CN102154274A - Nat2基因扩增用引物对、含有其的nat2基因扩增用试剂及其用途 - Google Patents

Nat2基因扩增用引物对、含有其的nat2基因扩增用试剂及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种引物对，其为用于利用基因扩增法扩增NAT2基因中的含有检测目标位点的目标区域的引物对，其能够特异地扩增上述区域。使用分别包含含有序列号7、序列号33和序列号60的碱基序列的正向引物和包含序列号18、序列号48和序列号81的碱基序列的反向引物的3对引物对。通过使用该引物对，可以在同一反应液中同时扩增NAT2基因的分别含有3种多态性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)发生位点的3个区域。

Description

NAT2基因扩增用引物对、含有其的NAT2基因扩增用试剂及其用途
本申请是分案申请，其原申请的国际申请号是PCT/JP2007/073204，中国国家申请号是200780027648.6，申请日为2007年11月30日，发明名称为“NAT2基因扩增用引物对、含有其的NAT2基因扩增用试剂及其用途”。 
技术领域
本发明涉及用于扩增NAT2基因的引物对、含有其的NAT2基因扩增用试剂及其用途。
背景技术
N-乙酰基转移酶(NATs)是与利用N-结合将芳香族胺或杂环胺的芳胺代谢成无毒且稳定的物质的代谢途径有关的酶。其中，NATs亚型中的NAT2关系到异烟肼(INH)、磺胺二甲嘧啶、其它的磺胺类、普鲁卡因胺、肼酞嗪、咖啡因、氨苯砜等同素环和杂环芳胺、胼样药物的解毒过程及2-氨基芴、4-氨基联苯、联苯胺、β-萘胺、蛋白质的热分解物质中存在的杂环芳胺等表达性生理物质、环境物质等的活化。已知NAT2显示多态性，在人体中有19种多态性。这些多态性中，NAT2*5类(NAT2*5A～5D)为NAT2基因的mRNA中的341位的T(胸腺嘧啶)突变成C(胞嘧啶)的多态性，NAT2*6类(NAT2*6A、NAT2*6B)为上述mRNA中的590位的G(鸟嘌呤)突变成A(腺嘌呤)的多态性，NAT2*7类(NAT2*7A、NAT2*7B)为mRNA中的857位的G(鸟嘌呤)突变成A(腺嘌呤)的多态性。
已知具有这些突变的患者在服用作为抗拮抗剂的INH时，会发生肝功能损伤。其原因在于，由于NAT2基因突变，NAT2活性改变，由此无法充分地进行INH的N-乙酰化，肝毒性高的肼的产生增多。另外，还已知NAT2的基因多态性与上述普鲁卡因胺或柳氮磺胺吡啶等的副作用有关。因此，确认患者 NAT2基因多态性在回避副作用、进行适当药物治疗时极为重要。特别是，对于NAT2而言，重要的是确认多个多态性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)。
另外，作为在基因水平解析所有疾病的原因、个体间的疾病易感性(易患疾病)、个体间的药效不同等的方法，广泛地进行点突变、所谓的单核苷酸多态性(SNP)的检测。点突变的通常检测方法可以举出(1)对于试样的目标DNA利用PCR(聚合物酶链反应)将相当于检测对象序列的区域扩增、对其全基因序列进行解析的直接测序法；(2)对于试样的目标DNA，利用PCR将相当于检测对象序列的区域扩增，通过随着上述检测对象序列中有无目标突变而剪切作用不同的限制酶将该扩增产物切断，进行电泳从而进行分型的RFLP解析；(3)使用目标突变位于3’末端区域的引物进行PCR，通过有无扩增来判断突变的ASP-PCR法等。
但是，这些方法例如必须进行由试样提取的DNA的精制、电泳、限制酶处理等，因此需要功夫和成本。另外，进行PCR后，有必要暂时开启反应容器，因此有上述扩增产物混入到之后的反应体系内，解析精度降低的顾虑。而且，由于自动化困难，因此无法解析大量的样品。另外，对于上述(3)的A SP-PCR法，还存在特异性低的问题。
由该问题出发，近年来作为点突变的检测方法，正在实施对由目标核酸和探针形成的双链核酸的融解温度(Tm)进行解析的方法。这种方法由于通过例如Tm解析或上述双链的融解曲线的解析来进行，因此称作融解曲线解析。其为以下的方法。即，首先使用与含有检测目标的点突变的检测对象序列互补的探针，使检测试样中的目标单链DNA与上述探针形成杂交体(双链DNA)。接着，对该杂交产物实施加热处理，通过吸光 度等信号的变动来检测伴随温度上升的杂交体的解离(融解)。然后，根据该检测结果确定Tm值，从而判断有无点突变。在杂交产物的同源性越高时Tm值越高、同源性越低时Tm值越低。因此，对于含有点突变的检测对象序列和与其互补的探针的杂交产物，预先求得Tm值(评价标准值)，再测定检测试样的目标单链DNA和上述探针的Tm值(测定值)。上述测定值与评价标准值相同时，则可以判断为匹配、即目标DNA中存在点突变，测定值低于评价标准值时，则可以判断为不匹配、即在目标DNA上不存在点突变。而且，通过该方法还可以使基因解析自动化。
但是，对于这种利用Tm解析的检测方法来说存在如下的问题：在PCR中必需特异且高效地扩增含有检测目标位点的区域。特别是由于NAT存在多个同工酶、编码它们的序列也极为相似，因此在PCR中，有NAT2以外的同工酶的编码基因也被扩增的顾虑。另外，当其它同工酶的编码基因也被扩增的情况下，也成为例如在NAT2基因的特定多态性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)的解析(非专利文献1或非专利文献2)中解析结果的可靠性降低的原因。而且，如此由于解析1个样品也需要大量的劳力，因此还具有解析大量样品方面并不实用的问题。
非专利文献1：PMID：8102908Jpn J Hum Genet.1993Jun；38(2)：163-8.
非专利文献2：PMID：10507782Br J Cancer.1999O ct；81(3)：537-41.
发明内容
因此，本发明的目的在于提供用于利用基因扩增法特异扩增NAT2基因的目标区域的引物对。
为了达成上述目的，本发明的引物对，其特征在于，是用于利用基因扩增法扩增NAT2基因的引物对，含有选自由下述引物对(1)～(3)所组成的组中的至少一对引物对。
引物对(1)：
含有包含下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对：
(F1)：与序列号1的碱基序列中的、以第1038位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向5’方向至第20～32个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述鸟嘌呤碱基(G)为3’末端，
(R1)：与序列号1的碱基序列中的、以第1096位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第17～24个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1096位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端；
引物对(2)：
含有包含下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对：
(F2)：与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第20～38个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)为3’末端，
(R2)：下述寡核苷酸中的至少一个：
与序列号1的碱基序列中的、以第1355位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向3’方向至第25～40个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1355位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)为3’末端，
以及
与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第21～36个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1614位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端；
引物对(3)：
含有包含下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对：
(F3)：下述寡核苷酸中的至少一个：
与序列号1的碱基序列中的、以第1556位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基朝向5’方向至第21～40个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基(T)为3’末端，
以及
与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第20～38个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)为3’末端，
(R3)：与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第21～36个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1614位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端。
另外，本发明的基因扩增用试剂其特征在于，是用于利用基因扩增法扩增NAT2基因的试剂，其含有上述本发明的NAT2基因扩增用引物对。
本发明的扩增产物的制造方法，其特征在于，其为利用基因扩增法制造NAT2基因的扩增产物的方法，包含下述(I)工序：
(I)以试样中的核酸作为模板，使用本发明的NAT2基因扩增用引物对，在反应液中扩增上述NAT2基因的工序。
本发明的多态性解析方法，其特征在于，其为解析NAT2中3个检测对象位点的多态性的方法，包括下述(i)～(iv)工序：
(i)利用本发明的扩增产物的制造方法，在反应液中扩增NAT2基因中的含有检测对象位点的区域的工序，
(ii)准备含有上述(i)工序的扩增产物和能够与上述检测对象位点杂交的探针的反应液的工序，
(iii)改变上述反应液的温度，测定上述扩增产物与上述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的工序，
(iv)由伴随温度变化的上述信号值的变动，确定上述检测对象位点的多态性的工序。
利用本发明的引物对，可以在反应液中特异且高效地扩增NAT2基因中的、含有检测目标多态性(NAT2*5或NAT2*6、NAT2*7)发生位点的目标区域。因此，与上述的现有方法不同，可以减少功夫和成本。另外，由于如此特异地扩增NAT2基因的含有特定多态性发生的检测对象位点的区域，因此通过进一步使用与检测对象序列互补的探针，可以使用上述反应液直接进行Tm解析，将上述多态性分型。另外，由于可以在一个反应液中进行扩增、分型，因此还能够实现操作的自动化。而且，当使用本发明的引物对时，例如即便是含有杂质的试样(例如全血或口腔粘膜等)，由于可以省略预处理，因此可以更为迅速且简单地进行扩增反应。另外，当使用本发明的引物对时，由于以优于以往的扩增效率进行扩增反应，因此还能够缩短扩增反应。因而，利用本发明的引物对、含有其的试剂、以及使用它们的扩增产物的制造方法和多态性解析方法，由于可以迅速 且简单地解析NAT2基因的多态性，因此在医疗领域中极为有效。
附图说明
图1为表示本发明实施例1的Tm解析结果的图表。
图2为表示本发明实施例2的Tm解析结果的图表。
具体实施方式
<NAT2基因扩增用引物对>
本发明的NAT2基因扩增用引物对如上所述，其特征在于，含有选自由上述引物对(1)～(3)所组成的组中的至少一对引物对。通过含有至少任一对引物对，例如可以特异地扩增NAT2基因中的特定目标区域。
本发明的NAT2基因扩增用引物对例如可以仅含有上述引物对(1)～(3)中的任一种，还可以含有任两种或者含有引物对(1)～(3)的全部。在后叙述，利用引物对(1)能够特异扩增的目标区域为在NAT2基因中含有多态性NAT2*5发生位点的区域，利用引物对(2)能够特异扩增的目标区域为在NAT2基因中含有多态性NAT2*6发生位点的区域，利用引物对(3)能够特异扩增的目标区域为在NAT2区域中含有多态性NAT2*7发生位点的区域。
如上所述，已知NAT2基因的这3种多态性全部为对药物代谢具有影响的多态性，因此重要的是不仅对任1种进行研究，还要对任2种或者3种全部进行研究。但是，以往方法具有无法在一个反应体系内解析多个序列的问题。这是由于如上所述NAT存在多个同工酶，因此在PCR中，连NAT2以外的同工酶的编码基因也被扩增。因而，为了研究NAT2 基因的3种多态性(NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7)中的2种或3种全部多态性，有必要在各反应体系中分别扩增含有各个多态性发生位点的区域，对所得扩增产物分别进行解析。如此，以往的方法难以做到仅将NAT基因中的NAT2基因作为模板、且在NAT2基因中仅特异地扩增分别含有上述多态性发生位点的2种或3种目标区域。而且，由于解析1个样品也需要大量劳力，因此具有解析大量样品并不实用的问题。与此相反，通过本发明的NAT2基因扩增用引物对，在含有上述引物对(1)～(3)中的任2种或3种全部时，可以在同一反应液中同时且特异地扩增各个目标区域。因此，与上述以往方法不同，可以减少功夫和成本。另外，由于在同一反应液中特异地扩增2个或3个目标区域，因此例如通过使用与各个目标区域的检测对象序列互补的探针，可以使用上述反应液直接进行Tm解析，分别对上述2种或3种多态性进行分型。如此，由于可以在同一反应液中解析NAT2基因中的2种或3种多态性，因此本发明的NAT2基因扩增用引物对例如在含有引物对(1)～(3)任一种时当然优选，在含有任2种或3种时也优选。使用这种NAT2基因扩增用引物对，扩增1个目标区域当然是可以的，当同时扩增2个或3个目标区域时，也可以较以往更为高效地进行NAT2基因的多态性解析。
予以说明，以下有时将正向引物称作F引物、将反向引物称作R引物。
上述引物对(1)如上所述，为含有包含下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对。
(F1)：与序列号1的碱基序列中的、以第1038位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向5’方向至第20～32个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述鸟嘌呤碱基(G)为3’末端，
(R1)：与序列号1的碱基序列中的、以第1096位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第17～24个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1096位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端。
序列号1所示的碱基序列是人来源的芳胺N-乙酰基转移酶NAT等位基因1-2基因(Human h NAT allele 1-2gene forarylamine N-acetyltransferase)的DNA序列，例如NCBI登录号：No.D10870所登录的基因。
上述引物对(1)为用于扩增序列号1中的、含有第1039～第1095区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第1063位碱基(序列号1的第1063位碱基)存在对NAT2的功能具有影响的点突变(1063T、1063C)，该多态性为上述NAT2*5。本发明中，该位点的多态性在为纯合子时用1063T/T、1063C/C表示，在为杂合子时用1063T/C表示。予以说明，序列号1中的第1063位碱基相当于NAT2基因的mRNA的第341位碱基，因此NAT2*5的多态性还可以表示为341T/T、341C/C、341T/C。以下，将该引物对(1)称作“NAT2*5用引物对”。予以说明，在仅解析NAT2*5的多态性时，可以仅使用NAT2*5用引物对。
引物对(1)的F1引物和R1引物，只要是起到决定DNA聚合酶扩增的起始点的作用的3’末端碱基满足上述条件即可。如此，通过固定各引物的3’末端的碱基，可以充分地防止引物对(1)例如结合在类似的其它同工酶基因(例如NAT1、NAT6、 NAT8、NAT9基因等)上。
这样，F1引物和R1引物由于只要其3’末端的碱基被固定即可，因此各引物的长度本身并无特别限定，可以适当调整至普通的长度。作为引物长度的一例，例如为13～50mer的范围、优选为14～45mer、更优选为15～40mer。作为具体例，上述F1引物优选为如下：与序列号1的碱基序列中的、以第1038位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向5’方向至第20～32个碱基(优选第24～30个碱基、更优选第25～29个碱基)的区域序列相同的至少一个寡核苷酸。另外，上述R1引物优选如下：与序列号1的碱基序列中的、以第1096位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第17～24个碱基(优选第19～23个碱基、更优选第20～22个碱基)的区域互补的至少一个寡核苷酸。予以说明，由于F1引物和R1引物的3’末端被固定，因此由引物延伸的区域例如如上所述为序列号1的第1039～第1095的区域，所得扩增产物的整个长度随所用引物的长度而改变。
另外，R1引物可以是与序列号1所示的碱基序列并非完全互补的寡核苷酸、F1引物可以是与上述碱基序列的互补链并非完全互补的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端碱基以外的部分中，可以与完全互补的寡核苷酸有1个～5个碱基不同。
以下举出F1引物和R1引物的具体例子，本发明并非限于此。另外，这些F1引物和R1引物的组合并无任何限定，这些中，特别优选含有包含序列号5或序列号7的寡核苷酸的F1’引物和包含序列号16或序列号18的寡核苷酸的R1’引物的引物对(1’)。予以说明，下述表的“Tm(℃)”是下述表的序列和与其完全互补的序列杂交时的Tm(℃)，通过MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com)、将参数设为寡核苷酸浓度 0.2μM、钠当量(Na eq.)50mM而计算的数值(以下相同)。上述Tm值例如可通过现有公知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com)等计算，另外，还可以通过邻接法(Nearest Neighbor Method)确定(以下相同)。
表1
Figure BSA00000431142700111
接着，上述引物对(2)如上所述，为含有包含下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R2)的寡核苷酸的反相引物的一对引物对。
(F2)：与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第20～38个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)为3’末端，
(R2)：下述寡核苷酸中的至少一个：
与序列号1的碱基序列中的、以第1355位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向3’方向至第25～40个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1355位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)为3’末端，
以及
与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第21～36个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1614位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端。
上述引物对(2)为用于扩增序列号1中的、含有第1279～第1354区域或第1279～第1613区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第1312位碱基(序列号1的第1312位碱基)存在对NAT2的功能具有影响的点突变(1312G、1312A)，该多态性为上述NAT2*6。本发明中，该位点的多态性在为纯合子时可用1312G/G、1312A/A表示，在为杂合子时可用1312G/A表示。予以说明，序列号1中的第1312位碱基相当于NAT2基因的mRNA中的第590位碱基，因此NAT2*6的多态性，例如还可以表示为590G/G、590A/A、590G/A。以下，将该引物对(2)称作“NAT2*6用引物对”。予以说明，在仅解析NAT2*6的多态性时，可以仅使用NAT2*6用引物对。
本发明中，从与上述引物对(1)相同的理由出发，引物对(2)的F2引物和R2引物只要是起到决定DNA聚合酶的扩增起始点的作用的3’末端的碱基满足上述条件即可。因此，F2引物和R2引物的长度本身并无特别限定，可以举出与上述同样的长度。作为具体例，上述F2引物优选如下：与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第20～38个碱基(优选第21～38个碱基、更 优选第22～38个碱基)的区域序列相同的至少一个寡核苷酸。另外，上述(R2)引物优选如下：与序列号1的碱基序列中的、以第1355位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向3’方向至第25～40个碱基(优选第27～35个碱基、更优选第28～34个碱基)的区域互补的至少一个寡核苷酸或者与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第21～36个碱基(优选第23～36个碱基、更优选第24～36个碱基)的区域互补的至少一个寡核苷酸。予以说明，由于F2引物和R2引物的3’末端被固定，因此由引物延伸的区域通常为序列号1的第1279～第1354区域或第1279～第1613区域，所得扩增产物的整个长度随所用引物的长度改变。
另外，R2引物可以是与序列号1所示的碱基序列并非完全互补的寡核苷酸、F2引物可以是与上述碱基序列的互补链并非完全互补的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端的碱基外的部分，可以与完全互补的寡核苷酸有1个～5个碱基不同。
以下举出F2引物和R2引物的具体例子，本发明并非限于此。另外，这些F2引物和R2引物的组合并无任何限定，这些中，特别优选含有包含序列号33或序列号109的寡核苷酸的F2’引物和包含序列号39或序列号48的寡核苷酸的R2’引物的引物对(2’)。
表2
Figure BSA00000431142700141
接着，如上所述，上述引物对(3)为含有包含下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对。
(F3)：下述寡核苷酸中的至少一个：
与序列号1的碱基序列中的、以第1556位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基朝向5’方向至第21～40个碱基的区域序列 相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基(T)为3’末端，
以及
与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第20～38个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)为3’末端，
(R3)：与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第21～36个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1614位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端。
上述引物对(3)为用于扩增序列号1中的、含有第1557～第1613区域或第1279～第1613区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第1579位碱基(序列号1中的第1579位碱基)存在对NAT2的功能具有影响的点突变(1579G、1579A)，该多态性为上述NAT2*7。本发明中，该位点的多态性在为纯合子时用1579G/G、1579A/A表示，在为杂合子时用1579G/A表示。予以说明，序列号1中的第1579位碱基相当于NAT2基因的mRNA的第857位碱基，因此NAT2*7的多态性例如还可以表示为857G/G、857A/A、857G/A。以下，将该引物对(3)称作“NAT2*7用引物对”。予以说明，在仅解析NAT2*7的多态性时，可以仅使用NAT2*7用引物对。
本发明中，从与上述引物对(1)相同的理由出发，引物对(3)的F3引物和R3引物只要是起到决定DNA聚合酶的扩增起始点的作用的3’末端的碱基满足上述条件即可。因此，F3引物和R3引物的长度本身并无特别限定，可以举出与上述同样的长度。作为具体例，上述F3引物优选如下：与序列号1 的碱基序列中的、以第1556位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基朝向5’方向至第21～40个碱基(优选第23～40个碱基、更优选第24～40个碱基)的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，或者优选如下：与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第20～38个碱基(优选第21～38个碱基、更优选第22～38个碱基)的区域序列相同的至少一个寡核苷酸。上述(R3)引物优选如下：与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第21～36个碱基(优选第23～35个碱基、更优选第24～28个碱基)的区域互补的至少一个寡核苷酸。予以说明，由于F3引物和R3引物的3’末端被固定，因此由引物延伸的区域通常如上所述为序列号1的第1557～第1613区域或第1279～第1613区域，所得扩增产物的整个长度随所用引物的长度改变。
另外，R3引物可以是与序列号1所示的碱基序列并非完全互补的寡核苷酸、F3引物可以是与上述碱基序列的互补链并非完全互补的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端的碱基以外的部分，可以与完全互补的寡核苷酸有1个～5个碱基不同。
以下举出F3引物和R3引物的具体例子，本发明并非限于此。另外，这些F3引物和R3引物的组合并无任何限定，这些中，特别优选含有包含序列号60或序列号113的寡核苷酸的F3’引物和包含序列号71或序列号81的寡核苷酸的R3’引物的引物对(3’)。
表3
Figure BSA00000431142700171
另外，上述各引物例如为了提高扩增反应的反应温度，还可以在5’末端添加现有公知的任意序列。
利用上述引物对(2)或上述引物对(3)扩增含有第1279～第1613的DNA链及其互补链时，无论任何引物对中，均可使用下面所示的相同的正向引物和反向引物。
正向引物
(F2)(F3)与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第20～38个碱基 的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)为3’末端。
反向引物
(R2)(R3)与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第21～36个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1614位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端。
此时，本发明的引物对除了含有引物对(1)之外，例如可以仅含有1种引物对(NAT2*6*7用引物)作为引物对(2)和(3)。另外，正向引物可以包含兼有上述引物对(2)和引物对(3)的正向引物的1种正向引物，反向引物可以包含上述引物对(2)和引物对(3)的各自的反向引物。
含有这种引物对(1)～(3)的至少1种的本发明的NAT2基因扩增用引物对，例如优选在扩增全血试样等生物试样的NAT2基因时使用。特别是，本发明的NAT2基因扩增用引物对与后述多态性检测用探针一起使用时，优选使基因扩增用反应液中的全血试样的添加比例为0.1～0.5体积％。对于该方面在后叙述。
<NAT2基因扩增用试剂>
如上所述，本发明的NAT2基因扩增用试剂，其特征在于，其为用于利用基因扩增法扩增NAT2基因的试剂，包含本发明的NAT2基因扩增用引物对。本发明的NAT2基因扩增用试剂的特征在于含有本发明的引物对，除此之外的组成等并无任何限定。
为了对使用本发明引物对、利用基因扩增法获得的扩增产物进行检测，本发明的NAT2基因扩增用试剂还可以含有例如能够与NAT2基因的检测对象位点杂交的探针。如上所述，利 用本发明的引物对，例如可以根据其中所含引物对(1)～(3)的种类，利用基因扩增法特异地扩增NAT2基因的1～3个目标区域。因此，通过同时存在与上述各目标区域的检测对象序列互补的探针，例如可以利用后述的方法检测有无扩增、分析检测对象位点的基因型(多态性)等。对于这种探针及其利用方法，在之后的多态性解析方法中说明。另外，本发明的NAT2基因扩增用试剂优选在扩增全血等生物试样中的NAT2基因时使用。特别是，在同时使用本发明的NAT2基因扩增用试剂与上述探针时，优选使基因扩增用反应液中的全血试样的添加比例为0.1～0.5体积％。予以说明，本发明中“检测对象序列”是指含有多态性发生位点(检测对象位点)的序列。
本发明的NAT2基因扩增用试剂的形态并无特别限定，例如可以是含有本发明NAT2基因扩增用引物对的液体试剂，还可以是在使用前用溶剂混悬的干燥试剂。另外，NAT2基因扩增用引物对的含量也无特别限定。
<扩增产物的制造方法>
本发明的扩增产物的制造方法，如上所述，其特征在于，是利用基因扩增法制造NAT2基因的扩增产物的方法，包含下述(I)工序：
(I)以试样中的核酸为模板，使用本发明的NAT2基因扩增用引物对，在反应液中扩增上述NAT2基因的工序。
如此通过使用本发明的NAT2基因扩增用引物对进行扩增反应，如上所述可以扩增NAT2基因的目标区域。另外，本发明的NAT2基因扩增用引物对含有上述引物对(1)～(3)中的任2种时，可以在同一反应液中同时扩增NAT2基因的分别含有2个检测对象位点的2个目标区域。另外，本发明的NAT2基因扩增用引物对含有上述引物对(1)～(3)全部时，可以 在同一反应液中同时扩增NAT2基因的分别含有3个检测对象位点的3个目标区域。通过本发明扩增的目标区域如上所述，为分别含有各多态性(NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7)发生的检测对象位点的区域。予以说明，本发明的扩增产物制造方法的特征在于使用本发明的引物对，对基因扩增法的种类、条件等并无任何限定。
上述基因扩增法如上所述并无特别限定，例如可以举出PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)法、NASBA(Nucleic acid sequence based amplification，基于核酸序列的扩增)法、TMA(Transcription-me diated amplification，转录介导扩增)法、SDA(Strand Displacement Amplification，链置换扩增)法等，优选PCR法。另外，以下以PCR法为例说明本发明，但并非局限于此。
作为应用本发明的试样，例如只要含有做为模板的核酸即可，并无特别限定，例如优选应用于含有杂质的材料。作为上述含有杂质的试样例如可以举出全血、口腔内细胞(例如口腔粘膜)、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、吐出的痰液、羊水、石蜡包埋组织、尿、胃液(例如胃洗涤液)等，它们的混悬液等。使用了本发明的引物对的扩增产物的制造方法，例如即便是含有各种杂质的试样(特别是全血、口腔内细胞等生物材料)，也不易受杂质的影响，可以特异地扩增NAT2基因的上述区域。因此，通过本发明，即便是通过以往方法较难分析的杂质多的试样，也可以不进行精制等预处理直接使用。因此，从试样的预处理的观点出发，可以较以往方法更为迅速地制造扩增产物。
上述反应液中的试样添加比例并无特别限定。作为具体例，当上述试样为生物试样(例如全血试样)时，上述反应液中的添加比例的下限例如优选为0.01体积％以上、更优选为0.05体 积％以上、进一步优选为0.1体积％以上。上述添加比例的上限并无特别限定，例如优选为2体积％以下、更优选为1体积％以下、进一步优选为0.5体积％以下。
另外，如后述的以光学检测为目的时，特别是使用标记探针进行光学检测时，上述反应液中的全血试样等生物试样的添加比例例如优选设定为0.1～0.5体积％。在PCR反应中，通常为了使DNA变性(解离成单链DNA)而实施热处理，但由于该热处理，试样所含的糖、蛋白质等发生变性，有产生不溶沉淀物、混浊等的顾虑。因此，在利用光学方法确认扩增产物的有无、检测对象位点的基因型(多态性)时，这种沉淀物、混浊的发生有可能对测定精度造成影响。但是，通过将反应液中的全血试样的添加比例设定在上述范围内，虽然原理不明，但由于例如可以充分地防止变性所产生的沉淀物等造成的影响，因此可以提高光学方法的测定精度。另外，由于还可充分地抑制全血试样中的杂质对PCR的干扰，因此可以进一步提高扩增效率。因而，在使用本发明的引物对的基础上，通过进一步将全血试样等试样的添加比例设定在上述范围内，可以进一步降低试样预处理的必要性。
另外，上述反应液中的全血试样的比例可以不用上述体积比例(例如0.1～0.5体积％)表示，用血红蛋白(以下称作“Hb”)的重量比例来表示也是可以的。此时，上述反应液的全血试样的比例换算为Hb量例如优选为0.565～113g/L的范围、更优选为2.825～56.5g/L的范围、进一步优选为5.65～28.25g/L的范围。予以说明，上述反应中的全血试样的添加比例例如可以满足上述体积比例和Hb重量比例两者，也可以满足任一者。
作为全血，例如可以是溶血的全血、未溶血的全血、抗凝固全血、含有凝固组分的全血等任一种。
本发明中，试样所含的目标核酸例如为DNA。上述DNA例如可以是生物试样等试样中原本含有的DNA，还可以是通过基因扩增法扩增的扩增产物DNA。为后者时，可以举出利用逆转录反应(例如RT-PCR(reverse transcriptase PCR))由上述试样原本含有的RNA(总RNA、mRNA)生成的cDNA。
本发明的扩增产物的制造方法中，优选在基因扩增反应开始前，向上述反应液中添加白蛋白。通过这种白蛋白的添加，例如可以进一步降低上述沉淀物、悬浊的产生所带来的影响，且可以进一步提高扩增效率。具体地说，优选在上述(I)工序的扩增反应中或解离成单链DNA的工序前添加白蛋白。
上述反应液中的白蛋白添加比例例如为0.01～2重量％的范围、优选为0.1～1重量％、更优选为0.2～0.8重量％。上述白蛋白并无特别限定，例如可以举出牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、马血清白蛋白等，这些物质可以使用任1种，还可以并用2种以上。
接着，列举例子对本发明的扩增产物制造方法进行说明，所述例子为：对全血试样，以DNA为目标核酸、使用含有上述引物对(1)～(3)的本发明NAT2基因扩增用引物对、利用PCR来制造NAT2基因的3个目标区域的扩增产物的例子。予以说明，本发明的特征在于使用本发明的引物对，其他构成及条件并无任何限定。
首先，制备PCR反应液。本发明的引物对的添加比例并无特别限定，优选按照引物对(1)～(3)的F引物分别达到0.1～2μmol/L地添加、更优选为0.25～1.5μmol/L、特别优选为0.5～1μmol/L。另外，优选按照引物对(1)～(3)的R引物分别达到0.1～2μmol/L地添加、更优选为0.25～1.5μmol/L、特别优选为0.5～1μmol/L。各引物对中的F引物和R引物的添加比 例(F∶R的摩尔比)并无特别限定，例如优选为1∶0.25～1∶4、更优选为1∶0.5～1∶2。
反应液中全血试样的比例并无特别限定，优选为上述范围。全血试样可以直接添加在反应液中，还可以预先用水或缓冲液等溶剂稀释后添加至反应液中。预先稀释全血试样时，其稀释率并无特别限定，例如可以按照反应液中最终全血添加比例达到上述范围进行设定，例如为100～2000倍、优选为200～1000倍。
上述反应液的其它组成成分并无特别限定，可以举出以往公知的成分，其比例也无特别限定。上述组成成分例如可以举出DNA聚合酶、核苷酸(核苷三磷酸(dNTP))和溶剂。另外，如上所述，优选上述反应液中进一步含有白蛋白。予以说明，上述反应液中，各组成成分的添加顺序并无任何限定。
上述DNA聚合酶并无特别限定，例如可以使用现有公知的耐热性细菌来源的聚合酶。具体例子有可以商业地获得的来自栖热水生菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(美国专利第4,889,818号以及美国专利第5,079,352号)(商品名Taq聚合酶)、来自极端嗜热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶(WO91/09950)(rTth DNA polymerase)、来自强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的DNA聚合酶(WO 92/9689)(Pfu DNApolymerase：Stratagenes公司产)、来自嗜热球菌(Thermococcuslitoralis)的DNA聚合酶(EP-A 455 430)(商标Vent：New EnglandBiolabs公司产)等，其中，优选来自栖热水生菌(Thermusaquaticus)的耐热性DNA聚合酶。
上述反应液中DNA聚合酶的添加比例并无特别限定，例如为1～100U/mL、优选为5～50U/mL、更优选为20～30U/mL。予以说明，DNA聚合酶的活性单位(U)一般是以活化鲑鱼精 子DNA为模板和引物，在活性测定用反应液中、74℃下、30分钟内将10nmol的总核苷酸吸收到酸不溶性沉淀物的活性作为1U。上述活性测定用反应液的组成例如为25mM TAPS buffer(pH9.3、25℃)、50mM KCl、2mM MgCl2、1mM巯基乙醇、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dTTP、100μM“α-32P”dCTP、0.25mg/mL活性鲑鱼精子DNA。
上述核苷三磷酸通常可以举出dNTP(dATP、dCTP、dTTP)。上述反应液中的dNTP的添加比例并无特别限定，例如为0.01～1mmol/L、优选为0.05～0.5mmol/L、更优选为0.1～0.3mmol/L。
上述溶剂例如可以举出Tris-HCl、Tricine、MES、MOP S、HEPES、CAP S等缓冲液，可以使用市售的PCR用缓冲液或市售的PCR试剂盒的缓冲液等。
另外，上述PCR反应液还可以含有肝素、甜菜碱、KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等，它们的添加比例例如可以在不阻碍PCR反应的范围内设定。
反应液的总体积并无特别限定，例如可以根据所用仪器(热循环仪)等适当地设定，通常为1～500μL、优选为10～100μL。
接着，进行PCR。PCR循环条件并无特别限定，例如(1)全血来源的双链DNA解离成单链DNA、(2)引物的退火、(3)引物的延伸(聚合酶反应)分别如下所述。另外，循环数也无特别限定，以下述(1)～(3)的3步骤为1个循环，例如优选为30个循环以上。上限并无特别限定，例如共计100个循环以下、优选70个循环以下、更优选50个循环以下。各步骤的温度变化例如可以使用热循环仪等自动地控制。使用本发明的引物对时，如上所述由于扩增效率优异，因此与利用以往方法时50个循环需要3小时左右相比，利用本发明可以在约1小时左右(优选1小时以内)完成50个循环。
表4
Figure BSA00000431142700251
如上所述，可以制造与NAT2基因的3个区域互补的扩增产物。予以说明，在制造与3个目标区域中任1个或任2个互补的扩增产物时，例如可以使用含有引物对(1)～(3)中与目标区域相应的任1种或任2种引物对的本发明的NAT2基因扩增用引物对。
本发明的扩增产物的制造方法还包含检测通过上述扩增反应获得的区域的扩增产物的工序。由此，可以检测扩增产物的有无、NAT2基因的上述目标区域中的基因型(多态性NAT2*5、多态性NAT2*6、多态性NAT2*7)。扩增产物的有无可以利用现有公知的方法确认。具体地说，在上述(I)工序中，在上述反应液中预先添加能够与NAT2基因的检测对象位点杂交的探针(例如荧光标记探针)，进而，通过(II)工序，即，测定上述反应液中的上述探针的荧光标记的荧光强度来确认。另外，当所扩增的目标区域为2个或3个时，例如在上述(I)工序中向上述反应液中预先添加2种或3种能够与NAT2基因的各检测对象位点杂交的探针(例如荧光标记探针)，进而，通过(III)工序，即，测定上述反应液中的各探针的各荧光标记的荧光强度来确认。予以说明，以下将NAT2基因的多态性NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7的检测作为本发明的一方式，进行说明。
<NAT2基因的多态性解析方法>
本发明的NAT2基因的多态性解析方法，其特征在于，其 为解析NAT2基因的检测对象位点的多态性的方法，包含下述(i)～(iv)工序：
(i)利用本发明的扩增产物的制造方法，在反应液中扩增NAT2基因的含有检测对象位点的区域的工序，
(ii)准备含有上述(i)工序的扩增产物和能够与上述检测对象位点杂交的探针的反应液的工序，
(iii)改变上述反应液的温度，测定上述扩增产物与上述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的工序，
(iv)由伴随温度变化的上述信号值的变动，确定上述检测对象位点的多态性的工序。
如此通过使用本发明的引物对制造扩增产物，可以如上所述地扩增NAT2基因中的含有多态性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)检测对象位点的目标区域、解析上述目标区域的检测对象位点的多态性。
上述(i)工序的探针并无特别限定，例如可以举出与多态性NAT2*5的发生位点杂交的探针(以下也称作“NAT2*5用探针”)、与多态性NAT2*6的发生位点杂交的探针(以下也称作“NAT2*6用探针”)、与多态性NAT2*7的发生位点杂交的探针(以下也称作“NAT2*7用探针”)。这些探针优选为与含有上述检测对象位点的检测对象序列互补的探针。这些探针可以为任1种，还可以是任2种或3种全部，例如可以根据通过本发明NAT2基因扩增用引物对扩增的目标区域的种类来确定。使用2种或3种探针时，例如可以使用同一反应液解析任2个检测对象位点或上述3个检测对象位点全部的多态性。
用于检测上述多态性的探针并无特别限定，可以利用现有公知的方法设定。例如作为含有多态性的检测对象位点的检测对象序列可以根据NAT2基因的正义链的序列来设计，还可以 根据反义链的序列设计。另外，多态性检测对象位点的碱基可根据各多态性的种类适当地确定。即，NAT2*5的情形中，已知序列号1的第1063位碱基存在“T”和“C”的多态性，因此可以举出例如与第1063位为T的检测对象序列和第1063位为C的检测对象序列的任一个互补的探针(正义链的检测用探针)、与其反义链的序列互补的探针(反义链的检测用探针)。另外，NAT2*6的情形中，已知序列号1的第1312位碱基存在“G”和“A”的多态性，因此可以举出例如与第1312位为G的检测对象序列和第1312位为A的检测对象序列的任一个互补的探针(正义链的检测用探针)、与其反义链的序列互补的探针(反义链的检测用探针)。NAT2*7的情形中，已知序列号1的第1579位碱基存在“G”和“A”的多态性，因此可以举出例如与第1579位为G的检测对象序列和第1579位为A的检测对象序列的任一个互补的探针(正义链的检测用探针)、与其反义链的序列互补的探针(反义链的检测用探针)。这样，在设计探针时，无论将发生多态性的检测对象位点的碱基设定为上述哪种碱基，都可以利用后述的方法来判断在NAT2基因的各检测对象位点处显示何种多态性。
上述各探针可以在上述(i)工序后、即对于NAT2基因的目标区域进行扩增反应后，添加于扩增反应液中，但优选在上述(i)工序的扩增反应之前预先添加到反应液中，其原因在于这样可容易且迅速地进行解析。
上述反应液中探针的添加比例并无特别限定，例如优选按照达到10～400nmol/L的范围添加各探针，更优选为20～200nmol/L。另外，使用荧光染料作为探针的标记时，例如为了调整所检测的荧光强度，可以同时使用与标记探针序列相同的但未标记的探针，该未标记探针可以在其3’末端附加有磷酸。 此时，标记探针与非标记探针的摩尔比例如优选为1∶10～10∶1。上述探针的长度并无特别限定，例如为5～50mer、优选为10～30mer。
对于Tm值进行说明。当持续加热含有双链DNA的溶液时，260nm的吸光度上升。这是由于双链DNA双链间的氢键通过加热而打开，解离成单链DNA(DNA融解)。而且，当全部的双链DNA解离、变为单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA的吸光度)的约1.5倍左右，由此可以判断融解结束。根据该现象，融解温度Tm一般定义为吸光度到达吸光度总上升量的50％时的温度。
在上述(iii)工序中，上述扩增产物与上述探针的杂交产物显示溶解状态的信号的测定，可以是上述260nm的吸光度测定，还可以是标记物的信号测定。具体地说，优选使用用标记物标记的标记探针作为上述探针，测定上述标记物的信号。作为上述标记探针例如可以举出单独时显示信号、由于形成杂交体而不显示信号的标记探针；或者单独不显示信号、由于形成杂交体而显示信号的标记探针。为前者的这种探针时，在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时不显示信号，通过加热探针游离时，则显示信号。另外，为后者的探针时，在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时显示信号，通过加热探针游离时，则信号减少(消失)。因此，通过在信号特有条件(吸收波长等)下检测该标记所产生的信号，可以与上述260nm的吸光度测定同样，可以确定融解的进展以及Tm值确定。
本发明中，如上所述，还可以对在同一反应液中扩增的2个或3个目标区域的扩增产物确认多态性。因此，使用2种或3种探针时，优选使用在各不相同的条件下被检测的不同标记进行标记。通过如此使用不同的标记，即便是同一反应液，通 过改变检测条件，也可以分别解析各扩增产物。
作为上述标记探针的标记物的具体例子，例如可以举出荧光染料(荧光团)。作为上述标记探针的具体例子例如优选用荧光染料进行标记、单独时显示荧光、且通过形成杂交体荧光减少(例如猝灭)的探针。利用这种荧光猝灭现象(Quenchingphenomenon)的探针一般被称作荧光猝灭探针。其中，上述探针优选寡核苷酸的3’末端或5’末端被荧光染料标记，被标记的上述末端的碱基优选为C。此时，优选将上述标记探针的碱基序列设计成：在上述标记探针所杂交的检测对象序列中，与上述标记探针的末端碱基C成对的碱基或者从上述成对的碱基起距离1～3个碱基的碱基为G。这种探针一般被称作鸟嘌呤猝灭探针，已知有所谓的QProbe(注册商标)。这种鸟嘌呤猝灭探针与检测对象序列杂交时，被荧光染料标记的末端C接近上述检测对象DNA的G，因此显示上述荧光染料的发色减弱(荧光强度减少)的现象。使用这种探针时，利用信号的变动可以容易地确认杂交或解离。
作为上述荧光染料并无特别限定，例如可以举出荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等，作为市售的荧光染料例如可以举出BODIPYFL(商标、モレキユラ一·プロ一ブ公司制)、FluorePrime(商品名、アマシヤムフアルマシア公司制)、Fluore dite(商品名、Milipore公司制)、FAM(ABI公司制)、Cy3和Cy5(アマシヤムフアルマシア公司制)、TAMRA(モレキユラ一·プロ一ブ公司制)等。3种探针中使用的荧光染料的组合例如只要能够在不同条件下检测即可，并无特别限定，例如可以举出Pacific Blue(检测波长450～480nm)、TAMRA(检测波长585～700nm)和BODIPY FL(检测波长515～555nm)的组合等。
以下举出用于检测多态性NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7的探针序列的具体例子，本发明并非局限于此。下述探针(1)为NAT2*5用探针的一例，是用于检测正义链的探针。下述探针(2)为NAT2*6用探针的一例，是用于检测反义链的探针。下述探针(3)为NAT2*7用探针的一例，是用于检测反义链的探针。
探针(1)
(1-1)与序列号1中的、以第1056位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向3’方向至第13～19个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基为3’末端。
探针(2)
与序列号1中的、以第1302位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第18～27个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基为5’末端。
探针(3)
与序列号1中的、以第1583位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第16～21个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基为3’末端。
上述探针(1)中，与序列号1的第1063位碱基互补的碱基用r表示，上述r为A或G，上述探针(2)中，位于序列号1的第1312位的碱基用r表示，上述r为G或A，上述探针(3)中，位于序列号1的第1579位的碱基用r表示，上述r为G或A。
然后将上述探针(1)、探针(2)和探针(3)的具体例子示于下述表中。予以说明，下述表中“Tm(℃)”是下述表中的序列和与其完全互补的序列杂交时的Tm(℃)，是利用MELTCAL软件(http://www.meltcalc.com/)、将参数设为寡核 苷酸浓度0.2μM、钠当量(Na eq.)50mM而计算出的值。
表5
上述表的探针(1)包含与序列号1的第1063位为C的区域互补的序列，大写的碱基表示与序列号1的第1063位碱基互补的碱基。予以说明，上述探针(1)中，上述大写碱基可以置换成r、上述r可以为G和A的任一种。上述表的探针(2)包含与序列号1的第1312位为A的区域相同的序列，大写的碱基表示序列号1的第1312位碱基。予以说明，上述探针(2)中，上述大写碱基可以置换成r、上述r可以为G和A的任一种。上述表的探针(3)包含与序列号1的第1579位为A的区域相同的序列，大写 的碱基表示序列号1的第1579位碱基。予以说明，上述探针(3)中，大写碱基可以置换成r、上述r可以为G和A的任一种。本发明探针的具体例子，还可以是如上所述的上述表所示的寡核苷酸的互补链。
上述探针为一个例子，本发明并非局限于此。在上述探针(1)中，优选选自含有序列号90、含有序列号91、含有序列号118和含有序列号122的碱基序列的寡核苷酸所组成的组中的至少1个寡核苷酸作为NAT2*5用探针。另外，优选并用所谓的野生型检测用探针和突变型检测用探针作为NAT2*5用探针。这里，野生型检测用探针是指例如用于检测序列号1的第1063位碱基为T的检测对象序列(正义链)或其互补链(反义链)的探针，突变型检测用探针是指例如用于检测序列号1的第1063位碱基为C的检测对象序列(正义链)或其互补链(反义链)的探针。本发明中，优选例如并用包含序列号87～92和116的碱基序列的至少1个寡核苷酸(突变型检测用探针)和包含序列号117～123的碱基序列的至少1个寡核苷酸(野生型检测用探针)，更优选并用包含序列号90或包含序列号91的碱序列的寡核苷酸(突变型检测用探针)和包含序列号118或序列号122的碱基序列的寡核苷酸(野生型检测用探针)。如此，当并用野生型检测用探针和突变型检测用探针时，例如优选将各探针的完全匹配的Tm值设定为错开。
NAT2*6用探针优选为包含序列号99的碱基序列的寡核苷酸。NAT2*7用探针优选为包含序列号105或序列号107的碱基序列的寡核苷酸。
这些探针在使用2种以上时，如上所述，优选用分别不同的荧光染料(用不同波长检测的荧光染料)标记。例如，当使上述表所示探针为鸟嘌呤猝灭探针时，优选NAT2*5用探针(探针 (1))和NAT2*7用探针(探针(3))3’末端的胞嘧啶用上述荧光染料(例如BODIPY EL、TAMRA等)标记，优选NAT2*6用探针(探针(2))5’末端的胞嘧啶用上述荧光染料(例如PacificBlue)标记。另外，为了防止5’末端被荧光染料标记的探针本身延伸，可以在其3’末端附加磷酸基。另外，如上所述使用野生型检测用探针和突变型检测用探针时，各个荧光染料可以相同也可以不同。
接着，列举一个例子说明本发明的检测方法，即，使用下述探针检测NAT2基因的3个多态性NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7。予以说明，本发明并非局限于此。
(探针)
NAT2*5用探针
5’-tgccgtcaGtggtcac-(BODIPY FL)-3’(序列号90)、
5’-gccgtcaGtggtcac-(BODIPY FL)-3’(序列号91)、
5’-cctgccgtcaAtggtcac-(BODIPY FL)-3’(序列号118)、或、
5’-ccgtcaAtgtcac-(BODIPY FL)-3’(序列号122)
NAT2*6用探针
5’-(Pacific Blue)-cttgaacctcAaacaattgaa-P-3’(序列号99)
NAT2*7用探针
5’-caaacctggtgatgAatcc-(TAMRA)-3’(序列号105)、或
5’-aacctggtgatgAatcc-(TAMRA)-3’(序列号107)
首先使用添加有上述3种标记探针的反应液，如上所述地进行PCR，在同一反应液中同时扩增NAT2基因的3个区域。上述反应液含有例如本发明NAT2基因扩增用引物对、DNA聚合酶、dNTP、含有成为模板的核酸的试样以及上述3种探针。除此之外，还可以含有能够用于核酸扩增的各种添加剂。
接着，进行所得扩增产物的解离以及使通过解离获得的单 链DNA与上述标记探针进行杂交。这可以通过例如改变上述反应液的温度来进行。
上述解离工序的加热温度只要是能使上述扩增产物解离的温度则无特别限定，例如为85～95℃。加热时间也无特别限定，通常为1秒～10分钟、优选1秒～5分钟。
解离的单链DNA和上述标记探针的杂交例如可以在上述解离工序后，降低上述解离工序的加热温度来进行。温度条件例如为40～50℃。
然后，改变上述反应液的温度，测定上述扩增产物与上述标记探针的杂交产物显示融解状态的信号值。具体地说，例如加热上述反应液(上述单链DNA与上述标记探针的杂交产物)，测定伴随温度上升的信号值变动。如上所述，当使用末端的C碱基被标记的探针(鸟嘌呤猝灭探针)时，在与单链杂交的状态下，荧光减少(或者猝灭)，在解离的状态下发出荧光。因此，例如可以慢慢加热荧光减少(或者猝灭)了的杂交产物，测定伴随温度上升的荧光强度增加。
测定荧光强度的变动时的温度范围并无特别限定，例如起始温度为室温～85℃、优选为25～70℃，终止温度例如为40～105℃。另外，温度的上升速度并无特别限定，例如为0.1～20℃/秒、优选为0.3～5℃/秒。
接着，解析上述信号的变动来确定Tm值。具体地说，从所得荧光强度求得各温度下每单位时间的荧光强度变化量(-d荧光强度增加量/dt)，将显示最低值的温度作为Tm值。另外，也可以将每单位时间的荧光强度增加量(d荧光强度增加量/dt)最高的点作为Tm值。予以说明，不使用猝灭探针，而是使用单独不显示信号且通过杂交显示信号的探针作为标记探针时，相反地可以测定荧光强度的减少量。
本发明中，为了检测3个多态性NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7，可以在与3种探针的各标记相应的条件下确定各个Tm值。NAT2*5用探针BODIPY FL例如可以在检测波长515～555nm下检测，NAT2*6用探针Pacific Blue例如可以在检测波长450～480nm下检测、NAT2*7用探针TAMRA例如可以在检测波长585～700nm下检测。
然后，由这些Tm值确定各检测对象位点的基因型。Tm解析中，可以获得如下的结果：完全互补的杂交体(匹配)的显示解离的Tm值比有一个碱基不同的杂交体(不匹配)高。因此，通过对上述探针预先确定完全互补的杂交体的Tm值和有一个碱基不同的杂交体的Tm值，可以确定各检测对象位点的基因型。例如，在将检测对象位点的碱基假设为突变型(例如序列号1的第1063位碱基为C)，使用与含有其的检测对象序列互补的探针时，所形成的杂交体的Tm值若与完全互补的杂交体的Tm值相同，则可确定上述扩增产物的多态性为突变型。另外，所形成的杂交体的Tm值若与有一个碱基不同的杂交体的Tm值相同(低于完全互补的杂交体的Tm值)，则可确定上述扩增产物的多态性为野生型(例如序列号1的第1063位碱基为T)。而且，当检测到两种Tm值时，可以判断为杂合子。如此，由与各标记探针相应的3个Tm值，可以判断多态性NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7的基因型。
另外，本发明中，如上所述，还可以取代提高含有上述探针的反应液的温度(加热杂交产物)、测定伴随温度上升的信号变动的方法，例如可以进行杂交体形成时的信号变动的测定。即，可以在降低含有上述探针的反应液的温度形成杂交产物时，测定伴随上述温度降低的信号变动。
作为具体例，当使用单独显示信号、且由于形成杂交体而 不显示信号的标记探针(例如鸟嘌呤猝灭探针)时，在单链DNA和探针解离的状态下发出荧光，但由于温度的降低而形成杂交体时，上述荧光减少(或者猝灭)。因此，例如可以慢慢降低上述反应液的温度，测定伴随温度降低的荧光强度的减少。另外，使用单独不显示信号、且由于形成杂交体而显示信号的标记探针时，在单链DNA和探针解离的状态下不会发出荧光，但由于温度的降低而形成杂交体时，则发出荧光。因此，例如可以慢慢降低上述反应液的温度，测定伴随温度降低的荧光强度的增加。
予以说明，当对NAT2基因的3种多态性(多态性NAT2*5、NAT2*6或NAT2*7)中任1个或任2个多态性进行解析时，例如可以使用包含引物对(1)～(3)中与目标区域相应的任1种或任2种引物对的本发明NAT2基因扩增用引物对，进而使用与目标检测对象位点杂交的任1种或任2种探针。
接着，说明本发明的实施例。本发明并不受下述实施例的限定。
实施例1
使用肝素锂采血管对4位待测者进行采血(样品1～4)。将所得血液10μL与蒸馏水90μL混合，进而将该混合液10μL与蒸馏水90μL混合。将该混合液10μL添加至下述组成的PCR反应液40μL中，使用热循环仪进行PCR。PCR的条件为在95℃下处理60秒钟后，以95℃下1秒钟和60℃下10秒钟为1个循环重复进行50个循环，进而在95℃下处理1秒钟，在40℃下处理60秒钟。接着，使温度的上升速度为1℃/3秒钟，将上述PCR反应液从40℃加热至95℃，测定实时的荧光强度变化。测定波长为450～480nm(荧光染料Pacific Blue的检测)、515～555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)和585～700nm(荧光染料TAMRA的检 测)。予以说明，50个循环的PCR所需要的时间约为1个小时。
表6
Figure BSA00000431142700371
*商品名Gene Taq FP：ニツポンジ一ン公司制
(探针)
NAT2*5用探针1
5’-tgccgtcaGtggtcac-(B ODIPY FL)-3’(序列号90)
NAT2*5用探针2
5’-tgccgtcaGtggtcac-P-3’(序列号90)
NAT2*6用探针
5’-(Pacific Blue)-cttgaacctcAaacaattgaa-P-3’(序列号99)
NAT2*7用探针
5’-caaacctggtgatgAatcc-(TAMRA)-3’(序列号105)
(引物对)
NAT2*5F 1引物
5’-cagttaacaaatacagcactggcatgg-3’(序列号7)
NAT2*5R1引物
5’-acatctgggaggagcttccag-3’(序列号18)
NAT2*6F2引物
5’-ctcatctcctgccaaagaagaaac-3’(序列号33)
NAT2*6R2引物
5’-gatgtggttataaatgaagatgttggagac-3’(序列号48)
NAT2*7F3引物
5’-aaatatatttaagatttccttggggagaaat-3’(序列号60)
NAT2*7R3引物
5’-tgagttgggtgatacatacacaaggg-3’(序列号81)
与NAT2*5用探针匹配的杂交体的Tm值为66.0、错误匹配的杂交体的Tm值为58.0℃，与NAT2*6用探针匹配的杂交体的Tm值为61.0℃、错误匹配的杂交体的Tm值为53.0℃，与NAT2*7用探针匹配的杂交体的Tm值为63.0℃、错误匹配的杂交体的Tm值为56.0℃。
将样品1～4的结果示于图1。该图为表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm解析的图表，纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”、横轴表示温度(以下同样)。如该图所示，由信号的峰确定各样品的NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7的基因型。为了支持这些实施例的结果，利用RFLP法和测序法对4位待测者确认NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7的多态性，结果获得与实施例相同的结果。如此，通过使用本发明的引物对，可以使用不实施预处理的全血试样，在同一反应液中同时扩增NAT2基因的3个区域，且可以使用上述同一反应液解析3种多态性。
实施例2
使用EDTA采血管对3位待测者进行采血(样品1～3)。将所得血液10μL与下述稀释液A 70μL混合，进而将该混合液10μL 与下述稀释液B 70μL混合。在95℃下将所得混合液10μL加热处理5分钟后，添加至下述组成的PCR反应液46μL中，使用热循环仪进行PCR。PCR的条件为在95℃下处理60秒钟后，以95℃下1秒钟和65℃下15秒钟为1个循环，重复进行50个循环，进而在95℃下处理1秒钟，在40℃下处理60秒钟。接着，使温度的上升速度为1℃/3秒钟，将上述PCR反应液从40℃加热至75℃，测定实时的荧光强度变化。测定波长为450～480nm(荧光染料Pacific Blue的检测)、515～555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)和585～700nm(荧光染料TAMRA的检测)。
(稀释液A)
10mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.05％NaN3、0.3％SDS
(稀释液B)
10mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.05％NaN3
表7
Figure BSA00000431142700391
*商品名Gene Taq FP：ニツポンジ一ン公司制
(探针)
NAT2*5用探针1
5’-gccgtcaGtggtcac-(BODIPY FL)-3’(序列号91)
NAT2*5用探针2
5’-ccgtcaAtggtcac-(BODIPY FL)-3’(序列号118)
NAT2*6用探针
5’-(Pacific Blue)-cttgaacctcAaacaattgaa-P-3’(序列号99)
NAT2*7用探针
5’-aacctggtgatgAatcc-(TAMRA)-3’(序列号107)
(引物对)
NAT2*5F 1引物
5’-tccagttaacaaatacagcactggcatgg-3’(序列号7)
NAT2*5R1引物
5’-ccacatctgggaggagcttccag-3’(序列号18)
NAT2*6F2引物
5’-agaatttcttaattctcatctcctgccaaagaagaaac-3’(序列号33)
NAT2*6R2引物
5’-gaacaaaatgatgtggttataaatgaagatgttggagac-3’(序列号48)
NAT2*7F3引物
5’-agtgctgaaaaatatatttaagatttccttggggagaaat-3’(序列号60)
NAT2*7R3引物
5’-tgataattagtgagttgggtgatacatacacaaggg-3’(序列号81)
与NAT2*5用探针匹配的杂交体的Tm值为63℃、错误匹配的杂交体的Tm值为56℃，与NAT2*6用探针匹配的杂交体的Tm值为58℃、错误匹配的杂交体的Tm值为50.5℃，与NAT2*7用探针匹配的杂交体的Tm值为58℃、错误匹配的杂交体的Tm值为 49℃。
将样品1～3的结果示于图2。该图为表示伴随温度上升的荧光强度变化的Tm解析的图表，纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”、横轴表示温度。如该图所示，由信号的峰确定各样品的NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7的基因型。为了支持这些实施例的结果，利用RFLP法和测序法对3位待测者确认NAT2*5、NAT2*6和NAT2*7的多态性，结果获得与实施例相同的结果。如此，通过使用本发明的引物对，可以使用不实施预处理的全血试样，在同一反应液中同时扩增NAT2基因的3个区域，且使用上述同一反应液可以解析3种多态性。
产业实用性
如上所述，利用本发明的引物对时，可以特异且高效地扩增NAT2基因的含有特定多态性(NAT2*5、NAT2*6或NAT2*7)发生位点的区域。因此，与上述现有方法不同，可以减少功夫和成本。另外，由于如上所述含有多态性检测对象位点的区域被特异地扩增，因此通过使用与含有上述检测对象位点的检测对象序列互补的探针，可以使用上述反应液直接进行Tm解析、对上述多态性进行分型。另外，由于可以用1个反应液扩增或分型，因此操作的自动化也成为可能。而且，当使用本发明的引物对时，例如即便是含有杂质的试样(例如全血或口腔粘膜等)，由于可以省略预处理，因此可以更为迅速且简单地进行扩增反应。另外，使用本发明的引物对时，由于可以以较以往更为优异的扩增效率进行扩增反应，因此还能够缩短扩增反应。因而，通过本发明的引物对、含有其的试剂以及使用它们的扩增产物的制造方法，可以迅速且简单地解析NAT2基因的多态性，因而在医疗领域中极为有效。
Figure ISA00000431142900011
Figure ISA00000431142900021
Figure ISA00000431142900031
Figure ISA00000431142900051
Figure ISA00000431142900061
Figure ISA00000431142900071
Figure ISA00000431142900081
Figure ISA00000431142900091
Figure ISA00000431142900101
Figure ISA00000431142900111
Figure ISA00000431142900121
Figure ISA00000431142900131
Figure ISA00000431142900141
Figure ISA00000431142900151
Figure ISA00000431142900161
Figure ISA00000431142900171
Figure ISA00000431142900181
Figure ISA00000431142900191
Figure ISA00000431142900221
Figure ISA00000431142900231
Figure ISA00000431142900251
Figure ISA00000431142900271
Figure ISA00000431142900281
Figure ISA00000431142900291
Figure ISA00000431142900301
Figure ISA00000431142900311
Figure ISA00000431142900321
Figure ISA00000431142900351
Figure ISA00000431142900361
Figure ISA00000431142900391

Claims (16)

1.一种探针，其特征在于，其为用于检测NAT2基因的多态性的探针，
其由下述(1)的寡核苷酸构成，
(1)与序列号1中的、以第1056位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向3’方向至第13～19个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基为3’末端。
2.根据权利要求1所述的探针，所述寡核苷酸(1)为序列号87～92和116～123中任一个寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的探针，所述寡核苷酸(1)为选自由序列号90的寡核苷酸、序列号91的寡核苷酸、序列号118的寡核苷酸以及序列号122的寡核苷酸组成组中的至少一个寡核苷酸。
4.根据权利要求1所述的探针，所述探针为荧光标记探针。
5.一种试剂，其特征在于，其为用于检测NAT2基因的多态性的试剂，其含有权利要求1所述的探针。
6.根据权利要求5所述的试剂，其还包含由下述(2)的寡核苷酸构成的探针和由下述(3)的寡核苷酸构成的探针，
(2)与序列号1中的、以第1302位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第18～27个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基为5’末端，
(3)与序列号1中的、以第1583位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第16～21个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基为3’末端。
7.根据权利要求6所述的探针，所述(2)的寡核苷酸为序列号93～102中任一个寡核苷酸，所述(3)的寡核苷酸为序列号103～108中任一个寡核苷酸。
8.根据权利要求7所述的探针，所述(2)的寡核苷酸为由序列号99的碱基序列构成的寡核苷酸；所述(3)的寡核苷酸为选自由序列号105的碱基序列构成的寡核苷酸、以及由序列号107的碱基序列构成的寡核苷酸中的至少一个寡核苷酸。
9.根据权利要求5所述的试剂，所述探针为荧光标记探针。
10.一种多态性解析方法，其特征在于，其为解析NAT2基因的检测对象位点的多态性的方法，包括下述(i)～(iv)工序：
(i)以试样中的核酸为模板，在反应液中扩增NAT2基因中含有检测对象位点的区域的工序，
(ii)准备含有上述(i)工序的扩增产物和权利要求1所述的探针的反应液的工序，
(iii)改变所述反应液的温度，测定所述扩增产物与所述试剂中的探针的杂交产物显示融解状态的信号值的工序，
(iv)由伴随温度变化的所述信号值的变动，确定所述检测对象位点的多态性的工序。
11.根据权利要求10所述的多态性解析方法，其中，在所述(i)工序中，在扩增反应之前，向所述反应液中添加权利要求1所述的探针。
12.根据权利要求10所述的多态性解析方法，所述试样为生物体试样。
13.根据权利要求12所述的多态性解析方法，所述生物体试样为全血。
14.根据权利要求10所述的多态性解析方法，在所述(i)工序中，使用下述引物对(1)，在反应液中进行所述NAT2的扩增，
引物对(1)：
含有包含下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对：
(F1)：与序列号1的碱基序列中的、以第1038位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向5’方向至第20～32个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述鸟嘌呤碱基(G)为3’末端，
(R1)：与序列号1的碱基序列中的、以第1096位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第17～24个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1096位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端。
15.根据权利要求14所述的多态性解析方法，
在所述(ii)工序中，所述反应液还含有由下述(2)的寡核苷酸构成的探针，在所述(i)工序中，还使用下述引物对(2)，在反应液中进行所述NAT2的扩增，
(2)与序列号1中的、以第1302位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第18～27个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基为5’末端，
引物对(2)：
含有包含下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对：
(F2)：与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第20～38个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)为3’末端，
(R2)：下述寡核苷酸中的至少一个：
与序列号1的碱基序列中的、以第1355位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1碱基朝向3’方向至第25～40个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1355位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)为3’末端，
以及
与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第21～36个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1614位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端。
16.根据权利要求14所述的多态性解析方法，
在所述(ii)工序中，所述反应液还含有由下述(3)的寡核苷酸构成的探针，在所述(i)工序中，还使用下述引物对(3)，在反应液中进行所述NAT2的扩增，
(3)与序列号1中的、以第1583位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第16～21个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基为3’末端，
引物对(3)：
含有包含下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和包含下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对：
(F3)：下述寡核苷酸中的至少一个：
与序列号1的碱基序列中的、以第1556位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1碱基朝向5’方向至第21～40个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胸腺嘧啶碱基(T)为3’末端，
以及
与序列号1的碱基序列中的、以第1278位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向5’方向至第20～38个碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以上述胞嘧啶碱基(C)为3’末端，
(R3)：与序列号1的碱基序列中的、以第1614位的胞嘧啶碱基(C)作为第1碱基朝向3’方向至第21～36个碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与上述第1614位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)为3’末端。
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