）に相補的なグアニン塩基（Ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
配列番号３に示す塩基配列は、ヒト由来脱共役タンパク質の５’多型領域（Ｈｕｍａｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｒｅｇｉｏｎ ５’ ｏｆ ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＵＣＰ）をコードする遺伝子配列であり、例えば、ＮＣＢＩアクセッション：Ｎｏ．Ｕ２８４７９に登録されている。
以下、前記プライマーセット（３）を、「ＵＣＰ１遺伝子用プライマーセット」ともいう。前記ＵＣＰ１遺伝子用プライマーセットは、配列番号３における２８１番目〜３４９番目の領域を含むＤＮＡ鎖ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。この領域内の２９２番目の塩基（配列番号３における２９２番目の塩基）は、点突然変異の存在が知られている（２９２Ａ、２９２Ｇ）。これらの多型は、ホモ接合体の場合、２９２Ａ／２９２Ａ、２９２Ｇ／２９２Ｇで表され、ヘテロ接合体の場合、２９２Ａ／２９２Ｇで表すことができる。なお、配列番号３における２９２番目の塩基は、ＵＣＰ１のｍＲＮＡにおける−３８２６番目（ＵＣＰ１遺伝子翻訳開始点の上流−３８２６番目）の塩基に相当し、前述の多型は、通常、−３８２６Ａ／−３８２６Ａ、−３８２６Ｇ／−３８２６Ｇ、−３８２６Ａ／−３８２６Ｇとして知られている。なお、ＵＣＰ１遺伝子の前記多型のみを解析する場合には、ＵＣＰ１遺伝子用プライマーセットのみを使用すればよい。
Ｆ３プライマーおよびＲ３プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす３’末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このように各プライマーの３’末端の塩基を固定することによって、ＵＣＰ１遺伝子用プライマーセットが、例えば、類似する他のアイソザイムの遺伝子（例えば、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、ＵＣＰ４遺伝子等）に結合することを十分に防止することができる。
ＵＣＰ１遺伝子用プライマーセットのＦ３プライマーおよびＲ３プライマーは、β２ＡＲ遺伝子用プライマーセットと同様の理由から、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす３’末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このため、Ｆ３プライマーおよびＲ３プライマーの長さ自体は特に制限されず、前述と同様の長さが例示できる。具体例として、前記Ｆ３プライマーは、配列番号３の塩基配列における２８０番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として５’方向に向かって２５〜４４塩基目（好ましくは、３０〜４０塩基目、より好ましくは３２〜３７塩基目）までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記Ｒ３プライマーは、配列番号３の塩基配列における３５０番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として３’方向に向かって２３〜３８塩基目（好ましくは、２５〜３６塩基目、より好ましくは２６〜３２塩基目）までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。なお、Ｆ３プライマーとＲ３プライマーの３’末端が固定されていることから、プライマーから伸長する領域は、例えば、前述のように、配列番号３における２８１番目〜３４９番目の領域であるが、得られる増幅産物の全体の長さは、使用するプライマーの長さに応じて変化する。
また、Ｒ３プライマーは、配列番号３に示す塩基配列に対して、Ｆ３プライマーは、前記塩基配列に対して、それぞれ完全に相補なオリゴヌクレオチドでなくともよい。すなわち、各プライマーにおける３’末端の塩基を除く部分において、完全に相補なオリゴヌクレオチドと１個〜５個の塩基が異なっていてもよい。
Ｒ３プライマーを構成するオリゴヌクレオチドは、配列番号３の塩基配列における３７６番目に相補的な塩基が、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）のいずれであってもよい。より好ましくは、Ｒ１プライマーとして、３７６番目に相補的な塩基がグアニンであるオリゴヌクレオチドと３７６番目に相補的な塩基がチミンであるオリゴヌクレオチドの両方を同時に使用することが好ましい。配列番号３の塩基配列における３７６番目の塩基については、多型（３７６Ｃ、３７６Ａ）が知られているが、本発明は、この部分における多型を検出目的とするものではない。このため、前記両方のオリゴヌクレオチドをＲ３プライマーとして使用することにより、３７６Ｃおよび３７６Ａのいずれであっても前記プライマーによる遺伝子増幅を行うことができ、検出目的以外の多型によって、目的領域の増幅が影響を受けることを十分に回避できる。３７６番目に相補的な塩基がグアニンであるオリゴヌクレオチドと３７６番目に相補的な塩基がチミンであるオリゴヌクレオチドの割合は、特に制限されないが、例えば、モル比１：１０〜１０：１が好ましい。
以下に、Ｆ３プライマーとＲ３プライマーの具体例を示すが、本発明は、これには限定されない。なお、配列番号５３〜６４の塩基配列における「ｋ」は、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）を示し、下記表の配列番号５３〜６４には、配列番号３の３７６番目の塩基に相補的な塩基をグアニンまたはチミンとした場合のそれぞれのＴｍ値を記載する。これらのＦ３プライマーとＲ３プライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号４３のオリゴヌクレオチドからなるＦ２’プライマーと配列番号６３のオリゴヌクレオチドからなるＲ３’プライマーとを含むプライマーセット（３’）が特に好ましい。なお、配列番号６３のオリゴヌクレオチドからなるＲ３’プライマーは、前述のように、「ｋ」がグアニンであるオリゴヌクレオチドと、「ｋ」がチミンであるオリゴヌクレオチドの両方を含むことが好ましい。
Figure 0005279492
また、前述したプライマーセット（１）〜（３）の各プライマーは、例えば、増幅反応の反応温度を上げるために、従来公知の任意の配列を５’末端に付加したものでもよい。
このようなプライマーセット（１）〜（３）の少なくとも１つを含む本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットは、例えば、全血試料等の生体試料における肥満遺伝子を増幅させる際に使用することが好ましい。特に、本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットを、後述するような多型の検出用プローブとともに使用する際には、遺伝子増幅用反応液における全血試料の添加割合を０．１〜０．５体積％とすることが好ましい。この点については、後述する。
＜肥満遺伝子増幅用試薬＞
本発明の肥満遺伝子増幅用試薬は、前述のように、遺伝子増幅法により肥満遺伝子を増幅するための試薬であって、前記肥満遺伝子がβ２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子であり、本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする。本発明の肥満遺伝子増幅用試薬は、本発明のプライマーセットを含むことが特徴であり、これ以外の組成等については何ら制限されない。
本発明の肥満遺伝子増幅用試薬は、例えば、本発明のプライマーセットを用いた遺伝子増幅法により得られる増幅産物を検出するために、さらに、前記肥満遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブを含んでもよい。前述のように、本発明のプライマーセットによれば、例えば、それに含まれるプライマーセット（１）〜（３）の種類に応じて、遺伝子増幅法によって３種類の肥満遺伝子の各目的領域を、それぞれ特異的に増幅することができる。このため、前記肥満遺伝子の目的領域における検出対象配列に相補的（ハイブリダイズ可能な）なプローブを共存させることによって、例えば、増幅の有無や、検出対象部位の遺伝子型（多型）等を、後述する方法によって検出することが可能である。このようなプローブやその利用方法に関しては、後の多型の解析方法において説明する。また、本発明の肥満遺伝子増幅用試薬は、全血等の生体試料における肥満遺伝子を増幅させる際に使用することが好ましい。特に、本発明の肥満遺伝子増幅用試薬を、前述のようなプローブとともに使用する際には、遺伝子増幅用反応液における全血試料の添加割合を０．１〜０．５体積％とすることが好ましい。なお、本発明において、「検出対象配列」とは、多型が発生する部位（検出対象部位）を含む配列を意味する。
本発明の肥満遺伝子増幅用試薬の形態は、特に制限されず、例えば、本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットを含有する液体試薬でもよいし、使用前に溶媒で懸濁する乾燥試薬であってもよい。また、肥満遺伝子増幅用プライマーセットの含有量も、特に制限されない。
＜増幅産物の製造方法＞
本発明の増幅産物の製造方法は、前述のように、遺伝子増幅法により肥満遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、前記肥満遺伝子が、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子であり、下記（Ｉ）工程を含むことを特徴とする。
（Ｉ）試料中の核酸を鋳型として、本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、反応液中で、前記β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子の増幅を行う工程
このように本発明のプライマーセットを用いて増幅反応を行うことによって、前述のように、肥満遺伝子の目的領域を増幅させることができる。また、本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットが、前記プライマーセット（１）〜（３）のうちいずれか２種類を含む場合は、いずれか２種類の肥満遺伝子について、それぞれの検出対象部位を含む目的領域を、同一反応液中で同時に増幅させることができる。また、本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットが、前記プライマーセット（１）〜（３）の全てを含む場合には、前記３種類の肥満遺伝子全てについて、それぞれの検出対象部位を含む目的領域を、同一反応液中で同時に増幅させることができる。本発明により増幅させる目的領域は、前述のように、各肥満遺伝子における各目的の多型が発生する検出対象部位をそれぞれ含む領域である。なお、本発明の増幅産物の製造方法においては、本発明のプライマーセットを使用することが特徴であって、遺伝子増幅法の種類や条件等は何ら制限されない。
前記遺伝子増幅法としては、前述のように特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法が好ましい。なお、以下、ＰＣＲ法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。
本発明を適用する試料としては、例えば、鋳型となる核酸を含んでいればよく、特に制限されないが、例えば、夾雑物が含まれる試料に適用することが好ましい。前記夾雑物が含まれる試料としては、例えば、全血、口腔内細胞（例えば、口腔粘膜）、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液（例えば、胃洗浄液）等や、それらの懸濁液等があげられる。本発明のプライマーセットを用いた増幅産物の製造方法によれば、例えば、様々な夾雑物が含まれる試料（特に、全血や口腔内細胞等の生体試料）であっても、その影響を受け難く、３種類の肥満遺伝子のそれぞれの目的領域を特異的に増幅することができる。このため、本発明によれば、従来法では困難であった夾雑物の多い試料であっても、例えば、精製等の前処理を行うことなく、そのまま使用することが可能である。したがって、試料の前処理の観点からも、従来法よりさらに迅速に増幅産物を調製することが可能といえる。
前記反応液における試料の添加割合は、特に制限されない。具体例として、前記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、前記反応液における添加割合の下限が、例えば、０．０１体積％以上であることが好ましく、より好ましくは０．０５体積％以上、さらに好ましくは０．１体積％以上である。また、前記添加割合の上限も、特に制限されないが、例えば、２体積％以下が好ましく、より好ましくは１体積％以下、さらに好ましくは０．５体積％以下である。
また、後述するような光学的検出を目的とする場合、特に、標識化プローブを用いた光学的検出を行う場合、全血試料のような生体試料の添加割合は、例えば、０．１〜０．５体積％に設定することが好ましい。ＰＣＲ反応においては、通常、ＤＮＡ変性（一本鎖ＤＮＡへの解離）のために熱処理が施されるが、この熱処理によって試料に含まれる糖やタンパク質等が変性し、不溶化の沈殿物や濁り等が発生するおそれがある。このため、増幅産物の有無や検出対象部位の遺伝子型（多型）を光学的手法により確認する場合、このような沈殿物や濁りの発生が、測定精度に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、反応液における全血試料の添加割合を前述の範囲に設定すれば、メカニズムは不明であるが、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止することができるため、光学的手法による測定精度を向上できる。また、全血試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上することができる。したがって、本発明のプライマーセットの使用に加えて、さらに、全血試料等の試料の添加割合を前述の範囲に設定することによって、より一層、試料の前処理の必要性を排除できる。
また、前記反応液中の全血試料の割合は、前述のような体積割合（例えば、０．１〜０．５体積％）ではなく、ヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」という）の重量割合で表すこともできる。この場合、前記反応液における全血試料の割合は、Ｈｂ量に換算して、例えば、０．５６５〜１１３ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは２．８２５〜５６．５ｇ／Ｌの範囲、さらに好ましくは５．６５〜２８．２５μｇ／Ｌの範囲である。なお、前記反応中における全血試料の添加割合は、例えば、前記体積割合とＨｂ重量割合の両方を満たしてもよいし、いずれか一方を満たしてもよい。
全血としては、例えば、溶血した全血、未溶血の全血、抗凝固全血、凝固画分を含む全血等のいずれであってもよい。
本発明において、試料に含まれる標的核酸は、例えば、ＤＮＡである。前記ＤＮＡは、例えば、生体試料等の試料に元来含まれるＤＮＡでもよいし、遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物ＤＮＡであってもよい。後者の場合、前記試料に元来含まれているＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）から逆転写反応（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ））により生成させたｃＤＮＡがあげられる。
本発明の増幅産物の製造方法において、遺伝子増幅反応の開始に先立ち、前記反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このように、アルブミンを添加すれば、例えば、前述のような沈殿物や濁りの発生による影響をより一層低減することができ、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。具体的には、前記（Ｉ）工程の増幅反応や、一本鎖ＤＮＡへの解離工程前に、アルブミンを添加することが好ましい。
前記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１〜２重量％の範囲であり、好ましくは０．１〜１重量％であり、より好ましくは０．２〜０．８重量％である。前記アルブミンとしては、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等があげられ、これらはいずれか１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。
つぎに、本発明の増幅産物の製造方法に関し、全血試料について、ＤＮＡを標的核酸とし、前記プライマーセット（１）〜（３）を含む本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットを用いたＰＣＲにより、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子の各増幅産物を、同一反応液において同時に製造する例をあげて説明する。なお、本発明は、本発明のプライマーセットを使用することが特徴であり、他の構成ならびに条件は何ら制限されない。
まず、ＰＣＲ反応液を調製する。本発明のプライマーセットの添加割合は、特に制限されないが、プライマーセット（１）〜（３）のＦプライマーを、それぞれ０．１〜２μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。また、プライマーセット（１）〜（３）のＲプライマーを、それぞれ０．１〜２μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。各プライマーセットにおけるＦプライマーとＲプライマーとの添加割合（Ｆ：Ｒ、モル比）は、特に制限されないが、例えば、１：０．２５〜１：４が好ましく、より好ましくは１：０．５〜１：２である。
反応液における全血試料の割合は、特に制限されないが、前述の範囲が好ましい。全血試料は、そのまま反応液に添加してもよいし、予め、水や緩衝液等の溶媒で希釈してから反応液に添加してもよい。全血試料を予め希釈する場合、その希釈率は特に制限されず、例えば、反応液での最終的な全血添加割合が前記範囲となるように設定できるが、例えば、１００〜２０００倍であり、好ましくは２００〜１０００倍である。
前記反応液における他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分があげられ、その割合も特に制限されない。前記組成成分としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド（ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ））および溶媒があげられる。また、前述のように前記反応液はさらにアルブミンを含有することが好ましい。なお、前記反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ ９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ ９２／９６８８）（Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ ４５５ ４３０）（商標Ｖｅｎｔ：Ｂｉｏｌａｂ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
前記反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されないが、例えば、１〜１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは２０〜３０Ｕ／ｍＬである。なお、ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍＭ ＴＡＰＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭメルカプトエタノール、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＴＴＰ、１００μＭ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
前記溶媒としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝液があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
また、前記ＰＣＲ反応液は、さらに、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。
反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、使用する機器（サーマルサイクラー）等に応じて適宜決定できるが、通常、１〜５００μＬであり、好ましくは１０〜１００μＬである。
つぎに、ＰＣＲを行う。ＰＣＲのサイクル条件は特に制限されないが、例えば、（１）全血由来二本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの解離、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長（ポリメラーゼ反応）は、それぞれ以下の通りである。また、サイクル数も特に制限されないが、下記（１）〜（３）の３ステップを１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されないが、例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。本発明のプライマーセットを使用した場合、前述のように増幅効率に優れるため、従来の方法によれば５０サイクルに３時間程度を要していたのに対して、本発明によれば、約１時間程度（好ましくは１時間以内）で５０サイクルを完了することも可能である。
Figure 0005279492
以上のようにして、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子の各目的領域の増幅産物を、同一反応液において同時に製造することができる。なお、３種類の肥満遺伝子のうちいずれか１種類またはいずれか２種類の肥満遺伝子の各目的領域に相補的な増幅産物を製造する場合には、例えば、プライマーセット（１）〜（３）のうち目的領域に対応するいずれか１種類またはいずれか２種類のプライマーセットを含む、本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットを使用すればよい。
本発明の増幅産物の製造方法は、さらに、前述の増幅反応によって得られた増幅産物を検出する工程を含んでもよい。これによって、増幅産物の有無や、前記肥満遺伝子の目的領域における遺伝子型を検出することもできる。増幅産物の有無は、従来公知の方法により確認できる。具体的には、例えば、前記（Ｉ）工程において、前記反応液に、さらに、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子またはＵＣＰ１遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブ（例えば、蛍光標識化プローブ）を添加しておき、さらに、（II）工程として、前記反応液について、前記プローブにおける蛍光標識の蛍光強度を測定することによって確認できる。また、増幅させる目的領域が２つまたは３つの場合には、例えば、前記（Ｉ）工程において、前記反応液に、さらに、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子のいずれかの各検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブ（例えば、蛍光標識化プローブ）を２種類または３種類添加しておき、さらに、（II）工程として、前記反応液について、各プローブにおける各蛍光標識の蛍光強度を測定することによって確認できる。なお、肥満遺伝子における多型の検出については、本発明の一形態として、以下に説明する。
＜肥満遺伝子の多型解析方法＞
本発明の多型解析方法は、肥満遺伝子における検出対象部位の多型を解析する方法であって、前記肥満遺伝子が、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子であり、下記（ｉ）〜（iv）工程を含むことを特徴とする。
（ｉ）本発明の増幅産物の製造方法により、前記β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子における検出対象部位を含む領域を反応液中で増幅させる工程
（ii）前記（ｉ）工程における増幅産物と、前記β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子における検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブとを含む反応液を準備する工程
（iii）前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（iv）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子における検出対象部位の多型を決定する工程
このように本発明のプライマーセットを用いて増幅産物を製造することによって、前述のように、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子のうち少なくとも１つの肥満遺伝子における多型の検出対象部位を含む目的領域を増幅し、前記目的領域における検出対象部位の多型を解析することができる。
前記（ｉ）工程におけるプローブは、特に制限されず、β２ＡＲ遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズするプローブ（以下、「β２ＡＲ遺伝子用プローブ」ともいう）、β３ＡＲ遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズするプローブ（以下、「β３ＡＲ遺伝子用プローブ」ともいう）およびＵＣＰ１遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズするプローブ（以下、「ＵＣＰ１遺伝子用プローブ」ともいう）であることが好ましい。これらのプローブは、前記検出対象配列を含む検出対象配列に相補的なプローブであることが好ましい。これらのプローブは、いずれか１種類でもよいし、いずれか２種類または３種類全てであってもよく、例えば、本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットによって増幅させた目的領域の種類に応じて決定できる。２種類または３種類のプローブを用いた場合、例えば、同一反応液を用いて、いずれか２つの検出対象部位または前記３つ全ての検出対象部位の多型を解析することができる。
前記肥満遺伝子に対するプローブは、特に制限されず、従来公知の方法によって設定でき、例えば、多型の検出目的部位を含む検出対象配列として、各肥満遺伝子のセンス鎖の配列に基づいて設計してもよいし、アンチセンス鎖の配列に基づいて設計してもよい。また、多型の検出目的部位の塩基は、各多型の種類に応じて適宜決定できる。すなわち、β２ＡＲ遺伝子の場合、配列番号１における４２６５番目の塩基に「Ａ」および「Ｇ」の多型が知られていることから、例えば、４２６５番目がＡである検出対象配列、および、４２６５番目がＧである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）や、そのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）があげられる。また、β３ＡＲ遺伝子の場合、配列番号２における４１３４番目の塩基に「Ｔ」および「Ｃ」の多型が知られていることから、例えば、４１３４番目がＴである検出対象配列、および、４２６５番目がＣである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）や、そのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）があげられる。また、ＵＣＰ１遺伝子の場合、配列番号３における２９２番目の塩基に「Ａ」および「Ｇ」の多型が知られていることから、例えば、４１３４番目がＡである検出対象配列、および、４２６５番目がＧである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）や、そのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）があげられる。このように、多型が生じる検出目的部位の塩基を前述のようないずれかの塩基に設定してプローブを設計しても、後述するような方法により、各肥満遺伝子の検出目的部位においてどのような多型を示すかを判断することが可能である。
前記各プローブは、前記（ｉ）工程の後、すなわち、前記肥満遺伝子の目的領域について増幅反応を行った後、増幅反応液に添加することもできるが、容易且つ迅速に解析を行えることから、前記（ｉ）工程の増幅反応に先立って、予め反応液に添加しておくことが好ましい。
前記反応液におけるプローブの添加割合は、特に制限されないが、例えば、各プローブを１０〜４００ｎｍｏｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜２００ｎｍｏｌである。また、プローブの標識として蛍光色素を用いている場合、例えば、検出する蛍光強度を調整するために、標識化プローブと同じ配列である未標識プローブを併用してもよく、この未標識プローブは、その３’末端にリン酸が付加されてもよい。この場合、標識化プローブと非標識プローブのモル比は、例えば、１：１０〜１０：１が好ましい。前記プローブの長さは、特に制限されず、例えば、５〜５０ｍｅｒであり、好ましくは１０〜３０ｍｅｒである。
Ｔｍ値について説明する。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
前記（iii）工程において、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナルの測定は、前述した、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定であってもよい。具体的には、前記プローブとして、標識物質で標識化された標識化プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸収波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。
本発明においては、同一反応液で増幅させた２種類または３種類の肥満遺伝子の増幅産物について各多型を確認することもできる。このため、２種類または３種類のプローブを使用する際には、それぞれ異なる条件で検出される異なる標識（例えば、蛍光標識）によって標識化されていることが好ましい。このように異なる標識を使用することによって、同一反応液であっても、検出条件を変えることによって、各増幅産物を別個に解析することが可能となる。
前記標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、例えば、蛍光色素（蛍光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記プローブとしては、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が蛍光色素で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、Ｃであることが好ましい。この場合、前記標識化プローブがハイブリダイズする検出対象配列において、前記標識化プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基もしくは前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がＧとなるように、前記標識化プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが検出対象配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のＣが、前記検出対象ＤＮＡにおけるＧに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。３種類のプローブに使用する蛍光色素の組み合わせは、例えば、異なる条件で検出できればよく、特に制限されないが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（検出波長４５０〜４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長５８５〜７００ｎｍ）およびＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（検出波長５１５〜５５５ｎｍ）の組み合わせ等があげられる。
以下に、前述したβ２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子の各多型を検出するためのプローブの配列の具体例を示す。なお、本発明は、これには制限されない。下記プローブ（Ｐ１）は、β２ＡＲ遺伝子用プローブの一例であり、（１−１）は、センス鎖を検出するためのプローブであり、（１−２）は、アンチセンス鎖を検出するためのプローブである。下記プローブ（２）は、β３ＡＲ遺伝子用プローブの一例であり、（２−１）は、アンチセンス鎖を検出するためのプローブであり、（２−２）は、センス鎖を検出するためのプローブである。下記プローブ（３）は、ＵＣＰ１遺伝子用プローブの一例であり、アンチセンス鎖を検出するためのプローブである。なお、各プローブ（Ｐ１）〜（Ｐ３）は、それぞれ１種類でもよいし、後述するように、それぞれ２種類以上を併用してもよい。
プローブ（Ｐ１）
（１−１）配列番号１における４２５４番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として３’方向に向かって２１〜２６塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記チミン塩基に相補的なアデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（１−２）配列番号１における４２５９番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として３’方向に向かって１５〜１９塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基を５’末端とするオリゴヌクレオチド
プローブ（Ｐ２）
（２−１）配列番号２における４１４０番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として５’方向に向かって１７〜２８塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（２−２）配列番号２における４１４４番目のグアニン塩基（Ｇ）を１塩基目として５’方向に向かって１２〜１７塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニン塩基に相補的なシトシン塩基（Ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチド
プローブ（Ｐ３）
配列番号３における２８０番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として３’方向に向かって１７〜３１塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基を５’末端とするオリゴヌクレオチド
前記プローブ（１−１）において、配列番号１の４２６５番目に相補的な塩基は、ｙで表され、前記ｙは、ＴまたはＣである。前記プローブ（１−２）において、配列番号１の４２６５番目にあたる塩基は、ｒで表され、前記ｒは、ＡまたはＧである。前記プローブ（２−１）において、配列番号２の４１３４番目にあたる塩基は、ｙで表され、前記ｙは、ＴまたはＣである。前記プローブ（２−２）において、配列番号２の４１３４番目に相補的な塩基は、ｒで表され、前記ｒは、ＡまたはＧである。前記プローブ（３）において、配列番号３の２９２番目にあたる塩基は、ｒで表され、前記ｒは、ＡまたはＧである。
さらに、前記プローブ（１）、プローブ（２）およびプローブ（３）の具体例を下記表に示す。なお、下記表における「Ｔｍ（℃）」は、下記表の配列と完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合のＴｍ（℃）であり、ＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）により、パラメーターをオリゴヌクレオチド濃度０．２μＭ、ナトリウム当量（Ｎａ ｅｑ．）５０ｍＭとして算出した値である。
Figure 0005279492
前記表において、配列番号６９〜７４のオリゴヌクレオチドが、プローブ（１−１）の具体例であり、各塩基配列における「ｙ」は、以下に示すように、ＴおよびＣのいずれであってもよい。前記表において、「ｙ」がＣである配列番号６９〜配列番号７４で表されるプローブ（１−１）は、配列番号１の４２６５番目の塩基がＧであるβ２ＡＲ遺伝子（センス鎖）に対して相補的（パーフェクトマッチ）なプローブであり、大文字の塩基Ｃが、配列番号１の４２６５番目の塩基Ｇに相補的な塩基を示す。前記表においては、具体例として、「ｙ」が「Ｃ」であるプローブの配列、ならびに、前記プローブとそれに完全に相補的な配列とがハイブリダイズした場合のＴｍ値（℃）を示す。
５’−cgcatggcttcyattgggtgcca−３’ （配列番号７２：ｙ）
５’−cgcatggcttccattgggtgcca−３’ （配列番号７２、１０１：ｙがＣ）
５’−cgcatggcttctattgggtgcca−３’ （配列番号７２、１０２：ｙがＴ）
前記表において、配列番号１１２〜１１６のオリゴヌクレオチドが、前記プローブ（１−２）の具体例であり、各塩基配列における「ｒ」は、前述のようにＡおよびＧのいずれであってもよい。また、前記表において、「ｒ」がＧである配列番号１１２〜配列番号１１６で表されるプローブ（１−２）は、配列番号１の４２６５番目の塩基がＧであるβ２ＡＲ遺伝子の相補鎖（アンチセンス鎖）に対して相補的（パーフェクトマッチ）なプローブであり、大文字の塩基が、配列番号１の４２６５番目の塩基を示す。前記表においては、具体例として、「ｒ」が「Ｇ」であるプローブの配列、ならびに、前記プローブとそれに完全に相補的な配列とがハイブリダイズした場合のＴｍ値（℃）を示す。
Figure 0005279492
前記表において、配列番号７５〜８６で表されるプローブ（２−１）は、配列番号２における４１３４番目がＣである領域と同じ配列からなり、大文字の塩基が、配列番号２における４１３４番目の塩基を示す。なお、前記プローブ（２−１）において、前記大文字の塩基は、ｙに置き換えることができ、前記ｙは、ＣおよびＴのいずれでもよい。前記表において、配列番号１１７〜１２８で表されるプローブ（２−２）は、配列番号２における４１３４番目がＣである領域に相補的な配列からなり、大文字の塩基が、配列番号２における４１３４番目の塩基に相補的な塩基を示す。なお、前記プローブ（２−２）において、前記大文字の塩基は、ｒに置き換えることができ、前記ｒは、ＧおよびＡのいずれでもよい。前記表において、配列番号８７〜１００および１３９で表されるプローブ（３）は、配列番号３における２９２番目がＧである領域と同じ配列からなり、大文字の塩基が、配列番号３の２９２番目の塩基を示す。なお、前記プローブ（３）において、大文字の塩基は、ｒで置き換えることができ、前記ｒは、ＧおよびＡのいずれでもよい。なお、本発明におけるプローブの具体例としては、例えば、前述のように、前記表に示すオリゴヌクレオチドの相補鎖であってもよい。
前記プローブは、一例であって、本発明は、これには何ら限定されない。β２ＡＲ遺伝子用プローブとしては、プローブ（１−１）の中でも、配列番号７２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましく、「ｙ」は、前述のようにＴおよびＣのいずれであってもよい。また、プローブ（１−２）の中でも、配列番号１１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましいく、「ｒ」は、ＡおよびＧのいずれであってもよい。また、β２ＡＲ遺伝子用プローブとしては、いわゆる野生型検出用プローブと変異型検出用プローブとを併用することが好ましい。ここで、野生型検出用プローブとは、例えば、配列番号１の４２６５番目の塩基がＡ（またはＧ）である検出対象配列（センス鎖）またはその相補鎖（アンチセンス鎖）を検出するためのプローブであり、変異型検出用プローブとは、配列番号１の４２６５番目の塩基がＧ（またはＡ）である検出対象配列（センス鎖）またはその相補鎖（アンチセンス鎖）を検出するためのプローブである。本発明においては、プローブ（１−１）の中でも、例えば、「ｙ」が「Ｃ」である配列番号６９〜７４の塩基配列からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（変異型検出用プローブ）と、「ｙ」が「Ｔ」である配列番号６９〜７４の塩基配列からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（野生型検出用プローブ）とを併用することが好ましく、より好ましくは、「ｙ」が「Ｃ」である配列番号７２からなるオリゴヌクレオチド（変異型検出用プローブ）と、「ｙ」が「Ｔ」である配列番号７２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（野生型検出用プローブ）との併用である。
本発明者らは、別途、多型の解析について研究を行った結果、β２ＡＲ遺伝子多型（β２ＡＲのアミノ酸１６位をコードする部位の多型：配列番号１の４２６５番目の塩基の多型）を解析する場合、プローブを用いたＴｍ解析によると、シグナルの検出が困難であるとの知見を得た。そこで、本発明者らは、さらに鋭意研究を行った結果、前述のプローブ（１）、特に、配列番号７２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（すなわち、配列番号１０１のオリゴヌクレオチドと配列番号１０２のオリゴヌクレオチド）であれば、後述するように、β２ＡＲ遺伝子の増幅産物とマッチする場合のシグナルとミスマッチする場合のシグナルとを、十分に区別して検出可能であることを見出した。配列番号１０１で表されるプローブは、配列番号１の４２６５番目の塩基がＧであるβ２ＡＲ遺伝子（センス鎖）の検出対象配列とパーフェクトマッチするプローブであり、配列番号１０２で表されるプローブは、配列番号１の４２６５番目の塩基がＡであるβ２ＡＲ遺伝子（センス鎖）の検出対象配列とパーフェクトマッチするプローブである。なお、本発明は、前述のように、肥満遺伝子増幅用プライマーセットを使用することによって、３種類の遺伝子のそれぞれの目的領域を、同一反応液において、同時且つ特異的に増幅することが特徴であるため、得られた増幅産物の解析に使用するプローブの配列は、特に制限されない。
β３ＡＲ遺伝子用プローブとしては、プローブ（２−１）の中でも、配列番号８３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、プローブ（２−２）としては、いわゆる野生型検出用プローブと変異型検出用プローブとを併用することが好ましい。ここで、野生型検出用プローブとは、例えば、配列番号２の４１３４番目の塩基がＴである検出対象配列（センス鎖）またはその相補鎖（アンチセンス鎖）を検出するためのプローブであり、変異型検出用プローブとは、配列番号２の４１３４番目の塩基がＣである検出対象配列（センス鎖）またはその相補鎖（アンチセンス鎖）を検出するためのプローブである。本発明においては、例えば、配列番号１１７〜１２２の塩基配列からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（変異型検出用プローブ）と、配列番号１２３〜１２８の塩基配列からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（野生型検出用プローブ）とを併用することが好ましく、より好ましくは、配列番号１２０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（変異型検出用プローブ）と配列番号１２７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（野生型検出用プローブ）とを併用である。このように野生型検出用プローブと変異型検出用プローブとを併用する場合、例えば、各プローブのパーフェクトマッチのＴｍ値をずらして設定することが好ましい。
ＵＣＰ１遺伝子用プローブとしては、プローブ（３）の中でも、配列番号９５または配列番号１３９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。
そして、これらのプローブは、２種類以上を使用する際には、前述のように、それぞれ異なる蛍光色素（異なる波長で検出される蛍光色素）で標識化することが好ましい。例えば、前記表に示すプローブを消光プローブとする場合、プローブ（１−１）およびプローブ（２−１）は、３’末端を前述のような蛍光色素（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ等）で標識化することが好ましく、プローブ（１−２）、プローブ（２−２）およびプローブ（３）は、５’末端のシトシンを前述のような蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡ等）で標識化することが好ましい。なお、上記表に示すプローブ（１−１）の３’末端はアデニン（Ａ）であるが、隣接するシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）とハイブリダイズすることによって消光を確認できるため、グアニン消光プローブとして使用できる。また、５’末端に蛍光色素を標識化したプローブは、例えば、プローブ自体が伸長することを予防するために、その３’末端に、さらにリン酸基が付加されてもよい。また、前述のように野生型検出用プローブと変異型検出用プローブを使用する場合、それぞれの蛍光色素は、同じであっても異なっていてもよい。
次に、本発明の検出方法について、一例として、下記プローブを用いて、β２ＡＲ遺伝子の多型（配列番号１における４２６５番目の塩基の多型）、β３ＡＲ遺伝子の多型（配列番号２における４１３４番目の塩基の多型）およびＵＣＰ１遺伝子の多型（配列番号３における２９２番目の塩基の多型）を検出する方法を説明する。なお、本発明はこれには制限されない。
（プローブ）
β２ＡＲ遺伝子用プローブ
5’−cgcatggcttcCattgggtgcca-(Pacific Blue)−3’ （配列番号７２）、または、
5’−(Pacific Blue)-cccaatGgaagccatgc-P−3’ （配列番号１１４）
β３ＡＲ遺伝子用プローブ
5’−cgtggccatcgccCggactc-(BODIPY FL)−3’ （配列番号８３）、または；
5’−(BODIPY FL)-ctcggagtccGggc-P−3’ （配列番号１２０）、および、
5’−(BODIPY FL)-ctcggagtccAggc-P−3’ （配列番号１２７）
ＵＣＰ１遺伝子用プローブ
5’−(TAMRA)-cacagtttgatcGagtgcatttg−3’ （配列番号９５）、または、
5’−(TAMRA)-cacagtttgatcGagtg−3’ （配列番号１３９）
まず、前記３種類の標識化プローブを添加した反応液を用いて、前述のようにＰＣＲを行い、同一反応液中で、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子の各目的領域を同時に増幅させる。
次に、得られた増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、例えば、グアニン消光プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
本発明においては、３つの遺伝子の各多型を検出するため、３種類のプローブの各標識に応じた条件で、それぞれのＴｍ値を決定する。β２ＡＲ遺伝子用プローブのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、例えば、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、β３ＡＲ遺伝子用プローブのＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、例えば、検出波長５１５〜５５５ｎｍ、ＵＣＰ１遺伝子用プローブのＴＡＭＲＡは、例えば、検出波長５８５〜７００ｎｍで検出することができる。
そして、これらのＴｍ値から、各遺伝子の検出対象部位における遺伝子型を決定する。Ｔｍ解析において、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、一塩基が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、一塩基が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、増幅産物がプローブとマッチであるかミスマッチであるかを決定できる。例えば、検出対象配列における目的部位の塩基を変異型（例えば、配列番号１における４２６５番目の塩基がＧ）と仮定し、それを含む検出対象配列に相補的なプローブを使用した場合、形成したハイブリッドのＴｍ値が、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、前記増幅産物の多型は、変異型と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補なハイブリッドのＴｍ値より低い値）であれば、前記増幅産物の多型は、野生型（配列番号１における４２６５番目の塩基がＡ）と判断できる。さらに、両方のＴｍ値が検出された場合には、ヘテロ接合体と決定できる。このようにして、各標識化プローブに対するＴｍ値から、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子の各多型を判断することができる。なお、蛍光強度の検出によりＴｍ値を確認する際、マッチのシグナルとミスマッチのシグナルとが十分に区別できるように、前述のように、プローブとして、同じオリゴヌクレオチド配列である非標識プローブをあわせて使用することが好ましい。β２ＡＲ遺伝子用プローブ、β３ＡＲ遺伝子用プローブおよびＵＣＰ１遺伝子用プローブのうち、非標識プローブをあわせて添加するものは、特に制限されないが、例えば、β３ＡＲ遺伝子用プローブについて標識化プローブと非標識プローブとを添加することが好ましい。
また、本発明においては、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇させて（ハイブリッド形成体を加熱して）、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
なお、３種類の肥満遺伝子（β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子）のうち、いずれか１種類の遺伝子の多型またはいずれか２種類の遺伝子の多型を解析する場合には、例えば、プライマーセット（１）〜（３）のうち目的領域に対応するいずれか１種類またはいずれか２種類のプライマーセットを含む、本発明の肥満遺伝子増幅用プライマーセットを使用し、さらに、目的の検出対象部位にハイブリダイズするいずれか１種類のプローブまたはいずれか２種類のプローブを使用すればよい。
＜β２ＡＲ遺伝子解析用プローブ＞
本発明の肥満解析用プローブは、肥満遺伝子の多型解析に使用するためのプローブであって、前記肥満遺伝子が、β２ＡＲ遺伝子であり、下記（Ｐ１）に示すオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
（Ｐ１）
下記（１−１）および下記（１−２）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
（１−１）配列番号１における４２５４番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として３’方向に向かって２１〜２６塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記チミン塩基に相補的なアデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（１−２）配列番号１における４２５９番目のシトシン塩基（Ｃ）を１塩基目として３’方向に向かって１５〜１９塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基を５’末端とするオリゴヌクレオチド
前記（Ｐ１）に示すオリゴヌクレオチドからなるプローブは、前記β２ＡＲ遺伝子用プローブであり、前述の通りである。
本発明のβ２ＡＲ遺伝子用プローブによれば、β２ＡＲ遺伝子におけるβ２ＡＲアミノ酸１６位をコードする部位を含む検出対象配列を検出できる。具体的には、本発明のプローブを用いることによって、例えば、本発明のプローブと前記検出対象配列とのハイブリッド形成体の融解温度解析を優れた信頼性で行うことが可能であり、さらに、前記融解温度解析により、試料中における前記検出対象配列の有無や量の解析、前記検出対象配列における前記検出対象部位の多型（配列番号１の４２６５番目の塩基の多型）の決定等も優れた信頼性で行うことができる。したがって、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用プローブは、後述するように、β２ＡＲ遺伝子の解析、具体的には、例えば、融解温度の解析、融解温度の解析によるβ２ＡＲ遺伝子の多型解析に使用できる。また、前述の３種類の肥満遺伝子の多型解析方法にも使用することができる。したがって、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用プローブや解析方法は、特に、肥満の治療や予防を行う医療の分野において、極めて有用なツール・解析方法であるといえる。
前記β２ＡＲ遺伝子用プローブは、例えば、標識物質が付加されていない未標識プローブでもよいが、標識物質が付加された標識化プローブであることが好ましい。標識部位や標識物質は、前述の通りである。
＜β２ＡＲ遺伝子解析用試薬＞
本発明の肥満遺伝子解析用試薬は、β２ＡＲ遺伝子の解析に使用するための試薬であって、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用プローブを含むことを特徴とする（以下、「β２ＡＲ遺伝子解析用試薬」ともいう）。本発明の解析用試薬は、後述するように、β２ＡＲ遺伝子の解析、具体的には、例えば、融解温度の解析、融解温度の解析によるβ２ＡＲ遺伝子の多型解析に使用できる。また、β２ＡＲ遺伝子を含む前述の２種類または３種類の肥満遺伝子の多型解析方法にも使用することができる。なお、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用試薬は、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用プローブを含むことが特徴であり、これ以外の組成等については何ら制限されない。
本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用試薬は、さらに、β２ＡＲ遺伝子における前記検出対象部位を有する検出対象配列を増幅するためのプライマーを含むことが好ましい。前記プライマーとしては、例えば、前述のβ２ＡＲ遺伝子用プライマーセットがあげられる。このようにβ２ＡＲ遺伝子用プライマーセットを含む本発明の解析用試薬を用いれば、例えば、β２ＡＲ遺伝子の増幅反応を行い、前記反応により得られた増幅産物を用いて、さらに、β２ＡＲ遺伝子の解析を行うことができる。前記β２ＡＲ遺伝子用プライマーによって増幅させる領域は、β２ＡＲ遺伝子における前記検出対象部位を含む領域であればよい。具体例としては、例えば、β２ＡＲ遺伝子において、前記検出対象部位を有する検出対象配列、すなわち、本発明のプローブをハイブリダイズさせる配列であってもよいし、前記検出対象配列を含む領域であってもよい。以下、増幅反応により増幅させる領域を「目的領域」ともいう。
また、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用試薬は、例えば、全血等の生体試料におけるβ２ＡＲ遺伝子を解析する際に使用することが好ましい。特に、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用試薬が、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用プローブの他に、前記β２ＡＲ遺伝子用プライマーセットを含み、検出対象配列の増幅に使用する際には、例えば、増幅反応の反応液における全血試料の添加割合を０．１〜０．５体積％とすることが好ましい。この点については、前述のとおりである。
本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用試薬の形態は、特に制限されず、例えば、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用プローブを含有する液体試薬でもよいし、使用前に溶媒で懸濁する乾燥試薬であってもよい。β２ＡＲ遺伝子解析用プローブの含有量も、特に制限されない。
また、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用試薬は、例えば、同一反応液において、他の遺伝子や他の多型を検出するためのプローブやプライマーをさらに含んでもよい。前述のように、β２ＡＲ遺伝子と同様に、β３ＡＲ遺伝子やＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の多型は、肥満の治療や予防の指標となることが知られているため、例えば、いずれか一方もしくは両方を検出するためのプローブやプライマーセットをさらに含んでもよい。このように、例えば、複数の遺伝子の目的領域を増幅させ、プローブによる検出を行う場合、β２ＡＲ遺伝子の目的領域を特異的に増幅できることから、前述のようなβ２ＡＲ遺伝子用のプライマーセットを含有させることが好ましい。
＜β２ＡＲ遺伝子解析方法＞
本発明の肥満遺伝子解析方法は、β２ＡＲ遺伝子を解析する解析方法であって、下記（ａ）〜（ｃ）工程を含むことを特徴とする。
（ａ）β２ＡＲ遺伝子における多型の検出対象部位を有する検出対象配列と、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用プローブとを含む反応液を準備する工程
（ｂ）前記反応液の温度を変化させ、前記検出対象配列と前記β２ＡＲ遺伝子解析用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（ｃ）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記ハイブリッド形成体の融解温度を決定する工程
このように、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用プローブを用いることによって、例えば、前記検出対象配列と前記β２ＡＲ遺伝子解析用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値の変動を、十分に検出することができる。このため、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析方法によれば、β２ＡＲ遺伝子の検出対象配列に関する融解温度の決定を高い信頼性で行うことが可能である。これによって、例えば、β２ＡＲ遺伝子の検出対象部位を含む領域について核酸増幅を行った際、前記目的領域の増幅の有無を、融解温度（Ｔｍ）の解析により高い信頼性で判断することも可能となる。さらに、本発明のプローブと前記検出対象配列とがパーフェクトマッチする場合のＴｍ値と、ミスマッチする場合のＴｍ値とが、十分に判別可能な差を示すことから、被検対象のβ２ＡＲ遺伝子が、本発明のプローブに対してパーフェクトマッチとミスマッチのいずれであるかを十分に区別することが可能である。このようにパーフェクトマッチとミスマッチとを十分に区別できれば、被検対象のβ２ＡＲ遺伝子の多型をより一層優れた信頼性で判断することができる。なお、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析方法は、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用プローブを使用することが特徴であって、例えば、測定するシグナルの種類、測定方法や測定条件等は、何ら制限されない。
本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析方法は、前述のようにＴｍ値の決定が可能であることから、さらに、下記（ｄ）工程を含んでもよい。
（ｄ）決定した融解温度から、β２ＡＲ遺伝子の検出対象部位の多型を決定する工程
本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析方法は、さらに、下記（ｘ）工程を含んでもよい。このような方法によれば、例えば、β２ＡＲ遺伝子の増幅、Ｔｍ値の決定、さらに、多型の解析を、同じ反応液を用いて連続的に行うことが可能である。なお、下記プライマーとしては、前述のβ２ＡＲ遺伝子用プライマーが使用できる。
（ｘ）試料中の核酸を鋳型として、β２ＡＲ遺伝子における前記検出対象配列を増幅するためのプライマーを用いて、反応液中、前記検出対象配列の増幅を行う工程
前記（ｘ）工程における遺伝子増幅方法としては、特に制限されず、例えば、前述のような手法が採用でき、ＰＣＲ法が好ましい。
前記β２ＡＲ遺伝子解析用プローブは、前記（ｘ）工程の後、すなわち、β２ＡＲ遺伝子の増幅反応を行った後、増幅反応の反応液に添加することもできるが、容易且つ迅速に解析を行えることから、前記（ｘ）工程の増幅反応に先立って、予め反応液に添加しておくことが好ましい。この場合、前記（ｘ）工程の増幅反応後の前記反応液を、前記（ａ）工程における反応液として使用することができる。このような方法によれば、増幅反応を行った反応液をそのまま用いて、融解温度解析を行うことができる。
前記反応液におけるプローブの添加割合は、特に制限されないが、例えば、各プローブを１０〜４００ｎｍｏｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜２００ｎｍｏｌである。また、プローブの標識として蛍光色素を用いている場合、例えば、検出する蛍光強度を調整するために、標識化プローブと同じ配列である未標識プローブを併用してもよく、この未標識プローブは、その３’末端にリン酸が付加されてもよい。この場合、標識化プローブと非標識プローブのモル比は、例えば、１：１０〜１０：１が好ましい。前記プローブの長さは、特に制限されず、例えば、５〜５０ｍｅｒであり、好ましくは１０〜３０ｍｅｒである。
前記（ｂ）工程において、前記検出対象配列と前記β２ＡＲ遺伝子解析用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値の測定は、例えば、非標識のプローブを用いて、前述した２６０ｎｍの吸光度測定を行ってもよいが、標識化プローブを用いて、標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。具体的には、前記β２ＡＲ遺伝子解析用プローブとして、標識物質で標識化された標識化プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、前述のようなものがあげられ、前述と同様に測定することができる。
本発明を適用する試料としては、例えば、鋳型となる核酸を含んでいればよく、特に制限されないが、前述のようなものがあげられる。また、前記反応液における試料の添加割合は、例えば、前述の通りである。
次に、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析方法について、一例として、全血試料からＰＣＲによりβ２ＡＲ遺伝子の増幅を行い、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析用プローブを用いて、β２ＡＲ遺伝子の多型（配列番号１における４２６５番目の塩基の多型）を決定する方法を説明する。なお、特に示さない限り、前述の本発明の肥満遺伝子の多型解析方法と同様に行うことができ、また、これには制限されない。
まず、ＰＣＲ反応液を調製してＰＣＲを行い、得られた増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記β２ＡＲ遺伝子解析用プローブとのハイブリダイズを行う。そして、前記反応液を加熱し（前記一本鎖ＤＮＡと前記β２ＡＲ遺伝子解析用プローブとのハイブリッド形成体を加熱し）、前記反応液のシグナル値を測定する。シグナル値の測定は、前述と同様に、使用するβ２ＡＲ遺伝子解析用プローブの標識の有無、ならびに、標識物質の種類等に応じて適宜決定できる。
次に、測定した前記シグナル値の変動を解析してＴｍ値を決定する。β２ＡＲ遺伝子解析用プローブが、蛍光標識化プローブの場合には、例えば、得られた蛍光強度から各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（−ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ、または、ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ）を算出し、最も大きい絶対値を示す温度をＴｍ値として決定できる。例えば、グアニン消光プローブの場合、−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔが最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定し、または、蛍光強度増加量／ｄｔが最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
そして、Ｔｍ値から、β２ＡＲ遺伝子の検出対象部位における遺伝子型を決定する。Ｔｍ解析において、完全に相補であるハイブリッド（パーフェクトマッチ）は、一塩基が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、一塩基が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、増幅産物がプローブとマッチであるかミスマッチであるかを決定できる。例えば、検出対象配列における検出対象部位の塩基を変異型（例えば、配列番号１における４２６５番目の塩基がグアニン）と仮定し、それを有する検出対象配列に相補的なプローブ（配列番号２におけるｙがシトシン）を使用した場合、形成したハイブリッドのＴｍ値が、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値と同程度であれば、前記増幅産物の多型は、変異型と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同程度（完全に相補なハイブリッドのＴｍ値より低い値）であれば、前記増幅産物の多型は、野生型（配列番号１における４２６５番目の塩基がアデニン）と判断できる。さらに、一方のＴｍ値のみが検出された場合には、ホモ接合性、両方のＴｍ値が検出された場合には、ヘテロ接合性と決定できる。このようにして、β２ＡＲ遺伝子解析用プローブに対するＴｍ値から、β２ＡＲ遺伝子の多型を判断することができる。
本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析方法によれば、本発明のプローブを使用することによって、前述のように、前記プローブと検出対象配列とがパーフェクトマッチである場合のＴｍ値と、ミスマッチである場合のＴｍ値とが、十分に判別可能な差を示す。この差は、例えば、４℃以上であり、好ましくは６℃以上である。
また、本発明においては、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇させて（ハイブリッド形成体を加熱して）、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。
＜多型解析方法＞
本発明の多型解析方法は、融解温度の解析によりβ２ＡＲ遺伝子における検出対象部位の多型の解析を行う多型解析方法であって、本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析方法を含むことを特徴とする。本発明の多型解析方法は、前述の本発明のβ２ＡＲ遺伝子解析方法と同様にして行うことができる。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記実施例により制限されない。
被検者８人からヘパリンリチウム採血管を用いて採血を行った（サンプル１〜８）。得られた血液１０μＬと蒸留水９０μＬを混合し、さらに、この混合液１０μＬと蒸留水９０μＬとを混合した。これら混合液１０μＬを、下記組成のＰＣＲ反応液４０μＬに添加し、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および５６℃１０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、４５０〜４８０ｎｍ（蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅの検出）、５１５〜５５５ｎｍ（蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの検出）、および、５８５〜７００ｎｍ（蛍光色素ＴＡＭＲＡの検出）とした。なお、５０サイクルのＰＣＲに要した時間は、約１時間であった。
Figure 0005279492
（プローブ）
β２ＡＲ遺伝子用プローブ
5’−cgcatggcttcCattgggtgcca−(Pacific Blue)−3’ （配列番号７２）
β３ＡＲ遺伝子用プローブ１
5’−cgtggccatcgccCggactc−(BODIPY FL)−3’ （配列番号８３）
β３ＡＲ遺伝子用プローブ２
5’−cgtggccatcgccCggactc−P−3’ （配列番号８３）
ＵＣＰ１遺伝子用プローブ
5’−(TAMRA)−cacagtttgatcGagtgcatttg−3’ （配列番号９５）
（プライマーセット）
β２ＡＲ遺伝子 Ｆ１プライマー
5'−cccgggaacggcagcgcctt−3' （配列番号９）
β２ＡＲ遺伝子 Ｒ１プライマーｍｉｘ
5'−cccacacctcgtccctttSctgcgt−3' （配列番号１８）
Ｓは、ｃまたはｇであり、両方のプライマーを１:１(モル比)で混合
β３ＡＲ遺伝子 Ｆ２プライマー
5'−ccaccgtgggaggcaacc−3' （配列番号２６）
β３ＡＲ遺伝子 Ｒ２プライマー
5'−ctgcggccagcgaagtc−3' （配列番号３１）
ＵＣＰ１遺伝子 Ｆ３プライマー
5'−ggaagacattttgtgcagcgatttctgattgacc−3' （配列番号４４）
ＵＣＰ１遺伝子 Ｒ３プライマーｍｉｘ
5'−cKtagcaaaggagtggcagcaagttctg−3' （配列番号６３）
Ｋは、ｇまたはｔであり、両方のプライマーを１:１(モル比)で混合
β２ＡＲ遺伝子用プローブとマッチするハイブリッドのＴｍ値は７０．０℃、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は６２．０℃、β３ＡＲ遺伝子用プローブとマッチするハイブリッドのＴｍ値は７３．０℃、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は６６．０℃、ＵＣＰ１遺伝子用プローブとマッチするハイブリッドのＴｍ値は６５．０℃、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は６０．０℃である。
サンプル１〜８の結果を図１〜図３に示す。これらの図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフであり、縦軸の微分値は「−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」を示し、横軸は温度を示す（以下、同様）。同図に示すように、シグナルのピークから、各サンプルにおけるβ２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子の各多型を決定した。これらの実施例の結果を裏付けるために、被検者８人について、ＲＦＬＰ法によって、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子の各多型を確認した結果、実施例と同じ結果が得られた。このように、本発明のプライマーセットを使用することにより、前処理を施していない全血試料を使用して、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子を同一反応液中で同時に増幅し、且つ、前記同一反応液を用いて前記遺伝子のそれぞれの多型を解析することができた。
被検者３人からＥＤＴＡ採血管を用いて採血を行った（サンプル１〜３）。得られた血液１０μＬと下記希釈液Ａ ７０μＬとを混合し、さらに、この混合液１０μＬと下記希釈液Ｂ ７０μＬとを混合した。得られた混合液１０μＬを９５℃で５分間加熱処理した後、下記組成のＰＣＲ反応液４６μＬに添加し、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６４℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から７５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、４５０〜４８０ｎｍ（蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅの検出）、５１５〜５５５ｎｍ（蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの検出）、および、５８５〜７００ｎｍ（蛍光色素ＴＡＭＲＡの検出）とした。
（希釈液Ａ）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＮａＮ３、０．３％ ＳＤＳ
（希釈液Ｂ）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＮａＮ３
Figure 0005279492
（プローブ）
β２ＡＲ遺伝子用プローブ
5’−(Pacific Blue)−cccaatGgaagccatgc−P−3’ （配列番号１１４）
β３ＡＲ遺伝子用プローブ１
5’−(BODIPY FL)−ctcggagtccGggc−P−3’ （配列番号１２０）
β３ＡＲ遺伝子用プローブ２
5’−(BODIPY FL)−ctcggagtccAgg−P−3’ （配列番号１２０）
ＵＣＰ１遺伝子用プローブ
5’−(TAMRA)−cacagtttgatcGagtg−P−3’ （配列番号１３９）
（プライマーセット）
β２ＡＲ遺伝子 Ｆ１プライマー
5'−cgggaacggcagcgccttct−3' （配列番号１０９）
β２ＡＲ遺伝子 Ｒ１プライマー
5'−ccaccacccacacctcgtccct−3' （配列番号１３４）
β３ＡＲ遺伝子 Ｆ２プライマー
5'−gccaccgtgggaggcaacc−3' （配列番号２４）
β３ＡＲ遺伝子 Ｒ２プライマー
5'−ggctgcggccagcgaagtc−3' （配列番号２８）
ＵＣＰ１遺伝子 Ｆ３プライマー
5'−ggaagacattttgtgcagcgatttctgattgacc−3' （配列番号４３）
ＵＣＰ１遺伝子 Ｒ３プライマーｍｉｘ
5'−cKtagcaaaggagtggcagcaagttctg−3' （配列番号６３）
Ｋは、ｇまたはｔであり、両方のプライマーを１:１(モル比)で混合
β２ＡＲ遺伝子用プローブとマッチするハイブリッドのＴｍ値は５８℃、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は５１℃、β３ＡＲ遺伝子用プローブとマッチするハイブリッドのＴｍ値は５８℃、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は５１℃、ＵＣＰ１遺伝子用プローブとマッチするハイブリッドのＴｍ値は５６℃、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は４９℃である。
サンプル１〜３の結果を図４に示す。これらの図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフであり、縦軸の微分値は「−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」を示し、横軸は温度を示す。同図に示すように、シグナルのピークから、各サンプルにおけるβ２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子の各多型を決定した。これらの実施例の結果を裏付けるために、被検者３人について、ＲＦＬＰ法によって、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子の各多型を確認した結果、実施例と同じ結果が得られた。このように、本発明のプライマーセットを使用することにより、前処理を施していない全血試料を使用して、β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子およびＵＣＰ１遺伝子を同一反応液中で同時に増幅し、且つ、前記同一反応液を用いて前記遺伝子のそれぞれの多型を解析することができた。
β２ＡＲ遺伝子に対する各種プローブを作製し、Ｔｍ解析を行った。まず、下記表９に示すプローブと、前記各プローブに相補的な下記表１０に示すオリゴヌクレオチド（相補鎖ＤＮＡ）とを合成した。下記表９のプローブ配列において、大文字の塩基が、配列番号１における４２６５番目に対応する塩基であって、これらのプローブは、センス鎖における４２６５番目（Ｇ，Ａ）もしくはそれと相補的なアンチセンス鎖における塩基（Ｃ，Ｔ）を検出するためのプローブとして設計した。下記表１０に示すオリゴヌクレオチドは、β２ＡＲ遺伝子のセンス鎖またはセンス鎖の部分配列であり、配列番号１の４２６５番目の塩基またはそれに相補的な塩基を含む配列である。そして、これらのプローブならびに相補鎖ＤＮＡを用いて、下記表１１の組成となるように反応液を調製した。プローブの検出対象鎖がセンス鎖の場合は、相補鎖ＤＮＡとして、１Ａ（４２６５Ａ）および１Ｂ（４２６５Ｇ）を使用し、それぞれを添加した反応液を調製した。また、プローブの検出対象鎖がアンチセンス鎖の場合は、相補鎖ＤＮＡとして、２Ａ（４２６５Ａ）および２Ｂ（４２６５Ｇ）を使用し、それぞれを添加した反応液を調製した。これらの反応液をサーマルサイクラー（商品名Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ、Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）に供し、温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記反応液を４５℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５６５〜６０５ｎｍ（ＴＡＭＲＡの検出、ｃｈ３）とした。
Figure 0005279492
Figure 0005279492
Figure 0005279492
実施例３−１のプローブを使用した結果を図５に、比較例３−９および比較例３−１１のプローブを使用した結果を図６にそれぞれ示す。これらの図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフ（融解曲線）であり、縦軸の微分値は「−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」を示し、横軸は温度を示す（以下、同様）。図５においては、反応液中に前記相補鎖ＤＮＡ（１Ａ）を添加した系の融解曲線（細線）と前記相補鎖ＤＮＡ（１Ｂ）を添加した系の融解曲線（太線）をあわせて示し、図６は、反応液中に前記相補鎖ＤＮＡ（２Ａ）を添加した系の融解曲線（細線）と前記相補鎖ＤＮＡ（２Ｂ）を添加した系の融解曲線（太線）をあわせて示す。
図６に示すように、比較例３−９のプローブを使用した場合、４２６５Ｇのシグナルピークが検出されなかった。また、比較例３−１１のプローブを使用した場合、前記プローブと相補鎖ＤＮＡ（２Ｂ）とのパーフェクトマッチを示すピークのＴｍ値（６８℃）と、前記プローブと相補鎖ＤＮＡ（２Ａ）とのミスマッチを示すピークのＴｍ値（６５℃）との差が小さかった（３℃）。このため、これらの比較例のプローブを用いた融解曲線からは、パーフェクトマッチとミスマッチのいずれを示すのか、優れた信頼性で判断することが困難であった。なお、他の比較例についても、図６における比較例３−９または比較例３−１１と同様の融解曲線を示した。これに対して、実施例３−１のプローブを使用した場合、図５に示すように、前記プローブと相補鎖ＤＮＡ（１Ｂ）とのパーフェクトマッチを示すシグナルピークと、前記プローブと相補鎖ＤＮＡ（１Ａ）とのミスマッチを示すシグナルピークの両方が十分に確認できた。さらに、前記パーフェクトマッチを示すピークのＴｍ値（７５℃）と、前記ミスマッチを示すピークのＴｍ値（６８℃）との差が、約７℃であり、両者を判別するには十分な差であった。このため、実施例のプローブによれば、パーフェクトマッチとミスマッチとのいずれを示すのかを十分に判断することが可能である。
配列番号１における４２６５番目が４２６５Ａ／４２６５Ａのホモ接合体を示すヒトの精製ゲノム、ならびに、４２６５Ｇ／４２６５Ｇのホモ接合体を示すヒトの精製ゲノムを準備した。これらの各精製ゲノム１μＬを、それぞれ下記組成のＰＣＲ反応液２４μｌに添加し、サーマルサイクラー（商品名Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ、Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）に供してＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６２℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。そして、続けて、温度の上昇速度を１℃／秒として、前記反応液を４５℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、Ｔｍ解析を行った。検出波長は、５０５〜５３７ｎｍ（蛍光色素ＦＡＭの検出、１ｃｈ）とした。
Figure 0005279492
（プローブ）
β２ＡＲ遺伝子解析用プローブ
5’−cgcatggcttcCattgggtgcca−(BODIPY FL)−3’ (配列番号７２)
（プライマーセット）
β２ＡＲ遺伝子用フォワードプライマー
5’−gggaacggcagcgccttcttgct−3’ (配列番号１６５)
β２ＡＲ遺伝子用リバースプライマー
5’−tggtgaccgtctgcagacgctcgaac−3’ (配列番号１６６)
前記プライマーセットを用いたＰＣＲによって増幅させた領域は、配列番号１における４２６５番目を含む２００塩基程度のＤＮＡ鎖である。４２６５Ｇ／４２６５Ｇを示すゲノムからは、４２６５番目がＧ（アンチセンス鎖はＣ）であるＤＮＡ鎖を増幅させ、４２６５Ａ／４２６５Ａを示すゲノムからは、４２６５番目がＡ（アンチセンスはＴ）であるＤＮＡを増幅させた。
前記配列番号７２に示すβ２ＡＲ遺伝子解析用プローブとマッチするハイブリッドのＴｍ値は６９℃、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は６２℃である。
これらの結果を図７に示す。図７は、これらの図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフ（融解曲線）であり、縦軸の微分値は「−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」を示し、横軸は温度を示す（以下、同様）。図７においては、４２６５Ａ／４２６５Ａホモ接合体を示すヒトの精製ゲノムを添加した系の融解曲線（細線）と４２６５Ｇ／４２６５Ｇホモ接合対を示すヒトの精製ゲノムを添加した系の融解曲線（太線）をあわせて示す。
同図に示すように、実施例４のプローブの共存下で、ヒト精製ゲノムのβ２ＡＲ遺伝子におけるＤＮＡを増幅させて、Ｔｍ解析を行った結果、４２６５番目の塩基を区別して検出することが可能であった。具体的に、前記プローブと４２６５Ｇ／４２６５Ｇホモ接合体由来の増幅物とのパーフェクトマッチを示すピークのＴｍ値（６９℃）と、前記プローブと４２６５Ａ／４２６５Ａホモ接合体由来の増幅物とのミスマッチを示すピークのＴｍ値（６２℃）との差が、約７℃であり、両者を判別するには十分な差であった。このため、実施例のプローブによれば、β２ＡＲ遺伝子における４２６５番目の多型を十分に解析することが可能である。
以上のように、本発明のプライマーセットによれば、肥満遺伝子（β２ＡＲ遺伝子、β３ＡＲ遺伝子またはＵＣＰ１遺伝子）における特定の多型が生じる部位を含む領域を、特異的に高効率で増幅することができる。このため、前述のような従来法とは異なり手間やコストを低減することが可能となる。また、このように多型の検出対象部位を含む領域が特異的に増幅されることから、例えば、前記検出対象部位を含む検出対象配列に相補的なプローブを使用することで、前記反応液を用いてそのままＴｍ解析を行い、前記多型をタイピングすることが可能となる。また、１つの反応液で増幅やタイピングが可能であることから、操作の自動化も可能になる。さらに、本発明のプライマーセットを用いれば、例えば、夾雑物が含まれる試料（例えば、全血や口腔粘膜等）であっても、前処理を省略できるため、より迅速且つ簡便に増幅反応を行うことができる。また、本発明のプライマーセットを用いれば、従来よりも優れた増幅効率で増幅反応が行えるため、増幅反応も短縮化が可能である。したがって、本発明のプライマーセットやこれを含む試薬、ならびにこれらを用いた増幅産物の製造方法によれば、肥満遺伝子の多型を迅速かつ簡便に解析できることから、医療分野においてきわめて有効といえる。

Claims (21)

  1. 肥満遺伝子の多型解析に使用するためのプローブであって、
    前記肥満遺伝子が、β２ＡＲ遺伝子であり、
    配列番号７２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする肥満遺伝子解析用プローブ。
  2. 前記プローブが、融解温度の解析によるβ２ＡＲ遺伝子の多型解析に使用するためのプローブである、請求項１記載の肥満遺伝子解析用プローブ
  3. 前記プローブが、標識物質が付加された標識化プローブである、請求項１または２記載の肥満遺伝子解析用プローブ。
  4. 前記標識物質が、蛍光物質である、請求項３記載の肥満遺伝子解析用プローブ。
  5. 前記標識化プローブが、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が消光するプローブである、請求項４記載の肥満遺伝子解析用プローブ
  6. 前記プローブが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に前記標識物質が付加された標識化プローブである、請求項３〜５のいずれか一項記載の肥満遺伝子解析用プローブ。
  7. 肥満遺伝子の解析に使用するための試薬であって、
    前記肥満遺伝子がβ２ＡＲ遺伝子であり、
    請求項１〜６のいずれか一項記載の肥満遺伝子解析用プローブを含むことを特徴とする肥満遺伝子解析用試薬。
  8. 前記試薬が、融解温度の解析による肥満遺伝子の多型解析に使用するための試薬である、請求項７記載の肥満遺伝子解析用試薬。
  9. さらに、β２ＡＲ遺伝子における多型の検出対象部位を有する検出対象配列を増幅するためのプライマーを含む、請求項７または８記載の肥満遺伝子解析用試薬。
  10. 前記肥満遺伝子解析用試薬が、生体試料中のβ２ＡＲ遺伝子における検出対象部位の多型を解析するための試薬である、請求項７〜９のいずれか一項記載の肥満遺伝子解析用試薬。
  11. 前記生体試料が、全血である、請求項１０記載の肥満遺伝子解析用試薬。
  12. 肥満遺伝子を解析する肥満遺伝子解析方法であって、
    前記肥満遺伝子が、β２ＡＲ遺伝子であり、
    下記（ａ）〜（ｃ）工程を含むことを特徴とする肥満遺伝子解析方法。
    （ａ）β２ＡＲ遺伝子における多型の検出対象部位を有する検出対象配列と、請求項１〜６のいずれか一項記載の肥満遺伝子解析用プローブとを含む反応液を準備する工程
    （ｂ）前記反応液の温度を変化させ、前記検出対象配列と前記肥満遺伝子解析用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
    （ｃ）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記ハイブリッド形成体の融解温度を決定する工程
  13. さらに、下記（ｄ）工程を含む、請求項１２記載の肥満遺伝子解析方法。
    （ｄ）決定した融解温度から、β２ＡＲ遺伝子の前記検出対象部位の多型を決定する工程
  14. 前記肥満遺伝子解析用プローブが、蛍光物質が付加された標識化プローブであり、
    前記（ｂ）工程において、前記シグナル値として、前記蛍光物質の蛍光強度を測定する、請求項１２または１３記載の肥満遺伝子解析方法。
  15. 前記標識化プローブが、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が消光するプローブであり、
    前記（ｂ）工程において、前記反応液の温度を上昇させ、温度上昇にともなう蛍光強度の減少を測定する、請求項１４記載の肥満遺伝子解析方法。
  16. さらに、下記（ｘ）工程を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項記載の肥満遺伝子解析方法。
    （ｘ）試料中の核酸を鋳型として、β２ＡＲ遺伝子における前記検出対象配列を増幅するためのプライマーを用いて、反応液中、前記検出対象配列の増幅を行う工程
  17. 前記（ｘ）工程において、増幅反応に先立って、前記反応液に前記肥満遺伝子解析用プローブを添加し、前記（ｘ）工程における増幅反応後の前記反応液を、前記（ａ）工程における反応液として使用する、請求項１６記載の肥満遺伝子解析方法。
  18. 前記試料が、生体試料である、請求項１６または１７記載の肥満遺伝子解析方法。
  19. 前記生体試料が、全血である、請求項１８記載の肥満遺伝子解析方法。
  20. 前記反応液における全血の添加割合が、０．１〜０．５体積％である、請求項１９記載の肥満遺伝子解析方法。
  21. 融解温度の解析により肥満遺伝子における検出対象部位の多型の解析を行う多型解析方法であって、
    前記肥満遺伝子が、β２ＡＲ遺伝子であり、
    請求項１２〜２０のいずれか一項記載の肥満遺伝子解析方法を含むことを特徴とする多型解析方法。
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