JPWO2008066163A1 - Ｃｙｐ２ｃ９遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むｃｙｐ２ｃ９遺伝子増幅用試薬およびその用途 - Google Patents

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Abstract

遺伝子増幅法により、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＣＹＰ２Ｃ９＊３の検出目的部位を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、前記領域を特異的に増幅することができるプライマーセットを提供する。配列番号４の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１７の塩基配列からなるリバースプライマーとを含む１対のプライマーセットを使用する。このプライマーセットを使用することにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３を生じる部分を含む目的領域を、特異的且つ高効率で増幅することができる。

Description

本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を増幅するためのプライマーセット、それを含むＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用試薬およびその用途に関する。
チトクロームＰ４５０は、スーパーファミリーに分類される酵素群であって、多くのサブファミリー（例えば、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ１Ｂ、ＣＹＰ２Ｃ，ＣＹＰ２Ｄ、ＣＹＰ２Ｅ、ＣＹＰ３Ａ等）が存在する。中でも、ヒトＣＹＰ２ＣサブファミリーのアイソザイムであるＣＹＰ２Ｃ９をコードする遺伝子（ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子）の変異は、ＣＹＰ２Ｃ９の基質薬物であるフェニトイン（抗てんかん剤）やワルファリン（抗凝固薬）の体内動態や効果に影響することが明らかになっている。ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の多型であるＣＹＰ２Ｃ９＊３は、アミノ酸３５９位（エキソン７）のイソロイシンがロイシンに変化した変異として知られている（非特許文献１）。そして、このＣＹＰ２Ｃ９＊３が存在するアミノ酸３５９位は、基質薬物の認識部位であり、そのアミノ酸が変化して立体構造（β−ｓｔｒａｎｄ）が変化することによって、薬剤代謝に関与する酵素の機能に影響を及ぼしている。したがって、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子について多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３を調べることは、薬剤による副作用を予測し、より良い効果を示す薬剤の投与条件を決定するために、極めて重要である。
他方、あらゆる疾患の原因や、個体間の疾患易罹患性（疾患のかかり易さ）、個体間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が広く行われている。点突然変異の一般的な検出方法としては、（１）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅させ、その全遺伝子配列を解析するＤｉｒｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、（２）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲにより増幅させ、前記検出対象配列における目的の変異の有無により切断作用が異なる制限酵素によってその増幅産物を切断し、電気泳動を行うことによりタイピングを行うＲＦＬＰ解析、（３）３’末端領域に目的の変異が位置するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無によって変異を判断するＡＳＰ−ＰＣＲ法等があげられる。
しかしなら、これらの方法は、例えば、試料から抽出したＤＮＡの精製、電気泳動、制限酵素処理等が必須であるため、手間やコストがかかってしまう。また、ＰＣＲを行った後、反応容器を一旦開封する必要があるため、前記増幅産物が次の反応系に混入し、解析精度が低下するおそれがある。さらに、自動化が困難であるため、大量のサンプルを解析することができない。また、前記（３）のＡＳＰ−ＰＣＲ法については、特異性が低いという問題もある。
このような問題から、近年、点突然変異の検出方法として、標的核酸とプローブとから形成される二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ：ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を解析する方法が実用化されている。このような方法は、例えば、Ｔｍ解析、または、前記二本鎖の融解曲線の解析により行われることから、融解曲線解析と呼ばれている。これは、以下のような方法である。すなわち、まず、検出目的の点突然変異を含む検出対象配列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させる。このハイブリッド形成体に加熱処理を施し、温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を、吸光度等のシグナルの変動によって検出する。そして、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって、点突然変異の有無を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、点突然変異を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定する。前記測定値が評価基準値と同程度であれば、マッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在すると判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在しないと判断できる。そして、この方法によれば、遺伝子解析の自動化も可能である。
しかしながら、このようなＴｍ解析を利用した検出方法についても、ＰＣＲにおいて、検出目的部位を含む領域を特異的且つ効率的に増幅できなければならないという問題がある。特に、ＣＹＰには多くのアイソザイムが存在し、それらをコードする配列も極めて類似しているため、ＰＣＲにおいて、ＣＹＰ２Ｃ９以外のアイソザイムのコード遺伝子までもが増幅されるおそれがある。また、このように他のアイソザイムのコード遺伝子までも増幅された場合には、例えば、解析結果の信頼性を低下させる原因にもなる。そして、このように、１つのサンプルを解析するにも多大な労力を伴うため、大量のサンプルを解析することは実用的ではないという問題もある。
ＰＭＩＤ： ８８７３２２０ Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ． １９９６ Ａｕｇ；６（４）：３４１−９．
そこで、本発明は、遺伝子増幅法によりＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の目的領域を特異的に効率良く増幅することができるプライマーセットの提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明のプライマーセットは、遺伝子増幅法によりＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を増幅するためのプライマーセットであって、下記プライマーセット（１）を含むことを特徴とする。
プライマーセット（１）
下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
（Ｆ１）配列番号１の塩基配列における５２４６６番目のアデニン塩基（Ａ）を一塩基目として５’方向に向かって１４〜１８塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）配列番号１の塩基配列における５２６３１番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として３’方向に向かって１９〜３６塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記５２６３１番目のチミン塩基（Ｔ）に相補的なアデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
また、本発明の遺伝子増幅用試薬は、遺伝子増幅法によりＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を増幅するための試薬であって、前記本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする。
本発明の増幅産物の製造方法は、遺伝子増幅法によりＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、下記（Ｉ）工程を含むことを特徴とする。
（Ｉ）試料中の核酸を鋳型として、本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、反応液中で、前記ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅を行う工程
本発明の多型解析方法は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における検出対象部位の多型を解析する方法であって、下記（ｉ）〜（iv）工程を含むことを特徴とする。
（ｉ）本発明の増幅産物の製造方法により、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における検出対象部位を含む領域を反応液中で増幅させる工程
（ii）前記（ｉ）工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブとを含む反応液を準備する工程
（iii）前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（iv）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定する工程
本発明のプライマーセットによれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における検出目的の多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３が発生する部位を含む目的領域を、反応液中で特異的且つ高効率で増幅することができる。このため、前述のような従来法とは異なり手間やコストを低減することが可能となる。また、このようにＣＹＰ２Ｃ９＊３が発生する検出対象部位を含む領域を特異的に増幅できることから、例えば、さらに、検出対象部位を含む検出対象配列に相補的なプローブを使用することで、前記反応液を用いてそのままＴｍ解析を行い、前記多型をタイピングすることが可能となる。また、１つの反応液で、前記目的領域の増幅ならびに多型のタイピングが可能であることから、操作の自動化も可能になる。さらに、本発明のプライマーセットを用いれば、例えば、夾雑物が含まれる試料（例えば、全血や口腔粘膜等）であっても、前処理を省略できるため、より迅速且つ簡便に増幅反応を行うことができる。また、本発明のプライマーセットを用いれば、従来よりも優れた増幅効率で増幅反応が行えるため、増幅反応も短縮化が可能である。したがって、本発明のプライマーセットやこれを含む試薬、ならびにこれらを用いた増幅産物の製造方法および多型解析方法によれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の多型を迅速かつ簡便に解析できることから、医療分野においてきわめて有効といえる。
図１は、本発明の実施例１におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図２は、本発明の前記実施例１におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図３は、本発明の実施例２におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
＜ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセット＞
本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセットは、前述のように、前記プライマーセット（１）を含むことを特徴とする。このプライマーセット（１）によれば、前述のように、ＣＹＰ２Ｃ９＊３が発生する検出対象部位を含む目的領域を特異的且つ高効率で増幅することが可能である。このため、本発明のプライマーセットを用いてこの領域を増幅すれば、従来よりも効率良く、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子多型の解析を行うことができる。なお、以下、フォワードプライマーをＦプライマー、リバースプライマーをＲプライマーということがある。
前記プライマーセット（１）は、前述のように、下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセットである。
（Ｆ１）配列番号１の塩基配列における５２４６６番目のアデニン塩基（Ａ）を一塩基目として５’方向に向かって１４〜１８塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）配列番号１の塩基配列における５２６３１番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として３’方向に向かって１９〜３６塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記５２６３１番目のチミン塩基（Ｔ）に相補的なアデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
配列番号１に示す塩基配列は、ヒトチトクロームＰ４５０ファミリー２サブファミリーＣポリペプチド９（ＣＹＰ２Ｃ９）の完全長配列であり、例えば、ＮＣＢＩアクセッション：Ｎｏ．ＡＹ７０２７０６に登録されている。
前記プライマーセット（１）は、配列番号１における５２４６７番目〜５２６３０番目の領域を含むＤＮＡ鎖ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。この領域内の５２５２１番目の塩基（配列番号１における５２５２１番目の塩基）は、ＣＹＰ２Ｃ９の機能に影響を与える点突然変異（５２５２１Ａ、５２５２１Ｃ）の存在が知られており、この多型が、前述のＣＹＰ２Ｃ９＊３である。５２５２１番目の塩基がＡであれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子がタンパク質に翻訳された際、アミノ酸３５９位はイソロイシン（Ｉｌｅ）となり、５２５２１番目の塩基がＣであれば、アミノ酸３５９位はロイシン（Ｌｅｕ）となる多型を示す。本発明において、この部位の多型は、ホモ接合体の場合、５２５２１Ａ／Ａ、５２５２１Ｃ／Ｃ、ヘテロ接合体の場合、５２５２１Ａ／Ｃで表すことができる。以下、このプライマーセット（１）を、「ＣＹＰ２Ｃ９＊３用プライマーセット」ともいう。
本発明において、プライマーセット（１）のＦ１プライマーおよびＲ１プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす３’末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このように前記プライマーの３’末端の塩基を固定することによって、プライマーセット（１）が、例えば、類似する他のアイソザイムの遺伝子（例えば、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ１７、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子等）に結合することを十分に防止することができる。
このように、Ｆ１プライマーおよびＲ１プライマーは、その３’末端の塩基が固定されていればよいことから、前記各プライマーの長さ自体は特に制限されず、一般的な長さに適宜調整することができる。プライマーの長さの一例としては、例えば、１３〜５０ｍｅｒの範囲であり、好ましくは１４〜４５ｍｅｒであり、より好ましくは１５〜４０ｍｅｒである。具体例として、前記Ｆ１プライマーは、配列番号１の塩基配列における５２４６６番目のアデニン塩基（Ａ）を一塩基目として５’方向に向かって１４〜１８塩基目（好ましくは、１４〜１７塩基目、より好ましくは１５〜１７塩基目）までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記Ｒ１プライマーは、配列番号１の塩基配列における５２６３１番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として３’方向に向かって１９〜３６塩基目（好ましくは、２２〜３０塩基目、より好ましくは２３〜２９塩基目）までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。なお、Ｆ１プライマーとＲ１プライマーの３’末端が固定されていることから、プライマーから伸長する領域は、例えば、前述のように配列番号１における５２４６７番目〜５２６３０番目の領域であるが、得られる増幅産物の全体の長さは使用するプライマーの長さに応じて変化する。
また、Ｒ１プライマーは、配列番号１に示す塩基配列に対して、Ｆ１プライマーは、前記塩基配列の相補鎖に対して、それぞれ完全に相補なオリゴヌクレオチドでなくともよい。すなわち、前記各プライマーにおける３’末端の塩基を除く部分において、完全に相補なオリゴヌクレオチドと１個〜５個の塩基が異なっていてもよい。
以下に、Ｆ１プライマーとＲ１プライマーの具体例を示すが、本発明は、これには限定されない。また、これらのＦ１プライマーとＲ１プライマーとの組み合わせは何ら制限されないが、これらの中でも、配列番号２または配列番号４のオリゴヌクレオチドからなるＦ１’プライマーと配列番号１４または配列番号１７のオリゴヌクレオチドからなるＲ１’プライマーとを含むプライマーセット（１’）が特に好ましい。なお、下記表における「Ｔｍ（℃）」は、下記表の配列と完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合のＴｍ（℃）であり、ＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）により、パラメーターをオリゴヌクレオチド濃度０．２μＭ、ナトリウム当量（Ｎａ ｅｑ．）５０ｍＭとして算出した値である。前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）等により算出でき、また、隣接法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）によって決定することもできる（以下、同様）。
Figure 2008066163
また、前述したプライマーセット（１）の各プライマーは、例えば、増幅反応の反応温度を上げるために、従来公知の任意の配列を５’末端に付加したものでもよい。
このようなプライマーセット（１）を含む本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセットは、例えば、全血試料等の生体試料におけるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を増幅させる際に使用することが好ましい。特に、本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセットを、後述するような多型の検出用プローブとともに使用する際には、遺伝子増幅用反応液における全血試料の添加割合を０．１〜０．５体積％とすることが好ましい。この点については、後述する。
＜ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用試薬＞
本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用試薬は、前述のように、遺伝子増幅法によりＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を増幅するための試薬であって、本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする。本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用試薬は、本発明のプライマーセットを含むことが特徴であり、これ以外の組成等については何ら制限されない。
本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用試薬は、例えば、本発明のプライマーセットを用いた遺伝子増幅法により得られる増幅産物を検出するために、さらにプローブを含んでもよい。前述のように本発明のプライマーセットによれば、遺伝子増幅法によって、ＣＹＰ２Ｃ９＊３の生じる検出対象部位を含む目的領域の増幅産物が得られる。このため、前記目的領域における検出対象配列に相補的なプローブを共存させることによって、例えば、増幅の有無や検出対象部位の遺伝子型（多型）等を、後述する方法によって検出することが可能である。このようなプローブやその利用方法に関しては、後の多型の解析方法において説明する。また、本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用試薬は、全血等の生体試料におけるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を増幅させる際に使用することが好ましく、特に、本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用試薬を、前述のようなプローブとともに使用する際には、遺伝子増幅用反応液における全血試料の添加割合を０．１〜０．５体積％とすることが好ましい。なお、本発明において、「検出対象配列」とは、多型が発生する部位（検出対象部位）を含む配列を意味する。
本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用試薬の形態は、特に制限されず、例えば、本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセットを含有する液体試薬でもよいし、使用前に溶媒で懸濁する乾燥試薬であってもよい。また、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセットの含有量も、特に制限されない。
＜増幅産物の製造方法＞
本発明の増幅産物の製造方法は、前述のように、遺伝子増幅法によりＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、下記（Ｉ）工程を含むことを特徴とする。
（Ｉ）試料中の核酸を鋳型として、本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、反応液中で、前記ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅を行う工程
このように本発明のプライマーセットを用いて増幅反応を行うことによって、前述のようにＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３の検出対象部位を含む目的領域を特異的に高効率で増幅させることができる。なお、本発明の増幅産物の製造方法においては、本発明のプライマーセットを使用することが特徴であって、遺伝子増幅法の種類や条件等は何ら制限されない。
前記遺伝子増幅法としては、前述のように特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法が好ましい。なお、以下、ＰＣＲ法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。
本発明を適用する試料としては、例えば、鋳型となる核酸配列を含んでいればよく、特に制限されないが、例えば、夾雑物が含まれる試料に適用することが好ましい。前記夾雑物が含まれる試料としては、例えば、全血、口腔内細胞（例えば、口腔粘膜）、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液（例えば、胃洗浄液）等や、それらの懸濁液等があげられる。本発明のプライマーセットを用いた増幅産物の製造方法によれば、例えば、様々な夾雑物が含まれる試料（特に、全血や口腔内細胞等の生体試料）であっても、その影響を受け難く、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の前記領域を特異的に増幅することができる。このため、本発明によれば、従来法では困難であった全血等の夾雑物の多い試料であっても、例えば、精製等の前処理を行うことなく、そのまま使用することが可能である。したがって、試料の前処理の観点からも、従来法よりさらに迅速に増幅産物を調製することが可能といえる。
前記反応液における試料の添加割合は、特に制限されない。具体例として、前記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、前記反応液における添加割合の下限が、例えば、０．０１体積％以上であることが好ましく、より好ましくは０．０５体積％以上、さらに好ましくは０．１体積％以上である。また、前記添加割合の上限も、特に制限されないが、例えば、２体積％以下が好ましく、より好ましくは１体積％以下、さらに好ましくは０．５体積％以下である。
また、後述するような光学的検出を目的とする場合、特に、標識化プローブを用いた光学的検出を行う場合、全血試料のような生体試料の添加割合は、例えば、０．１〜０．５体積％に設定することが好ましい。ＰＣＲ反応においては、通常、ＤＮＡ変性（一本鎖ＤＮＡへの解離）のために熱処理が施されるが、この熱処理によって試料に含まれる糖やタンパク質等が変性し、不溶化の沈殿物や濁り等が発生するおそれがある。このため、増幅産物の有無や検出対象部位の遺伝子型（多型）を光学的手法により確認する場合、このような沈殿物や濁りの発生が、測定精度に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、反応液における全血試料の添加割合を前述の範囲に設定すれば、メカニズムは不明であるが、例えば、変性による沈殿物等の発生を十分に防止することができるため、光学的手法による測定精度を向上できる。また、全血試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上することができる。したがって、本発明のプライマーセットの使用に加えて、さらに、全血試料等の試料の添加割合を前述の範囲に設定することによって、より一層、試料の前処理の必要性を排除できる。
また、前記反応液中の全血試料の割合は、前述のような体積割合（例えば、０．１〜０．５体積％）ではなく、ヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」という）の重量割合で表すこともできる。この場合、前記反応液における全血試料の割合は、Ｈｂ量に換算して、例えば、０．５６５〜１１３ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは２．８２５〜５６．５ｇ／Ｌの範囲、さらに好ましくは５．６５〜２８．２５μｇ／Ｌの範囲である。なお、前記反応中における全血試料の添加割合は、例えば、前記体積割合とＨｂ重量割合の両方を満たしてもよいし、いずれか一方を満たしてもよい。
全血としては、例えば、溶血した全血、未溶血の全血、抗凝固全血、凝固画分を含む全血等のいずれであってもよい。
本発明において、試料に含まれる標的核酸は、例えば、ＤＮＡである。前記ＤＮＡは、例えば、生体試料等の試料に元来含まれるＤＮＡでもよいし、遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物ＤＮＡであってもよい。後者の場合、前記試料に元来含まれているＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）から逆転写反応（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ））により生成させたｃＤＮＡがあげられる。
本発明の増幅産物の製造方法において、遺伝子増幅反応の開始に先立ち、前記反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、前述のような沈殿物や濁りの発生による影響をより一層低減することができ、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。具体的には、前記（Ｉ）工程の増幅反応や、一本鎖ＤＮＡへの解離工程前に、アルブミンを添加することが好ましい。
前記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１〜２重量％の範囲であり、好ましくは０．１〜１重量％であり、より好ましくは０．２〜０．８重量％である。前記アルブミンとしては、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等があげられ、これらはいずれか一種類でもよいし二種類以上を併用してもよい。
つぎに、本発明の増幅産物の製造方法に関し、全血試料について、ＤＮＡを標的核酸とし、本発明のプライマーセットを用いたＰＣＲによりＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の前記目的領域の増幅産物を製造する例をあげて説明する。なお、本発明は、本発明のプライマーセットを使用することが特徴であり、他の構成ならびに条件は何ら制限されない。
まず、ＰＣＲ反応液を調製する。本発明のプライマーセットの添加割合は、特に制限されないが、プライマーセット（１）のＦプライマーを、０．１〜２μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。また、プライマーセット（１）のＲプライマーを、０．１〜２μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。プライマーセットにおけるＦプライマーとＲプライマーとの添加割合（Ｆ：Ｒ、モル比）は、特に制限されないが、例えば、１：０．２５〜１：４が好ましく、より好ましくは１：０．５〜１：２である。
反応液における全血試料の割合は、特に制限されないが、前述の範囲が好ましい。全血試料は、そのまま反応液に添加してもよいし、予め、水や緩衝液等の溶媒で希釈してから反応液に添加してもよい。全血試料を予め希釈する場合、その希釈率は特に制限されず、例えば、反応液での最終的な全血添加割合が前記範囲となるように設定できるが、例えば、１００〜２０００倍であり、好ましくは２００〜１０００倍である。
前記反応液における他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分があげられ、その割合も特に制限されない。前記組成成分としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド（ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ））および溶媒があげられる。また、前述のように前記反応液はさらにアルブミンを含有することが好ましい。なお、前記反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ ９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ ９２／９６８８）（Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ ４５５ ４３０）（商標Ｖｅｎｔ：Ｂｉｏｌａｂ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
前記反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されないが、例えば、１〜１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは２０〜３０Ｕ／ｍＬである。なお、ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍＭ ＴＡＰＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭメルカプトエタノール、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＴＴＰ、１００μＭ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
前記溶媒としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝液があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
また、前記ＰＣＲ反応液は、さらに、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。
反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、使用する機器（サーマルサイクラー）等に応じて適宜決定できるが、通常、１〜５００μＬであり、好ましくは１０〜１００μＬである。
つぎに、ＰＣＲを行う。ＰＣＲのサイクル条件は特に制限されないが、例えば、（１）全血由来二本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの解離、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長（ポリメラーゼ反応）は、それぞれ以下の通りである。また、サイクル数も特に制限されないが、下記（１）〜（３）の３ステップを１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されないが、例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。本発明のプライマーセットを使用した場合、前述のように増幅効率に優れるため、従来の方法によれば５０サイクルに３時間程度を要していたのに対して、本発明によれば、約１時間程度（好ましくは１時間以内）で５０サイクルを完了することも可能である。
Figure 2008066163
以上のようにして、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＣＹＰ２Ｃ９＊３の検出対象部位を含む領域に相補的な増幅産物を製造することができる。
本発明の増幅産物の製造方法は、さらに、前述の増幅反応によって前記増幅産物を検出する工程を含んでもよい。これによって、増幅産物の有無や、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の前記目的領域における遺伝子型（多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３）を検出することもできる。増幅産物の有無は、従来公知の方法により確認できる。具体的には、例えば、前記（Ｉ）工程において、前記反応液に、さらに、前記目的領域における検出対象配列に相補的な配列である蛍光標識化プローブを添加しておき、さらに、（II）工程として、前記反応液について、前記プローブにおける蛍光標識の蛍光強度を測定することによって確認できる。なお、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３の検出については、本発明の一形態として、以下に説明する。
＜ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の多型解析方法＞
本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の多型解析方法は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における検出対象部位の多型（ＣＹＰ２Ｃ９＊３）を解析する方法であって、下記（ｉ）〜（iv）工程を含むことを特徴とする。
（ｉ）本発明の増幅産物の製造方法により、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における検出対象部位を含む領域を反応液中で増幅させる工程
（ii）前記（ｉ）工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブとを含む反応液を準備する工程
（iii）前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（iv）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定する工程
このように本発明のプライマーセットを用いて増幅産物の製造することによって、前述のようにＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３の検出対象塩基を含む領域を増幅することができる。
前記（ii）工程におけるプローブは、特に制限されず、多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３の発生部位を含む検出対象配列に相補的なプローブ（以下、「ＣＹＰ２Ｃ９＊３用プローブ」ともいう）があげられる。このプローブは、前記検出対象配列を含む検出対象配列に相補的なプローブであることが好ましい。
前記多型を検出するためのプローブは、特に制限されず、従来公知の方法によって設定できる。例えば、多型の検出対象部位を含む検出対象配列として、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のセンス鎖の配列に基づいて設計してもよいし、アンチセンス鎖の配列に基づいて設計してもよい。また、多型の検出対象部位の塩基は、多型の種類に応じて適宜決定できる。すなわち、ＣＹＰ２Ｃ９＊３は、配列番号１における５２５２１番目の塩基に「Ａ」および「Ｃ」の多型が知られていることから、例えば、５２５２１番目がＡである検出対象配列、および、５２５２１番目がＣである検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）や、そのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）があげられる。このように、多型が生じる検出対象部位の塩基を前述のようないずれかの塩基に設定してプローブを設計しても、後述するような方法により、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の検出対象部位においてどのような多型を示すかを判断することが可能である。
前記プローブは、前記（ｉ）工程の後、すなわち、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の目的領域について増幅反応を行った後、増幅反応液に添加することもできるが、容易且つ迅速に解析を行えることから、前記（ｉ）工程の増幅反応に先立って、予め反応液に添加しておくことが好ましい。
前記反応液におけるプローブの添加割合は、特に制限されないが、例えば、プローブを１０〜４００ｎｍｏｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜２００ｎｍｏｌである。また、プローブの標識として蛍光色素を用いている場合、例えば、検出する蛍光強度を調整するために、標識化プローブと同じ配列である未標識プローブを併用してもよく、この未標識プローブは、その３’末端にリン酸が付加されてもよい。この場合、標識化プローブと非標識プローブのモル比は、例えば、１：１０〜１０：１が好ましい。前記プローブの長さは、特に制限されず、例えば、５〜５０ｍｅｒであり、好ましくは１０〜３０ｍｅｒである。
Ｔｍ値について説明する。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
前記（iii）工程において、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナルの測定は、前述した、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定であってもよい。具体的には、前記プローブとして、標識物質で標識化された標識化プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸収波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。
前記標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、例えば、蛍光色素（蛍光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、蛍光色素（蛍光団）で標識された、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような、蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブとしては、中でも、オリゴヌクレオチドを３’末端もしくは５’末端がＣとなるように設計し、その末端のＣがＧに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で標識化したプローブが特に好ましい。このプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。
以下に、多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３を検出するためのプローブの配列の具体例を示すが、本発明は、これには制限されない。下記プローブは、センス鎖を検出するためのプローブである。
プローブ
配列番号１における５２５１６番目のグアニン塩基（Ｇ）を一塩基目として３’方向に向かって１７〜２２塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記グアニン塩基に相補的なシトシン塩基を３’末端とするオリゴヌクレオチド
前記プローブにおいて、配列番号１の５２５２１番目に相補的な塩基は、ｋで表され、前記ｋは、ＧまたはＴである。
さらに、前記プローブの具体例を下記表に示す。なお、下記表における「Ｔｍ（℃）」は、下記表の配列と完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合のＴｍ（℃）であり、ＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）により、パラメーターをオリゴヌクレオチド濃度０．２μＭ、ナトリウム当量（Ｎａ ｅｑ．）５０ｍＭとして算出した値である。
Figure 2008066163
前記表におけるプローブは、配列番号１における５２５１６番目がＣである領域に相補的な配列からなり、大文字の塩基が、配列番号１の５２５１６番目の塩基に相補的な塩基を示す。なお、前記プローブにおいて、前記大文字の塩基は、ｋに置き換えることができ、前記ｋは、ＧおよびＴのいずれでもよい。本発明におけるプローブの具体例としては、例えば、前述のように、前記表に示すオリゴヌクレオチドの相補鎖であってもよい。
前記プローブは一例であって、本発明はこれには限定されない。ＣＹＰ２Ｃ９用プローブとしては、前記プローブの中でも、配列番号２８または配列番号２９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。例えば、前記表に示すプローブをグアニン消光プローブとする場合、３’末端のシトシンを前述のような蛍光色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＴＡＭＲＡ等）で標識化することが好ましい。また、５’末端に蛍光色素を標識化したプローブは、例えば、プローブ自体が伸長することを予防するために、その３’末端に、さらにリン酸基が付加されてもよい。
次に、本発明の検出方法について、一例として、下記プローブを用いて、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３を検出する方法を説明する。なお、本発明はこれには制限されない。
（プローブ）
ＣＹＰ２Ｃ９＊３用プローブ
5'−gggagaaggtcaaggtatc−(BODIPY FL)−3' （配列番号２８）、または、
5'−ggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPY FL)−3' （配列番号２９）
まず、前記標識化プローブを添加した反応液を用いて、前述のようにＰＣＲを行い、反応液中で、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の前記目的領域を増幅させる。前記反応液は、例えば、本発明のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、鋳型となる核酸を含む試料、および、前記プローブを含む。この他に、核酸増幅に使用できる種々の添加剤を含んでもよい。
次に、得られた増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
そして、このＴｍ値から、検出対象部位における遺伝子型を決定する。Ｔｍ解析において、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、一塩基が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、一塩基が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、前記検出対象部位における遺伝子型を決定することができる。例えば、検出対象部位の塩基を変異型（例えば、配列番号１における５２５２１番目の塩基がＣ）と仮定し、それを含む検出対象配列に相補的なプローブを使用した場合、形成したハイブリッドのＴｍ値が、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、前記増幅産物の多型は、変異型と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補なハイブリッドのＴｍ値より低い値）であれば、前記増幅産物の多型は、野生型（例えば、配列番号１における５２５２１番目の塩基がＡ）と判断できる。さらに、両方のＴｍ値が検出された場合には、ヘテロ接合体と決定できる。このようにして、標識化プローブに対するＴｍ値から、多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３の遺伝子型を判断することができる。
また、本発明においては、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇させて（ハイブリッド形成体を加熱して）、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
被検者９人からヘパリンリチウム採血管を用いて採血を行った（サンプル１〜９）。得られた血液１０μＬと蒸留水９０μＬを混合し、さらに、この混合液１０μＬと蒸留水９０μＬとを混合した。これら混合液１０μＬを、下記組成のＰＣＲ反応液４０μＬに添加し、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および５２℃１０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５１５〜５５５ｎｍ（蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの検出）とした。なお、５０サイクルのＰＣＲに要した時間は、約１時間であった。
Figure 2008066163
（プローブ）
ＣＹＰ２Ｃ９＊３用プローブ
5'−gggagaaggtcaaggtatc−(BODIPY FL)−3' （配列番号２８）
（プライマーセット）
ＣＹＰ２Ｃ９＊３ Ｆ１プライマー
5'−gagcccctgcatgcaa−3' （配列番号４）
ＣＹＰ２Ｃ９＊３ Ｒ１プライマー
5'−gatactatgaatttggggacttcgaa−3' （配列番号１７）
ＣＹＰ２Ｃ９＊３用プローブとマッチするハイブリッドのＴｍ値は、５９℃、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は、５４℃である。
サンプル１〜９の結果を図１および２に示す。これらの図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフであり、縦軸の微分値は「−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」を示し、横軸は温度を示す（以下、同様）。同図に示すように、シグナルのピークから、各サンプルにおけるＣＹＰ２Ｃ９＊３の遺伝子型を決定した。これらの実施例の結果を裏付けるために、被検者９人について、ＲＦＬＰ法によって、ＣＹＰ２Ｃ９＊３の遺伝子型を確認した結果、実施例と同じ結果が得られた。このように、本発明のプライマーセットを使用することにより、前処理を施していない全血試料を使用して、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＣＹＰ２Ｃ９＊３の検出対象部位を含む目的領域を、特異的且つ効率良く増幅し、多型を解析することができた。
被検者２人からＥＤＴＡ採血管を用いて採血を行った（サンプル１〜２）。得られた血液１０μＬと下記希釈液Ａ ７０μＬとを混合し、さらに、この混合液１０μＬと下記希釈液Ｂ ７０μＬとを混合した。得られた混合液１０μＬを９５℃で５分間加熱処理した後、下記組成のＰＣＲ反応液４６μＬに添加し、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および５８℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から７５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、５１５〜５５５ｎｍ（蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの検出）とした。
（希釈液Ａ）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＮａＮ３、０．３％ ＳＤＳ
（希釈液Ｂ）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＮａＮ３
Figure 2008066163
（プローブ）
ＣＹＰ２Ｃ９＊３用プローブ
5'−ggagaaggtcaaggtatc−(BODIPY FL)−3' （配列番号２９）
（プライマーセット）
ＣＹＰ２Ｃ９＊３ Ｆ１プライマー
5'−cggagcccctgcatgcaa−3' （配列番号２）
ＣＹＰ２Ｃ９＊３ Ｒ１プライマー
5'−aatgatactatgaatttggggacttcgaa−3' （配列番号１４）
ＣＹＰ２Ｃ９＊３用プローブとマッチするハイブリッドのＴｍ値は、５６℃、ミスマッチのハイブリッドのＴｍ値は、５０℃である。
サンプル１〜２の結果を図３に示す。この図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフであり、縦軸の微分値は「−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」を示し、横軸は温度を示す。同図に示すように、シグナルのピークから、前記サンプルにおけるＣＹＰ２Ｃ９＊３の遺伝子型を決定した。この実施例の結果を裏付けるために、被検者２人について、ＲＦＬＰ法によって、ＣＹＰ２Ｃ９＊３の遺伝子型を確認した結果、実施例と同じ結果が得られた。このように、本発明のプライマーセットを使用することにより、前処理を施していない全血試料を使用して、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＣＹＰ２Ｃ９＊３の検出対象部位を含む目的領域を、特異的且つ効率良く増幅し、多型を解析することができた。
以上のように、本発明のプライマーセットによれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における多型ＣＹＰ２Ｃ９＊３が生じる部位を含む領域を、特異的に高効率で増幅することができる。このため、前述のような従来法とは異なり手間やコストを低減することが可能となる。また、このように多型の検出対象部位を含む領域が特異的に増幅されることから、例えば、前記検出対象部位を含む検出対象配列に相補的なプローブを使用することで、前記反応液を用いてそのままＴｍ解析を行い、前記多型をタイピングすることが可能となる。また、１つの反応液で増幅やタイピングが可能であることから、操作の自動化も可能になる。さらに、本発明のプライマーセットを用いれば、例えば、夾雑物が含まれる試料（例えば、全血や口腔粘膜等）であっても、前処理を省略できるため、より迅速且つ簡便に増幅反応を行うことができる。また、本発明のプライマーセットを用いれば、従来よりも優れた増幅効率で増幅反応が行えるため、増幅反応も短縮化が可能である。したがって、本発明のプライマーセットやこれを含む試薬、ならびにこれらを用いた増幅産物の製造方法によれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の多型を迅速かつ簡便に解析できることから、医療分野においてきわめて有効といえる。

Claims (18)

  1. 遺伝子増幅法によりＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を増幅するためのプライマーセットであって、
    下記プライマーセット（１）を含むことを特徴とするＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセット。
    プライマーセット（１）
    下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
    （Ｆ１）配列番号１の塩基配列における５２４６６番目のアデニン塩基（Ａ）を一塩基目として５’方向に向かって１４〜１８塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
    （Ｒ１）配列番号１の塩基配列における５２６３１番目のチミン塩基（Ｔ）を１塩基目として３’方向に向かって１９〜３６塩基目までの領域に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、前記５２６３１番目のチミン塩基（Ｔ）に相補的なアデニン塩基（Ａ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
  2. 前記（１）のプライマーセットが、下記（１’）のプライマーセットである、請求の範囲１記載のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセット。
    プライマーセット（１’）
    下記（Ｆ１’）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ１’）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
    （Ｆ１’）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
    （Ｒ１’）配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号１７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
  3. ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセットが、生体試料中のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を増幅するためのプライマーセットである、請求の範囲１記載のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセット。
  4. 前記生体試料が、全血である、請求の範囲３記載のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセット。
  5. 遺伝子増幅法によりＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を増幅するための試薬であって、請求の範囲１記載のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とするＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用試薬。
  6. さらに、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブを含む、請求の範囲５記載のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用試薬。
  7. 前記プローブが、下記（Ｐ１’）に示すオリゴヌクレオチドからなるプローブである、請求の範囲６記載のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用試薬。
    （Ｐ１’）配列番号２８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号２９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
  8. 前記プローブが、蛍光標識化プローブである、請求の範囲６記載のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用試薬。
  9. 遺伝子増幅法によりＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、
    下記（Ｉ）工程を含むことを特徴とする増幅産物の製造方法。
    （Ｉ）試料中の核酸を鋳型として、請求の範囲１記載のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、反応液中で、前記ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅を行う工程
  10. 前記（Ｉ）工程において、前記反応液に、さらに、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブを添加する、請求の範囲９記載の増幅産物の製造方法。
  11. 前記プローブが、下記（Ｐ１’）に示すオリゴヌクレオチドからなるプローブである、請求の範囲１０記載の増幅産物の製造方法。
    （Ｐ１’）配列番号２８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号２９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
  12. 前記プローブが、蛍光標識化プローブである、請求の範囲１０記載の増幅産物の製造方法。
  13. さらに、下記（II）工程を含む、請求の範囲１２記載の増幅産物の製造方法。
    （II）前記反応液について、前記蛍光標識化プローブにおける蛍光標識の蛍光強度を測定する工程
  14. 前記試料が、生体試料である、請求の範囲９記載の増幅産物の製造方法。
  15. 前記生体試料が、全血である、請求の範囲１４記載の増幅産物の製造方法。
  16. 前記反応液における全血試料の添加割合が、０．１〜０．５体積％である、請求の範囲１５記載の増幅産物の製造方法。
  17. ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における検出対象部位の多型を解析する方法であって、
    下記（ｉ）〜（iv）工程を含むことを特徴とする多型解析方法。
    （ｉ）請求の範囲９記載の増幅産物の製造方法により、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における検出対象部位を含む領域を反応液中で増幅させる工程
    （ii）前記（ｉ）工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブとを含む反応液を準備する工程
    （iii）前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
    （iv）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定する工程
  18. 前記（ｉ）工程において、増幅反応に先立って、前記反応液に、前記検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブを添加する、請求の範囲１７記載の多型解析方法。
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