WO2008066163A1 - Ensemble d'amorces utilisé dans l'amplification du gène cyp2c9, réactif utilisé dans l'amplification du gène cyp2c9, et son utilisation - Google Patents

Ensemble d'amorces utilisé dans l'amplification du gène cyp2c9, réactif utilisé dans l'amplification du gène cyp2c9, et son utilisation Download PDF

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WO2008066163A1
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WO
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probe
amplification
cyp2c9
cyp2c9 gene
primer set
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PCT/JP2007/073206
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French (fr)
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Mitsuharu Hirai
Satoshi Majima
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Arkray, Inc.
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Publication date
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • CYP2C9 gene amplification primer set CYP2C9 gene amplification primer set, CYP2C9 gene amplification reagent containing the same, and use thereof
  • the present invention relates to a primer set for amplifying a CYP2C9 gene, a CYP2 C9 gene amplification reagent containing the same, and a use thereof.
  • Cytochrome P450 is a group of enzymes classified into a superfamily, and there are many subfamilies (for example, CYP1A, CYP1B, CYP2C, CYP2D, CYP2E, CYP3A, etc.).
  • mutations in the gene encoding CYP2C9 (CYP2C9 gene), an isozyme of the human CYP2C subfamily, are related to the pharmacokinetics of phenytoin (anti-tension, anti-coagulant) and ⁇ rufaline (anticoagulant), which are CYP2C9 substrate drugs. It is clear that the effect is affected.
  • CYP2C9 * 3 which is a polymorphism of the CYP2C9 gene, is known as a mutation in which isoleucine at amino acid position 359 (exon 7) is changed to leucine (Non-patent Document 1).
  • the CYP2C9 * 3 amino acid position 359 is a recognition site for the substrate drug, and the amino acid changes to change the three-dimensional structure (/ 3-strand). Is affecting the function of. Therefore, examining the polymorphism CYP2C9 * 3 for the CYP2C9 gene is extremely important in order to predict side effects caused by drugs and to determine the administration conditions for drugs that have better effects.
  • a region corresponding to the sequence to be detected is amplified by PCR, and the amplified product is cleaved with restriction enzymes that have different cleaving actions depending on the presence or absence of the target mutation in the sequence to be detected.
  • restriction enzymes that have different cleaving actions depending on the presence or absence of the target mutation in the sequence to be detected.
  • ASP-PCR which performs PCR using primers with the target mutation located in the 3 'end region, and judges mutations based on the presence or absence of amplification.
  • Tm melting temperature
  • the hybrid is subjected to heat treatment, and the dissociation (melting) of the hybrid with an increase in temperature is detected by the change in signal such as absorbance. Then, by determining the Tm value based on this detection result, it is a method for determining the presence or absence of sudden point change.
  • a Tm value evaluation reference value
  • a hybrid of a detection target sequence containing a point mutation and a complementary probe thereto is obtained in advance for a hybrid of a detection target sequence containing a point mutation and a complementary probe thereto, and the target single-stranded DNA of the detection sample is compared with the probe. Measure the Tm value (measured value).
  • the measured value is the same as the evaluation reference value, it can be determined that there is a match, that is, a point mutation in the target DNA. If the measured value is lower than the evaluation reference value, a mismatch, that is, a point mutation in the target DNA. Can be determined not to exist. According to this method, gene analysis can be automated.
  • Non-Patent Document 1 PMID: 8873220 Pharmacogenetics. 1996 Aug; 6 (4): 34 1-9.
  • an object of the present invention is to provide a primer set that can specifically and efficiently amplify a target region of a CYP2C9 gene by a gene amplification method.
  • the primer set of the present invention comprises
  • a primer set for amplifying the P2C9 gene comprising the following primer set (1):
  • a pair of primer sets including a forward primer composed of the oligonucleotide (F1) below and a reverse primer composed of the oligonucleotide (R1) below
  • the 52466th adenine base (A) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 is directed to the 5 'direction as the first base, ie 14 to; at least one of the same sequence as the region up to the 18th base
  • the 52631th thymine base (T) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 is at least one oligonucleotide complementary to the region from the 19th to the 36th base in the 3 'direction with the first base as the first base.
  • the gene amplification reagent of the present invention is a reagent for amplifying the CYP2C9 gene by a gene amplification method, and is characterized by including the CYP2C9 gene amplification primer set of the present invention.
  • the method for producing an amplification product of the present invention is a method for producing an amplification product of the CYP2C9 gene by a gene amplification method, which comprises the following step (I).
  • the polymorphism analysis method of the present invention is a method for analyzing a polymorphism at a site to be detected in the CYP2C9 gene, and includes the following steps (i) to (iv).
  • the ability to specifically and efficiently amplify a target region including a site where a polymorphism CYP2C9 * 3 for detection in the CYP2C9 gene is generated can be achieved. .
  • the region including the detection target site where CYP2C9 * 3 is generated can be specifically amplified in this manner, for example, by using a probe complementary to the detection target sequence including the detection target site, The polymorphism can be typed by performing Tm analysis as it is using the reaction solution.
  • the target region can be amplified and polymorphic typing can be performed with one reaction solution, the operation can be automated.
  • the primer set of the present invention is used, for example, even a sample containing contaminants (for example, whole blood, oral mucosa, etc.), pretreatment can be omitted, so that an amplification reaction can be performed more quickly and easily. It can be carried out. Further, if the primer set of the present invention is used, an amplification reaction can be performed with an amplification efficiency superior to that of the prior art, so that the amplification reaction can be shortened. Therefore, according to the primer set of the present invention, the reagent containing the primer set, the production method of the amplification product using them, and the polymorphism analysis method, the polymorphism of the CYP2C9 gene is detected. It can be said that it is extremely effective in the medical field because it can be analyzed quickly and easily. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 is a graph showing the results of Tm analysis in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Tm analysis in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Tm analysis in Example 2 of the present invention.
  • the CYP2C9 gene amplification primer set of the present invention includes the primer set (1).
  • this primer set (1) as described above, it is possible to amplify the target region including the detection target site where CYP2C9 * 3 is generated specifically and efficiently. Therefore, if this region is amplified using the primer set of the present invention, CYP2C9 gene polymorphism can be analyzed more efficiently than before.
  • the forward primer may be referred to as F primer and the reverse primer as R primer.
  • the primer set (1) is a pair of primer sets including a forward primer composed of the following oligonucleotide (F1) and a reverse primer composed of the following oligonucleotide (R1).
  • the 52466th adenine base (A) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 is directed to the 5 'direction as the first base, ie 14 to; at least one of the same sequence as the region up to the 18th base
  • the 52631th thymine base (T) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 is at least one oligonucleotide complementary to the region from the 19th to the 36th base in the 3 'direction with the first base as the first base.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the full-length sequence of human cytochrome P450 family 2 subfamily C polypeptide 9 (CYP2C9).
  • NCBI accession: No. A ⁇ 702706 ⁇ has been registered! / RU
  • the primer set (1) is a primer set for amplifying a DNA strand containing the region from region 52467 to region 52630 in IJ No. 1 and its complementary strand.
  • the 52521st base in this region (52521st base in SEQ ID NO: 1) is known to have a point mutation (52521A, 52521C) that affects the function of CYP2 C9. It is CYP2C9 * 3 mentioned above.
  • the polymorphism at this site can be represented by 52521A / A and 52521 C / C in the case of a homozygote and 52521A / C in the case of a heterozygote.
  • this primer set (1) is also referred to as “primer set for CYP2C9 * 3”.
  • the F1 primer and the R1 primer of the primer set (1) only need to satisfy the above-described conditions for the 3 ′ terminal base that plays a role in determining the starting point of amplification by DNA polymerase. .
  • the primer set (1) binds to, for example, other similar isozyme genes (for example, CYP2C8, CYP2C17, CYP2C18, CYP2C19 genes, etc.). Can be sufficiently prevented.
  • the length of each primer is not particularly limited, and is appropriately set to a general length. Can be adjusted.
  • the length of a primer it is the range of 13-50mer, for example, Preferably it is 14-45mer, More preferably, it is 15-40mer.
  • the F1 primer is directed to the 5 ′ direction from the 52466th adenine base (A) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the 5 ′ direction; the 18th base (preferably, the 14th base; It is preferably at least one oligonucleotide having the same sequence as the region from the 17th base, more preferably from 15 to the 17th base).
  • the R1 primer is directed in the 3 ′ direction with the 52631st thymine base (T) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 as the first base, the 19th to 36th base (preferably the 22th to 30th base).
  • the extension region is the force of the 52467th to 52630th region in IJ No. 1 as described above.
  • the total length of the amplification product obtained varies depending on the length of the primer used. .
  • the R1 primer may not be an oligonucleotide that is completely complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the F1 primer is not completely complementary to the complementary strand of the base sequence. That is, in the portions other than the 3 ′ terminal base in each primer, the completely complementary oligonucleotide and 1 to 5 bases may be different.
  • F1 primer and R1 primer The present invention is not limited to this. Further, the combination of these F1 primer and R1 primer is not limited at all, but among these, the F1 ′ primer comprising the oligonucleotide of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 17 Particularly preferred is a primer set (1 ') comprising R1' primer.
  • T m (° C) is the Tm (° C.) when the sequence shown in the table below and a completely complementary sequence are hybridized.
  • MELTCALC software http: //www.meltcalc com /
  • the parameters were calculated with the oligonucleotide concentration of 0 ⁇ 2 2 and the sodium equivalent (Na eq.) 50 mM.
  • the Tm value can be calculated by, for example, conventionally known MELTCALC software (http://www.meltcalc.com/) or the like, and can also be determined by a neighbor method (hereinafter the same).
  • Each primer of the primer set (1) described above may be, for example, one having a conventionally known arbitrary sequence added to the 5 'end in order to increase the reaction temperature of the amplification reaction.
  • the CYP2C9 gene amplification primer set of the present invention including such a primer set (1) is preferably used when, for example, a CYP2C9 gene is amplified in a biological sample such as a whole blood sample.
  • a biological sample such as a whole blood sample.
  • the CYP2C9 gene amplification primer set of the present invention is used together with a polymorphism detection probe as described later, the addition ratio of the whole blood sample in the reaction solution for gene amplification is 0. 5% by volume is preferable. This point will be described later.
  • the CYP2C9 gene amplification reagent of the present invention is a reagent for amplifying the CYP2C9 gene by the gene amplification method, and includes the CYP2C9 gene amplification primer set of the present invention.
  • the CYP2C9 gene amplification reagent of the present invention is characterized by including the primer set of the present invention, and the composition other than this is not limited at all.
  • the CYP2C9 gene amplification reagent of the present invention uses, for example, the primer set of the present invention.
  • a probe may be further included.
  • an amplification product of a target region including a detection target site where CYP2C9 * 3 occurs can be obtained by gene amplification. Therefore, by coexisting a probe complementary to the detection target sequence in the target region, for example, the presence / absence of amplification and the genotype (polymorphism) of the detection target site can be detected by the method described later. Is possible.
  • the CYP2C9 gene amplification reagent of the present invention is preferably used when amplifying the CYP2C9 gene in a biological sample such as whole blood.
  • the CYP2C9 gene amplification reagent of the present invention is used as described above.
  • the addition rate of the whole blood sample in the reaction solution for gene amplification is preferably 0.1 to 0.5% by volume.
  • the “detection target sequence” means a sequence including a site where a polymorphism occurs (detection target site).
  • the form of the CYP2C9 gene amplification reagent of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a liquid reagent containing the CYP2C9 gene amplification primer set of the present invention, or may be dried by suspending in a solvent before use. It may be a reagent.
  • the content of the primer set for CYP2C9 gene amplification is not particularly limited.
  • the method for producing an amplification product of the present invention is a method for producing an amplification product of the CYP2C9 gene by gene amplification, and includes the following step (I).
  • the target region including the site to be detected for polymorphism CYP2C9 * 3 in the CYP2C9 gene is specifically and efficiently amplified as described above. be able to.
  • the production method of the amplification product of the present invention is characterized by using the primer set of the present invention, and the type and conditions of the gene amplification method are not limited at all.
  • the gene amplification method is not particularly limited as described above.
  • PCR Polym erase Chain Reaction
  • NASBA Nucleic acid sequence based amp
  • TMA Transcription—mediated amplification
  • SDA String and Displacement Amplification
  • the sample to which the present invention is applied is not particularly limited as long as it contains a nucleic acid sequence having a cage shape, for example, but is preferably applied to a sample containing impurities, for example.
  • Samples containing the contaminants include, for example, whole blood, oral cells (eg, oral mucosa), somatic cells such as nails and hair, germ cells, sputum, amniotic fluid, paraffin-embedded tissue, urine, gastric fluid (eg, For example, gastric lavage fluid) and suspensions thereof.
  • gastric fluid eg, For example, gastric lavage fluid
  • the method for producing an amplification product using the primer set of the present invention for example, even a sample containing various contaminants (particularly, biological samples such as whole blood and oral cells) is affected by the influence.
  • This region of the difficult CYP2C9 gene can be specifically amplified. Therefore, according to the present invention, even a sample having a large amount of contaminants such as whole blood, which has been difficult with the conventional method, can be used as it is without performing pretreatment such as purification. . Therefore, it can be said that the amplification product can be prepared more rapidly than the conventional method from the viewpoint of sample pretreatment.
  • the addition ratio of the sample in the reaction solution is not particularly limited.
  • the lower limit of the addition ratio in the reaction solution is preferably 1S, for example, 0.01% by volume or more, more preferably 0.05 volume. % Or more, more preferably 0.1% by volume or more.
  • the upper limit of the addition ratio is not particularly limited, but is preferably 2% by volume or less, more preferably 1% by volume or less, and still more preferably 0.5% by volume or less.
  • the addition ratio of a biological sample such as a whole blood sample is, for example, 0. It is preferably set to 1 to 0.5% by volume.
  • heat treatment is usually applied for DNA denaturation (dissociation into single-stranded DNA). This heat treatment denatures sugars and proteins contained in the sample, resulting in insoluble precipitates and turbidity. May occur. For this reason, when the presence or absence of amplification products and the genotype (polymorphism) of the site to be detected are confirmed by optical methods, the occurrence of such precipitates and turbidity may affect the measurement accuracy.
  • the addition ratio of the whole blood sample in the reaction solution is set within the above range.
  • the mechanism is unknown, for example, the generation of precipitates and the like due to denaturation can be sufficiently prevented, so that the measurement accuracy by an optical method can be improved.
  • the amplification efficiency can be further improved. Therefore, in addition to the use of the primer set of the present invention, the necessity for pretreatment of the sample can be further eliminated by setting the addition ratio of the sample such as the whole blood sample within the above-mentioned range.
  • the ratio of the whole blood sample in the reaction solution, the volume fraction as described above (e.g., 0.1;! ⁇ 0.5 volume 0/0), the nag hemoglobin (hereinafter, referred to as "Hb") can also be expressed as a weight ratio.
  • the ratio of the whole blood sample in the reaction solution is preferably in the range of, for example, 0.565 to 113 g / L, more preferably (converted to 2.825-55.5 g / L) in terms of Hb amount. More preferably, it is in the range of 5.65-28.25 g / L
  • the addition rate of the whole blood sample in the reaction may satisfy both the volume ratio and the Hb weight ratio, for example. However, either one may be satisfied.
  • the whole blood may be, for example, hemolyzed whole blood, unhemolyzed whole blood, anticoagulated whole blood, whole blood containing a coagulated fraction, or the like!
  • the target nucleic acid contained in the sample is, for example, DNA.
  • the DNA may be, for example, DNA originally contained in a sample such as a biological sample, or may be amplification product DNA amplified by a gene amplification method. In the latter case, cDNA generated by reverse transcription reaction (for example, RT-PCR (Reverse Transcription PCR)) from RNA (total RNA, mRNA, etc.) originally contained in the sample can be mentioned.
  • RT-PCR Reverse Transcription PCR
  • albumin it is preferable to add albumin to the reaction solution prior to the start of the gene amplification reaction.
  • albumin for example, it is possible to further reduce the influence of the generation of precipitates and turbidity as described above, and to further improve the amplification efficiency.
  • albumin it is preferable to add albumin before the amplification reaction in the step (I) or the dissociation step into single-stranded DNA.
  • the addition ratio of albumin in the reaction solution is, for example, in the range of 0.0;! To 2% by weight, preferably 0 .;! To 1% by weight, and more preferably 0.2 to 0%. 8% by weight.
  • the albumin is not particularly limited, and examples thereof include ushi serum albumin (BSA), human serum There are albumin, rat serum albumin, horse serum albumin, etc. These may be used alone or in combination of two or more! /.
  • the amplification product of the target region of the CYP2C9 gene is produced by PCR using the primer set of the present invention, using DNA as the target nucleic acid for the whole blood sample.
  • An example will be described.
  • the present invention is characterized by using the set of primers of the present invention, and other configurations and conditions are not limited at all.
  • the addition ratio of the primer set of the present invention is not particularly limited, but it is more preferable that the F primer of the primer set (1) is added so as to be 0 ⁇ 1 to 2 ⁇ 11101 /. 25-1. 5 11101 /, and particularly preferably 0.5 to 1 11101 /. Further, it is preferable to add the R primer of the primer set (1) so as to be 0.1 to 21110 1 / L, more preferably 0.25-1 S mol / L, and particularly preferable. Is between 0 ⁇ 5 and 1 ⁇ 11101 /.
  • the addition ratio (F: R, molar ratio) of the F primer and R primer in the primer set is not particularly limited, but is preferably, for example, 1: 0.25 to 1: 4, more preferably 1: 0. 5 ⁇ ; 1: 2.
  • the ratio of the whole blood sample in the reaction solution is not particularly limited, but the above-mentioned range is preferable.
  • the whole blood sample may be added to the reaction solution as it is, or it may be diluted with a solvent such as water or buffer in advance and then added to the reaction solution.
  • the dilution rate is not particularly limited.
  • the power can be set so that the final whole blood addition ratio in the reaction solution falls within the above range. It is 2000 times, preferably (it is 200 to 000 times).
  • composition components in the reaction solution are not particularly limited, and examples thereof include conventionally known components, and the ratios thereof are not particularly limited.
  • the composition component include DNA polymerase, nucleotide (nucleoside triphosphate (dNTP)), and solvent.
  • the reaction solution preferably further contains albumin. Note that the order of addition of each composition component is not limited at all to the reaction solution! /.
  • the DNA polymerase is not particularly limited, and for example, a conventionally known polymerase derived from a thermostable bacterium can be used. Specific examples include DNA polymerase from Thermus aayaticus (US Pat. Nos. 4, 889, 818 and 5, 079, 352) (trade name Taa polymerase), DNA polymerase derived from Thermus thermophilus (WO 91/09950) (rTth DNA polymerase), DNA polymerase derived from Pyrococcus (WO 9)
  • thermostable DNA polymerase from Thermus aauaticus is preferred! / ⁇
  • the addition rate of the DNA polymerase in the reaction solution is not particularly limited, but is, for example, 1 to 100 U / mL, preferably 5 to 50 U / mL, more preferably 20 to 30 U / mL. It is.
  • the DNA polymerase activity unit (U) is generally an acid-insoluble precipitate of activated salmon sperm DNA as a saddle primer and lOnmol of all nucleotides in a reaction solution for activity measurement at 74 ° C for 30 minutes.
  • S1U which is the active power to be taken into
  • 25 mM TAPS buffer pH 9.3, 25.C
  • 50 mM KC1 2 mM MgCl
  • ImM menorecaptoethanolate 200 ⁇ M dATP, 200 ⁇ M dGTP.
  • nucleoside triphosphate examples include dNTP (dATP, dCTP, dTTP).
  • the addition rate of dNTP in the reaction solution is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 1 mmol / L, preferably 0.05 to 0.5 mmol / L, and more preferably 0 to! Measure with ⁇ 0.3mmolZL.
  • Examples of the solvent include buffers such as Tris-HCl, Tricine, MES, MOPS, HEPES, and CAPS. Commercially available buffers for PCR, buffers for commercially available PCR kits, and the like can be used. .
  • the PCR reaction solution further contains heparin, betaine, KC1, MgCl, MgSO, glycerin.
  • the ratio of addition of cerol and the like may be set within a range not inhibiting the PCR reaction, for example.
  • the total volume of the reaction liquid is not particularly limited.
  • the apparatus used thermal cycler
  • the force that can be appropriately determined according to the above is usually 1 to 500, preferably 10 to 100.
  • PCR cycle conditions are not particularly limited.
  • (1) dissociation of double-stranded DNA from whole blood into single-stranded DNA, (2) primer annealing, and (3) primer extension (polymerase reaction) are as follows.
  • the number of cycles is not particularly limited, but the following three steps (1) to (3) are considered as one cycle, and for example, 30 cycles or more are preferable.
  • the upper limit is not particularly limited.
  • the total is 100 cycles or less, preferably 70 cycles or less, and more preferably 50 cycles or less.
  • the temperature change at each step may be automatically controlled using, for example, a thermal cycler.
  • the primer set of the present invention is used, the amplification efficiency is excellent as described above. Therefore, according to the conventional method, about 3 hours were required for 50 cycles, whereas according to the present invention, about 1 It is possible to complete 50 cycles in about an hour (preferably within 1 hour).
  • an amplification product complementary to the region containing the CYP2C9 * 3 detection target site in the CYP2C9 gene can be produced.
  • the method for producing an amplification product of the present invention may further include a step of detecting the amplification product by the amplification reaction described above.
  • This makes it possible to detect the presence or absence of an amplification product and the genotype (polymorphism CYP2C9 * 3) in the target region of the CYP2C9 gene.
  • the presence or absence of the amplification product can be confirmed by a conventionally known method.
  • a fluorescent labeled probe which is a sequence complementary to the detection target sequence in the target region is further added to the reaction solution, and further (II ) Step, measuring the fluorescence intensity of the fluorescent label in the probe for the reaction solution.
  • the detection of polymorphism CYP2C9 * 3 in the CYP2C9 gene will be described below as an embodiment of the present invention.
  • the CYP2C9 gene polymorphism analysis method of the present invention is a method for analyzing a polymorphism (CYP2C9 * 3) of a site to be detected in the CYP2C9 gene, comprising the following steps (i) to (iv): To do.
  • the probe in the step (ii) is not particularly limited, and a probe complementary to the detection target sequence containing the polymorphic CYP2C9 * 3 generation site (hereinafter also referred to as "CYP2C9 * 3 probe") is used. can give.
  • This probe is preferably a probe complementary to the detection target sequence including the detection target sequence.
  • the probe for detecting the polymorphism is not particularly limited, and can be set by a conventionally known method.
  • the detection target sequence including the polymorphic detection target site may be designed based on the sense strand sequence of the CYP2C9 gene, or may be designed based on the antisense strand sequence.
  • the base of the polymorphism detection target site can be appropriately determined according to the type of polymorphism.
  • CYP2C9 * 3 is known to have a polymorphism of “A” and “C” in the 52521 th base in IJ number 1, for example, the detection target sequence in which 52521nd is A, And complementary to one of the detection target sequences in which 52521st position is C Probe (sense strand detection probe) and a probe complementary to the antisense strand sequence (antisense strand detection probe).
  • the probe is designed by setting the base of the detection target site where polymorphism occurs to any of the bases as described above, any method in the CYP2C9 gene detection target site can be performed by the method described later. It is possible to determine the force indicating polymorphism.
  • the probe can be added to the amplification reaction solution after the step (i), that is, after the amplification reaction is performed on the target region of the CYP2C9 gene, and can be easily and quickly analyzed. Therefore, prior to the amplification reaction in the step (i), it is preferably added in advance to the reaction solution.
  • the addition ratio of the probe in the reaction solution is not particularly limited! /, But for example, it is preferable to add the probe in a range of 10 to 400 nmol, more preferably 20 to 200 nmol. It is.
  • this unlabeled probe may be used in combination with an unlabeled probe having the same sequence as the labeled probe in order to adjust the fluorescence intensity to be detected. May have phosphoric acid added to its 3 'end.
  • the molar ratio of the labeled probe to the unlabeled probe is preferably, for example, 1:10 to 10: 1.
  • the length of the probe is not particularly limited, and is, for example, 5 to 50 mer, preferably 10 to 30 mer.
  • the Tm value will be described. As the solution containing double-stranded DNA is heated, the absorbance at 260 nm increases. This is because hydrogen bonds between both strands in double-stranded DNA are unwound by heating and dissociated into single-stranded DNA (DNA melting). When all double-stranded DNA is dissociated into single-stranded DNA, the absorbance is about 1.5 times the absorbance at the start of heating (absorbance of double-stranded DNA alone). Therefore, it can be judged that melting has been completed. Based on this phenomenon, the melting temperature Tm is generally defined as the temperature at which the absorbance reaches 50% of the total increase in absorbance.
  • the measurement of the signal indicating the fusion state of the hybrid product of the amplification product and the probe may be performed by measuring the absorbance at 260 nm as described above. It may be a signal measurement.
  • a labeled probe labeled with a labeling substance is used as the probe, and the signal of the labeling substance can be measured.
  • the labeled probe include a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybrid formation, or a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization. If the probe is like the former, it forms a hybrid (double-stranded DNA) with the sequence to be detected!
  • Specific examples of the labeling substance in the labeled probe include, for example, fluorescent dyes (fluorophores).
  • a probe labeled with a fluorescent dye fluorophore
  • the oligonucleotide is designed so that the 3 'end or 5' end is C, and light emission occurs when the C at the end approaches G.
  • a probe labeled with a fluorescent dye that weakens This probe is generally called a guanine quenching probe and is known as a so-called QProbe (registered trademark). If such a probe is used, it is possible to easily confirm hybridization and dissociation with the force S due to signal fluctuation.
  • the fluorescent dye is not particularly limited, and examples thereof include fluorescein, phosphor, rhodamine, polymethine dye derivatives and the like, and commercially available fluorescent dyes include, for example, BODIPY FL (trademark, Molecular 'Probe Co., Ltd.). ), FluorePrime (trade name, manufactured by Amersham Almacia), Fluoredite (trade name, manufactured by Millipore), FAM (manufactured by ABI), Cy 3 and Cy5 (manufactured by Amersham Almacia), TAMRA (manufactured by Molecular Probes) ) Etc.
  • the detection conditions are not particularly limited, and can be appropriately determined depending on the fluorescent dye used.
  • Pacific Blue has a detection wavelength of 450 to 480 nm
  • TAMRA has a detection wavelength of 585 to 700 nm
  • BODIPY FL has a detection wavelength of 515.
  • Detectable at ⁇ 555nm Specific examples of probe sequences for detecting polymorphism CYP2C9 * 3 are shown below, but the present invention is not limited thereto.
  • the following probes are probes for detecting the sense strand.
  • the 52521st base complementary to SEQ ID NO: 1 is represented by k, and the k is G or T.
  • Tm (° C) in the following table is the Tm (° C) when the sequence shown in the table below and a completely complementary sequence are hybridized, and MELTCALC software (http: //www.meltcalc. com /), parameter 1 was calculated as an oligonucleotide concentration of 0.2 ⁇ 2 ⁇ and a sodium equivalent (Na eq.) of 50 mM.
  • the probe in the above table is composed of a sequence complementary to the region where the 52516th position in SEQ ID NO: 1 is C, and the capital letter base indicates the base complementary to the 52516th base in SEQ ID NO: 1.
  • the capital letter base can be replaced with k, and k can be either G or T.
  • the probe in the present invention for example, as described above, it may be a complementary strand of the oligonucleotide shown in the above table.
  • the probe is an example, and the present invention is not limited to this.
  • a probe for CYP2C9 among the probes, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 29 Oligonucleotides are preferred.
  • the probe shown in the above table is a guanine quenching probe, the 3 ′ end cytosine is replaced with a fluorescent dye as described above (for example, BODIP
  • YFL, TAMRA, etc. are preferable.
  • a phosphate group may be further added to the 3 ′ end in order to prevent the probe itself from extending.
  • a method for detecting polymorphism CYP2C9 * 3 in 9 genes is described.
  • the present invention is not limited to this.
  • the reaction solution includes, for example, the CYP2C9 gene amplification primer set of the present invention, a DNA polymerase, dNTP, a sample containing a nucleic acid to be a cage, and the probe. In addition to this, it contains various additives that can be used for nucleic acid amplification.
  • the amplification product thus obtained is dissociated, and the single-stranded DNA obtained by the dissociation and the labeled probe are hybridized. This can be done, for example, by changing the temperature of the reaction solution.
  • the heating temperature in the dissociation step is not particularly limited as long as the amplification product can be dissociated, and is, for example, 85 to 95 ° C.
  • the heating time is not particularly limited, but is usually 1 second to 10 minutes, preferably 1 second to 5 minutes.
  • Hybridization between the dissociated single-stranded DNA and the labeled probe can be performed, for example, by lowering the heating temperature in the dissociation step after the dissociation step.
  • temperature conditions it is 40-50 degreeC, for example.
  • the temperature of the reaction solution is changed, and a signal value indicating the melting state of the hybrid former between the amplification product and the labeled probe is measured.
  • the reaction solution hybridized product of the single-stranded DNA and the labeled probe
  • the reaction solution is heated, and the change in the signal value as the temperature rises is measured.
  • a probe labeled with a C-terminal at the end (guanine quenching probe) is used, fluorescence is reduced or quenched in the hybridized state with single-stranded DNA. Then, it emits fluorescence.
  • a hybrid that has decreased or quenched fluorescence may be gradually heated to measure the increase in fluorescence intensity with increasing temperature.
  • the temperature range for measuring the fluctuation of the fluorescence intensity is not particularly limited.
  • the start temperature is room temperature to 85 ° C, preferably 25 to 70 ° C
  • the end temperature is, for example, 40-105 ° C.
  • the rate of temperature rise is not particularly limited, but is, for example, 0.;! To 20 ° C./second, and preferably 0.3 to 5 ° C./second.
  • the Tm value is determined by analyzing the fluctuation of the signal. Specifically, the amount of change in fluorescence intensity per unit time at each temperature (1d increase in fluorescence intensity / dt) is calculated from the obtained fluorescence intensity, and the temperature showing the lowest value can be determined as the Tm value. In addition, the point where the amount of increase in fluorescence intensity per unit time (the amount of increase in fluorescence intensity / 1) is the highest can also be determined as straight. If a probe that does not show a signal alone and that shows a signal by hybridization is used as a labeled probe, on the other hand, measure the decrease in fluorescence intensity.
  • the genotype at the detection target site is determined from the Tm value.
  • Tm analysis a hybrid (match) that is completely complementary has a higher Tm value indicating dissociation than a hybrid (mismatch) that differs in one base. Therefore, the genotype at the detection target site can be determined by determining in advance the Tm value of a hybrid that is completely complementary to the probe and the Tm value of a hybrid that differs in one base.
  • the base of the detection target site is assumed to be a mutant type (for example, the 52521st base in SEQ ID NO: 1 is C) and a probe complementary to the detection target sequence containing it is used, the Tm of the hybrid formed If the value is the same as the Tm value of the fully complementary hybrid, the polymorphism of the amplification product can be judged as a mutant type.
  • the polymorphism of the amplification product is the wild type (for example, For example, it can be determined that the 52521st base in SEQ ID NO: 1 is A). Furthermore, if both Tm values are detected, it can be determined as a heterozygote. In this way, the genotype of the polymorphic CYP2C9 * 3 can be determined from the Tm value for the labeled probe.
  • the method of measuring the signal fluctuation accompanying the temperature rise by raising the temperature of the reaction solution containing the probe may be measured.
  • signal fluctuations during hybridization may be measured.
  • the hybrid is formed by lowering the temperature of the reaction solution containing the probe, the signal fluctuation accompanying the temperature drop may be measured.
  • a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal due to hybridization for example, a guanine quenching probe
  • a hybrid is formed by a decrease in temperature S and a decrease in temperature
  • the fluorescence is reduced or quenched. Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually lowered to measure the decrease in fluorescence intensity as the temperature drops.
  • a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization the single-stranded DNA and the probe dissociate! /, But does not emit fluorescence.
  • a hybrid is formed due to a decrease in temperature, it becomes fluorescent. Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually lowered and the increase in fluorescence intensity accompanying the temperature drop may be measured.
  • Blood was collected from 9 subjects using a heparin lithium blood collection tube (Samples 1 to 9).
  • the obtained blood 10 HL and distilled water 90 HL were mixed, and further 10 L of this mixed solution and 90 ⁇ L of distilled water were mixed. 10 L of these mixed solutions were added to 40 ⁇ L of a PCR reaction solution having the following composition, and PCR was performed using a thermal cycler. The PCR was performed at 95 ° C for 60 seconds, followed by 50 cycles of 95 ° C for 1 second and 52 ° C for 10 seconds, followed by 95 ° C for 1 second and 40 ° C for 60 seconds.
  • the PCR reaction solution was heated from 40 ° C to 95 ° C at a rate of temperature increase of C / 3 seconds, and the change in fluorescence intensity over time was measured. It was.
  • the measurement wavelength was 515 to 5511111 (detection of fluorescent dye 8001? FL).
  • the time required for 50 cycles of PCR was about 1 hour.
  • the Tm value of the hybrid that matches the CYP2C9 * 3 probe is 59 ° C, and the Tm value of the mismatched hybrid is 54 ° C.
  • FIGS. These graphs are graphs of Tm analysis showing changes in fluorescence intensity with increasing temperature.
  • the differential value on the vertical axis indicates “1d increase in fluorescence intensity / dt”, and the horizontal axis indicates temperature (hereinafter referred to as “temperature increase”). The same).
  • temperature increase indicates temperature (hereinafter referred to as “temperature increase”). The same).
  • genotype of CYP2C9 * 3 in each sample was determined from the signal peak.
  • the CYP2C9 * 3 genotype was confirmed by RFLP for 9 subjects, and the same results as in the examples were obtained.
  • the primer of the present invention By using a whole blood sample that has not been pretreated by using the set, the target region including the CYP2C9 * 3 detection target site in the CYP2C9 gene is specifically and efficiently amplified, and the polymorphism is analyzed. I was able to.
  • Blood was collected from two subjects using EDTA blood collection tubes (samples;! To 2).
  • the obtained blood solution 1011 L and the following dilution solution A 7011 L were mixed, and further, this mixture solution 10 L and the following dilution solution 70 ⁇ L were mixed.
  • 10 L of the obtained mixed solution was heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes, and then added to 46 ⁇ L of a PCR reaction solution having the following composition, and PCR was performed using a thermal cycler. PCR was performed at 95 ° C for 60 seconds, followed by 50 cycles of 95 ° C for 1 second and 58 ° C for 15 seconds, followed by treatment at 95 ° C for 1 second and 40 ° C for 60 seconds.
  • the PCR reaction solution was heated from 40 ° C. to 75 ° C. at a temperature increase rate of C / 3 seconds, and the change in fluorescence intensity over time was measured.
  • the measurement wavelength was 515 to 555 nm (detection of fluorescent dye BODIPY FL).
  • the Tm value of the hybrid matching the CYP2C9 * 3 probe is 56 ° C, and the Tm value of the mismatched hybrid is 50 ° C.
  • FIG. 1 The results of Samples 1 and 2 are shown in FIG.
  • This figure is a graph of Tm analysis showing the change in fluorescence intensity with increasing temperature.
  • the differential value on the vertical axis shows “1d increase in fluorescence intensity / dt”, and the horizontal axis shows temperature.
  • the genotype of CYP2C9 * 3 in the sample was determined from the signal peak.
  • the CYP2C9 * 3 genotype was confirmed by RFLP method for two subjects, and the same results as in the example were obtained.
  • the target region including the CYP2C9 * 3 detection target site in the CYP2C9 gene can be specifically and efficiently used using a whole blood sample that has not been pretreated. Amplify and analyze polymorphism with S.
  • the primer set of the present invention it is possible to specifically and efficiently amplify a region including a site where polymorphism CYP2C9 * 3 occurs in the CYP2C9 gene. For this reason, it is possible to reduce labor and cost unlike the conventional method as described above.
  • the region including the polymorphic detection target site is specifically amplified in this way, for example, by using a probe complementary to the detection target sequence including the detection target site, the reaction solution It is possible to perform Tm analysis as is and type the polymorphism.
  • the operation can be automated.
  • the primer set of the present invention when used, pretreatment can be omitted even for samples containing contaminants (for example, whole blood or oral mucosa).
  • the amplification reaction can be performed more quickly and easily.
  • an amplification reaction can be performed with an amplification efficiency superior to that of the prior art, so that the amplification reaction can be shortened. Therefore, according to the primer set of the present invention, the reagent containing the primer set, and the production method of the amplification product using them, the polymorphism of the CYP2C9 gene can be analyzed quickly and easily. It is valid.

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Description

明 細 書
CYP2C9遺伝子増幅用プライマーセット、それを含む CYP2C9遺伝子 増幅用試薬およびその用途
技術分野
[0001] 本発明は、 CYP2C9遺伝子を増幅するためのプライマーセット、それを含む CYP2 C9遺伝子増幅用試薬およびその用途に関する。
背景技術
[0002] チトクローム P450は、スーパーファミリーに分類される酵素群であって、多くのサブ ファミリー（例えば、 CYP1A、 CYP1B、 CYP2C, CYP2D、 CYP2E、 CYP3A等） が存在する。中でも、ヒト CYP2Cサブファミリーのアイソザィムである CYP2C9をコー ドする遺伝子（CYP2C9遺伝子）の変異は、 CYP2C9の基質薬物であるフエニトイン (抗てん力、ん剤)やヮルフアリン (抗凝固薬)の体内動態や効果に影響することが明ら かになつている。 CYP2C9遺伝子の多型である CYP2C9 * 3は、アミノ酸 359位（ェ キソン 7)のイソロイシンがロイシンに変化した変異として知られている（非特許文献 1) 。そして、この CYP2C9 * 3が存在するアミノ酸 359位は、基質薬物の認識部位であ り、そのアミノ酸が変化して立体構造（/3— strand)が変化することによって、薬剤代 謝に関与する酵素の機能に影響を及ぼしている。したがって、 CYP2C9遺伝子につ いて多型 CYP2C9 * 3を調べることは、薬剤による副作用を予測し、より良い効果を 示す薬剤の投与条件を決定するために、極めて重要である。
[0003] 他方、あらゆる疾患の原因や、個体間の疾患易罹患性 (疾患のかかり易さ）、個体 間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわ ゆる一塩基多型（SNP)の検出が広く行われて!/、る。点突然変異の一般的な検出方 法としては、（1)試料の標的 DNAについて、検出対象配列に相当する領域を PCR ( Polymerase chain reaction)により増幅させ、その全遺伝子配列を解析する Dir ect Sequencing法、（2)試料の標的 DNAについて、検出対象配列に相当する領 域を PCRにより増幅させ、前記検出対象配列における目的の変異の有無により切断 作用が異なる制限酵素によってその増幅産物を切断し、電気泳動を行うことによりタ ィビングを行う RFLP解析、（3) 3'末端領域に目的の変異が位置するプライマーを用 いて PCRを行い、増幅の有無によって変異を判断する ASP— PCR法等があげられ
[0004] しかしなら、これらの方法は、例えば、試料から抽出した DNAの精製、電気泳動、 制限酵素処理等が必須であるため、手間やコストがかかってしまう。また、 PCRを行 つた後、反応容器を一旦開封する必要があるため、前記増幅産物が次の反応系に 混入し、解析精度が低下するおそれがある。さらに、 自動化が困難であるため、大量 のサンプルを解析することができない。また、前記（3)の ASP— PCR法については、 特異性が低!/、とレ、う問題もある。
[0005] このような問題から、近年、点突然変異の検出方法として、標的核酸とプローブとか ら形成される二本鎖核酸の融解温度（Tm： melting temperature)を解析する方 法が実用化されている。このような方法は、例えば、 Tm解析、または、前記二本鎖の 融解曲線の解析により行われることから、融解曲線解析と呼ばれている。これは、以 下のような方法である。すなわち、まず、検出目的の点突然変異を含む検出対象配 列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖 DNAと前記プローブとの ハイブリッド（二本鎖 DNA)を形成させる。このハイブリッド形成体に加熱処理を施し、 温度上昇に伴うハイブリッドの解離 (融解）を、吸光度等のシグナルの変動によって検 出する。そして、この検出結果に基づいて Tm値を決定することによって、点突然変 異の有無を判断する方法である。 Tm値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高 ぐ相同性が低い程低くなる。このため、点突然変異を含む検出対象配列とそれに相 補的なプローブとのハイブリッド形成体について予め Tm値（評価基準値）を求めて おき、検出試料の標的一本鎖 DNAと前記プローブとの Tm値 (測定値)を測定する。 前記測定値が評価基準値と同程度であれば、マッチ、すなわち標的 DNAに点突然 変異が存在すると判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわ ち標的 DNAに点突然変異が存在しないと判断できる。そして、この方法によれば、 遺伝子解析の自動化も可能である。
[0006] しかしながら、このような Tm解析を利用した検出方法についても、 PCRにおいて、 検出目的部位を含む領域を特異的且つ効率的に増幅できなければならないという 問題がある。特に、 CYPには多くのアイソザィムが存在し、それらをコードする配列も 極めて類似しているため、 PCRにおいて、 CYP2C9以外のアイソザィムのコード遺 伝子までもが増幅されるおそれがある。また、このように他のアイソザィムのコード遺 伝子までも増幅された場合には、例えば、解析結果の信頼性を低下させる原因にも なる。そして、このように、 1つのサンプルを解析するにも多大な労力を伴うため、大量 のサンプルを解析することは実用的ではないという問題もある。
非特許文献 1 : PMID : 8873220 Pharmacogenetics. 1996 Aug ; 6 (4) : 34 1 - 9.
発明の開示
[0007] そこで、本発明は、遺伝子増幅法により CYP2C9遺伝子の目的領域を特異的に効 率良く増幅することができるプライマーセットの提供を目的とする。
[0008] 前記目的を達成するために、本発明のプライマーセットは、遺伝子増幅法により CY
P2C9遺伝子を増幅するためのプライマーセットであって、下記プライマーセット（1) を含むことを特徴とする。
プライマーセット（1)
下記（F1)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R1)のオリ ゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F1)配列番号 1の塩基配列における 52466番目のアデニン塩基 (A)を一塩基目と して 5'方向に向力、つて 14〜； 18塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも 1つの オリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基 (A)を 3'末端とするオリゴヌクレオチ ド、
(R1)配列番号 1の塩基配列における 52631番目のチミン塩基 (T)を 1塩基目として 3'方向に向力、つて 19〜36塩基目までの領域に相補的な少なくとも 1つのオリゴヌク レオチドであって、前記 52631番目のチミン塩基 (T)に相補的なアデニン塩基 (A)
[0009] また、本発明の遺伝子増幅用試薬は、遺伝子増幅法により CYP2C9遺伝子を増 幅するための試薬であって、前記本発明の CYP2C9遺伝子増幅用プライマーセット を含むことを特徴とする。 [0010] 本発明の増幅産物の製造方法は、遺伝子増幅法により CYP2C9遺伝子の増幅産 物を製造する方法であって、下記 (I)工程を含むことを特徴とする。
(I)試料中の核酸を铸型として、本発明の CYP2C9遺伝子増幅用プライマーセットを 用いて、反応液中で、前記 CYP2C9遺伝子の増幅を行う工程
[0011] 本発明の多型解析方法は、 CYP2C9遺伝子における検出対象部位の多型を解析 する方法であって、下記 (i)〜（iv)工程を含むことを特徴とする。
(i)本発明の増幅産物の製造方法により、 CYP2C9遺伝子における検出対象部位を 含む領域を反応液中で増幅させる工程
(ϋ)前記 ω工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダィズ可能なプ ローブとを含む反応液を準備する工程
(iii)前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形 成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(iv)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定 する工程
[0012] 本発明のプライマーセットによれば、 CYP2C9遺伝子における検出目的の多型 C YP2C9 * 3が発生する部位を含む目的領域を、反応液中で特異的且つ高効率で 増幅すること力 Sできる。このため、前述のような従来法とは異なり手間やコストを低減 すること力 S可能となる。また、このように CYP2C9 * 3が発生する検出対象部位を含 む領域を特異的に増幅できることから、例えば、さらに、検出対象部位を含む検出対 象配列に相補的なプローブを使用することで、前記反応液を用いてそのまま Tm解 析を行い、前記多型をタイピングすることが可能となる。また、 1つの反応液で、前記 目的領域の増幅ならびに多型のタイピングが可能であることから、操作の自動化も可 能になる。さらに、本発明のプライマーセットを用いれば、例えば、夾雑物が含まれる 試料 (例えば、全血や口腔粘膜等）であっても、前処理を省略できるため、より迅速且 つ簡便に増幅反応を行うことができる。また、本発明のプライマーセットを用いれば、 従来よりも優れた増幅効率で増幅反応が行えるため、増幅反応も短縮化が可能であ る。したがって、本発明のプライマーセットやこれを含む試薬、ならびにこれらを用い た増幅産物の製造方法および多型解析方法によれば、 CYP2C9遺伝子の多型を 迅速かつ簡便に解析できることから、医療分野においてきわめて有効といえる。 図面の簡単な説明
[0013] [図 1]図 1は、本発明の実施例 1における Tm解析の結果を示すグラフである。
[図 2]図 2は、本発明の前記実施例 1における Tm解析の結果を示すグラフである。
[図 3]図 3は、本発明の実施例 2における Tm解析の結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0014] < CYP2C9遺伝子増幅用プライマーセット〉
本発明の CYP2C9遺伝子増幅用プライマーセットは、前述のように、前記プライマ 一セット（1)を含むことを特徴とする。このプライマーセット（1)によれば、前述のように 、 CYP2C9 * 3が発生する検出対象部位を含む目的領域を特異的且つ高効率で増 幅することが可能である。このため、本発明のプライマーセットを用いてこの領域を増 幅すれば、従来よりも効率良ぐ CYP2C9遺伝子多型の解析を行うことができる。な お、以下、フォワードプライマーを Fプライマー、リバースプライマーを Rプライマーと レ、うことがある。
[0015] 前記プライマーセット（1)は、前述のように、下記（F1)のオリゴヌクレオチドからなる フォワードプライマーおよび下記（R1)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマ 一を含む一対のプライマーセットである。
(F1)配列番号 1の塩基配列における 52466番目のアデニン塩基 (A)を一塩基目と して 5'方向に向力、つて 14〜； 18塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも 1つの オリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基 (A)を 3'末端とするオリゴヌクレオチ ド、
(R1)配列番号 1の塩基配列における 52631番目のチミン塩基 (T)を 1塩基目として 3'方向に向力、つて 19〜36塩基目までの領域に相補的な少なくとも 1つのオリゴヌク レオチドであって、前記 52631番目のチミン塩基 (T)に相補的なアデニン塩基 (A)
[0016] 配列番号 1に示す塩基配列は、ヒトチトクローム P450ファミリー 2サブファミリー Cポ リペプチド 9 (CYP2C9)の完全長配列であり、例えば、 NCBIァクセッション： No. A Υ702706ίこ登録されて!/、る。 [0017] 前記プライマーセット（1)は、酉己歹 IJ番号 1における 52467番目〜 52630番目の領 域を含む DNA鎖ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。こ の領域内の 52521番目の塩基（配列番号 1における 52521番目の塩基）は、 CYP2 C9の機能に影響を与える点突然変異（52521A、 52521C)の存在が知られており 、この多型が、前述の CYP2C9 * 3である。 52521番目の塩基が Aであれば、 CYP 2C9遺伝子がタンパク質に翻訳された際、アミノ酸 359位はイソロイシン (lie)となり、 52521番目の塩基が Cであれば、アミノ酸 359位はロイシン（Leu)となる多型を示す 。本発明において、この部位の多型は、ホモ接合体の場合、 52521A/A、 52521 C/C、ヘテロ接合体の場合、 52521A/Cで表すことができる。以下、このプライマ 一セット（1)を、「CYP2C9 * 3用プライマーセット」ともいう。
[0018] 本発明において、プライマーセット（1)の F1プライマーおよび R1プライマーは、 DN Aポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす 3'末端の塩基が、前述 の条件を満たしていればよい。このように前記プライマーの 3'末端の塩基を固定する ことによって、プライマーセット（1)が、例えば、類似する他のアイソザィムの遺伝子（ 例えば、 CYP2C8、 CYP2C17、 CYP2C18、 CYP2C19遺伝子等）に結合するこ とを十分に防止することができる。
[0019] このように、 F1プライマーおよび R1プライマーは、その 3'末端の塩基が固定されて いればよいことから、前記各プライマーの長さ自体は特に制限されず、一般的な長さ に適宜調整することができる。プライマーの長さの一例としては、例えば、 13〜50me rの範囲であり、好ましくは 14〜45merであり、より好ましくは 15〜40merである。具 体例として、前記 F1プライマーは、配列番号 1の塩基配列における 52466番目のァ デニン塩基 (A)を一塩基目として 5'方向に向力 て 14〜； 18塩基目（好ましくは、 14 〜； 17塩基目、より好ましくは 15〜； 17塩基目 )までの領域と同じ配列である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記 R1プライマーは、配列番 号 1の塩基配列における 52631番目のチミン塩基 (T)を 1塩基目として 3'方向に向 力、つて 19〜36塩基目（好ましくは、 22〜30塩基目、より好ましくは 23〜29塩基目 ) までの領域に相補的な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。なお 、 F1プライマーと R1プライマーの 3'末端が固定されていることから、プライマーから 伸長する領域は、例えば、前述のように酉己歹 IJ番号 1における 52467番目〜 52630番 目の領域である力 得られる増幅産物の全体の長さは使用するプライマーの長さに 応じて変化する。
[0020] また、 R1プライマーは、配列番号 1に示す塩基配列に対して、 F1プライマーは、前 記塩基配列の相補鎖に対して、それぞれ完全に相補なオリゴヌクレオチドでなくとも よい。すなわち、前記各プライマーにおける 3 '末端の塩基を除く部分において、完全 に相補なオリゴヌクレオチドと 1個〜 5個の塩基が異なっていてもよい。
[0021] 以下に、 F1プライマーと R1プライマーの具体例を示す力 本発明は、これには限 定されない。また、これらの F1プライマーと R1プライマーとの組み合わせは何ら制限 されないが、これらの中でも、配列番号 2または配列番号 4のオリゴヌクレオチドからな る F1 'プライマーと配列番号 14または配列番号 17のオリゴヌクレオチドからなる R1 ' プライマーとを含むプライマーセット（1 ' )が特に好ましい。なお、下記表における「T m (°C)」は、下記表の配列と完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合の Tm (°C )であり、 MELTCALCソフトウェア（http : //www. meltcalc. com/)により、パ ラメーターをオリゴヌクレオチド濃度 0· 2 Μ、ナトリウム当量（Na eq. ) 50mMとし て算出した値である。前記 Tm値は、例えば、従来公知の MELTCALCソフトウェア (http： //www. meltcalc. com/)等により算出でき、また、隣接法（Nearest Neighbor Method)によって決定することもできる（以下、同様）。
[0022] [表 1]
ブライマ一 配列 Tm (。C) 配列番号
5 -cggagcccctgcatgcaa-3 59.4 2
Fプライマー 5し ggagcccctgcatgcaa - 3 56.5 3
CYP2C9 * 3ffl 0 -gagcccctgcatgcaa-3 53.6 4
o -agcccctgcatgcaa-3 52.1 5
5'-gcccctgcatgcaa-3 50.2 6 o -gtttaaaaatgatactatgaatttggggacttcgaa-3 58.1 フ
5'-tttaaaaatgatactatgaatttggggacttcgaa-3' 57.5 8
5'-ttaaaaatgatactatgaatttggggacttcgaa-3' 57.2 9
5'-taaaaatgatactatgaatttggggacttcgaa-3' 56.9 10
5'-aaaaatgatactatgaatttggggacttcgaa-3' 57.2 1 1
5'-aaaatgatactatgaatttggggacttcgaa-3' 56.9 12
5'-aaatgatactatgaatttggggacttcgaa-3' 56.6 13
Rプライマー 5'-aatgatactatgaatttggggacttcgaa-3' 56.3 14
CYP2C9 * 3ffl 5'-atgatactatgaatttggggacttcgaa-3' 55.9 15
5'-tgatactatgaatttggggaettcgaa-3' 55.7 16
5'-gatactatgaatttggggacttcgaa-3' 54.5 17
5'-atactatgaatttggggacttcgaa-3' 53.6 18
5'-tactatgaatttggggacttcgaa-3' 53.3 19
5'- a ctatgaatttgggga cttcgaa-3 ' 53.5 20
5'-ctatgaatttggggacttcgaa-3' 52 21
5 ' -tatgaatttgggga cttcgaa-3' 50.9 22
5'-atgaatttggggacttcgaa-3' 51 23
5'- tgaatttggggacttcgaa-3' 50.5 24
[0023] また、前述したプライマーセット（1)の各プライマーは、例えば、増幅反応の反応温 度を上げるために、従来公知の任意の配列を 5'末端に付加したものでもよい。
[0024] このようなプライマーセット（1)を含む本発明の CYP2C9遺伝子増幅用プライマー セットは、例えば、全血試料等の生体試料における CYP2C9遺伝子を増幅させる際 に使用すること力好ましい。特に、本発明の CYP2C9遺伝子増幅用プライマーセット を、後述するような多型の検出用プローブとともに使用する際には、遺伝子増幅用反 応液における全血試料の添加割合を 0. ；!〜 0. 5体積％とすることが好ましい。この 点については、後述する。
[0025] < CYP2C9遺伝子増幅用試薬〉
本発明の CYP2C9遺伝子増幅用試薬は、前述のように、遺伝子増幅法により CY P2C9遺伝子を増幅するための試薬であって、本発明の CYP2C9遺伝子増幅用プ ライマーセットを含むことを特徴とする。本発明の CYP2C9遺伝子増幅用試薬は、本 発明のプライマーセットを含むことが特徴であり、これ以外の組成等については何ら 制限されない。
[0026] 本発明の CYP2C9遺伝子増幅用試薬は、例えば、本発明のプライマーセットを用 いた遺伝子増幅法により得られる増幅産物を検出するために、さらにプローブを含ん でもよい。前述のように本発明のプライマーセットによれば、遺伝子増幅法によって、 CYP2C9 * 3の生じる検出対象部位を含む目的領域の増幅産物が得られる。このた め、前記目的領域における検出対象配列に相補的なプローブを共存させることによ つて、例えば、増幅の有無や検出対象部位の遺伝子型（多型）等を、後述する方法 によって検出することが可能である。このようなプローブやその利用方法に関しては、 後の多型の解析方法において説明する。また、本発明の CYP2C9遺伝子増幅用試 薬は、全血等の生体試料における CYP2C9遺伝子を増幅させる際に使用すること が好ましぐ特に、本発明の CYP2C9遺伝子増幅用試薬を、前述のようなプローブと ともに使用する際には、遺伝子増幅用反応液における全血試料の添加割合を 0. 1 〜0. 5体積％とすることが好ましい。なお、本発明において、「検出対象配列」とは、 多型が発生する部位 (検出対象部位）を含む配列を意味する。
[0027] 本発明の CYP2C9遺伝子増幅用試薬の形態は、特に制限されず、例えば、本発 明の CYP2C9遺伝子増幅用プライマーセットを含有する液体試薬でもよいし、使用 前に溶媒で懸濁する乾燥試薬であってもよい。また、 CYP2C9遺伝子増幅用プライ マーセットの含有量も、特に制限されない。
[0028] <増幅産物の製造方法〉
本発明の増幅産物の製造方法は、前述のように、遺伝子増幅法により CYP2C9遺 伝子の増幅産物を製造する方法であって、下記 (I)工程を含むことを特徴とする。
(I)試料中の核酸を铸型として、本発明の CYP2C9遺伝子増幅用プライマーセットを 用いて、反応液中で、前記 CYP2C9遺伝子の増幅を行う工程
[0029] このように本発明のプライマーセットを用いて増幅反応を行うことによって、前述のよ うに CYP2C9遺伝子における多型 CYP2C9 * 3の検出対象部位を含む目的領域を 特異的に高効率で増幅させることができる。なお、本発明の増幅産物の製造方法に おいては、本発明のプライマーセットを使用することが特徴であって、遺伝子増幅法 の種類や条件等は何ら制限されなレ、。
[0030] 前記遺伝子増幅法としては、前述のように特に制限されず、例えば、 PCR(Polym erase Chain Reaction)法、 NASBA (Nucleic acid sequence based amp lification)法、 TMA (Transcription— mediated amplification)法、 SDA (Str and Displacement Amplification)法等があげられる力 PCR法が好ましい。な お、以下、 PCR法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。
[0031] 本発明を適用する試料としては、例えば、铸型となる核酸配列を含んでいればよく 、特に制限されないが、例えば、夾雑物が含まれる試料に適用することが好ましい。 前記夾雑物が含まれる試料としては、例えば、全血、口腔内細胞（例えば、口腔粘膜 )、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液 (例 えば、胃洗浄液）等や、それらの懸濁液等があげられる。本発明のプライマーセットを 用いた増幅産物の製造方法によれば、例えば、様々な夾雑物が含まれる試料 (特に 、全血や口腔内細胞等の生体試料）であっても、その影響を受け難ぐ CYP2C9遺 伝子の前記領域を特異的に増幅することができる。このため、本発明によれば、従来 法では困難であった全血等の夾雑物の多い試料であっても、例えば、精製等の前処 理を行うことなぐそのまま使用することが可能である。したがって、試料の前処理の 観点からも、従来法よりさらに迅速に増幅産物を調製することが可能といえる。
[0032] 前記反応液における試料の添加割合は、特に制限されな V、。具体例として、前記 試料が生体試料 (例えば、全血試料）の場合、前記反応液における添加割合の下限 1S 例えば、 0. 01体積％以上であることが好ましぐより好ましくは 0. 05体積％以上 、さらに好ましくは 0. 1体積％以上である。また、前記添加割合の上限も、特に制限 されないが、例えば、 2体積％以下が好ましぐより好ましくは 1体積％以下、さらに好 ましくは 0. 5体積％以下である。
[0033] また、後述するような光学的検出を目的とする場合、特に、標識化プローブを用い た光学的検出を行う場合、全血試料のような生体試料の添加割合は、例えば、 0. 1 〜0. 5体積％に設定することが好ましい。 PCR反応においては、通常、 DNA変性（ 一本鎖 DNAへの解離）のために熱処理が施される力 この熱処理によって試料に含 まれる糖やタンパク質等が変性し、不溶化の沈殿物や濁り等が発生するおそれがあ る。このため、増幅産物の有無や検出対象部位の遺伝子型（多型）を光学的手法に より確認する場合、このような沈殿物や濁りの発生が、測定精度に影響を及ぼす可能 性がある。し力、しながら、反応液における全血試料の添加割合を前述の範囲に設定 すれば、メカニズムは不明であるが、例えば、変性による沈殿物等の発生を十分に防 止することができるため、光学的手法による測定精度を向上できる。また、全血試料 中の夾雑物による PCRの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上す ること力 Sできる。したがって、本発明のプライマーセットの使用に加えて、さらに、全血 試料等の試料の添加割合を前述の範囲に設定することによって、より一層、試料の 前処理の必要性を排除できる。
[0034] また、前記反応液中の全血試料の割合は、前述のような体積割合 (例えば、 0. ；!〜 0. 5体積0 /0)ではなぐヘモグロビン（以下、「Hb」という）の重量割合で表すこともで きる。この場合、前記反応液における全血試料の割合は、 Hb量に換算して、例えば 、 0. 565〜； 113g/Lの範囲カ好ましく、より好ましく (ま 2. 825-56. 5g/Lの範囲、 さらに好ましくは 5. 65-28. 25 g/Lの範囲である。なお、前記反応中における 全血試料の添加割合は、例えば、前記体積割合と Hb重量割合の両方を満たしても よいし、いずれか一方を満たしてもよい。
[0035] 全血としては、例えば、溶血した全血、未溶血の全血、抗凝固全血、凝固画分を含 む全血等の!/、ずれであってもよ!/、。
[0036] 本発明にお!/、て、試料に含まれる標的核酸は、例えば、 DNAである。前記 DNA は、例えば、生体試料等の試料に元来含まれる DNAでもよいし、遺伝子増幅法によ り増幅させた増幅産物 DNAであってもよい。後者の場合、前記試料に元来含まれて いる RNA (トータル RNA、 mRNA等）から逆転写反応（例えば、 RT— PCR(Revers e Transcription PCR) )により生成させた cDNAがあげられる。
[0037] 本発明の増幅産物の製造方法において、遺伝子増幅反応の開始に先立ち、前記 反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によ つて、例えば、前述のような沈殿物や濁りの発生による影響をより一層低減することが でき、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。具体的には、前記 (I)工程の増 幅反応や、一本鎖 DNAへの解離工程前に、アルブミンを添加することが好ましい。
[0038] 前記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、 0. 0；!〜 2重量％の範囲で あり、好ましくは 0. ；!〜 1重量％であり、より好ましくは 0. 2〜0. 8重量％である。前記 アルブミンとしては、特に制限されず、例えば、ゥシ血清アルブミン（BSA)、ヒト血清 アルブミン、ラット血清アルブミン、ゥマ血清アルブミン等があげられ、これらはいずれ か一種類でもよレ、し二種類以上を併用してもよ!/、。
[0039] つぎに、本発明の増幅産物の製造方法に関し、全血試料について、 DNAを標的 核酸とし、本発明のプライマーセットを用いた PCRにより CYP2C9遺伝子の前記目 的領域の増幅産物を製造する例をあげて説明する。なお、本発明は、本発明のブラ イマ一セットを使用することが特徴であり、他の構成ならびに条件は何ら制限されな い。
[0040] まず、 PCR反応液を調製する。本発明のプライマーセットの添加割合は、特に制限 されないが、プライマーセット（1)の Fプライマーを、 0· 1〜2〃11101/しとなるように添 加することが好ましぐより好ましくは 0. 25-1. 5 11101/しでぁり、特に好ましくは0 . 5〜1 11101/しである。また、プライマーセット（1)の Rプライマーを、 0. 1〜2 1110 1/Lとなるように添加することが好ましぐより好ましくは 0· 25-1. S mol/Lであり 、特に好ましくは 0· 5〜1 ^ 11101/しである。プライマーセットにおける Fプライマーと R プライマーとの添加割合 (F : R、モル比）は、特に制限されないが、例えば、 1 : 0. 25 〜； 1 : 4が好ましぐより好ましくは 1 : 0. 5〜； 1 : 2である。
[0041] 反応液における全血試料の割合は、特に制限されないが、前述の範囲が好ましい 。全血試料は、そのまま反応液に添加してもよいし、予め、水や緩衝液等の溶媒で希 釈してから反応液に添加してもよい。全血試料を予め希釈する場合、その希釈率は 特に制限されず、例えば、反応液での最終的な全血添加割合が前記範囲となるよう に設定できる力 ί列え (ま、、 100〜2000倍で り、好ましく (ま 200〜 000倍である。
[0042] 前記反応液における他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分があげら れ、その割合も特に制限されない。前記組成成分としては、例えば、 DNAポリメラー ゼ、ヌクレオチド (ヌクレオシド三リン酸 (dNTP) )および溶媒があげられる。また、前 述のように前記反応液はさらにアルブミンを含有することが好ましい。なお、前記反応 液にぉレ、て、各組成成分の添加順序は何ら制限されな!/、。
[0043] 前記 DNAポリメラーゼとしては、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌 由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス ·アクアティカス（Therm us aayaticus)由来 DNAポリメラーゼ（米国特許第 4, 889, 818号および同第 5, 079, 352号）（商品名 Taaポリメラーゼ）、テルムス ·テルモフィラス（Thermus ther mophilus)由来 DNAポリメラーゼ（WO 91/09950) (rTth DNA polymerase )、ピロコッカス ·フリオサス（Pyrococcus 由来 DNAポリメラーゼ（WO 9
2/9688) (Pfu DNA polymerase： Stratagenes社製）、テルモコッカス'リトラリ ス (Thermococcus litoralis)由来 DNAポリメラーゼ（EP— A 455 430) (商標 V ent : Biolab New England社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス •アクアティカス (Thermus aauaticus)由来の耐熱性 DNAポリメラーゼが好まし!/ヽ
〇
[0044] 前記反応液中の DNAポリメラーゼの添加割合は、特に制限されないが、例えば、 1 〜； 100U/mLであり、好ましくは 5〜50U/mLであり、より好ましくは 20〜30U/m Lである。なお、 DNAポリメラーゼの活性単位（U)は、一般に、活性化サケ精子 DN Aを铸型プライマーとして、活性測定用反応液中、 74°Cで、 30分間に lOnmolの全 ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性力 S1Uである。前記活性測定用反応 液の糸且成は、例えば、 25mM TAPS buffer (pH9. 3、 25。C)、 50mM KC1、 2 mM MgCl 、 ImMメノレカプトエタノーノレ、 200 μ M dATP、 200 μ M dGTP、 2
2
00 Μ dTTP、 100 M「 α— 32P」dCTP、 0. 25mg/mL活性化サケ精子 DNA である。
[0045] 前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、 dNTP (dATP、 dCTP、 dTTP)があげら れる。前記反応液中の dNTPの添加割合は、特に制限されないが、例えば、 0. 01 〜； lmmol/Lであり、好ましくは 0· 05—0. 5mmol/Lであり、より好ましくは 0· ；!〜 0. 3mmolZLでめる。
[0046] 前記溶媒としては、例えば、 Tris-HCl, Tricine, MES、 MOPS, HEPES、 CA PS等の緩衝液があげられ、市販の PCR用緩衝液や市販の PCRキットの緩衝液等が 使用できる。
[0047] また、前記 PCR反応液は、さらに、へパリン、ベタイン、 KC1、 MgCl 、 MgSO、グリ
2 4 セロール等を含んでもよぐこれらの添加割合は、例えば、 PCR反応を阻害しない範 囲で設定すればよい。
[0048] 反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、使用する機器 (サーマルサイクラ一 )等に応じて適宜決定できる力 通常、 1〜500 しであり、好ましくは 10〜； 100 し である。
[0049] つぎに、 PCRを行う。 PCRのサイクル条件は特に制限されないが、例えば、（1)全 血由来二本鎖 DNAの 1本鎖 DNAへの解離、（2)プライマーのアニーリング、（3)プ ライマーの伸長（ポリメラーゼ反応）は、それぞれ以下の通りである。また、サイクル数 も特に制限されないが、下記（1)〜（3)の 3ステップを 1サイクルとして、例えば、 30サ イタル以上が好ましい。上限は特に制限されないが、例えば、合計 100サイクル以下 、好ましくは 70サイクル以下、さらに好ましくは 50サイクル以下である。各ステップの 温度変化は、例えば、サーマルサイクラ一等を用いて自動的に制御すればよい。本 発明のプライマーセットを使用した場合、前述のように増幅効率に優れるため、従来 の方法によれば 50サイクルに 3時間程度を要していたのに対して、本発明によれば、 約 1時間程度（好ましくは 1時間以内）で 50サイクルを完了することも可能である。
[0050] [表 2]
Figure imgf000015_0001
[0051] 以上のようにして、 CYP2C9遺伝子における CYP2C9 * 3の検出対象部位を含む 領域に相補的な増幅産物を製造することができる。
[0052] 本発明の増幅産物の製造方法は、さらに、前述の増幅反応によって前記増幅産物 を検出する工程を含んでもよい。これによつて、増幅産物の有無や、 CYP2C9遺伝 子の前記目的領域における遺伝子型（多型 CYP2C9 * 3)を検出することもできる。 増幅産物の有無は、従来公知の方法により確認できる。具体的には、例えば、前記（ I)工程において、前記反応液に、さらに、前記目的領域における検出対象配列に相 補的な配列である蛍光標識化プローブを添加しておき、さらに、（II)工程として、前記 反応液について、前記プローブにおける蛍光標識の蛍光強度を測定することによつ て確認できる。なお、 CYP2C9遺伝子における多型 CYP2C9 * 3の検出について は、本発明の一形態として、以下に説明する。
[0053] < CYP2C9遺伝子の多型解析方法〉
本発明の CYP2C9遺伝子の多型解析方法は、 CYP2C9遺伝子における検出対 象部位の多型（CYP2C9 * 3)を解析する方法であって、下記（i)〜（iv)工程を含む ことを特徴とする。
(i)本発明の増幅産物の製造方法により、 CYP2C9遺伝子における検出対象部位を 含む領域を反応液中で増幅させる工程
(ii)前記 (i)工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダィズ可能なプ ローブとを含む反応液を準備する工程
(iii)前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形 成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(iv)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定 する工程
[0054] このように本発明のプライマーセットを用いて増幅産物の製造することによって、前 述のように CYP2C9遺伝子における多型 CYP2C9 * 3の検出対象塩基を含む領域 を増幅すること力できる。
[0055] 前記（ii)工程におけるプローブは、特に制限されず、多型 CYP2C9 * 3の発生部 位を含む検出対象配列に相補的なプローブ（以下、「CYP2C9 * 3用プローブ」とも いう）があげられる。このプローブは、前記検出対象配列を含む検出対象配列に相補 的なプローブであることが好ましレ、。
[0056] 前記多型を検出するためのプローブは、特に制限されず、従来公知の方法によつ て設定できる。例えば、多型の検出対象部位を含む検出対象配列として、 CYP2C9 遺伝子のセンス鎖の配列に基づいて設計してもよいし、アンチセンス鎖の配列に基 づいて設計してもよい。また、多型の検出対象部位の塩基は、多型の種類に応じて 適宜決定できる。すなわち、 CYP2C9 * 3は、酉己歹 IJ番号 1における 52521番目の塩 基に「A」および「C」の多型が知られていることから、例えば、 52521番目が Aである 検出対象配列、および、 52521番目が Cである検出対象配列のいずれかに相補的 なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）や、そのアンチセンス鎖の配列に相補的な プローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）があげられる。このように、多型が生じる 検出対象部位の塩基を前述のようないずれかの塩基に設定してプローブを設計して も、後述するような方法により、 CYP2C9遺伝子の検出対象部位においてどのような 多型を示す力、を判断することが可能である。
[0057] 前記プローブは、前記（i)工程の後、すなわち、 CYP2C9遺伝子の目的領域につ いて増幅反応を行った後、増幅反応液に添加することもできる力 容易且つ迅速に 解析を行えることから、前記 (i)工程の増幅反応に先立って、予め反応液に添加して おくことが好ましい。
[0058] 前記反応液におけるプローブの添加割合は、特に制限されな!/、が、例えば、プロ ーブを 10〜400nmolの範囲となるように添加することが好ましぐより好ましくは 20〜 200nmolである。また、プローブの標識として蛍光色素を用いている場合、例えば、 検出する蛍光強度を調整するために、標識化プローブと同じ配列である未標識プロ ーブを併用してもよぐこの未標識プローブは、その 3'末端にリン酸が付加されてもよ い。この場合、標識化プローブと非標識プローブのモル比は、例えば、 1： 10〜10： 1 が好ましい。前記プローブの長さは、特に制限されず、例えば、 5〜50merであり、好 ましくは 10〜30merである。
[0059] Tm値について説明する。二本鎖 DNAを含む溶液を加熱していくと、 260nmにお ける吸光度が上昇する。これは、二本鎖 DNAにおける両鎖間の水素結合が加熱に よってほどけ、一本鎖 DNAに解離 (DNAの融解）することが原因である。そして、全 ての二本鎖 DNAが解離して一本鎖 DNAになると、その吸光度は加熱開始時の吸 光度（二本鎖 DNAのみの吸光度）の約 1. 5倍程度を示し、これによつて融解が完了 したと判断できる。この現象に基づき、融解温度 Tmとは、一般に、吸光度が、吸光度 全上昇分の 50%に達した時の温度と定義される。
[0060] 前記（iii)工程にお V、て、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融 解状態を示すシグナルの測定は、前述した、 260nmの吸光度測定でもよいが、標識 物質のシグナル測定であってもよい。具体的には、前記プローブとして、標識物質で 標識化された標識化プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが 好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブ リツド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さ ず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者の ようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖 DNA)を形成して!/、る 際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、 後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖 DNA)を形成するこ とによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失） する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸収波長等）で検 出することによって、前記 260nmの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびに Tm 値の決定等を行うことができる。
[0061] 前記標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、例えば、蛍光色素（蛍 光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、蛍光色素（蛍 光団）で標識された、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例え ば、消光）するプローブが好ましい。このような、蛍光消光現象（Quenching pheno menon)を利用したプローブとしては、中でも、オリゴヌクレオチドを 3'末端もしくは 5' 末端が Cとなるように設計し、その末端の Cが Gに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で 標識化したプローブが特に好ましい。このプローブは、一般的に、グァニン消光プロ ーブと呼ばれており、いわゆる QProbe (登録商標）として知られている。このようなプ ローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダィズと解離とを容易に確認 すること力 Sでさる。
[0062] 前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルォレセイン、リン光体、 ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、 BODIPY FL (商標、モレキュラー 'プローブ社製）、 FluorePrime (商品名、アマシ ャムフアルマシア社製）、 Fluoredite (商品名、ミリポア社製）、 FAM (ABI社製）、 Cy 3および Cy5 (アマシャムフアルマシア社製）、 TAMRA (モレキュラープローブ社製） 等があげられる。検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定 できる力 例えば、例えば、 Pacific Blueは、検出波長 450〜480nm、 TAMRAは 、検出波長 585〜700nm)、： BODIPY FLは、検出波長 515〜555nmで検出でき [0063] 以下に、多型 CYP2C9 * 3を検出するためのプローブの配列の具体例を示すが、 本発明は、これには制限されない。下記プローブは、センス鎖を検出するためのプロ ーブ ある。
[0064] プローブ
配列番号 1における 52516番目のグァニン塩基（G)を一塩基目として 3'方向に向か つて 17〜22塩基目までの領域に相補的な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであつ て、前記グァニン塩基に相補的なシトシン塩基を 3'末端とするオリゴヌクレオチド
[0065] 前記プローブにおいて、配列番号 1の 52521番目に相補的な塩基は、 kで表され、 前記 kは、 Gまたは Tである。
[0066] さらに、前記プローブの具体例を下記表に示す。なお、下記表における「Tm(°C)」 は、下記表の配列と完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合の Tm(°C)であり、 MELTCALCソフトウェア（http : //www. meltcalc. com/)により、パラメータ 一をオリゴヌクレオチド濃度 0· 2 Μ、ナトリウム当量（Na eq. ) 50mMとして算出し たィ直である。
[0067] [表 3]
Figure imgf000019_0001
[0068] 前記表におけるプローブは、配列番号 1における 52516番目が Cである領域に相 補的な配列からなり、大文字の塩基が、配列番号 1の 52516番目の塩基に相補的な 塩基を示す。なお、前記プローブにおいて、前記大文字の塩基は、 kに置き換えるこ とができ、前記 kは、 Gおよび Tのいずれでもよい。本発明におけるプローブの具体例 としては、例えば、前述のように、前記表に示すオリゴヌクレオチドの相補鎖であって あよい。
[0069] 前記プローブは一例であって、本発明はこれには限定されない。 CYP2C9用プロ ーブとしては、前記プローブの中でも、配列番号 28または配列番号 29の塩基配列 力、らなるオリゴヌクレオチドが好ましい。例えば、前記表に示すプローブをグァニン消 光プローブとする場合、 3'末端のシトシンを前述のような蛍光色素（例えば、 BODIP
Y FL、 TAMRA等）で標識化することが好ましい。また、 5'末端に蛍光色素を標識 化したプローブは、例えば、プローブ自体が伸長することを予防するために、その 3' 末端に、さらにリン酸基が付加されてもよい。
[0070] 次に、本発明の検出方法について、一例として、下記プローブを用いて、 CYP2C
9遺伝子における多型 CYP2C9 * 3を検出する方法を説明する。なお、本発明はこ れには制限されない。
[0071] (プローブ）
CYP2C9 * 3用プローブ
5' - gggagaaggtcaaggtatc - (BODIPY FL)— 3' (配列番号 28)、または、
5' -ggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPY FL)— 3' (配列番号 29)
[0072] まず、前記標識化プローブを添加した反応液を用いて、前述のように PCRを行い、 反応液中で、 CYP2C9遺伝子の前記目的領域を増幅させる。前記反応液は、例え ば、本発明の CYP2C9遺伝子増幅用プライマーセット、 DNAポリメラーゼ、 dNTP、 铸型となる核酸を含む試料、および、前記プローブを含む。この他に、核酸増幅に使 用できる種々の添加剤を含んでもょレ、。
[0073] 次に、得られた増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖 DNAと前記 標識化プローブとのハイブリダィズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化 によって fiうことができる。
[0074] 前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特 に制限されないが、例えば、 85〜95°Cである。加熱時間も特に制限されないが、通 常、 1秒〜 10分であり、好ましくは 1秒〜 5分である。
[0075] 解離した一本鎖 DNAと前記標識化プローブとのハイブリダィズは、例えば、前記解 離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことがで きる。温度条件としては、例えば、 40〜50°Cである。
[0076] そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとの ハイプリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、 前記反応液（前記一本鎖 DNAと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加 熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端の C塩基が 標識化されたプローブ（グァニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖 DNAとのハ イブリダィズした状態では、蛍光が減少ほたは消光）し、解離した状態では、蛍光を 発する。したがって、例えば、蛍光が減少ほたは消光）しているハイブリッド形成体を 徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
[0077] 蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始 温度が室温〜 85°Cであり、好ましくは 25〜70°Cであり、終了温度は、例えば、 40〜 105°Cである。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、 0.；!〜 20 °C /秒であり、好ましくは 0. 3〜5°C/秒である。
[0078] 次に、前記シグナルの変動を解析して Tm値を決定する。具体的には、得られた蛍 光強度から各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（一 d蛍光強度増加量 /dt)を算出し、最も低い値を示す温度を Tm値として決定できる。また、単位時間当 たりの蛍光強度増加量 (蛍光強度増加量/ 1)が最も高い点を Τι^直として決定するこ ともできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなぐ単独でシグナルを 示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反 対に、蛍光強度の減少量を測定すればょレ、。
[0079] そして、この Tm値から、検出対象部位における遺伝子型を決定する。 Tm解析に おいて、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、一塩基が異なるハイブリッド (ミス マッチ）よりも、解離を示す Tm値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、 前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドの Tm値と、一塩基が異なる ハイブリッドの Tm値とを決定しておくことにより、前記検出対象部位における遺伝子 型を決定することができる。例えば、検出対象部位の塩基を変異型 (例えば、配列番 号 1における 52521番目の塩基が C)と仮定し、それを含む検出対象配列に相補的 なプローブを使用した場合、形成したハイブリッドの Tm値が、完全に相補なハイプリ ッドの Tm値と同じであれば、前記増幅産物の多型は、変異型と判断できる。また、形 成したハイブリッドの Tm値力 S、一塩基異なるハイブリッドの Tm値と同じ（完全に相補 なハイブリッドの Tm値より低い値）であれば、前記増幅産物の多型は、野生型（例え ば、配列番号 1における 52521番目の塩基が A)と判断できる。さらに、両方の Tm値 が検出された場合には、ヘテロ接合体と決定できる。このようにして、標識化プローブ に対する Tm値から、多型 CYP2C9 * 3の遺伝子型を判断することができる。
[0080] また、本発明においては、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇 させて (ノ、イブリツド形成体を加熱して）、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方 法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよ い。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を 形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
[0081] 具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さな い標識化プローブ (例えば、グァニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖 DNAと プローブとが解離している状態では蛍光を発している力 S、温度の降下によりハイブリツ ドを形成すると、前記蛍光が減少ほたは消光）する。したがって、例えば、前記反応 液の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他 方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プロ ーブを使用した場合、一本鎖 DNAとプローブとが解離して!/、る状態では蛍光を発し ていないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。し たがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度 の増加を測定すればよい。
[0082] つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により 制限されない。
実施例 1
[0083] 被検者 9人からへパリンリチウム採血管を用いて採血を行った（サンプル 1〜9)。得 られた血液 10 H Lと蒸留水 90 H Lを混合し、さらに、この混合液 10 Lと蒸留水 90 μ Lとを混合した。これら混合液 10 Lを、下記組成の PCR反応液 40 μ Lに添加し、 サーマルサイクラ一を用いて PCRを行った。 PCRの条件は、 95°Cで 60秒処理した 後、 95°C1秒および 52°C10秒を 1サイクルとして 50サイクル繰り返し、さらに 95°Cで 1秒、 40°Cで 60秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を C/3秒として、前 記 PCR反応液を 40°Cから 95°Cに加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定し た。測定波長は、 515〜5551111(蛍光色素8001?¥ FLの検出）とした。なお、 50 サイクルの PCRに要した時間は、約 1時間であった。
[0084] [表 4]
(P CR反応液：単位// I )
蒸留水 8. 75
5 % N a N a 0. 5
20 % B S A 1
40%グリセロール 1 8. 75
1 0 G e n e T a q b u f f e r ' 5
2. 5m d N T P s 4
5 uM G Y P 2 C 9 * 3用プローブ 1
^ 00 μΜ CY P 2 C9 F 1プライマ一 0. 5
^ 00 μΜ CY P 2 C9 R 1プライマー 0. 25
5U u I G e n e T a g FP^ 0. 25
T o t a l 40 u L
* 商品名 G e n e T a q F P ： 二ツボンジーン社製
[0085] (プローブ）
CYP2C9*3用プローブ
5'— gggagaaggtcaaggtatc— (BODIPY FL)— 3' (配列番号 28)
[0086] (プライマーセット）
CYP2C9*3 F1プライマー
5― gagcccctgcatgcaa― ό ' (酉己歹1 Jil号 4)
CYP2C9*3 R1プライマー
5— gatactatgaatttggggacttcgaa— 3 (目 ti列番^ "17)
[0087] CYP2C9 * 3用プローブとマッチするハイブリッドの Tm値は、 59°C、ミスマッチの ハイブリッドの Tm値は、 54°Cである。
[0088] サンプル 1〜9の結果を図 1および 2に示す。これらの図は、温度上昇に伴う蛍光強 度の変化を示す Tm解析のグラフであり、縦軸の微分値は「一 d蛍光強度増加量/ dt 」を示し、横軸は温度を示す（以下、同様)。同図に示すように、シグナルのピークから 、各サンプルにおける CYP2C9* 3の遺伝子型を決定した。これらの実施例の結果 を裏付けるために、被検者 9人について、 RFLP法によって、 CYP2C9*3の遺伝子 型を確認した結果、実施例と同じ結果が得られた。このように、本発明のプライマー セットを使用することにより、前処理を施していない全血試料を使用して、 CYP2C9 遺伝子における CYP2C9 * 3の検出対象部位を含む目的領域を、特異的且つ効率 良く増幅し、多型を解析することができた。
実施例 2
[0089] 被検者 2人から EDTA採血管を用いて採血を行った（サンプル;!〜 2)。得られた血 液 1011 Lと下記希釈液 A 7011 Lとを混合し、さらに、この混合液 10 Lと下記希釈 液 Β 70 μ Lとを混合した。得られた混合液 10 Lを 95°Cで 5分間加熱処理した後、 下記組成の PCR反応液 46 μ Lに添加し、サーマルサイクラ一を用いて PCRを行つ た。 PCRの条件は、 95°Cで 60秒処理した後、 95°C1秒および 58°C15秒を 1サイク ルとして 50サイクル繰り返し、さらに 95°Cで 1秒、 40°Cで 60秒処理した。そして、続 けて、温度の上昇速度を C/3秒として、前記 PCR反応液を 40°Cから 75°Cに加熱 していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、 515〜555nm (蛍光 色素 BODIPY FLの検出）とした。
[0090] (希釈液 A)
10mM Tris— HCl(pH8)、 0. ImM EDTA, 0.05% NaN
3、 0.3% SDS
(希釈液 B)
lOmM Tris— HCl(pH8)、 0· ImM EDTA, 0.05% NaN
3
[0091] [表 5]
(PCR反応液：単位/ I )
蒸留水 1 8
5 % N a N a 0. 5
20 % B S A 0. 5
40%グリセロール 1 5
1 0 x Ge n e Ta q b u f f e r ¾ 5
2. 5mM d NTPs 4
5 uM C Y P 2 C 9 * 3用プローブ 2
1 00 jU CYP2C9 F 1プライマ一 0. 5
1 00 CYP2C9 FMプライマ一 0. 25
5 U u I G e n e T a q FP 0. 25
To t a l 46 fl L
* 商品名 G e n e T a q FP ： 二ツボンジーン社製
[0092] (プローブ） CYP2C9 * 3用プローブ
5' - ggagaaggtcaaggtatc - (BODIPY FL)— 3' (配列番号 29)
[0093] (プライマーセット）
CYP2C9 * 3 F1プライマー
5 cggagcccctgcatgcaa—《5' (酉己歹1 J番号 2)
CYP2C9 * 3 R1プライマー
5— aatgatactatgaatttggggacttcgaa— 3 (目己歹1 J番^ "丄 4)
[0094] CYP2C9 * 3用プローブとマッチするハイブリッドの Tm値は、 56°C、ミスマッチの ハイブリッドの Tm値は、 50°Cである。
[0095] サンプル 1〜2の結果を図 3に示す。この図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を 示す Tm解析のグラフであり、縦軸の微分値は「一 d蛍光強度増加量/ dt」を示し、横 軸は温度を示す。同図に示すように、シグナルのピークから、前記サンプルにおける CYP2C9 * 3の遺伝子型を決定した。この実施例の結果を裏付けるために、被検者 2人について、 RFLP法によって、 CYP2C9 * 3の遺伝子型を確認した結果、実施 例と同じ結果が得られた。このように、本発明のプライマーセットを使用することにより 、前処理を施していない全血試料を使用して、 CYP2C9遺伝子における CYP2C9 * 3の検出対象部位を含む目的領域を、特異的且つ効率良く増幅し、多型を解析す ること力 Sでさた。
産業上の利用可能性
[0096] 以上のように、本発明のプライマーセットによれば、 CYP2C9遺伝子における多型 CYP2C9 * 3が生じる部位を含む領域を、特異的に高効率で増幅することができる 。このため、前述のような従来法とは異なり手間やコストを低減することが可能となる。 また、このように多型の検出対象部位を含む領域が特異的に増幅されることから、例 えば、前記検出対象部位を含む検出対象配列に相補的なプローブを使用すること で、前記反応液を用いてそのまま Tm解析を行い、前記多型をタイピングすることが 可能となる。また、 1つの反応液で増幅やタイピングが可能であることから、操作の自 動化も可能になる。さらに、本発明のプライマーセットを用いれば、例えば、夾雑物が 含まれる試料 (例えば、全血や口腔粘膜等）であっても、前処理を省略できるため、よ り迅速且つ簡便に増幅反応を行うことができる。また、本発明のプライマーセットを用 いれば、従来よりも優れた増幅効率で増幅反応が行えるため、増幅反応も短縮化が 可能である。したがって、本発明のプライマーセットやこれを含む試薬、ならびにこれ らを用いた増幅産物の製造方法によれば、 CYP2C9遺伝子の多型を迅速かつ簡便 に解析できることから、医療分野にぉレ、てきわめて有効とレ、える。

Claims

請求の範囲 [1] 遺伝子増幅法により CYP2C9遺伝子を増幅するためのプライマーセットであって、 下記プライマーセット（1)を含むことを特徴とする CYP2C9遺伝子増幅用プライマ 一セット。 プライマーセット（1) 下記（F1)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R1)のオリ ゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット (F1)配列番号 1の塩基配列における 52466番目のアデニン塩基 (A)を一塩基目と して 5'方向に向力、つて 14〜； 18塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも 1つの オリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基 (A)を 3'末端とするオリゴヌクレオチ ド、
(R1)配列番号 1の塩基配列における 52631番目のチミン塩基 (T)を 1塩基目として 3'方向に向力、つて 19〜36塩基目までの領域に相補的な少なくとも 1つのオリゴヌク レオチドであって、前記 52631番目のチミン塩基 (T)に相補的なアデニン塩基 (A)
[2] 前記（1)のプライマーセットが、下記（1 ' )のプライマーセットである、請求の範囲 1 記載の CYP2C9遺伝子増幅用プライマーセット。
プライマーセット '） 下記（F1 ' )のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R1 ' )の オリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F1 ' )配列番号 2の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号 4の塩基 配列からなるオリゴヌクレオチド
(R1 ' )配列番号 14の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号 17の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
[3] CYP2C9遺伝子増幅用プライマーセットが、生体試料中の CYP2C9遺伝子を増 幅するためのプライマーセットである、請求の範囲 1記載の CYP2C9遺伝子増幅用 プライマーセット。
[4] 前記生体試料が、全血である、請求の範囲 3記載の CYP2C9遺伝子増幅用プライ マーセット。
[5] 遺伝子増幅法により CYP2C9遺伝子を増幅するための試薬であって、請求の範囲
1記載の CYP2C9遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする CYP2C9 遺伝子増幅用試薬。
[6] さらに、 CYP2C9遺伝子の検出対象部位にハイブリダィズ可能なプローブを含む、 請求の範囲 5記載の CYP2C9遺伝子増幅用試薬。
[7] 前記プローブが、下記（ΡΙ ' )に示すオリゴヌクレオチドからなるプローブである、請 求の範囲 6記載の CYP2C9遺伝子増幅用試薬。
(ΡΙ ' )配列番号 28の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 29の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
[8] 前記プローブが、蛍光標識化プローブである、請求の範囲 6記載の CYP2C9遺伝 子増幅用試薬。
[9] 遺伝子増幅法により CYP2C9遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、
下記 (I)工程を含むことを特徴とする増幅産物の製造方法。
(I)試料中の核酸を铸型として、請求の範囲 1記載の CYP2C9遺伝子増幅用プライ マーセットを用いて、反応液中で、前記 CYP2C9遺伝子の増幅を行う工程
[10] 前記 (I)工程において、前記反応液に、さらに、 CYP2C9遺伝子の検出対象部位 にハイブリダィズ可能なプローブを添加する、請求の範囲 9記載の増幅産物の製造 方法。
[11] 前記プローブが、下記（ΡΙ ' )に示すオリゴヌクレオチドからなるプローブである、請 求の範囲 10記載の増幅産物の製造方法。
(ΡΙ ' )配列番号 28の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 29の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
[12] 前記プローブが、蛍光標識化プローブである、請求の範囲 10記載の増幅産物の 製造方法。
[13] さらに、下記 (II)工程を含む、請求の範囲 12記載の増幅産物の製造方法。
(II)前記反応液について、前記蛍光標識化プローブにおける蛍光標識の蛍光強度 を測定する工程
[14] 前記試料が、生体試料である、請求の範囲 9記載の増幅産物の製造方法。
[15] 前記生体試料が、全血である、請求の範囲 14記載の増幅産物の製造方法。
[16] 前記反応液における全血試料の添加割合力 0. ；!〜 0. 5体積％である、請求の範 囲 15記載の増幅産物の製造方法。
[17] CYP2C9遺伝子における検出対象部位の多型を解析する方法であって、
下記 ω〜（iV)工程を含むことを特徴とする多型解析方法。
(i)請求の範囲 9記載の増幅産物の製造方法により、 CYP2C9遺伝子における検出 対象部位を含む領域を反応液中で増幅させる工程
(ϋ)前記 ω工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダィズ可能なプ ローブとを含む反応液を準備する工程
(iii)前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形 成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(iv)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定 する工程
[is] 前記 ω工程において、増幅反応に先立って、前記反応液に、前記検出対象部位 にハイブリダィズ可能なプローブを添加する、請求の範囲 17記載の多型解析方法。
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