KR101110425B1 - Ｎａｔ2 유전자 증폭용 프라이머 셋트, 그것을 포함하는 ｎａｔ2 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 - Google Patents

Ｎａｔ2 유전자 증폭용 프라이머 셋트, 그것을 포함하는 ｎａｔ2 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

유전자 증폭법에 의해, NAT2 유전자에서의 검출 목적 부위를 포함하는 목적 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 셋트로서, 상기 영역을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 셋트를 제공한다. 서열 번호 7, 서열 번호 33 및 서열 번호 60의 염기 서열로 이루어진 포워드 프라이머와, 서열 번호 18, 서열 번호 48 및 서열 번호 81의 염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머를 각각 포함하는 3쌍의 프라이머 셋트를 사용한다. 이 프라이머 셋트를 사용함으로써, 동일 반응액에서 동시에 NAT2 유전자의 3종류의 다형(NAT2*5, NAT2*6, NAT2*7)이 발생하는 부위를 각각 포함하는 3개의 영역을 증폭시킬 수 있다.

Description

ＮＡＴ2 유전자 증폭용 프라이머 셋트, 그것을 포함하는 ＮＡＴ2 유전자 증폭용 시약 및 그 용도{PRIMER SET FOR AMPLIFICATION OF NAT2 GENE, REAGENT FOR AMPLIFICATION OF NAT2 GENE COMPRISING THE SAME, AND USE OF THE SAME}
본 발명은, NAT2 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 셋트, 그것을 포함하는 NAT2 유전자 증폭용 시약 및 그 용도에 관한 것이다.
N-아세틸트랜스퍼라제(NAT)는, 방향족 아민이나 복소환 아민의 아릴아민을 N-포합화에 의해 무독성이며 안정된 물질로 대사하는 대사 경로에 관여하는 효소이다. 그 중에서도 NAT의 서브 타입인 NAT2는, 이소니아지드(INH), 설파메타진(sulfamethazine), 그 밖에 설폰아미드(sulfonamides), 프로카인아미드(procainamide), 히드랄라진(hydralazine), 카그페인(cagffeine), 다프손(dapsone) 등의 동소환 및 복소환 아릴아민이나 유사 히드라진 약물의 무독화 과정; 2-아미노플루오렌, 4-아미노비페닐, 벤지딘, β-나프틸아민, 단백질의 열분해 물질 중에 존재하는 복소환 아릴아민 등의 발현성 생리 물질이나 환경 물질 등의 활성화에 관여하고 있다. NAT2는 다형성을 나타내는 것이 알려져 있고, 인간에 있어서는 19종류의 다형이 알려져 있다. 이들 다형 중에서, NAT2*5류(NAT2*5A～5D)는, NAT2 유전자의 mRNA에서의 341위치의 T(티민)가 C(시토신)로 변이되어 있고, NAT2*6류(NAT2*6A, NAT2*6B)는, 상기 mRNA에서의 590위치의 G(구아닌)가 A(아데닌)으로, NAT2*7류(NAT2*7A, NAT2*7B)는 mRNA에서의 857위치의 G(구아닌)가 A(아데닌)으로 변이된 다형이다.
이러한 변이를 갖는 환자가 길항 항제인 INH를 복용한 경우, 간기능 장해가 발생하는 것이 알려져 있다. 이것은, NAT2 유전자 변이로 인해 NAT2 활성이 변하고, 이에 의해 INH의 N-아세틸화가 충분히 행해지지 않아, 간독성이 높은 히드라진의 생성이 증대되었기 때문이다. 그 밖에도, 상술한 프로카인아미드나 설파살라진 등의 부작용에, NAT2의 유전자 다형이 관련되어 있는 것이 명확해졌다. 이 때문에, 환자의 NAT2의 유전자 다형을 확인하는 것은, 부작용을 회피하여 적절한 약물 치료를 함에 있어 매우 중요하다. 특히 NAT2에 대해서는, 복수의 다형(NAT2*5, NAT2*6, NAT2*7)을 확인하는 것이 중요하다.
한편, 모든 질환의 원인이나, 개체간의 질환 이(易)나환성(질환에 걸리기 쉬움), 개체간에 있어서의 약효의 차이 등을 유전자 레벨로 해석하는 방법으로서, 점돌연변이, 소위 일염기 다형(SNP)의 검출이 널리 행해지고 있다. 점돌연변이의 일반적인 검출 방법으로는, (1) 시료의 표적 DNA에 대해, 검출 대상 서열에 상당하는 영역을 PCR(Polymerase chain reaction)에 의해 증폭시켜 그 전체 유전자 서열을 해석하는 Direct Sequencing법, (2) 시료의 표적 DNA에 대해, 검출 대상 서열에 상당하는 영역을 PCR에 의해 증폭시켜, 상기 검출 대상 서열에서의 목적의 변이의 유무에 따라 절단 작용이 상이한 제한 효소에 의해 그 증폭 산물을 절단하고, 전기 영동을 행함으로써 타이핑을 행하는 RFLP 해석, (3) 3' 말단 영역에 목적의 변이가 위치하는 프라이머를 사용하여 PCR을 행하고, 증폭의 유무에 따라 변이를 판단하는 ASP-PCR법 등을 들 수 있다.
그러나, 이러한 방법은, 예를 들어 시료로부터 추출한 DNA의 정제, 전기 영동, 제한 효소 처리 등이 필수이므로, 수고나 비용이 들게 된다. 또, PCR을 행한 후 반응 용기를 일단 개봉해야 하기 때문에, 상기 증폭 산물이 다음 반응계에 혼입되어 해석 정밀도가 저하될 우려가 있다. 또한, 자동화가 어렵기 때문에, 대량의 샘플을 해석할 수 없다. 또, 상기 (3)의 ASP-PCR법은 특이성이 낮다는 문제도 있다.
이러한 문제 때문에, 최근 점돌연변이의 검출 방법으로서, 표적 핵산과 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해 온도(Tm : melting temperature)를 해석하는 방법이 실용화되고 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해 곡선 해석이라 불리고 있다. 이것은 이하와 같은 방법이다. 즉, 우선 검출 목적의 점돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 이어서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하여, 온도 상승에 따르는 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 점돌연변이의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은, 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 점돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해 미리 Tm값(평가 기준치)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정치)을 측정한다. 상기 측정치가 평가 기준치와 동일한 정도라면 매치, 즉 표적 DNA에 점돌연변이가 존재한다고 판단할 수 있고, 측정치가 평가 기준치보다 낮으면 미스매치, 즉 표적 DNA에 점돌연변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다. 그리고, 이 방법에 의하면, 유전자 해석의 자동화도 가능하다.
그러나, 이러한 Tm 해석을 이용한 검출 방법도, PCR에 있어서 검출 목적 부위를 포함하는 영역을 특이적이고 효율적으로 증폭시켜야 한다는 문제가 있다. 특히, NAT에는 많은 아이소자임이 존재하고, 이들을 코드하는 서열도 매우 유사하기 때문에, PCR에 있어서 NAT2 이외의 아이소자임의 코드 유전자까지도 증폭될 우려가 있다. 또, 이와 같이 다른 아이소자임의 코드 유전자까지도 증폭된 경우, 예를 들어 NAT2 유전자의 특정 다형(NAT2*5, NAT2*6 또는 NAT2*7)의 해석(비특허문헌 1 또는 비특허문헌 2)에 있어서 해석 결과의 신뢰성을 저하시키는 원인도 된다. 그리고, 이와 같이, 하나의 샘플을 해석하는 데에도 많은 노력이 수반되므로, 대량의 샘플을 해석하는 것은 실용적이지 않다는 문제도 있다.
비특허문헌 1 : PMID : 8102908 Jpn J Hum Genet. 1993 Jun; 38(2) : 163-8.
비특허문헌 2 : PMID : 10507782 Br J Cancer. 1999 Oct; 81(3) : 537-41.
따라서, 본 발명은 유전자 증폭법에 의해 NAT2 유전자의 목적 영역을 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머 셋트의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 프라이머 셋트는, 유전자 증폭법에 의해 NAT2 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 셋트로서, 하기 프라이머 셋트 (1)～(3)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 프라이머 셋트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
프라이머 셋트 (1)
하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 포워드 프라이머 및 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 리버스 프라이머를 포함하는 한쌍의 프라이머 셋트:
(F1) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1038번째 구아닌 염기 (G)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～32번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드,
(R1) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1096번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 17～24번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1096번째 시토신 염기 (C)에 상보적인 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드;
프라이머 셋트 (2)
하기 (F2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 포워드 프라이머 및 하기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 리버스 프라이머를 포함하는 한쌍의 프라이머 셋트:
(F2) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1278번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～38번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기 (C)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드,
(R2) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1355번째 구아닌 염기 (G)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 25～40번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1355번째 구아닌 염기 (G)에 상보적인 시토신 염기 (C)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드, 및
서열 번호 1의 염기 서열에서의 1614번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 21～36번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1614번째 시토신 염기 (C)에 상보적인 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
중 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드;
프라이머 셋트 (3)
하기 (F3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 포워드 프라이머 및 하기 (R3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 리버스 프라이머를 포함하는 한쌍의 프라이머 셋트:
(F3) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1556번째 티민 염기 (T)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 21～40번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 티민 염기 (T)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드, 및
서열 번호 1의 염기 서열에서의 1278번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～38번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기 (C)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
중 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드,
(R3) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1614번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 21～36번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1614번째 시토신 염기 (C)에 상보적인 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
또, 본 발명의 유전자 증폭용 시약은, 유전자 증폭법에 의해 NAT2 유전자를 증폭시키기 위한 시약으로서, 상기 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법은, 유전자 증폭법에 의해 NAT2 유전자의 증폭 산물을 제조하는 방법으로서, 하기 (I) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(I) 시료 중의 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트를 사용하여, 반응액 중에서 상기 NAT2 유전자를 증폭시키는 공정.
본 발명의 다형 해석 방법은, NAT2에서의 3개의 검출 대상 부위의 다형을 해석하는 방법으로서, 하기 (i)～(iv) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(i) 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의해 NAT2 유전자에서의 검출 대상 부위를 포함하는 영역을 반응액 중에서 증폭시키는 공정,
(ii) 상기 (i) 공정에서의 증폭 산물과, 상기 검출 대상 부위에 하이브리드화가능한 프로브를 포함하는 반응액을 준비하는 공정,
(iii) 상기 반응액의 온도를 변화시켜 상기 증폭 산물과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 공정, 및
(iv) 온도 변화에 따르는 상기 시그널값의 변동으로부터 상기 검출 대상 부위의 다형을 결정하는 공정.
본 발명의 프라이머 셋트에 의하면, NAT2 유전자에서의 검출 목적의 다형(NAT2*5, NAT2*6 또는 NAT2*7)이 발생하는 부위를 포함하는 목적 영역을, 반응액 중에서 특이적으로 또한 고효율로 증폭시킬 수 있다. 이 때문에, 상술한 바와 같은 종래법과는 달리, 수고나 비용을 저감하는 것이 가능해진다. 또, 이와 같이 NAT2 유전자의 특정 다형이 발생하는 검출 대상 부위를 포함하는 영역이 특이적으로 증폭되기 때문에, 예를 들어 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용함으로써, 상기 반응액을 사용하여 그대로 Tm 해석을 행하여, 상기 다형을 타이핑하는 것이 가능해진다. 또, 하나의 반응액으로 증폭이나 타이핑이 가능하기 때문에, 조작의 자동화도 가능해진다. 또한, 본 발명의 프라이머 셋트를 사용하면, 예를 들어 불순물이 포함되는 시료(예를 들어, 전혈(全血)이나 구강 점막 등)라 하더라도, 전처리를 생략할 수 있기 때문에, 보다 신속하고 간편하게 증폭 반응을 행할 수 있다. 또, 본 발명의 프라이머 셋트를 사용하면, 종래보다 우수한 증폭 효율로 증폭 반응을 행할 수 있기 때문에, 증폭 반응도 단축화가 가능하다. 따라서, 본 발명의 프라이머 셋트나 이것을 포함하는 시약, 및 이들을 사용한 증폭 산물의 제조 방법 및 다형 해석 방법에 의하면, NAT2 유전자의 다형을 신속하고 간편하게 해석할 수 있기 때문에, 의료 분야에서 매우 유효하다고 할 수 있다.
-발명을 실시하기 위한 최량의 형태-
<NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트>
본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트는, 상술한 바와 같이, 상기 프라이머 셋트 (1)～(3)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 프라이머 셋트를 포함하는 것을 특징으로 한다. 적어도 어느 하나의 프라이머 셋트를 포함함으로써, 예를 들어 NAT2 유전자에서의 특정한 목적 영역을 특이적으로 증폭시키는 것이 가능하다.
본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트는, 예를 들어 상기 프라이머 셋트 (1)～(3) 중 어느 1종류만을 포함해도 되고, 어느 2종류, 또는 프라이머 셋트 (1)～(3) 모두를 포함해도 된다. 후술하지만, 프라이머 셋트 (1)에 의해 특이적으로 증폭시킬 수 있는 목적 영역은, NAT2 유전자에 있어서 다형 NAT2*5가 발생하는 부위를 포함하는 영역이고, 프라이머 셋트 (2)에 의해 특이적으로 증폭시킬 수 있는 목적 영역은, NAT2 유전자에 있어서 다형 NAT2*6이 발생하는 부위를 포함하는 영역이고, 프라이머 셋트 (3)에 의해 특이적으로 증폭시킬 수 있을 목적 영역은, NAT2 유전자에 있어서 다형 NAT2*7이 발생하는 부위를 포함하는 영역이다.
상술한 바와 같이, NAT2 유전자의 이들 3종류의 다형은, 모두 약제 대사에 영향을 미치는 다형으로 알려져 있기 때문에, 어느 1종류 뿐만 아니라, 어느 2종류 또는 3종류 모두의 다형을 조사하는 것이 중요시되고 있다. 그러나, 종래법에서는, 하나의 반응계에서 복수의 서열을 해석할 수 없다는 문제가 있다. 이것은, 상술한 바와 같이, NAT에는 많은 아이소자임이 존재하기 때문에, PCR에 있어서 NAT2 이외의 아이소자임의 코드 유전자까지도 증폭되는 것이 원인으로 생각된다. 이 때문에, NAT2 유전자의 3종류의 다형(NAT2*5, NAT2*6 및 NAT2*7) 중 2종류 또는 3종류 모두를 조사하기 위해서는, 각각의 다형이 발생하는 부위를 포함하는 영역을 별개의 반응계에서 각각 증폭시켜, 얻어진 증폭 산물을 별개로 해석해야 한다. 이와 같이, 종래의 방법에서는, NAT 유전자 중에서도 NAT2 유전자만을 주형으로 하고, 또한 NAT2 유전자에 있어서 상기 다형이 발생하는 부위를 각각 포함하는 2종류 또는 3종류의 목적 영역만을 특이적으로 증폭시키는 것은 매우 어렵다. 그리고, 이와 같이 하나의 샘플을 해석하는 데에도 많은 노력이 수반되므로, 대량의 샘플을 해석하는 것은 실용적이지 않다는 문제가 있다. 이에 비해, 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트에 의하면, 상기 프라이머 셋트 (1)～(3) 중 어느 2종류 또는 3종류 모두를 포함하는 경우라 하더라도, 각각의 목적 영역을, 동일 반응액에서 동시에 또한 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 이 때문에, 상술한 종래법과는 달리, 수고나 비용을 저감하는 것이 가능해진다. 또, 이와 같이 동일 반응액에서 2개 또는 3개의 목적 영역이 특이적으로 증폭되기 때문에, 예를 들어 각각의 목적 영역에서의 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용함으로써, 상기 반응액을 사용하여 그대로 Tm 해석을 행하여, 상기 2종류 또는 3종류의 다형을 각각 타이핑하는 것이 가능해진다. 이와 같이, NAT2 유전자에서의 2종류 또는 3종류의 다형을 동일 반응액으로 해석하는 것이 가능해지기 때문에, 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트는, 예를 들어 프라이머 셋트 (1)～(3) 중 어느 1종류를 포함하는 경우는 물론, 어느 2종류 또는 3종류를 포함하는 것도 바람직하다. 이러한 NAT2 유전자 프라이머 셋트를 사용하여, 1개의 목적 영역은 물론, 2개 또는 3개의 목적 영역을 동시에 증폭시키면, 종래보다 효율적으로 NAT2 유전자의 다형 해석을 행할 수 있다.
이하, 포워드 프라이머를 F 프라이머, 리버스 프라이머를 R 프라이머라고 하기도 한다.
상기 프라이머 셋트 (1)은, 상술한 바와 같이, 하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 포워드 프라이머 및 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 리버스 프라이머를 포함하는 한쌍의 프라이머 셋트이다.
하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 포워드 프라이머 및 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 리버스 프라이머를 포함하는 한쌍의 프라이머 셋트:
(F1) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1038번째 구아닌 염기 (G)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～32번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드 ,
(R1) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1096번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 17～24번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1096번째 시토신 염기 (C)에 상보적인 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
서열 번호 1에 나타내는 염기 서열은, 인간 유래 알릴아민 N-아세틸트랜스퍼라제 NAT 대립유전자 1-2 유전자(Human hNAT allele 1-2 gene for arylamine N-acetyltransferase)의 DNA 서열로서, 예를 들어 NCBI 기탁번호 No. D10870로 등록되어 있다.
상기 프라이머 셋트 (1)은, 서열 번호 1에서의 1039번째～1095번째 영역을 포함하는 DNA쇄 및 그 상보쇄를 증폭시키기 위한 프라이머 셋트이다. 이 영역내의 1063번째 염기(서열 번호 1에서의 1063번째 염기)는, NAT2의 기능에 영향을 미치는 점돌연변이(1063T, 1063C)의 존재가 알려져 있고, 이 다형이 상술한 NAT2*5이다. 본 발명에 있어서, 이 부위의 다형은, 호모 접합체의 경우 1063T/T, 1063C/C, 헤테로 접합체의 경우 1063T/C로 나타낼 수 있다. 서열 번호 1에서의 1063번째 염기는, NAT2 유전자의 mRNA에서의 341번째 염기에 상당하기 때문에, NAT2*5의 다형으로서, 예를 들어 341T/T, 341C/C, 341T/C로 나타낼 수도 있다. 이하, 이 프라이머 셋트 (1)을 「NAT2*5용 프라이머 셋트」라고도 한다. NAT2*5의 다형만을 해석하는 경우에는, NAT2*5용 프라이머 셋트만을 사용하면 된다.
프라이머 셋트 (1)의 F1 프라이머 및 R1 프라이머는, DNA 폴리머라제에 의한 증폭의 개시점을 결정하는 역할을 하는 3' 말단의 염기가, 상술한 조건을 만족하면 된다. 이와 같이 각 프라이머의 3' 말단의 염기를 고정함으로써, 프라이머 셋트 (1)가 예를 들어, 유사한 다른 아이소자임의 유전자(예를 들어, NAT1, NAT6, NAT8, NAT9 유전자 등)에 결합하는 것을 충분히 방지할 수 있다.
이와 같이, F1 프라이머 및 R1 프라이머는, 그 3' 말단의 염기가 고정되어 있으면 되기 때문에, 각 프라이머의 길이 자체는 특별히 제한되지 않고, 일반적인 길이로 적절히 조정할 수 있다. 프라이머의 길이의 일례로는, 예를 들어 13～50mer의 범위이며, 바람직하게는 14～45mer이고, 보다 바람직하게는 15～40mer이다. 구체예로서, 상기 F1 프라이머는 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1038번째 구아닌 염기 (G)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～32번째 염기(바람직하게는 24～30번째 염기, 보다 바람직하게는 25～29번째 염기)까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또, 상기 R1 프라이머는, 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1096번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 17～24번째 염기(바람직하게는 19～23번째 염기, 보다 바람직하게는 20～22번째 염기)까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. F1 프라이머와 R1 프라이머의 3' 말단이 고정되어 있기 때문에, 프라이머로부터 신장되는 영역은, 예를 들어 상술한 바와 같이 서열 번호 1에서의 1039번째～1095번째 영역이지만, 얻어지는 증폭 산물의 전체 길이는 사용하는 프라이머의 길이에 따라 변화한다.
또, R1 프라이머는 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 대해, F1 프라이머는 상기 염기 서열의 상보쇄에 대해, 각각 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드가 아니라도 된다. 즉, 각 프라이머에서의 3' 말단의 염기를 제외한 부분에서, 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드와 1개～5개의 염기가 상이해도 된다.
이하에, F1 프라이머와 R1 프라이머의 구체예를 나타내지만, 본 발명은 이것에 한정되지는 않는다. 또, 이들 F1 프라이머와 R1 프라이머의 조합은 전혀 제한되지 않지만, 이들 중에서도, 서열 번호 5 또는 서열 번호 7의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 F1' 프라이머와 서열 번호 16 또는 서열 번호 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 R1' 프라이머를 포함하는 프라이머 셋트 (1')가 특히 바람직하다. 하기 표에서의 「Tm(℃)」는, 하기 표의 서열과 완전히 상보적인 서열이 하이브리드한 경우의 Tm(℃)이고, MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/)에 의해, 파라메터를 올리고뉴클레오티드 농도 0.2 uM, 나트륨 당량(Na eq.) 50mM로 하여 산출한 값이다(이하, 동일). 상기 Tm값은, 예를 들어 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/) 등에 의해 산출할 수 있고, 또 인접법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수도 있다(이하, 동일).
Figure 112011005628120-pat00001
다음으로, 상기 프라이머 셋트 (2)는, 상술한 바와 같이, 하기 (F2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 포워드 프라이머 및 하기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 리버스 프라이머를 포함하는 한쌍의 프라이머 셋트이다.
하기 (F2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 포워드 프라이머 및 하기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 리버스 프라이머를 포함하는 한쌍의 프라이머 셋트:
(F2) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1278번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～38번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기 (C)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드,
(R2) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1355번째 구아닌 염기 (G)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 25～40번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1355번째 구아닌 염기 (G)에 상보적인 시토신 염기 (C)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드, 및
서열 번호 1의 염기 서열에서의 1614번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 21～36번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1614번째 시토신 염기 (C)에 상보적인 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
중 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드.
상기 프라이머 셋트 (2)는, 서열 번호 1에서의 1279번째～1354번째 영역 또는 1279번째～1613번째 영역을 포함하는 DNA쇄 및 그 상보쇄를 증폭시키기 위한 프라이머 셋트이다. 이 영역내의 1312번째 염기(서열 번호 1에서의 1312번째 염기)는, NAT2의 기능에 영향을 미치는 점돌연변이(1312G, 1312A)의 존재가 알려져 있고, 이 다형이 상술한 NAT2*6이다. 본 발명에 있어서, 이 부위의 다형은, 호모 접합체의 경우 1312G/G, 1312A/A, 헤테로 접합체의 경우 1312G/A로 나타낼 수 있다. 서열 번호 1에서의 1312번째 염기는, NAT2 유전자의 mRNA에서의 590번째 염기에 상당하므로, NAT2*6의 다형으로서, 예를 들어 590G/G, 590A/A, 590G/A로 나타낼 수도 있다. 이하, 이 프라이머 셋트 (2)를 「NAT2*6용 프라이머 셋트」라고도 한다. NAT2*6의 다형만을 해석하는 경우에는, NAT2*6용 프라이머 셋트만을 사용하면 된다.
본 발명에 있어서, 프라이머 셋트 (2)의 F2 프라이머 및 R2 프라이머는, 상기 프라이머 셋트 (1)과 동일한 이유로, DNA 폴리머라제에 의한 증폭의 개시점을 결정하는 역할을 하는 3' 말단의 염기가, 상술한 조건을 만족하면 된다. 이 때문에, F2 프라이머 및 R2 프라이머의 길이 자체는 특별히 제한되지 않고, 상술한 것과 동일한 길이를 예시할 수 있다. 구체예로서, 상기 F2 프라이머는, 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1278번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～38번째 염기(바람직하게는 21～38번째 염기, 보다 바람직하게는 22～38번째 염기)까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또, 상기 R2 프라이머는, 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1355번째 구아닌 염기 (G)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 25～40번째 염기(바람직하게는 27～35번째 염기, 보다 바람직하게는 28～34번째 염기)까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드, 또는 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1614번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 21～36번째 염기(바람직하게는 23～36번째 염기, 보다 바람직하게는 24～36번째 염기)까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. F2 프라이머와 R2 프라이머의 3' 말단이 고정되어 있기 때문에, 프라이머로부터 신장되는 영역은, 통상 상술한 바와 같이 서열 번호 1에서의 1279번째～1354번째 영역 또는 1279번째～1613번째 영역이지만, 얻어지는 증폭 산물의 전체 길이는 사용하는 프라이머의 길이에 따라 변화한다.
또, R2 프라이머는 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 대하여, F2 프라이머는 상기 염기 서열의 상보쇄에 대하여, 각각 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드가 아니라도 된다. 즉, 각 프라이머에서의 3' 말단의 염기를 제외한 부분에서, 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드와 1개～5개의 염기가 상이해도 된다.
이하에, F2 프라이머와 R2 프라이머의 구체예를 나타내지만, 본 발명은 이것에 한정되지는 않는다. 또, 이들 F2 프라이머와 R2 프라이머의 조합은 전혀 제한되지 않지만, 이들 중에서도, 서열 번호 33 또는 서열 번호 109의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 F2' 프라이머와 서열 번호 39 또는 서열 번호 48의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 R2' 프라이머를 포함하는 프라이머 셋트 (2')가 특히 바람직하다.
Figure 112011005628120-pat00002
다음으로, 상기 프라이머 셋트 (3)은, 상술한 바와 같이, 하기 (F3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 포워드 프라이머 및 하기 (R3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 리버스 프라이머를 포함하는 한쌍의 프라이머 셋트이다.
하기 (F3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 포워드 프라이머 및 하기 (R3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 리버스 프라이머를 포함하는 한쌍의 프라이머 셋트:
(F3) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1556번째 티민 염기 (T)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 21～40번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 티민 염기 (T)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드, 및
서열 번호 1의 염기 서열에서의 1278번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～38번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기 (C)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
중 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드,
(R3) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1614번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 21～36번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1614번째 시토신 염기 (C)에 상보적인 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
상기 프라이머 셋트 (3)은, 서열 번호 1에서의 1557번째～1613번째 영역 또는 1279번째～1613번째 영역을 포함하는 DNA쇄 및 그 상보쇄를 증폭시키기 위한 프라이머 셋트이다. 이 영역내의 1579번째 염기(서열 번호 1에서의 1579번째 염기)는, NAT2의 기능에 영향을 미치는 점돌연변이(1579G, 1579A)의 존재가 알려져 있고, 이 다형이 상술한 NAT2*7이다. 본 발명에 있어서, 이 부위의 다형은, 호모 접합체의 경우 1579G/G, 1579A/A, 헤테로 접합체의 경우 1579G/A로 나타낼 수 있다. 서열 번호 1에서의 1579번째 염기는, NAT2 유전자의 mRNA에서의 857번째 염기에 상당하므로, NAT2*7의 다형으로서, 예를 들어 857G/G, 857A/A, 857G/A로 나타낼 수도 있다. 이하, 이 프라이머 셋트 (3)을 「NAT2*7용 프라이머 셋트」라고도 한다. NAT2*7의 다형만을 해석하는 경우에는, NAT2*7용 프라이머 셋트만을 사용하면 된다.
*본 발명에 있어서, 프라이머 셋트 (3)의 F3 프라이머 및 R3 프라이머는, 상기 프라이머 셋트 (1)과 동일한 이유로, DNA 폴리머라제에 의한 증폭의 개시점을 결정하는 역할을 하는 3' 말단의 염기가 상술한 조건을 만족하면 된다. 이 때문에, F3 프라이머 및 R3 프라이머의 길이 자체는 특별히 제한되지 않고, 상술한 것과 동일한 길이를 예시할 수 있다. 구체예로서, 상기 F3 프라이머는, 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1556번째 티민 염기 (T)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 21～40번째 염기(바람직하게는 23～40번째 염기, 보다 바람직하게는 24～40번째 염기)까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드, 또는 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1278번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～38번째 염기(바람직하게는 21～38번째 염기, 보다 바람직하게는 22～38번째 염기)까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또, 상기 R3 프라이머는, 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1614번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 21～36번째 염기(바람직하게는 23～35번째 염기, 보다 바람직하게는 24～28번째 염기)까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. F3 프라이머와 R3 프라이머의 3' 말단이 고정되어 있기 때문에, 프라이머로부터 신장되는 영역은, 통상 상술한 바와 같이 서열 번호 1에서의 1557번째～1613번째 영역 또는 1279번째～1613번째 영역이지만, 얻어지는 증폭 산물의 전체 길이는 사용하는 프라이머의 길이에 따라 변화한다.
또, R3 프라이머는 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 대하여, F3 프라이머는 상기 염기 서열의 상보쇄에 대하여, 각각 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드가 아니라도 된다. 즉, 각 프라이머에서의 3' 말단의 염기를 제외한 부분에서, 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드와 1개～5개의 염기가 상이해도 된다.
이하에, F3 프라이머와 R3 프라이머의 구체예를 나타내지만, 본 발명은 이것에 한정되지는 않는다. 또, 이들 F3 프라이머와 R3 프라이머의 조합은 전혀 제한되지 않지만, 이들 중에서도, 서열 번호 60 또는 서열 번호 113의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 F2' 프라이머와 서열 번호 71 또는 서열 번호 81의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 R3' 프라이머를 포함하는 프라이머 셋트 (3')가 특히 바람직하다.
Figure 112011005628120-pat00003
또, 상술한 각 프라이머는, 예를 들어 증폭 반응의 반응 온도를 높이기 위해, 종래 공지의 임의의 서열을 5' 말단에 부가한 것이어도 된다.
상기 프라이머 셋트 (2) 또는 상기 프라이머 셋트 (3)에 의해, 1279번째～1613번째를 포함하는 DNA쇄 및 그 상보쇄를 증폭시키는 경우, 어느 프라이머 셋트에 있어서도, 이하에 나타내는 동일한 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 사용할 수 있다.
포워드 프라이머:
(F2) (F3) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1278번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～38번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기 (C)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
리버스 프라이머:
(R2) (R3) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1614번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 21～36번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1614번째 시토신 염기 (C)에 상보적인 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
이 경우, 본 발명의 프라이머 셋트는, 프라이머 셋트 (1) 외에, 프라이머 셋트 (2) 및 (3)으로서, 예를 들어 1종류의 프라이머 셋트(NAT2*6*7용 프라이머)를 포함하기만 해도 된다. 또, 포워드 프라이머는 상기 프라이머 셋트 (2) 및 프라이머 셋트 (3)의 포워드 프라이머를 겸하는 1종류의 포워드 프라이머를 포함하고, 리버스 프라이머는 상기 프라이머 셋트 (2) 및 프라이머 셋트 (3)의 각각의 리버스 프라이머를 포함해도 된다.
이러한 프라이머 셋트 (1)～(3)의 적어도 하나를 포함하는 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트는, 예를 들어 전혈 시료 등의 생체 시료에서의 NAT2 유전자를 증폭시킬 때 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트를, 후술하는 바와 같은 다형의 검출용 프로브와 함께 사용할 때에는, 유전자 증폭용 반응액에서의 전혈 시료의 첨가 비율을 0.1～0.5 체적%로 하는 것이 바람직하다. 이 점에 관해서는 후술한다.
<NAT2 유전자 증폭용 시약>
본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 시약은, 상술한 바와 같이, 유전자 증폭법에 의해 NAT2 유전자를 증폭시키기 위한 시약으로서, 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 시약은, 본 발명의 프라이머 셋트를 포함하는 것이 특징이며, 그 외의 조성 등은 전혀 제한되지 않는다.
본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 시약은, 예를 들어, 본 발명의 프라이머 셋트를 사용한 유전자 증폭법에 의해 얻어지는 증폭 산물을 검출하기 위해, NAT2 유전자의 검출 대상 부위에 하이브리드화가능한 프로브를 더 포함해도 된다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 프라이머 셋트에 의하면, 예를 들어 그것에 포함되는 프라이머 셋트 (1)～(3)의 종류에 따라, 유전자 증폭법에 의해 NAT2 유전자에서의 1개～3개의 목적 영역을 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 이 때문에, 상기 각 목적 영역에서의 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 공존시킴으로써, 예를 들어 증폭의 유무나 검출 대상 부위의 유전자형(다형) 등을, 후술하는 방법에 의해 검출하는 것이 가능하다. 이러한 프로브나 그 이용 방법에 관해서는, 이후의 다형의 해석 방법에서 설명한다. 또, 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 시약은, 전혈 등의 생체 시료에서의 NAT2 유전자를 증폭시킬 때 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 시약을, 상술한 프로브와 함께 사용할 때에는, 유전자 증폭용 반응액에서의 전혈 시료의 첨가 비율을 0.1～0.5 체적%로 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 「검출 대상 서열」이란, 다형이 발생하는 부위(검출 대상 부위)를 포함하는 서열을 의미한다.
본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 시약의 형태는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트를 함유하는 액체 시약이어도 되고, 사용전에 용매로 현탁하는 건조 시약이어도 된다. 또, NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트의 함유량도 특별히 제한되지 않는다.
<증폭 산물의 제조 방법>
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법은, 상술한 바와 같이, 유전자 증폭법에 의해 NAT2 유전자의 증폭 산물을 제조하는 방법으로서, 하기 (I) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(I) 시료 중의 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트를 사용하여, 반응액 중에서 상기 NAT2 유전자를 증폭시키는 공정.
이와 같이 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트를 사용하여 증폭 반응을 행함으로써, 상술한 바와 같이, NAT2 유전자의 목적 영역을 증폭시킬 수 있다. 또, 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트가, 상기 프라이머 셋트 (1)～(3) 중 어느 2종류를 포함하는 경우는, NAT2 유전자에서의 2개의 검출 대상 부위를 각각 포함하는 2개의 목적 영역을, 동일 반응액 중에서 동시에 증폭시킬 수 있다. 또, 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트가, 상기 프라이머 셋트 (1)～(3) 모두를 포함하는 경우에는, NAT2 유전자에서의 3개의 검출 대상 부위를 각각 포함하는 3개의 목적 영역을, 동일 반응액 중에서 동시에 증폭시킬 수 있다. 본 발명에 의해 증폭시키는 목적 영역은, 상술한 바와 같이, 각 다형(NAT2*5, NAT2*6 및 NAT2*7)이 발생하는 검출 대상 부위를 각각 포함하는 영역이다. 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 있어서는, 본 발명의 프라이머 셋트를 사용하는 것이 특징이며, 유전자 증폭법의 종류나 조건 등은 전혀 제한되지 않는다.
상기 유전자 증폭법으로는, 상술한 바와 같이 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA(Transcription-mediated amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법 등을 들 수 있지만, PCR법이 바람직하다. 이하, PCR법을 예를 들어 본 발명을 설명하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명을 적용하는 시료로는, 예를 들어 주형이 되는 핵산을 포함하고 있으면 되고, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 불순물이 포함되는 재료에 적용하는 것이 바람직하다. 상기 불순물이 포함되는 시료로는, 예를 들어, 전혈, 구강내 세포(예를 들어, 구강 점막), 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식세포, 객담, 양수, 파라핀 포매 조직, 뇨, 위액(예를 들어, 위세정액) 등, 또는 이들의 현탁액 등을 들 수 있다. 본 발명의 프라이머 셋트를 사용한 증폭 산물의 제조 방법에 의하면, 예를 들어 여러가지 불순물이 포함되는 시료(특히, 전혈이나 구강내 세포 등의 생체 시료)라 하더라도 그 영향을 잘 받지 않아, NAT2 유전자의 상기 영역을 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 이 때문에, 본 발명에 의하면, 종래법에서는 어려웠던 불순물이 많은 시료라 하더라도, 예를 들어 정제 등의 전처리를 행하지 않고 그대로 사용하는 것이 가능하다. 따라서, 시료의 전처리의 관점에서도, 종래법보다 더욱 신속하게 증폭 산물을 조제하는 것이 가능하다고 할 수 있다.
상기 반응액에서의 시료의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않는다. 구체예로서, 상기 시료가 생체 시료(예를 들어, 전혈 시료)인 경우, 상기 반응액에서의 첨가 비율의 하한이, 예를 들어 0.01 체적% 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05 체적% 이상, 더욱 바람직하게는 0.1 체적% 이상이다. 또, 상기 첨가 비율의 상한도 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 2 체적% 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1 체적% 이하, 더욱 바람직하게는 0.5 체적% 이하이다.
또, 후술하는 바와 같은 광학적 검출을 목적으로 하는 경우, 특히 표지화 프로브를 사용한 광학적 검출을 행하는 경우, 상기 반응액에서의 전혈 시료 등의 생체 시료의 첨가 비율은, 예를 들어 0.1～0.5 체적%로 설정하는 것이 바람직하다. PCR 반응에 있어서는, 통상 DNA 변성(단일쇄 DNA로의 해리)을 위해 열처리가 실시되지만, 이 열처리에 의해 시료에 포함되는 당이나 단백질 등이 변성되어, 불용화의 침전물이나 혼탁 등이 발생할 우려가 있다. 이 때문에, 증폭 산물의 유무나 검출 대상 부위의 유전자형(다형)을 광학적 수법에 의해 확인하는 경우, 이러한 침전물이나 혼탁의 발생이 측정 정밀도에 영향을 미칠 가능성이 있다. 그러나, 반응액에서의 전혈 시료의 첨가 비율을 상술한 범위로 설정하면, 메커니즘은 불명확하지만, 예를 들어 변성에 의한 침전물 등의 발생에 의한 영향을 충분히 방지할 수 있으므로, 광학적 수법에 의한 측정 정밀도를 향상시킬 수 있다. 또, 전혈 시료 중의 불순물에 의한 PCR의 저해도 충분히 억제되기 때문에, 증폭 효율을 한층 더 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머 셋트의 사용에 더하여, 전혈 시료 등의 시료의 첨가 비율을 상술한 범위로 설정함으로써, 한층 더 시료의 전처리의 필요성을 배제할 수 있다.
또, 상기 반응액 중의 전혈 시료의 비율은, 상술한 바와 같은 체적 비율(예를 들어, 0.1～0.5 체적%)이 아니라, 헤모글로빈(이하, 「Hb」라 한다)의 중량 비율로 나타낼 수도 있다. 이 경우, 상기 반응액에서의 전혈 시료의 비율은, Hb량으로 환산하여, 예를 들어 0.565～113 g/L의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 2.825～56.5 g/L의 범위, 더욱 바람직하게는 5.65～28.25 ㎍/L의 범위이다. 상기 반응 중에서의 전혈 시료의 첨가 비율은, 예를 들어 상기 체적 비율과 Hb 중량 비율 모두를 만족해도 되고, 어느 하나를 만족해도 된다.
전혈로는, 예를 들어 용혈한 전혈, 미용혈의 전혈, 항응고 전혈, 응고 분획을 포함하는 전혈 등 어느 것이라도 된다.
본 발명에 있어서, 시료에 포함되는 표적 핵산은, 예를 들어 DNA이다. 상기 DNA는, 예를 들어 생체 시료 등의 시료에 원래 포함되는 DNA이어도 되고, 유전자 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물 DNA이어도 된다. 후자의 경우, 상기 시료에 원래 포함되어 있는 RNA(토탈 RNA, mRNA 등)로부터 역전사 반응(예를 들어, RT-PCR(Reverse Transcription PCR))에 의해 생성시킨 cDNA를 들 수 있다.
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 있어서, 유전자 증폭 반응의 개시에 앞서, 상기 반응액에 알부민을 더 첨가하는 것이 바람직하다. 이러한 알부민의 첨가에 의해, 예를 들어 상술한 바와 같은 침전물이나 혼탁의 발생에 의한 영향을 한층 더 저감할 수 있고, 또한 증폭 효율도 더욱 향상시킬 수 있다. 구체적으로는, 상기 (I) 공정의 증폭 반응이나, 단일쇄 DNA로의 해리 공정전에 알부민을 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 반응액에서의 알부민의 첨가 비율은, 예를 들어 0.01～2 중량%의 범위이며, 바람직하게는 0.1～1 중량%이고, 보다 바람직하게는 0.2～0.8 중량%이다. 상기 알부민은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민, 래트 혈청 알부민, 말 혈청 알부민 등을 들 수 있고, 이들은 어느 1종류이어도 되고 2종류 이상을 병용해도 된다.
다음으로, 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 대하여, 전혈 시료에 대해 DNA를 표적 핵산으로 하여, 상기 프라이머 셋트 (1)～(3)을 포함하는 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트를 사용한 PCR에 의해 NAT2 유전자의 3개의 목적 영역의 증폭 산물을 제조하는 예를 들어 설명한다. 본 발명은, 본 발명의 프라이머 셋트를 사용하는 것이 특징이며, 다른 구성 및 조건은 전혀 제한되지 않는다.
우선, PCR 반응액을 조제한다. 본 발명의 프라이머 셋트의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않지만, 프라이머 셋트 (1)～(3)의 F 프라이머를, 각각 0.1～2 μ㏖/L이 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.25～1.5 μ㏖/L이고, 특히 바람직하게는 0.5～1 μ㏖/L이다. 또, 프라이머 셋트 (1)～(3)의 R 프라이머를, 각각 0.1～2 μ㏖/L이 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.25～1.5 μ㏖/L이고, 특히 바람직하게는 0.5～1 μ㏖/L이다. 각 프라이머 셋트에서의 F 프라이머와 R 프라이머와의 첨가 비율(F:R, 몰비)은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 1:0.25～1:4가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1:0.5～1:2이다.
반응액에서의 전혈 시료의 비율은 특별히 제한되지 않지만, 상술한 범위가 바람직하다. 전혈 시료는, 그대로 반응액에 첨가해도 되고, 미리 물이나 완충액 등의 용매로 희석하고 나서 반응액에 첨가해도 된다. 전혈 시료를 미리 희석하는 경우, 그 희석율은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 반응액에서의 최종적인 전혈 첨가 비율이 상기 범위가 되도록 설정할 수 있지만, 예를 들어 100～2000배이고, 바람직하게는 200～1000배이다.
상기 반응액에서의 다른 조성 성분은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 성분을 들 수 있고, 그 비율도 특별히 제한되지 않는다. 상기 조성 성분으로는, 예를 들어, DNA 폴리머라제, 뉴클레오티드(뉴클레오시드 삼인산(dNTP)) 및 용매를 들 수 있다. 또, 상술한 바와 같이 상기 반응액은 알부민을 더 함유하는 것이 바람직하다. 상기 반응액에 있어서, 각 조성 성분의 첨가 순서는 전혀 제한되지 않는다.
상기 DNA 폴리머라제로는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 종래 공지의 내열성 세균 유래의 폴리머라제를 사용할 수 있다. 구체예로는, 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래 DNA 폴리머라제(미국특허 제4,889,818 호 및 동 제 5,079,352호)(상품명 Taq 폴리머라제), 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) 유래 DNA 폴리머라제(WO 91/09950)(rTth DNA polymerase), 파이로코커스 퓨리어서스(Pyrococcus furiosus) 유래 DNA 폴리머라제(WO 92/9688)(Pfu DNA polymerase : Stratagenes사 제조), 테루모코커스 리토랄리스(thermococcus litoralis) 유래 DNA 폴리머라제(EP-A 455 430) (상표 Vent : Biolab New England사 제조) 등이 상업적으로 입수가능하고, 그 중에서도 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래의 내열성 DNA 폴리머라제가 바람직하다.
상기 반응액 중의 DNA 폴리머라제의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 1～100 U/㎖이고, 바람직하게는 5～50 U/㎖이고, 보다 바람직하게는 20～30 U/㎖이다. DNA 폴리머라제의 활성 단위(U)는, 일반적으로 활성화 연어정자 DNA를 주형 프라이머로 하여, 활성 측정용 반응액 중 74℃, 30분간에 10 n㏖의 전체 뉴클레오티드를 산불용성 침전물에 도입하는 활성이 1U이다. 상기 활성 측정용 반응액의 조성은, 예를 들어 25 mM TAPS 완충액(pH9.3, 25℃), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM 메르캅토 에탄올, 200 uM dATP, 200 uM dGTP, 200 uM dTTP, 100 uM 「α-32P」dCTP, 0.25㎎/㎖ 활성화 연어정자 DNA이다.
상기 뉴클레오시드 삼인산으로는, 통상 dNTP(dATP, dCTP, dTTP)를 들 수 있다. 상기 반응액 중의 dNTP의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 0.01～1mmol/L이고, 바람직하게는 0.05～0.5mmol/L이고, 보다 바람직하게는 0.1～0.3mmol/L이다.
상기 용매로는, 예를 들어 Tris-HCl, 트리신, MES, MOPS, HEPES, CAPS 등의 완충액을 들 수 있고, 시판하는 PCR용 완충액이나 시판하는 PCR 키트의 완충액 등을 사용할 수 있다.
또, 상기 PCR 반응액은, 헤파린, 베타인, KCl, MgCl2, MgSO4, 글리세롤 등을 포함해도 되고, 이들의 첨가 비율은, 예를 들어 PCR 반응을 저해하지 않는 범위에서 설정하면 된다.
반응액의 전체 체적은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 사용하는 기기(서멀 사이클러) 등에 따라 적절히 결정할 수 있지만, 통상 1～500 ㎕이고, 바람직하게는 10～100 ㎕이다.
다음으로 PCR을 행한다. PCR의 사이클 조건은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, (1) 전혈 유래 이중쇄 DNA의 단일쇄 DNA로의 해리, (2) 프라이머의 어닐링, (3) 프라이머의 신장(폴리머라제 반응)은, 각각 이하와 같다. 또, 사이클수도 특별히 제한되지 않지만, 하기 (1)～(3)의 3스텝을 1사이클로 하여, 예를 들어 30사이클 이상이 바람직하다. 상한은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 합계 100사이클 이하, 바람직하게는 70사이클 이하, 더욱 바람직하게는 사이클 이하이다. 각 스텝의 온도 변화는, 예를 들어 서멀 사이클러 등을 사용하여 자동적으로 제어하면 된다. 본 발명의 프라이머 셋트를 사용한 경우, 상술한 바와 같이 증폭 효율이 우수하므로, 종래의 방법에 의하면 50사이클에 3시간 정도를 요한 데 비해, 본 발명에 의하면 약 1시간 정도(바람직하게는 1시간 이내)로 50사이클을 완료하는 것도 가능하다.
온도(℃) 및 시간(초)
(1) 단일쇄 DNA의 해리 예를 들어, 90～99℃, 1～120초
바람직하게는, 92～95℃, 1～60초
(2) 프라이머의 어닐링
 예를 들어, 40～70℃, 1～300초
바람직하게는, 50～70℃, 5～60초
(3) 신장 반응
 예를 들어, 50～80℃, 1～300초
바람직하게는, 50～75℃, 5～60초
이상과 같이 하여, NAT2 유전자의 3개 영역에 상보적인 증폭 산물을 제조할 수 있다. 3개의 목적 영역 중 어느 하나 또는 어느 2개에 상보적인 증폭 산물을 제조하는 경우에는, 예를 들어 프라이머 셋트 (1)～(3) 중 목적 영역에 대응하는 어느 1종류 또는 어느 2종류의 프라이머 셋트를 포함하는 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트를 사용하면 된다.
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법은, 상술한 증폭 반응에 의해 얻어진 영역의 증폭 산물을 검출하는 공정을 더 포함해도 된다. 이에 의해, 증폭 산물의 유무나, NAT2 유전자의 상기 목적 영역에서의 유전자형(다형 NAT2*5, NAT2*6 또는 NAT2*7)을 검출할 수도 있다. 증폭 산물의 유무는 종래 공지의 방법에 의해 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 상기 (I) 공정에서 상기 반응액에 NAT2 유전자의 검출 대상 부위에 하이브리드화가능한 프로브(예를 들어, 형광 표지화 프로브)를 더 첨가해 두고, 또한 (II) 공정으로서, 상기 반응액에 대하여 상기 프로브에서의 형광 표지의 형광 강도를 측정함으로써 확인할 수 있다. 또, 증폭시키는 목적 영역이 2개 또는 3개인 경우에는, 예를 들어 상기 (I) 공정에서 상기 반응액에 NAT2 유전자의 각 검출 대상 부위에 하이브리드화가능한 프로브(예를 들어, 형광 표지화 프로브)를 2종류 또는 3종류 더 첨가해 두고, 또한 (II) 공정으로서, 상기 반응액에 대해 각 프로브에서의 각 형광 표지의 형광 강도를 측정함으로써 확인할 수 있다. NAT2 유전자에서의 다형 NAT2*5, NAT2*6 및 NAT2*7의 검출에 관해서는, 본 발명의 한 형태로서 이하에 설명한다.
<NAT2 유전자의 다형 해석 방법>
본 발명의 NAT2 유전자의 다형 해석 방법은, NAT2 유전자에서의 검출 대상 부위의 다형을 해석하는 방법이며, 하기 (i)～(iv) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(i) 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의해, NAT2 유전자에서의 검출 대상 부위를 포함하는 영역을 반응액 중에서 증폭시키는 공정,
(ii) 상기 (i) 공정에서의 증폭 산물과, 상기 검출 대상 부위에 하이브리드화가능한 프로브를 포함하는 반응액을 준비하는 공정,
(iii) 상기 반응액의 온도를 변화시켜 상기 증폭 산물과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 공정, 및
(iv) 온도 변화에 따르는 상기 시그널값의 변동으로부터 상기 검출 대상 부위의 다형을 결정하는 공정.
이와 같이 본 발명의 프라이머 셋트를 사용하여 증폭 산물을 제조함으로써, 상술한 바와 같이 NAT2 유전자에서의 다형(NAT2*5, NAT2*6 및 NAT2*7)의 검출 대상 부위를 포함하는 목적 영역을 증폭시켜, 상기 목적 영역에서의 검출 대상 부위의 다형을 해석할 수 있다.
상기 (i) 공정에서의 프로브는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 다형 NAT2*5의 발생 부위에 하이브리드화하는 프로브(이하, 「NAT2*5용 프로브」라고도 한다), 다형 NAT2*6의 발생 부위에 하이브리드화하는 프로브(이하, 「NAT2*6용 프로브」라고도 한다) 및 다형 NAT2*7의 발생 부위에 하이브리드화하는 프로브(이하, 「NAT2*7용 프로브」라고도 한다)를 들 수 있다. 이들 프로브는, 상기 검출 대상 서열을 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브인 것이 바람직하다. 이들 프로브는, 어느 1종류이어도 되고, 어느 2종류 또는 3종류 모두이어도 되고, 예를 들어 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트에 의해 증폭시킨 목적 영역의 종류에 따라 결정할 수 있다. 2종류 또는 3종류의 프로브를 사용한 경우, 예를 들어 동일 반응액을 사용하여, 어느 2개의 검출 대상 부위 또는 상기 3개 모든 검출 대상 부위의 다형을 해석할 수 있다.
상기 다형을 검출하기 위한 프로브는 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 설정할 수 있다. 예를 들어, 다형의 검출 대상 부위를 포함하는 검출 대상 서열로서, NAT2 유전자의 센스쇄의 서열에 기초하여 설계해도 되고, 안티센스쇄의 서열에 기초하여 설계해도 된다. 또, 다형의 검출 대상 부위의 염기는, 각 다형의 종류에 따라 적절히 결정할 수 있다. 즉, NAT2*5의 경우, 서열 번호 1에서의 1063번째 염기에 「T」 및 「C」의 다형이 알려져 있기 때문에, 예를 들어 1063번째가 T인 검출 대상 서열 및 1063번째가 C인 검출 대상 서열 중 어느 하나에 상보적인 프로브(센스쇄의 검출용 프로브)나, 그 안티센스쇄의 서열에 상보적인 프로브(안티센스쇄의 검출용 프로브)를 들 수 있다. 또, NAT2*6의 경우, 서열 번호 1에서의 1312번째 염기에 「G」 및 「A」의 다형이 알려져 있기 때문에, 예를 들어 1312번째가 G인 검출 대상 서열 및 1312번째가 A인 검출 대상 서열 중 어느 하나에 상보적인 프로브(센스쇄의 검출용 프로브)나, 그 안티센스쇄의 서열에 상보적인 프로브(안티센스쇄의 검출용 프로브)를 들 수 있다. 또, NAT2*7의 경우, 서열 번호 1에서의 1579번째 염기에「G」및「A」의 다형이 알려져 있기 때문에, 예를 들어, 1579번째가 G인 검출 대상 서열 및 1579번째가 A인 검출 대상 서열 중 어느 하나에 상보적인 프로브(센스쇄의 검출용 프로브)나, 그 안티센스쇄의 서열에 상보적인 프로브(안티센스쇄의 검출용 프로브)를 들 수 있다. 이와 같이, 다형이 발생하는 검출 대상 부위의 염기를 상술한 바와 같은 어느 하나의 염기에 설정하여 프로브를 설계하더라도, 후술하는 바와 같은 방법에 의해, NAT2 유전자의 각 검출 대상 부위에서 어떠한 다형을 나타내는지를 판단하는 것이 가능하다.
상기 각 프로브는, 상기 (i) 공정의 후, 즉 NAT2 유전자의 목적 영역에 대해 증폭 반응을 행한 후, 증폭 반응액에 첨가할 수도 있지만, 용이하고 신속하게 해석을 행할 수 있기 때문에, 상기 (i) 공정의 증폭 반응에 앞서, 미리 반응액에 첨가해 두는 것이 바람직하다.
상기 반응액에서의 프로브의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 각 프로브를 10～400 n㏖의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20～200 n㏖이다. 또, 프로브의 표지로서 형광 색소를 사용하고 있는 경우, 예를 들어 검출하는 형광 강도를 조정하기 위해, 표지화 프로브와 동일한 서열인 미표지 프로브를 병용해도 되고, 이 미표지 프로브는 그 3' 말단에 인산이 부가되어도 된다. 이 경우, 표지화 프로브와 비표지 프로브의 몰비는, 예를 들어 1:10～10:1이 바람직하다. 상기 프로브의 길이는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 5～50mer이고, 바람직하게는 10～30mer이다.
Tm값에 관해 설명한다. 이중쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열하면, 260㎚에서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 이중쇄 DNA에서의 두 쇄간의 수소 결합이 가열에 의해 풀어져, 단일쇄 DNA에 해리(DNA의 융해)되는 것이 원인이다. 그리고, 모든 이중쇄 DNA가 해리되어 단일쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시시의 흡광도(이중쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이에 의해 융해가 완료되었다고 판단할 수 있다. 이 현상에 기초하여, 융해 온도 Tm이란, 일반적으로 흡광도가 흡광도 전체 상승분의 50%에 도달했을 때의 온도로 정의된다.
상기 (iii) 공정에서, 상기 증폭 산물과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널의 측정은, 상술한 260㎚의 흡광도 측정이어도 되지만, 표지 물질의 시그널 측정이어도 된다. 구체적으로는, 상기 프로브로서, 표지 물질로 표지화된 표지화 프로브를 사용하여, 상기 표지화 물질의 시그널 측정을 행하는 것이 바람직하다. 상기 표지화 프로브로는, 예를 들어 단독으로 시그널을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지화 프로브, 또는 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지화 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브라면, 검출 대상 서열과 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않고, 가열에 의해 프로브가 유리되면 시그널을 나타낸다. 또, 후자의 프로브라면, 검출 대상 서열과 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성함으로써 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 유리되면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 표지에 의한 시그널을 시그널 특유의 조건(흡수 파장 등)으로 검출함으로써, 상기 260㎚의 흡광도 측정과 마찬가지로, 융해의 진행 및 Tm값의 결정 등을 행할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 상술한 바와 같이, 동일 반응액으로 증폭시킨 2개 또는 3개의 목적 영역의 증폭 산물에 대해 다형을 확인할 수도 있다. 이 때문에, 2종류 또는 3종류의 프로브를 사용할 때에는, 각각 상이한 조건으로 검출되는 상이한 표지에 의해 표지화되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같이 상이한 표지를 사용함으로써, 동일 반응액이라 하더라도, 검출 조건을 변경함으로써, 각 증폭 산물을 별개로 해석하는 것이 가능해진다.
상기 표지화 프로브에서의 표지 물질의 구체예로는, 예를 들어 형광 색소(형광단)를 들 수 있다. 상기 표지화 프로브의 구체예로는, 예를 들어 형광 색소로 표지되고, 단독으로 형광을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소(예를 들어, 소광)하는 프로브가 바람직하다. 이러한 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 일반적으로 형광 소광 프로브라 불린다. 그 중에서도, 상기 프로브로는, 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단이 형광 색소로 표지화되어 있는 것이 바람직하고, 표지화되는 상기 말단의 염기는 C인 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 표지화 프로브가 하이브리드화하는 검출 대상 서열에 있어서, 상기 표지화 프로브의 말단 염기 C와 쌍을 이루는 염기 또는 상기 쌍을 이루는 염기로부터 1～3 염기 떨어진 염기가 G가 되도록, 상기 표지화 프로브의 염기 서열을 설계하는 것이 바람직하다. 이러한 프로브는, 일반적으로 구아닌 소광 프로브라 불리고, 소위 QProbe(등록 상표)로서 알려져 있다. 이러한 구아닌 소광 프로브가 검출 대상 서열에 하이브리드화하면, 형광 색소로 표지화된 말단의 C가 상기 검출 대상 DNA에서의 G에 근접함으로써, 상기 형광 색소의 발광이 약해지는(형광 강도가 감소하는) 현상을 나타낸다. 이러한 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리드화와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.
상기 형광 색소는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있고, 시판하는 형광 색소로는, 예를 들어 BODIPY FL(상표명, 몰레큘러ㆍ프로브사 제조), FluorePrime(상품명, 아마샴파마샤사 제조), Fluoredite(상품명, 미리포어사 제조), FAM(ABI사 제조), Cy3 및 Cy5(아마샴파마샤사 제조), TAMRA(몰레큘러ㆍ프로브사 제조) 등을 들 수 있다. 3종류의 프로브에 사용하는 형광 색소의 조합은, 예를 들어 상이한 조건으로 검출할 수 있으면 되고, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 Pacific Blue(검출 파장 450～480㎚), TAMRA(검출 파장 585～700㎚) 및 BODIPY FL(검출 파장 515～555㎚)의 조합 등을 들 수 있다.
이하에, 다형 NAT2*5, NAT2*6 및 NAT2*7을 검출하기 위한 프로브의 서열의 구체예를 나타내지만, 본 발명은 이것에 제한되지는 않는다. 하기 프로브 (1)은, NAT2*5용 프로브의 일례이며, 센스쇄를 검출하기 위한 프로브이다. 하기 프로브 (2)는 NAT2*6용 프로브의 일례이며, 안티센스쇄를 검출하기 위한 프로브이다. 하기 프로브 (3)은 NAT2*7용 프로브의 일례이며, 안티센스쇄를 검출하기 위한 프로브이다.
프로브 (1)
(1-1) 서열 번호 1에서의 1056번째 구아닌 염기 (G)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 13～19번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 구아닌 염기 (G)에 상보적인 시토신 염기를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
프로브 (2)
서열 번호 1에서의 1302번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 18～27번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기를 5' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
프로브 (3)
서열 번호 1에서의 1583번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 16～21번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
상기 프로브 (1)에 있어서, 서열 번호 1의 1063번째 염기에 상보적인 염기는 r로 표시되고, 상기 y는 A 또는 G이고, 상기 프로브 (2)에 있어서, 서열 번호 1의 1312번째에 해당하는 염기는 r로 표시되고, 상기 r은 G 또는 A이고, 상기 프로브 (3)에 있어서, 서열 번호 1의 1579번째에 해당하는 염기는 r로 표시되고, 상기 r은 G 또는 A이다.
또한, 상기 프로브 (1), 프로브 (2) 및 프로브 (3)의 구체예를 하기 표에 나타낸다. 하기 표에서의 「Tm(℃)」은, 하기 표의 서열과 완전하게 상보적인 서열이 하이브리드한 경우의 Tm(℃)이며, MELTCALC 소프트웨어(http://wwwmeltcalc.com/)에 의해, 파라메터를 올리고뉴클레오티드 농도 0.2 uM, 나트륨 당량(Na eq.) 50mM으로서 산출한 값이다.
Figure 112011005628120-pat00004
상기 표에서의 프로브 (1)은, 서열 번호 1에서의 1063번째가 C인 영역에 상보적인 서열로 이루어지고, 대문자의 염기가 서열 번호 1의 1063번째 염기에 상보적인 염기를 나타낸다. 상기 프로브 (1)에 있어서, 상기 대문자의 염기는 r로 치환할 수 있고, 상기 r은 G 및 A 어느 것이라도 된다. 상기 표에서의 프로브 (2)는, 서열 번호 1에서의 1312번째가 A인 영역과 동일한 서열로 이루어지고, 대문자의 염기가 서열 번호 1에서의 1312번째 염기를 나타낸다. 상기 프로브 (2)에 있어서, 상기 대문자의 염기는 r로 치환할 수 있고, 상기 r은 G 및 A 어느 것이라도 된다. 상기 표에서의 프로브 (3)은, 서열 번호 1에서의 1579번째가 A인 영역과 동일한 서열로 이루어지고, 대문자의 염기가 서열 번호 1의 1579번째 염기를 나타낸다. 상기 프로브 (3)에 있어서, 대문자의 염기는 r로 치환할 수 있고, 상기 r은 G 및 A 어느 것이라도 된다. 본 발명에서의 프로브의 구체예로는, 예를 들어 상술한 바와 같이, 상기 표에 나타내는 올리고뉴클레오티드의 상보쇄이어도 된다.
상기 프로브는 일례이며, 본 발명은 이에 한정되지는 않는다. NAT2*5용 프로브로는, 상기 프로브 (1) 중에서도, 예를 들어 서열 번호 90, 서열 번호 91, 서열 번호 118 및 서열 번호 122의 염기 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 또, NAT2*5용 프로브로는, 소위 야생형 검출용 프로브와 변이형 검출용 프로브를 병용하는 것이 바람직하다. 여기서, 야생형 검출용 프로브란, 예를 들어 서열 번호 1의 1063번째 염기가 T인 검출 대상 서열(센스쇄) 또는 그 상보쇄(안티센스쇄)를 검출하기 위한 프로브이며, 변이형 검출용 프로브란, 서열 번호 1의 1063번째 염기가 C인 검출 대상 서열(센스쇄) 또는 그 상보쇄(안티센스쇄)를 검출하기 위한 프로브이다. 본 발명에 있어서는, 예를 들어 서열 번호 87～92 및 116의 염기 서열로 이루어진 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드(변이형 검출용 프로브)와, 서열 번호 117～123의 염기 서열로 이루어진 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드(야생형 검출용 프로브)를 병용하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 서열 번호 90 또는 서열 번호 91의 염기 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드(변이형 검출용 프로브)와, 서열 번호 118 또는 서열 번호 122의 염기 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드(야생형 검출용 프로브)와의 병용이다. 이와 같이 야생형 검출용 프로브와 변이형 검출용 프로브를 병용하는 경우, 예를 들어 각 프로브의 퍼펙트매치의 Tm값을 다르게 설정하는 것이 바람직하다.
NAT2*6용 프로브로는, 서열 번호 99의 염기 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. NAT2*7용 프로브로는, 서열 번호 105 또는 서열 번호 107의 염기 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.
그리고, 이들 프로브는, 2종류 이상을 사용할 때에는, 상술한 바와 같이, 각각 상이한 형광 색소(상이한 파장으로 검출되는 형광 색소)로 표지화하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 표에 나타내는 프로브를 구아닌 소광 프로브로 하는 경우, NAT2*5용 프로브(프로브 (1)) 및 NAT2*7용 프로브(프로브 (3))는, 3' 말단의 시토신을 상술한 바와 같은 형광 색소(예를 들어 BODIPY FL, TAMRA 등)로 표지화하고, NAT2*6용 프로브(프로브 (2))는, 5' 말단의 시토신을 상술한 바와 같은 형광 색소(예를 들어 Pacific Blue)로 표지화하는 것이 바람직하다. 또, 5' 말단에 형광 색소를 표지화한 프로브는, 예를 들어 프로브 자체가 신장되는 것을 예방하기 위해, 그 3' 말단에 인산기가 더 부가되어도 된다. 또, 상술한 바와 같이 야생형 검출용 프로브와 변이형 검출용 프로브를 사용하는 경우, 각각의 형광 색소는 동일해도 되고 상이해도 된다.
다음으로, 본 발명의 검출 방법에 관해, 일례로서 하기 프로브를 사용하여, NAT2 유전자에서의 3개의 다형 NAT2*5, NAT2*6 및 NAT2*7을 검출하는 방법을 설명한다. 본 발명은 이것에 제한되지는 않는다.
(프로브)
NAT2*5용 프로브
5'-tgccgtcaGtggtcac-(BODIPY FL)-3' (서열 번호 90),
5'-gccgtcaGtggtcac-(BODIPY FL)-3' (서열 번호 91),
5'-cctgccgtcaAtggtcac-(BODIPY FL)-3' (서열 번호 118), 또는,
5'-ccgtcaAtggtcac-(BODIPY FL)-3' (서열 번호 122)
NAT2*6용 프로브
5'-(Pacific Blue)-cttgaacctcAaacaattgaa-P-3' (서열 번호 99)
NAT2*7용 프로브
5'-caaacctggtgatgAatcc-(TAMRA)-3' (서열 번호 105), 또는,
5'-aacctggtgatgAatcc-(TAMRA)-3' (서열 번호 107),
우선, 상기 3종류의 표지화 프로브를 첨가한 반응액을 사용하여, 상술한 바와 같이 PCR을 행하고, 동일 반응액 중에서, NAT2 유전자의 3개의 영역을 동시에 증폭시킨다. 상기 반응액은, 예를 들어 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트, DNA 폴리머라제, dNTP, 주형이 되는 핵산을 포함하는 시료 및 상기 3종류의 프로브를 포함한다. 그 밖에, 핵산 증폭에 사용할 수 있는 여러가지 첨가제를 포함해도 된다.
다음으로, 얻어진 증폭 산물의 해리 및 해리에 의해 얻어진 단일쇄 DNA와 상기 표지화 프로브와의 하이브리드화를 행한다. 이것은, 예를 들어 상기 반응액의 온도 변화에 의해 행할 수 있다.
상기 해리 공정에서의 가열 온도는, 상기 증폭 산물이 해리될 수 있는 온도라면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 85～95℃이다. 가열 시간도 특별히 제한되지 않지만, 통상 1초～10분이며, 바람직하게는 1초～5분이다.
해리된 단일쇄 DNA와 상기 표지화 프로브와의 하이브리드화는, 예를 들어, 상기 해리 공정후, 상기 해리 공정에서의 가열 온도를 강하시킴으로써 행할 수 있다. 온도 조건은, 예를 들어 40～50℃이다.
그리고, 상기 반응액의 온도를 변화시켜 상기 증폭 산물과 상기 표지화 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정한다. 구체적으로는, 예를 들어 상기 반응액(상기 단일쇄 DNA와 상기 표지화 프로브와의 하이브리드 형성체)을 가열하여, 온도 상승에 따르는 시그널값의 변동을 측정한다. 상술한 바와 같이, 말단의 C 염기가 표지화된 프로브(구아닌 소광 프로브)를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와 하이브리드화한 상태에서는 형광이 감소(또는 소광)하고, 해리된 상태에서는 형광을 발한다. 따라서, 예를 들어 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드 형성체를 서서히 가열하여, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.
형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 개시 온도가 실온～85℃이고, 바람직하게는 25～70℃이고, 종료 온도는, 예를 들어 40～105℃이다. 또, 온도의 상승 속도는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 0.1～20℃/초이고, 바람직하게는 0.3～5℃/초이다.
다음으로, 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값을 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에서의 단위시간당 형광 강도 변화량(-d 형광 강도 증가량/dt)을 산출하고, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또, 단위시간당 형광 강도 증가량(형광 강도 증가량/t)이 가장 높은 점을 Tm값으로 결정할 수도 있다. 표지화 프로브로서, 소광 프로브가 아니라, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 프로브를 사용한 경우에는, 반대로 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.
본 발명에 있어서는, 3개의 다형 NAT2*5, NAT2*6 및 NAT2*7을 검출하므로, 3종류의 프로브의 각 표지에 따른 조건으로 각각의 Tm값을 결정한다. NAT2*5용 프로브의 BODIPY FL은, 예를 들어 검출 파장 515～555㎚, NAT2*6용 프로브의 Pacific Blue는, 예를 들어 검출 파장 450～480㎚, NAT2*7용 프로브의 TAMRA는, 예를 들어 검출 파장 585～700㎚에서 검출할 수 있다.
그리고, 이들 Tm값으로부터, 각 검출 대상 부위에서의 유전자형을 결정한다. Tm 해석에 있어서, 완전히 상보적인 하이브리드(매치)는, 일염기가 상이한 하이브리드(미스매치)보다 해리를 나타내는 Tm값이 높아지는 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 미리 상기 프로브에 대해 완전히 상보적인 하이브리드의 Tm값과, 일염기가 상이한 하이브리드의 Tm값을 결정해 둠으로써, 각 검출 대상 부위에서의 유전자형을 결정할 수 있다. 예를 들어, 검출 대상 부위의 염기를 변이형(예를 들어, 서열 번호 1에서의 1063번째 염기가 C)으로 가정하고, 그것을 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용한 경우, 형성한 하이브리드의 Tm값이 완전히 상보적인 하이브리드의 Tm값과 동일하다면, 상기 증폭 산물의 다형은 변이형으로 판단할 수 있다. 또, 형성한 하이브리드의 Tm값이 일염기 상이한 하이브리드의 Tm값과 동일하다면(완전히 상보적인 하이브리드의 Tm값보다 낮은 값), 상기 증폭 산물의 다형은 야생형(예를 들어, 서열 번호 1에서의 1063번째 염기가 T)으로 판단할 수 있다. 또한, 양쪽의 Tm값이 검출된 경우에는, 헤테로 접합체로 결정할 수 있다. 이렇게 하여, 각 표지화 프로브에 대한 3개의 Tm값으로부터, 다형 NAT2*5, NAT2*6 및 NAT2*7의 유전자형을 판단할 수 있다.
또, 본 발명에 있어서는, 상술한 바와 같이, 상기 프로브를 포함하는 반응액의 온도를 상승시켜(하이브리드 형성체를 가열하여), 온도 상승에 따르는 시그널 변동을 측정하는 방법 대신, 예를 들어 하이브리드 형성시에서의 시그널 변동의 측정을 행해도 된다. 즉, 상기 프로브를 포함하는 반응액의 온도를 강하시켜 하이브리드 형성체를 형성할 때, 상기 온도 강하에 따르는 시그널 변동을 측정해도 된다.
구체예로서, 단독으로 시그널을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지화 프로브(예를 들어, 구아닌 소광 프로브)를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와 프로브가 해리되어 있는 상태에서는 형광을 발하고 있지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들어, 상기 반응액의 온도를 서서히 강하하여 온도 하강에 따르는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다. 한편, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지화 프로브를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와 프로브가 해리되어 있는 상태에서는 형광을 발하지 않지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면 형광을 발하게 된다. 따라서, 예를 들어 상기 반응액의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.
NAT2 유전자의 3종류의 다형(NAT2*5, NAT2*6 또는 NAT2*7) 중 어느 1개 또는 어느 2개의 다형을 해석하는 경우에는, 예를 들어 프라이머 셋트 (1)～(3) 중 목적 영역에 대응하는 어느 1종류 또는 어느 2종류의 프라이머 셋트를 포함하는, 본 발명의 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 셋트를 사용하고, 또한 목적의 검출 대상 부위에 하이브리드화하는 어느 1종류의 프로브 또는 어느 2종류의 프로브를 사용하면 된다.
다음으로, 본 발명의 실시예에 관해 설명한다. 단, 본 발명은 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다.
도 1은, 본 발명의 실시예 1에서의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는, 본 발명의 실시예 2에서의 Tm 해석의 결과를 나타내는 그래프이다.
실시예 1
피검자 4명으로부터 헤파린 리튬 채혈관을 사용하여 채혈했다(샘플 1～4). 얻어진 혈액 10 ㎕과 증류수 90 ㎕을 혼합하고, 이 혼합액 10 ㎕과 증류수 90 ㎕을 더 혼합했다. 이들 혼합액 10 ㎕를, 하기 조성의 PCR 반응액 40 ㎕에 첨가하여, 서멀 사이클러를 사용하여 PCR을 행했다. PCR의 조건은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃ 1초 및 60℃ 10초를 1사이클로 하여 50사이클 반복하고, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 더 처리했다. 그리고, 이어서 온도의 상승 속도를 1℃/3초로 하여, 상기 PCR 반응액을 40℃～95℃로 가열하고, 시간의 경과에 따른 형광 강도의 변화를 측정했다. 측정 파장은, 450～480 ㎚(형광 색소 Pacific Blue의 검출), 515～555 ㎚(형광 색소 BODIPY FL의 검출) 및 585～700 ㎚(형광 색소 TAMRA의 검출)로 했다. 50사이클의 PCR에 요한 시간은 약 1시간이었다.
[표 6]
(PCR 반응액 : 단위 ㎕)
증류수 17.375
5% NaN3 0.5
20% BSA 1
40% 글리세롤 3.125
10×Gene Taq buffer ※ 5
2.5 mM dNTPs 4
100 mM MgCl2 0.5
5 uM NAT2*5용 프로브 1 1
5 uM NAT2*5용 프로브 2 3
5 uM NAT2*6용 프로브 1.5
5 uM NAT2*7용 프로브 0.5
100 uM NAT2*5 F1 프라이머 0.5
100 uM NAT2*5 R1 프라이머 0.25
100 uM NAT2*6 F2 프라이머 0.25
100 uM NAT2*6 R2 프라이머 0.5
100 uM NAT2*7 F3 프라이머 0.25
100 uM NAT2*7 R3 프라이머 0.5
5U/㎕ Gene Taq Fp * 0.25
총량 40 ㎕
* 상품명 Gene Taq FP : NIPPON GENE CO., LTD. 제조
(프로브)
NAT2*5용 프로브 1
5'-tgccgtcaGtggtcac-(BODIPY FL)-3' (서열 번호 90)
NAT2*5용 프로브 2
5'-tgccgtcaGtggtcac-P-3' (서열 번호 90)
NAT2*6용 프로브
5'-(Pacific Blue)-cttgaacctcAaacaattgaa-P-3' (서열 번호 99)
NAT2*7용 프로브
5'-caaacctggtgatgAatcc-(TAMRA)-3' (서열 번호 105)
(프라이머 셋트)
NAT2*5 F1 프라이머
5'-cagttaacaaatacagcactggcatgg-3' (서열 번호 7)
NAT2*5 R1 프라이머
5'-acatctgggaggagcttccag-3' (서열 번호 18)
NAT2*6 F2 프라이머
5'-ctcatctcctgccaaagaagaaac-3' (서열 번호 33)
NAT2*6 R2 프라이머
5'-gatgtggttataaatgaagatgttggagac3' (서열 번호 48)
NAT2*7 F3 프라이머
5'-aaatatatttaagatttccttggggagaaat-3' (서열 번호 60)
NAT2*7 R3 프라이머
5'-tgagttgggtgatacatacacaaggg-3' (서열 번호 81)
NAT2*5용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 66.0℃, 미스매치의 하이브리드의 Tm값은 58.0℃, NAT2*6용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 61.0℃, 미스매치의 하이브리드의 Tm값은 53.0℃, NAT2*7용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 63.0℃, 미스매치의 하이브리드의 Tm값은 56.0℃이다.
샘플 1～4의 결과를 도 1에 나타낸다. 이 도면은, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이고, 종축의 미분값은 「-d 형광 강도 증가량/dt」를 나타내고, 횡축은 온도를 나타낸다(이하, 동일). 동 도면에 나타낸 바와 같이, 시그널의 피크로부터, 각 샘플에서의 NAT2*5, NAT2*6 및 NAT2*7의 유전자형을 결정했다. 이들 실시예의 결과를 뒷받침하기 위해, 피검자 8명에 대해, RFLP법 및 시퀀스법에 의해, NAT2*5, NAT2*6 및 NAT2*7의 다형을 확인한 결과, 실시예와 동일한 결과가 얻어졌다. 이와 같이, 본 발명의 프라이머 셋트를 사용함으로써, 전처리를 실시하지 않은 전혈 시료를 사용하여, NAT2 유전자의 3개 영역을 동일 반응액 중에서 동시에 증폭시키고, 또한, 상기 동일 반응액을 사용하여 3종류의 다형을 해석할 수 있었다.
실시예 2
피검자 3명으로부터 EDTA 채혈관을 사용하여 채혈했다(샘플 1～3). 얻어진 혈액 10 ㎕와 하기 희석액 A 70 ㎕를 혼합하고, 이 혼합액 10㎕와 하기 희석액 B 70㎕를 더 혼합했다. 얻어진 혼합액 10 ㎕을 95℃에서 5분간 가열 처리한 후, 하기 조성의 PCR 반응액 46 ㎕에 첨가하여, 서멀 사이클러를 사용하여 PCR을 행했다. PCR의 조건은 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃ 1초 및 65℃ 15초를 1사이클로 하여 50사이클 반복하고, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 더 처리했다. 그리고, 이어서 온도의 상승 속도를 1℃/3초로 하여, 상기 PCR 반응액을 40℃에서 75℃로 가열하고, 시간의 경과에 따른 형광 강도의 변화를 측정했다. 측정 파장은 450～480 ㎚(형광 색소 Pacific Blue의 검출), 515～555 ㎚(형광 색소 BODIPY FL의 검출) 및 585～700 ㎚(형광 색소 TAMRA의 검출)로 했다.
(희석액 A)
10mM Tris-HCl (pH8), 0.1mM EDTA, 0.05% NaN3, 0.3% SDS
(희석액 B)
10mM Tris-HCl (pH8), 0.1mM EDTA, 0.05% NaN3
[표 7]
(PCR 반응액 : 단위 ㎕)
증류수 14.5
5% NaN3 0.5
20% BSA 0.5
40% 글리세롤 12.5
10×Gene Taq buffer ※ 5
2.5 mM dNTPs 4
100 mM MgCl2 0.5
5 uM NAT2*5용 프로브 1 1
5 uM NAT2*5용 프로브 2 1
5 uM NAT2*6용 프로브 2
5 uM NAT2*7용 프로브 2
100 uM NAT2*5 F1 프라이머 0.5
100 uM NAT2*5 R1 프라이머 0.25
100 uM NAT2*6 F2 프라이머 0.25
100 uM NAT2*6 R2 프라이머 0.5
100 uM NAT2*7 F3 프라이머 0.25
100 uM NAT2*7 R3 프라이머 0.5
5 U/㎕ Gene Taq Fp * 0.25
총량 46 ㎕
* 상품명 Gene Taq FP : NIPPON GENE CO., LTD. 제조
(프로브)
NAT2*5용 프로브 1
5'-gccgtcaGtggtcac-(BODIPY FL)-3' (서열 번호 91)
NAT2*5용 프로브 2
5'-ccgtcaAtggtcac-(BODIPY FL)-3' (서열 번호 118)
NAT2*6용 프로브
5'-(Pacific Blue)-cttgaacctcAaacaattgaa-P-3' (서열 번호 99)
NAT2*7용 프로브
5'-aacctggtgatgAatcc-(TAMRA)-3' (서열 번호 107)
(프라이머 셋트)
NAT2*5 F1 프라이머
5'-tccagttaacaaatacagcactggcatgg-3' (서열 번호 7)
NAT2*5 R1 프라이머
5'-ccacatctgggaggagcttccag-3' (서열 번호 18)
NAT2*6 F2 프라이머
5'-agaatttcttaattctcatctcctgccaaagaagaaac-3' (서열 번호 33)
NAT2*6 R2 프라이머
5'-gaacaaaatgatgtggttataaatgaagatgttggagac-3' (서열 번호 48)
NAT2*7 F3 프라이머
5'-agtgctgaaaaatatatttaagatttccttggggagaaat-3' (서열 번호 60)
NAT2*7 R3 프라이머
5'-tgataattagtgagttgggtgatacatacacaaggg-3' (서열 번호 81)
NAT2*5용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 63℃, 미스매치의 하이브리드의 Tm값은 56℃, NAT2*6용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 58℃, 미스매치의 하이브리드의 Tm값은 50.5℃, NAT2*7용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 58℃, 미스매치의 하이브리드의 Tm값은 49℃이다.
샘플 1～3의 결과를 도 2에 나타낸다. 이 도면은, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이고, 종축의 미분값은 「-d 형광 강도 증가량/dt」을 나타내고, 횡축은 온도를 나타낸다. 동 도면에 나타낸 바와 같이, 시그널의 피크로부터, 각 샘플에서의 NAT2*5, NAT2*6 및 NAT2*7의 유전자형을 결정했다. 이들 실시예의 결과를 뒷받침하기 위해, 피검자 3명에 대해, RFLP법 및 시퀀스법에 의해, NAT2*5, NAT2*6 및 NAT2*7의 다형을 확인한 결과, 실시예와 동일한 결과가 얻어졌다. 이와 같이, 본 발명의 프라이머 셋트를 사용함으로써, 전처리를 실시하지 않은 전혈 시료를 사용하여, NAT2 유전자의 3개의 영역을 동일 반응액 중에서 동시에 증폭시키고, 또한 상기 동일 반응액을 사용하여 3종류의 다형을 해석할 수 있었다.
이상과 같이, 본 발명의 프라이머 셋트에 의하면, NAT2 유전자에서의 특정 다형(NAT2*5, NAT2*6 또는 NAT2*7)이 발생하는 부위를 포함하는 영역을, 특이적으로 고효율로 증폭시킬 수 있다. 이 때문에, 상술한 바와 같은 종래법과는 달리 수고나 비용을 저감하는 것이 가능해진다. 또, 이와 같이 다형의 검출 대상 부위를 포함하는 영역이 특이적으로 증폭되기 때문에, 예를 들어 상기 검출 대상 부위를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용함으로써, 상기 반응액을 사용하여 그대로 Tm 해석을 행하여 상기 다형을 타이핑하는 것이 가능해진다. 또, 하나의 반응액으로 증폭이나 타이핑이 가능하기 때문에 조작의 자동화도 가능해진다. 또한, 본 발명의 프라이머 셋트를 사용하면, 예를 들어 불순물이 포함되는 시료(예를 들어, 전혈이나 구강 점막 등)라 하더라도 전처리를 생략할 수 있기 때문에, 보다 신속하고 간편하게 증폭 반응을 행할 수 있다. 또, 본 발명의 프라이머 셋트를 사용하면, 종래보다 우수한 증폭 효율로 증폭 반응을 행할 수 있기 때문에, 증폭 반응도 단축화가 가능하다. 따라서, 본 발명의 프라이머 셋트나 이것을 포함하는 시약 및 이들을 사용한 증폭 산물의 제조 방법에 의하면, NAT2 유전자의 다형을 신속하고 간편하게 해석할 수 있기 때문에, 의료 분야에서 매우 유효하다고 할 수 있다.
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Claims (16)

  1. NAT2 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브 시약으로서, 하기 (1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브, 하기 (2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브, 및 하기 (3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브 중 적어도 2개 이상의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브 시약:
    (1) 서열 번호 1에서의 1056번째 구아닌 염기 (G)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 13～19번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 구아닌 염기 (G)에 상보적인 시토신 염기를 3' 말단으로 하며, 상기 시토신 염기가 형광 표지화되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (2) 서열 번호 1에서의 1302번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 18～27번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기를 5' 말단으로 하며, 상기 시토신 염기가 형광 표지화되어 있는 올리고뉴클레오티드,
    (3) 서열 번호 1에서의 1583번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 16～21번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기를 3' 말단으로 하며, 상기 시토신 염기가 형광 표지화되어 있는 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (1)의 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 87～92 및 116～123 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드이고, 상기 (2)의 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 93～102 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드이고, 상기 (3)의 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 103～108 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드인 프로브 시약.
  3. 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 (1)이 서열 번호 90의 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 91의 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 118의 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 122의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드이고, 상기 (2)의 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 99의 염기 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드이고, 상기 (3)의 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 105의 염기 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 107의 염기 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 프로브 시약.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브, 상기 (2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브, 및 상기 (3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브를 포함하는 프로브 시약.
  5. NAT2 유전자에서의 검출 대상 부위의 다형을 해석하는 방법으로서, 하기 (i)～(iv) 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 다형 해석 방법:
    (i) 시료 중의 핵산을 주형으로 하고, NAT2 유전자에서의 검출 대상 부위를 포함하는 영역을 반응액 중에서 증폭시키는 공정,
    (ii) 상기 (i) 공정에서의 증폭 산물과, 제1항에 기재된 프로브 시약을 포함하는 반응액을 준비하는 공정,
    (iii) 상기 반응액의 온도를 변화시켜 상기 증폭 산물과 상기 프로브 시약 중의 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 공정,
    (iv) 온도 변화에 따르는 상기 시그널값의 변동으로부터 상기 검출 대상 부위의 다형을 결정하는 공정.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (i) 공정에 있어서, 증폭 반응에 앞서, 상기 반응액에, 제1항에 기재된 프로브 시약을 첨가하는 다형 해석 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 시료가 생체 시료인 다형 해석 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 생체 시료가 전혈인 다형 해석 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 프로브 시약이 상기 (1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브, 상기 (2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브, 및 상기 (3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브를 포함하고, 상기 (i) 공정에 있어서, 하기 프라이머 셋트 (1), 하기 프라이머 셋트 (2), 및 하기 프라이머 셋트 (3)을 사용하여, 반응액 중에서 상기 NAT2를 증폭시키는 다형 해석 방법:
    - 프라이머 셋트 (1)
    하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 포워드 프라이머 및 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 리버스 프라이머를 포함하는 한쌍의 프라이머 셋트:
    (F1) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1038번째 구아닌 염기 (G)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～32번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드,
    (R1) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1096번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 17～24번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1096번째 시토신 염기 (C)에 상보적인 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드,
    - 프라이머 셋트 (2)
    하기 (F2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 포워드 프라이머 및 하기 (R2)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 리버스 프라이머를 포함하는 한쌍의 프라이머 셋트:
    (F2) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1278번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～38번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기 (C)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드,
    (R2) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1355번째 구아닌 염기 (G)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 25～40번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1355번째 구아닌 염기 (G)에 상보적인 시토신 염기 (C)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드, 및
    서열 번호 1의 염기 서열에서의 1614번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 21～36번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1614번째 시토신 염기 (C)에 상보적인 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드,
    - 프라이머 셋트 (3)
    하기 (F3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 포워드 프라이머 및 하기 (R3)의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 리버스 프라이머를 포함하는 한쌍의 프라이머 셋트:
    (F3) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1556번째 티민 염기 (T)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 21～40번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 티민 염기 (T)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드, 및
    서열 번호 1의 염기 서열에서의 1278번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 5' 방향을 향해 20～38번째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기 (C)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
    중 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드,
    (R3) 서열 번호 1의 염기 서열에서의 1614번째 시토신 염기 (C)를 1번째 염기로 하여 3' 방향을 향해 21～36번째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 1614번째 시토신 염기 (C)에 상보적인 구아닌 염기 (G)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
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