CN102076850B - 靶核酸序列的扩增方法、使用该方法的突变检测方法、以及用于该方法的试剂 - Google Patents

靶核酸序列的扩增方法、使用该方法的突变检测方法、以及用于该方法的试剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种能够在1个反应体系中灵敏度和可靠性优异地进行突变检测的突变检测方法。使用引物(Xmt)和(Xwt)，以与作为检测目标的碱基为正常型的靶核酸序列的扩增效率相比更高的扩增效率，来扩增作为检测目标的碱基为突变型的靶核酸序列。(Xmt)为与模板核酸中包含突变型碱基的区域互补、且3’区域具有与突变型碱基互补的碱基的引物，(Xwt)为与模板核酸中包含正常型碱基的区域互补、且3’区域具有与正常型碱基互补的碱基的引物。(Xmt)对突变型模板核酸的扩增效率优选高于(Xwt)对正常型模板核酸的扩增效率。并且，对显示所得到的扩增产物与探针的杂交产物的熔解状态的信号值进行测定，由与温度变化相伴的信号值变动来确定目标碱基位点有无突变。

Description

靶核酸序列的扩增方法、使用该方法的突变检测方法、以及用于该方法的试剂
技术领域
本发明涉及靶核酸序列的扩增方法，所述靶核酸序列包含发生作为检测目标的突变的碱基位点，使用该方法的突变检测方法，以及用于该方法的试剂。
背景技术
在所有疾病的预防和治疗中，以单核苷酸多态性(SNP)为代表的基因突变的检测正在广泛进行。例如，在癌细胞的基因中观察到许多突变，已知这些突变与细胞的癌化有关。因此，认为通过检测细胞中的基因的突变，能够确认癌化的可能性和恶化程度等，在治疗中是非常有用的信息。另外，还报道有在药物治疗中癌细胞的基因出现显示耐药性的突变。通过该突变的检测，能够判断药物对于各患者的有效性，因而能进行更适合的治疗。例如，慢性髓性白血病(CML)广泛使用了抗癌剂伊马替尼(imatinib)的给药治疗，但认为bcr-abl基因上的突变(例如，T315I)影响耐药性。这样，基因中的突变的检测对于临床领域中的早期发现和治疗是有用的，因而要求较高的可靠性。
作为基因中的突变的检测方法，通常已知直接测序法、ASP(等位基因特异性引物)-PCR(聚合酶链反应)法(专利文献1)、Tm(熔解温度)分析法(非专利文献1)。所述直接测序法为扩增包含作为检测目标的碱基位点的区域，并对所获得的扩增产物的碱基序列进行分析的方法。所述ASP-PCR法为如下方法：使用与包含作为检测目标的碱基位点的区域互补、且在3’末端区域具有与所述检测目标的碱基位点的碱基互补的碱基的引物来进行PCR，根据扩增的有无而判断突变。根据该方法，例如，在使用与将所述检测目标的碱基位点设定为突变型碱基的序列(以下，也称为“突变序列”)互补的引物时，能够通过扩增的检测来确认突变。另外，在使用与将检测目标的碱基位点设定为正常型碱基的序列(以下，也称为“正常序列”)互补的引物时，能够通过扩增的检测来确认非突变(即正常)。所述Tm分析首先对包含所述检测目标的碱基位点的区域进行扩增，并形成所得到的扩增产物和与所述突变序列互补的探针的杂交体(双链DNA)。并且，对该杂交产物实施加热处理，通过吸光度等的信号测定来检测伴随温度上升的杂交体的解离(熔解)，确定Tm值。由此，判断突变的有无。在构成杂交产物的各链为匹配时Tm值升高，在为错配时Tm值降低。因此，对所述突变序列和与其互补的探针的杂交产物，预先求得Tm值(评价基准值)，并通过比较该评价基准值与前述确定的Tm值(测定值)，能够进行如下判断。若所述测定值与所述评价基准值相同，则判断为完全匹配，即，所述检测目标的碱基位点存在突变。另一方面，若所述测定值低于所述评价基准值，则判断为错配，即，所述检测目标的碱基位点为正常(不存在突变)。
然而，所述直接测序法的灵敏度较低，而且操作需要花费大量的劳力和时间。所述ASP-PCR法虽然灵敏度优异，但存在特异性欠佳的问题。即，在使用与所述突变序列互补的引物时，即便不存在突变，但可能会确认到扩增，判断为假阳性。另外，在所述ASP-PCR法中，在1个反应体系中，仅能够使用与所述突变序列互补的引物和与所述正常序列互补的引物中的任一者。因此，为了确认检测目标的碱基位点是正常还是突变，需要对使用与所述突变序列互补的引物的反应体系和使用与所述正常序列互补的引物的反应体系这2种体系进行PCR。这样，由于使用2种反应体系，因而会花费操作的劳力和时间、成本。此外，即便使用2种反应体系，也存在难以进行可靠性足够优异的判断的问题。即，在2种反应体系当中，在使用了与所述正常序列互补的引物的反应体系中未确认到扩增、而仅在使用了与所述突变序列互补的引物的反应体系中确认到扩增的情况下，能够判断为真正的阳性。然而，在两者的反应体系中均观察到扩增时，依然难以判断为正常还是为突变。另一方面，由于所述Tm分析法的特异性优异，因而能够避免假阳性的问题，而且，在1个反应体系中能够判断所述检测目标的碱基位点为正常还是为突变。然而，Tm分析法存在灵敏度不充分的问题。
尤其是，如前所述，在对于癌检测突变的情况下，在由患者采集的待测体中混杂有目标基因发生突变的细胞和正常的细胞。因此，例如，对于包含大量正常基因和少量突变基因的生物体试样，也要求能够正确地检测突变的有无。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第2853864号
非专利文献
非专利文献1：Analytical Biochemistry 290，89-97(2001)
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的目的在于提供一种能够在1个反应体系中简便、且灵敏度和可靠性优异地检测突变的靶核酸序列的扩增方法，和突变的检测方法以及用于该方法的试剂。
用于解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明的靶核酸序列的扩增方法的特征在于，其为模板核酸中的靶核酸序列的扩增方法，
所述靶核酸序列为所述模板核酸中包含发生作为检测目标的突变的碱基位点的序列，
该方法包括如下扩增工序：在同一反应体系中，与所述碱基位点为正常型碱基的靶核酸序列相比，优先扩增所述碱基位点为突变型碱基的靶核酸序列。
本发明的突变检测方法的特征在于，其为检测模板核酸中的作为检测目标的碱基位点有无突变的方法，其包括下述(a)～(c)工序：
(a)通过本发明的靶核酸序列的扩增方法在反应体系中扩增所述模板核酸中包含所述碱基位点的靶核酸序列的工序；
(b)在能够与所述模板核酸中包含所述碱基位点的序列杂交的探针的存在下，改变包含由所述(a)工序得到的扩增产物的所述反应体系的温度，测定显示所述扩增产物和所述探针的杂交产物的熔解状态的信号值的工序；
(c)由伴随温度变化的所述信号值的变动，确定所述目标碱基位点有无突变的工序。
发明的效果
本发明的特征在于，例如，即便在试样中共存有所述碱基位点为突变型的模板核酸和所述碱基位点为正常型的模板核酸而作为模板核酸的情况下，也能与正常型的靶核酸序列相比优先扩增所述突变型的靶核酸序列。这样，通过优先扩增突变型的靶核酸序列，例如，即便在突变型的模板核酸的比例低于正常型的模板核酸的情况下，通过对本发明的扩增产物进行使用了探针的Tm分析，也能够以优异的灵敏度以及可靠性检测突变的有无。因此，如前所述，对于包含正常基因和突变基因这两者的试样尤其有用。由以上观点出发，本发明可以说例如在通过检测基因突变来进行治疗和诊断的近年来的临床领域中是极其有用的。
附图说明
图1所示为本发明的实施例1中的Tm分析的结果的图表。
图2所示为比较例1中的Tm分析的结果的图表。
图3所示为本发明的实施例2中的Tm分析的结果的图表。
图4所示为本发明的实施例3中的Tm分析的结果的图表。
图5所示为比较例3中的Tm分析的结果的图表。
图6所示为本发明的一个实施方式中的引物与模板核酸的关系的模式图。
图7所示为本发明的其他实施方式中的引物与模板核酸的关系的模式图。
具体实施方式
<靶核酸序列的扩增方法>
本发明的靶核酸序列的扩增方法的特征在于，如前所述，其为模板核酸中的靶核酸序列的扩增方法，所述靶核酸序列为所述模板核酸中包含发生作为检测目标的突变的碱基位点的序列，该方法包括如下扩增工序：在同一反应体系中，与所述碱基位点为正常型碱基的靶核酸序列相比，优先扩增所述碱基位点为突变型碱基的靶核酸序列。
在本发明中，以下，将所述碱基位点的碱基为突变型的模板核酸也称为“突变型模板核酸”，将所述碱基位点的碱基为突变型的靶核酸序列也称为“突变型靶核酸序列”，将所述碱基位点的碱基为正常型的模板核酸也称为“正常型模板核酸”，将所述碱基位点的碱基为正常型的靶核酸序列也称为“正常型靶核酸序列”。另外，本发明的扩增方法为如下方法：例如，在所述模板核酸仅为正常型模板核酸时，能够扩增正常型模板核酸；在所述模板核酸仅为突变型模板核酸时，能够扩增突变型模板核酸；在所述模板核酸包含正常型模板核酸和突变型模板核酸两者时，能够对它们分别进行扩增。
本发明中，“优先扩增”例如可以是指促进突变型靶核酸序列的扩增，也可以是指抑制或干扰正常型靶核酸序列的扩增。
本发明中，例如，可以将单链的核酸作为模板核酸而进行扩增；也可以对于互补的双链核酸，将构成该双链核酸的2条单链分别作为模板而进行扩增。本发明中，在将构成双链核酸的2条单链分别作为模板的情况下，方便起见，将一者称为(+)链、另一者称为(-)链。另外，本发明中，(+)链和(-)链的任一者可以是正义链也可以是反义链。另外，在后述的本发明的突变检测方法中，检测目标的碱基位点例如可以是(+)链中的碱基位点，也可以是与所述碱基位点对应的所述(-)链的碱基位点。在后述的本发明的突变检测方法中使用的探针例如可以按照能够与(+)链杂交的方式设计，也可以按照能够与(-)链杂交的方式设计。
根据本发明的靶核酸序列的扩增方法，如前所述，能够与正常型靶核酸序列相比而优先扩增突变型的靶核酸序列。因此，本发明的扩增方法例如也可以称作突变型靶核酸序列的扩增方法。本发明的扩增方法例如只要是能够与正常型靶核酸序列相比而优先扩增突变型的靶核酸序列即可，其他工序和条件没有任何限制。关于本发明，以下举出具体例子，但本发明不限于此。
(第1实施方式)
作为本发明的第1扩增方法，例如，可列举出使用包含引物(Xmt)和引物(Xwt)的所述第1扩增试剂的方式。具体而言，该方式如下所述：所述扩增工序为在同一反应体系中使用所述引物(Xmt)和所述引物(Xwt)扩增所述靶核酸序列的工序。
引物(Xmt)：
为与所述模板核酸中包含突变型的所述碱基位点的区域互补、且3’区域具有与所述碱基位点的碱基互补的碱基的引物，
引物(Xwt)：
为与所述模板核酸中包含正常型的所述碱基位点的区域互补、且3’区域具有与所述碱基位点的碱基互补的碱基的引物。
本发明中，以下，也将所述模板核酸中的、与各种引物退火的区域称为“退火区域”。另外，本发明中，各种引物例如只要是能够与所述模板核酸中的退火区域特异性结合即可，可以是与所述退火区域完全互补的序列，也可以是部分互补的序列、具有部分错配的碱基的序列。以下其他实施方式中也是同样的。
所述引物(Xmt)为能够与所述碱基位点为突变型的区域退火的引物，以下，也称为“突变型引物”。另一方面，引物(Xwt)为能够与所述碱基位点为正常型的区域退火的引物，以下，也称为“正常型引物”。所述模板核酸如前所述可以是单链也可以是双链。在所述模板核酸为双链的情况下，例如，优选以与构成所述双链的任一条单链互补的方式设计突变型引物(Xmt)和正常型引物(Xwt)。另外，优选对于另一条单链例如以互补的方式设计后述的引物(Y2)。在图6的模式图中示出了模板核酸与引物的关系的一个例子。在图6中，(+)和(-)分别为构成双链的模板核酸的一条链，斜线部分表示检测目标的碱基位点。如该图所示，突变型引物(Xmt)和正常型引物(Xwt)均被设计为与(+)链互补的引物。此时，所述引物(Y2)优选被设计为与(-)链互补的引物。另外，图6终究只是示出一个例子的模式图，并不限制例如各引物的长度、模板核酸中的退火区域等，引物(Y2)也是任意的。另外，突变型引物(Xmt)和正常型引物(Xwt)均被设计为与(-)链互补的引物，所述引物(Y2)被设计为与(+)链互补的引物。
本实施方式中，所述引物(Xmt)和所述引物(Xwt)优选满足如下关系：所述引物(Xmt)对所述碱基位点为突变型的模板核酸的扩增效率高于所述引物(Xwt)对所述碱基位点为正常型的模板核酸的扩增效率。由此，例如，能够使如下内容变为现实。即，即便所述模板核酸包含正常型模板核酸和突变型模板核酸、且突变型模板核酸为低含量，与引物(Xwt)对正常型模板核酸的扩增效率相比，引物(Xmt)对突变型模板核酸的扩增效率也较高，因而，能够高效地扩增低含量的突变型模板核酸。因此，即便是低含量的突变型模板核酸，例如，在后述的Tm分析中也可获得能够检测的程度的扩增产物，能够实现突变型模板核酸的检测。另外，根据本发明，例如，即便所述模板核酸中的突变型模板核酸的含量为约0.1％左右，在后述的Tm分析中也可获得能够检测的扩增产物。
另外，在所述模板核酸仅为突变型模板核酸的情况下、或仅为正常型模板核酸的情况下，通过突变型引物(Xmt)或正常型引物(Xwt)，能够分别扩增。因此，如前所述，不仅是包含突变型模板核酸和正常型模板核酸两者的情况，即便是任一者的模板核酸也能够通过后述的Tm分析而进行检测。另外，在所述模板核酸仅为正常型模板核酸的情况下，例如，不仅是正常型引物，突变型引物也能够与模板核酸退火而延伸。然而，在本实施方式中，与正常型引物(Xwt)对“正常型”模板核酸的扩增效率相比，突变型引物(Xmt)对“突变型”模板核酸的扩增效率被设定为更高。因此，突变型引物(Xmt)对“正常型”模板核酸的扩增效率例如比正常型引物(Xwt)对“正常型”模板核酸的扩增效率更低，对于正常型模板核酸而言，正常型引物更能显示特别优异的扩增效率。因此，即便错误地由突变型引物发生了扩增，从其扩增效率的观点来看，例如，也难以扩增至在后述的Tm分析中获得充分的检测灵敏度的程度。其结果，例如，在Tm分析中，还能够防止由于错误扩增导致的假阳性的问题。
突变型引物(Xmt)和正常型引物(Xwt)没有特别限制，可以优选使用满足前述关系的引物。这种关系例如可以通过使突变型引物(Xmt)对突变型模板核酸的亲和性、即退火的容易程度高于正常型引物(Xwt)对正常型模板核酸的亲和性来实现。另外，例如，使与突变型模板核酸退火的突变型引物(Xmt)的延伸反应比与正常型模板核酸退火的正常型引物(Xmt)的延伸反应，更容易发生，也可以由此来实现。
所述引物的亲和性的调节方法没有特别限制，例如，可以通过Tm值的设定而进行。在本实施方式中，例如，优选突变型引物(Xmt)与互补序列的Tm值为比正常型引物(Xwt)与互补序列的Tm值相对更高的值。这样，通过将突变型引物(Xmt)的Tm值设定为高于正常型引物(Xwt)的Tm值，能够与正常型引物(Xwt)相比更加提高突变型引物(Xmt)与所述模板核酸的结合性，因此，能够提高突变型引物(Xmt)的扩增效率。突变型引物(Xmt)的Tm值与正常型引物(Xwt)的Tm值之差没有特别限制，例如，优选超过0℃且在20℃以下，更优选为超过0℃且在10℃以下，尤其优选为超过0℃且在5℃以下。这里所述的引物设计中的Tm值是指，例如，正常型引物和与其100％互补的碱基序列的杂交产物的Tm值、突变型引物和与其100％互补的碱基序列的杂交产物的Tm值。
突变型引物(Xmt)的Tm值和正常型引物(Xwt)的Tm值的设定方法没有特别限制，例如，可以根据各引物的长度、和GC含量等调节。在通过长度调节的情况下，通常，引物相对越长，则Tm值相对设定得越高。在本实施方式的情况下，例如，优选将突变型引物(Xmt)的长度设定为长于正常型引物(Xwt)的长度。由此，能够将突变型引物(Xmt)的Tm值设定为与正常型引物(Xwt)的Tm值相比相对更高的值。另外，在通过GC含量而调节的情况下，例如，GC含量相对越高，则能够将Tm值相对设定得越高。在本实施方式的情况下，例如，优选将突变型引物(Xmt)的GC含量设定为高于正常型引物(Xwt)的GC含量。另外，还可以通过引物的长度和GC含量两者来设定Tm值。除此之外，例如，还可以通过形成包含作为RNA类似物的LNA、作为肽核酸的PNA、作为交联化核酸的BNA等的序列，而例如与不包含它们的序列相比，将Tm值设定为相对更高。
在与正常型引物(Xwt)相比更长地设定突变型引物(Xmt)的情况下，两者的长度的差没有特别限制，例如为超过0且在20碱基以下，优选为超过0且在10碱基以下，更优选为超过0且在5碱基以下。
另外，引物起始的延伸反应的反应性例如能够调节，其方法没有特别限制，可以通过以往公知的方法进行。作为具体例子，例如，可列举出在突变型引物(Xmt)的5’区域附加荧光物质和生物素等物质、或添加附加序列的方法等。这些方法例如可以基于日本特开2004-337124号公报等的记载来进行。
突变型引物(Xmt)只要是在其3’区域存在与所述作为检测目标的碱基位点的碱基(突变型碱基)互补的碱基即可，例如，优选3’末端的第1位或第2位的碱基是与所述突变型碱基互补的碱基。作为具体例子，例如，在将模板核酸的序列假设为“5’-…acGtt…-3’”、将突变型碱基假设为下划线部分“G”的情况下，突变型引物(Xmt)能够设计为3’末端的第1位的碱基是突变型碱基(G)的互补碱基(C)的序列“5’-…aaC-3’”。另外，所述突变型引物(Xmt)也可以设计为例如3’末端的第2位的碱基是突变型碱基(G)的互补碱基(C)的序列“5’-…aaCg-3’”。3’末端的第1位的碱基是指3’末端的碱基，3’末端的第2位的碱基是指以3’末端的碱基为第1位且沿5’方向的第2位的碱基(以下，同样)。
在前者的情况下，优选将所述3’末端的第1位的碱基设定为与突变型碱基互补的碱基，此外，将从所述3’末端的第2位至5’末端的至少1个碱基设定为与所述模板核酸错配的碱基(错配碱基)。其中，优选将所述3’末端的第2位和第3位中的至少1个碱基设定为所述错配碱基，更优选将所述3’末端的第2位的碱基设定为错配碱基。作为具体例子，例如，在将模板核酸中的序列与前述同样地假设为“5’-…acGtt…-3’”、将突变型碱基假设为下划线部分“G”的情况下，突变型引物(Xmt)可以设计为3’末端的第1位的碱基是突变型碱基(G)的互补碱基(C)，第2位的碱基不是与模板核酸的碱基(t)互补的碱基(a)、而是作为错配碱基(t)的序列“5’-…atC-3’”。另外，在后者的情况下，优选将所述3’末端的第2位的碱基设定为与突变型碱基互补的碱基，此外，将所述3’末端的第1位、和/或第3位至5’末端的至少1个碱基设定为与所述模板核酸错配的碱基(错配碱基)。其中，优选将所述3’末端的第1位和第3位中的至少1个碱基设定为所述错配碱基，更优选将所述3’末端的第3位的碱基设定为错配碱基。作为具体例子，例如，在将模板核酸中的序列与前述同样地假设为“5’-…acGtt…-3’”、将突变型碱基假设为下划线部分“G”的情况下，突变型引物(Xmt)可以设计为3’末端的第2位的碱基是突变型碱基(G)的互补碱基(C)，第3位的碱基不是与模板核酸的碱基(t)互补的碱基(a)、而是作为错配碱基(t)的序列“5’-…atCg-3’”。这样，通过在突变型引物中引入错配碱基，能够进一步提高突变型引物(Xmt)对于突变型模板核酸的特异性。
正常型引物(Xwt)只要是在其3’区域存在与所述检测目标的碱基位点的碱基(正常型碱基)互补的碱基即可，例如，优选3’末端的第1位或第2位的碱基为与所述正常型碱基互补的碱基。作为具体例子，例如，在将模板核酸的序列假设为“5’-…acAtt…-3’”、将正常型碱基假设为下划线部分“A”的情况下，正常型引物(Xwt)可以设计为3’末端的第1位的碱基是正常型碱基(A)的互补碱基(T)的序列“5’-…aaT-3’”。另外，所述正常型引物(Xwt)可以设计为从3’末端起第2位的碱基是正常型碱基(A)的互补碱基(T)的序列“5’-…aaTg-3’”。
在前者的情况下，优选将所述3’末端的第1位的碱基设定为与正常型碱基互补的碱基，此外，将所述3’末端的第2位至5’末端的至少1个碱基设定为与所述模板核酸错配的碱基(错配碱基)。其中，优选将所述3’末端的第2位和第3位中的至少1个碱基设定为所述错配碱基，更优选为将所述3’末端的第2位的碱基设定为错配碱基。作为具体例子，例如，在将模板核酸中的序列与前述同样地假设为“5’-…acAtt…-3’”、将正常型碱基假设为下划线部分“A”的情况下，正常型引物(Xwt)可以设定为3’末端的第1位的碱基是正常型碱基(A)的互补碱基(T)，第2位的碱基不是与模板核酸的碱基(t)互补的碱基(a)、而是为错配碱基(t)的序列“5’-…atA-3’”。另外，在后者的情况下，优选将所述3’末端的第2位的碱基设定为与正常型碱基互补的碱基，此外，将所述3’末端的第1位、和/或第3位至5’末端的至少1个碱基设定为与所述模板核酸错配的碱基(错配碱基)。其中，优选将所述3’末端的第1位和第3位中的至少1个碱基设定为所述错配碱基，更优选将所述3’末端的第3位的碱基设定为错配碱基。作为具体例子，例如，在将模板核酸中的序列与前述同样地假设为“5’-…acAtt…-3’”、将正常型碱基假设为下划线部分“A”的情况下，正常型引物(Xwt)可以设计为3’末端的第2位的碱基是正常型碱基(A)的互补碱基(T)，第3位的碱基不是与模板核酸的碱基(t)互补的碱基(a)、而是作为错配碱基(t)的序列“5’-…atAg-3’”。这样，通过在正常型引物中引入错配碱基，能够进一步提高正常型引物(Xwt)对于正常型模板核酸的特异性。
突变型引物(Xmt)和正常型引物(Xwt)的长度没有特别限制，作为一般的长度，例如，可列举出10～50碱基，优选可列举出15～40碱基，进一步优选为16～35碱基。
在本发明的所述扩增工序中，优选与突变型引物(Xmt)和正常型引物(Xwt)一起如前所述使用下述引物(Y2)。
引物(Y2)
为与所述模板核酸中位于所述碱基位点的5’侧的区域的互补序列互补的引物。
引物(Y2)例如是与突变型引物(Xmt)和正常型引物(Xwt)能够退火的模板核酸的互补链互补的引物(参照图6)。因此，例如，突变型引物(Xmt)和引物(Y2)、正常型引物(Xwt)和引物(Y2)能够分别作为引物对来扩增模板核酸与其互补链。另外，由于该引物(Y2)是在与检测目标的所述碱基位点不同的区域退火的引物，因而无论所述碱基位点是突变型或者正常型，均能够扩增靶核酸序列。如前所述，在突变型引物(Xmt)与正常型碱基退火而产生扩增的情况下、或者正常型引物(Xwt)与突变型碱基退火而产生扩增的情况下，所获得的扩增产物分别依赖于各引物而形成序列。然而，通过使引物(Y2)共存，能够一并获得维持了模板核酸本来的序列的扩增产物。由此，能够进一步提高突变检测的可靠性。
引物(Y2)的长度没有特别限制，通常优选为10～50碱基，更优选为15～40碱基，尤其优选为16～35碱基。另外，引物(Y2)只要是能够与所述模板核酸中位于所述碱基位点的5’侧的区域的互补序列退火即可，其序列没有特别限制，可以根据以往公知的一般的引物设计方法而设计。
所述模板核酸如前所述可以是单链，也可以是双链。作为所述模板核酸，例如，可列举出DNA、和总RNA、mRNA等RNA等。另外，所述模板核酸例如可列举出生物体试样等试样中所含的核酸。所述试样中的核酸例如可以是生物体试样中本来含有的核酸，但例如由于能够提高突变检测的精度，因而可列举出将所述生物体试样中的核酸作为模板并通过核酸扩增法扩增而得的扩增产物等。作为具体例子，例如，可列举出将所述生物体试样中本来含有的DNA作为模板并通过核酸扩增法扩增而得的扩增产物；将从所述生物体试样中本来含有的RNA通过逆转录PCR反应(RT-PCR：Reverse Transcription PCR)而生成的cDNA作为模板，并通过核酸扩增法扩增而得的扩增产物。也可以将这些扩增产物作为本发明的模板核酸。所述扩增产物的长度没有特别限制，例如，为50～1000碱基，优选为80～200碱基。
在本发明的扩增工序中，在同一反应体系中的扩增例如可列举出在一个反应液内扩增靶核酸序列。
在本发明的扩增工序中，优选将试样中的核酸作为模板而进行扩增反应。作为所述试样，只要是包含作为模板的核酸的试样即可，没有特别限制，例如，可列举出包含生物体试样来源的核酸的试样。作为所述生物体试样，例如，可列举出全血、口腔粘膜等口腔内细胞、指甲和毛发等体细胞、生殖细胞、喀痰、羊水、石蜡包埋组织、尿、胃液、胃清洗液等，以及它们的悬浮液等。另外，如前所述，也可以将以生物体试样来源的核酸作为模板而进行核酸扩增法而得的反应液作为本发明的核酸试样，并将所述反应液中含有的扩增产物作为模板核酸。
另外，在将本发明的靶核酸序列的扩增方法适用于后述的本发明的突变检测方法时，所述试样没有特别限制，例如，对于以下试样是非常有用的：包含不确定目标碱基位点显示为突变型还是正常型中的何者的核酸的试样；包含具有突变型的核酸和具有正常型的核酸的试样；有可能包含上述试样的试样等。所述DNA和RNA等核酸的来源没有限制，例如，可列举出各种癌细胞等细胞、病毒、线粒体等。由于这样癌化的血液细胞等细胞中包含具有产生了突变型的核酸的细胞、和具有显示为正常型的核酸的细胞，因而容易产生前述那样的问题。因此，本发明的突变检测方法尤其优选适用于具有显示为突变型的核酸和显示为正常型的核酸的试样，例如，白血病等各种癌细胞等的生物体试样，作为具体例子，优选适用于血液试样和白细胞等。另外，本发明中，试样的采集方法、核酸的调制方法等没有限制，可以采用以往公知的方法。
前述的生物体试样来源的核酸例如可以通过以往公知的方法从生物体试样中分离。从全血分离基因组DNA例如可以使用市售的基因组DNA分离试剂盒(商品名GFX Genomic BloodDNA Purificationkit；Ge Healthcare Bio-sciences Corp.制)等。
本发明的靶核酸序列的扩增方法的特征在于，该方法在所述扩增工序中使用前述的引物，其他工序和条件等没有任何限制。所述扩增工序中的核酸扩增法没有特别限制，例如，可列举出PCR(聚合酶链反应)法、NASBA(基于核酸序列的扩增)法、TMA(转录介导扩增)法、SDA(链置换扩增)法等，其中，优选PCR法。另外，核酸扩增法的条件没有特别限制，可以通过以往公知的方法进行。
在所述扩增工序中，扩增反应的反应体系(例如，反应液)中的核酸试样的添加比例没有特别限制。作为具体例子，在所述核酸试样为生物体试样(例如，全血试样)的情况下，所述反应体系中的添加比例的下限例如优选为0.01体积％以上，更优选为0.05体积％以上，进一步优选为0.1体积％以上。另外，所述添加比例的上限也没有特别限制，例如优选为2体积％以下，更优选为1体积％以下，进一步优选为0.5体积％以下。
另外，在后述的突变的检测中，例如，在进行使用了标记探针的光学检测的情况下，所述反应体系中的全血试样等生物体试样的添加比例例如优选设定为0.1～0.5体积％。在PCR反应中通常实施用于DNA变性(解离为单链DNA)的热处理，但由于该热处理，试样中含有的糖和蛋白质等可能会变性，从而产生不溶化的沉淀物或浑浊等。因此，在通过光学手法确认突变的有无时，这种沉淀物或浑浊的产生可能会对测定精度造成影响。然而，如果将反应体系中的全血试样的添加比例设定在前述的范围内的话，虽然机理尚不明确，但例如能够充分防止由于变性而产生沉淀物等所造成的影响，因而能够提高光学手法的测定精度。另外，由于还能充分抑制全血试样中的夹杂物对于PCR的干扰，因此能够进一步提高扩增效率。因此，通过将全血试样等生物体试样的添加比例设定在前述的范围内，例如不必为防止产生沉淀物或浑浊或将其除去而进行所述试样的前处理。
另外，所述反应体系中的全血试样的比例也可以不用前述那样的体积比例(例如，0.1～0.5体积％)表示，而用血红蛋白(以下，称为“Hb”)的重量比例表示。此时，所述反应体系中的全血试样的比例以Hb量换算例如优选为0.565～113g/L的范围，更优选为2.825～56.5g/L的范围，进一步优选为5.65～28.25μg/L的范围。另外，所述反应体系中的全血试样的添加比例例如可以满足所述体积比例与Hb重量比例两者，也可以满足任一者。作为全血，例如，可以是溶血的全血、未溶血的全血、抗凝固全血、包含凝固部分的全血等的任一种。
在开始所述扩增工序中的扩增反应之前，优选向所述反应体系中进一步添加白蛋白。通过这种白蛋白的添加，例如，能够进一步降低前述那样的沉淀物或浑浊的产生所造成的影响，且还能够进一步提高扩增效率。
所述反应体系中的白蛋白的添加比例例如为0.01～2重量％的范围，优选为0.1～1重量％，更优选为0.2～0.8重量％。作为所述白蛋白，没有特别限制，例如可列举出牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、马血清白蛋白等，它们可以使用任一种，也可以并用2种以上。
接着，关于本发明的靶核酸序列的扩增方法，作为所述扩增工序中的扩增法以PCR法为例而对本发明进行说明。另外，本发明不受该例的限制。此外，PCR的条件没有特别限制，可以通过以往公知的方法进行。
首先，调制包含模板核酸和前述各种引物的PCR反应液。所述PCR反应液中的各种引物的添加比例没有特别限制，突变型引物(Xmt)例如优选以0.01～10μmol/L的方式添加，更优选为0.05～5μmol/L，尤其优选为0.1～1μmol/L。正常型引物(Xwt)例如优选以0.01～10μmol/L的方式添加，更优选为0.05～5μmol/L，尤其优选为0.1～0.5μmol/L。突变型引物(Xmt)与正常型引物(Xwt)的摩尔比(Xmt∶Xwt)例如优选为1∶0.001～1∶10，更优选为1∶0.01～1∶2，尤其优选为1∶0.1～1∶1。
另外，在除了突变型引物(Xmt)和正常型引物(Xwt)以外还并用引物(Y2)的情况下，引物(Y2)例如优选以0.01～10μmol/L的方式添加，更优选为0.05～5μmol/L，尤其优选为0.1～1μmol/L。突变型引物(Xmt)与引物(Y2)的摩尔比(Xmt∶Y2)例如优选为1∶0.001～1∶10，更优选为1∶0.01～1∶2，尤其优选为1∶0.1～1∶1。
所述反应液中的其他组成成分没有特别限制，可列举出以往公知的成分，其比例也没有特别限制。作为所述组成成分，例如，可列举出DNA聚合酶、核苷三磷酸(dNTP)等核苷酸和溶剂等。在所述反应液中，各组成成分的添加顺序没有任何限制。
作为所述DNA聚合酶，没有特别限制，例如，可以使用以往公知的耐热性细菌来源的聚合酶。作为具体例子，水生栖热菌(Thermus aquaticus)来源的DNA聚合酶(美国专利第4,889,818号和美国专利第5079,352号)(商品名Taq聚合酶)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)来源的DNA聚合酶(WO91/09950)(rTthDNA polymerase)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)来源的DNA聚合酶(WO92/9689)(Pfu DNA polymerase：Stratagene公司制)、附岸热球菌(Thermococcus litoralis)来源的DNA聚合酶(EP0455430)(商标Vent：New England Biolabs公司制)等能够在商业上获得，其中，优选水生栖热菌(Thermus aquaticus)来源的耐热性DNA聚合酶。
所述反应液中的DNA聚合酶的添加比例没有特别限制，例如为1～100U/mL，优选为5～50U/mL，更优选为20～30U/mL。另外，关于DNA聚合酶的活性单位(U)，通常以活性化鲑鱼精子DNA为模板引物，将活性测定用反应液中、74℃下、30分钟内将10nmol的总核苷酸吸收到酸不溶性沉淀物中的活性作为1U。所述活性测定用反应液的组成例如为25mmol/L TAPS缓冲液(pH9.3，25℃)、50mmol/L KCl、2mmol/LMgCl2、1mmol/L巯基乙醇、200μmol/L dATP、200μmol/L dGTP、200μmol/L dTTP、100μmol/L[α-32P]dCTP、0.25mg/mL活性化鲑鱼精子DNA。
作为所述核苷三磷酸，通常可列举出dNTP(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP等)。所述反应液中的dNTP的添加比例没有特别限制，例如为0.01～1mmol/L，优选为0.05～0.5mmol/L，更优选为0.1～0.3mmol/L。
作为所述溶剂，例如，可列举出Tris-HCl、Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)、MES、MOPS、HEPES、CAPS等缓冲液，可以使用市售的PCR用缓冲液或市售的PCR试剂盒的缓冲液等。
另外，所述PCR反应液可以进一步含有甘油、肝素、甜菜碱、KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等，它们的添加比例例如在不干扰PCR反应的范围内设定即可。
反应液的总体积没有特别限制，例如，可以根据所使用的仪器(热循环仪)等适宜决定，通常为1～500μL，优选为10～100μL。
然后，进行PCR。PCR例如包含(1)双链核酸向单链核酸的解离、(2)引物的退火、(3)引物的延伸(聚合酶反应)这三个工序。各工序的条件没有特别限制，所述(1)工序例如优选为90～99℃、1～120秒，更优选为92～95℃、1～60秒，所述(2)工序例如优选为40～70℃、1～300秒，更优选为50～70℃、5～60秒，所述(3)工序例如优选为50～80℃、1～300秒，更优选为50～75℃、5～60秒。另外，循环数也没有特别限制，以所述(1)～(3)的3个工序为1循环，例如优选为30循环以上。上限没有特别限制，例如总计为100循环以下，优选为70循环以下，进一步优选为50循环以下。各阶段的温度变化例如使用热循环仪等自动控制即可。
如上所述，能够制造包含检测目标的碱基位点的靶核酸序列。另外，本发明中，还能够在1个反应液中同时扩增两种以上的靶核酸序列。此时，根据作为目标的靶核酸序列准备前述突变型引物(Xmt)和正常型引物(Xwt)、以及任选的引物(Y2)，并在这些物质的共存下进行前述那样的扩增反应即可。
本发明的靶核酸序列的扩增方法还可以进一步包含检测通过前述扩增反应而得到的扩增产物的工序。由此，例如，能够检测所述靶核酸序列中的目标碱基位点有无突变。所述突变的检测例如能够通过后述的Tm分析来确认。具体而言，例如，向所述扩增工序中的所述扩增反应的反应体系中进一步添加能够与包含检测目标的所述碱基位点的序列(以下，也称为“检测目标序列”)杂交的探针。然后，改变所述反应体系的温度，测定显示扩增产物与所述探针的杂交产物的熔解状态的信号值，从而能够由与温度变化相伴的所述信号值变动来确认突变的有无。所述探针的添加的时间没有特别限制，例如，可以在所述扩增反应前、扩增反应途中和扩增反应后的任一阶段添加到所述反应体系中，其中，优选扩增反应前。另外，关于突变的检测，具体而言，在后述的本发明的突变检测方法中进行说明。另外，关于所述探针等也如后所述。
(第2实施方式)
作为本发明的第2扩增方法，例如，可列举出使用包含所述引物(Xmt)和引物(Y1)的所述第2扩增试剂的方式。具体而言，可列举出所述扩增工序为在同一反应体系中使用所述引物(Xmt)和引物(Y1)扩增所述靶核酸序列的工序的方式。
引物(Y1)
为与所述模板核酸中位于所述碱基位点的3’侧的区域互补的引物。
本实施方式中的引物(Xmt)与第1实施方式相同。另外，本实施方式只要没有特别说明，则可以与前述的第1实施方式同样进行。模板核酸如前所述可以是单链也可以是双链。在所述模板核酸为双链的情况下，例如，优选按照与构成所述双链的任一条单链互补的方式设计突变型引物(Xmt)和引物(Y1)。另外，优选按照与另一条单链例如互补的方式设计前述的引物(Y2)。在图7的模式图中示出了模板核酸与引物的关系的一个例子。在图7中，(+)和(-)分别为构成双链的模板核酸的一条链，斜线部分表示检测目标的碱基位点。如该图所示，突变型引物(Xmt)和引物(Y1)均被设计为与(+)链互补的引物。此时，所述引物(Y2)优选被设计为与(-)链互补的引物。另外，图7终究只是示出一个例子的模式图，并不限制例如各引物的长度、模板核酸中的退火区域等，引物(Y2)也是任意的。另外，突变型引物(Xmt)和引物(Y1)均被设计为与(-)链互补的引物，所述引物(Y2)被设计为与(+)链互补的引物。
根据本实施方式，通过使用突变型引物(Xmt)和引物(Y1)，例如能够使如下内容变为现实。即，即便模板核酸包含正常型模板核酸和突变型模板核酸、且所述突变型模板核酸为低含量，与正常型模板核酸相比，突变型引物(Xmt)与突变型模板核酸的亲和性较高，因而，能够高效地扩增低含量的突变型模板核酸。另一方面，引物(Y1)为在与检测目标的所述碱基位点不同的区域退火的引物，因而无论所述碱基位点为突变型还是正常型，均能够扩增靶核酸序列。因此，也可以通过引物(Y1)进一步扩增突变型模板核酸。因此，即便是低含量的突变型模板核酸，例如，也可以获得在后述的Tm分析中能够检测的程度的扩增产物，能够检测突变型模板核酸。另外，通过引物(Y1)，正常型模板核酸被扩增，能够通过Tm分析检测正常型。另外，在模板核酸仅为突变型模板核酸的情况下，同样地也能够通过突变型引物(Xmt)和引物(Y1)而进行扩增。此外，即便模板核酸仅为正常型模板核酸，也能够通过该引物(Y1)扩增所述检测目标的碱基位点为正常型碱基的靶核酸序列，因而即便对于正常型模板核酸，也能够通过后述的Tm分析而进行正常型的分析。
另外，若使用引物(Y1)，能够获得维持了模板核酸本来的序列的扩增产物。即，例如，在突变型引物(Xmt)与正常型模板核酸退火而引起扩增的情况下，所得到的扩增产物成为依赖于突变型引物(Xmt)的序列。然而，通过使引物(Y1)共存，能够一并获得维持了模板核酸本来的序列的扩增产物。由此，能够防止仅仅是错误获得的扩增产物增加，能够提高突变检测的可靠性。
所述引物(Y1)的长度没有特别限制，通常，优选为10～50碱基，更优选为15～40碱基，尤其优选为16～35碱基。另外，所述引物(Y1)只要是能够在所述模板核酸中的所述碱基位点的3’侧的区域退火即可，其序列没有特别限制，可以根据以往公知的一般的引物的设计方法来设计。
扩增反应的反应液中的各种引物的添加比例没有特别限制，突变型引物(Xmt)例如优选以0.01～10μmol/L的方式添加，更优选为0.05～5μmol/L，尤其优选为0.1～1μmol/L。引物(Y1)例如优选以0.01～10μmol/L的方式添加，更优选为0.05～5μmol/L，尤其优选为0.1～1μmol/L。突变型引物(Xmt)和引物(Y1)的摩尔比(Xmt∶Y1)例如优选为1∶0.001～1∶10，更优选为1∶0.01～1∶2，尤其优选为1∶0.1～1∶1。另外，与第1实施方式同样地，优选进一步并用形成引物对的引物(Y2)。
(第3实施方式)
作为本发明的第3扩增方法，例如，可列举出所述扩增工序为在所述反应体系中使用下述引物(Xmt)和3’→5’核酸外切酶扩增所述靶核酸序列的工序的方式。
本实施方式中的引物(Xmt)与第1实施方式相同，另外，只要没有特别说明，本实施方式可以与前述的各实施方式同样进行。
根据本实施方式，通过在3’→5’核酸外切酶的存在下进行使用了突变型引物(Xmt)的扩增反应，从而例如能够使如下内容变为现实。即，在模板核酸包含正常型模板核酸和突变型模板核酸的情况下，认为突变型引物(Xmt)不仅是与突变型模板核酸、也会与正常型模板核酸退火，从而合成延伸链。然而，由于突变型引物(Xmt)不是与正常型模板核酸互补的引物，而是与突变型模板核酸互补的引物，因而，即便与正常型模板核酸退火，也至少在检测目标的碱基位点产生错配，从而与对于突变型模板核酸的延伸反应相比反应性低劣。因此，即便在正常型模板核酸与突变型模板核酸共存的情况下，也能够优先扩增突变型模板核酸。另一方面，与正常型模板核酸退火的突变型引物(Xmt)，其3’区域(即包含突变型碱基的对应碱基的区域)对于正常型模板核酸而言为错配，因而关于所述区域，不退火而形成单链的状态。通过该单链的区域被3’→5’核酸外切酶切断，与正常模板序列互补的序列被扩增。由此获得的扩增产物为正常型的靶核酸序列，因此在模板核酸中包含正常型时，通过由突变型引物(Xmt)产生的扩增产物还能够检测正常型。
扩增反应的反应液中的突变型引物(Xmt)的添加比例没有特别限制，例如优选以0.001～10μmol/L的方式添加，更优选为0.01～5μmol/L，尤其优选为0.1～1μmol/L。另外，作为3’→5’核酸外切酶没有特别限制，例如，用于扩增反应的聚合酶优选具备该催化反应。作为具有3’→5’核酸外切酶活性的聚合酶，例如，可列举出Pfu聚合酶、Tli聚合酶、KOD聚合酶、Vent聚合酶、Tgo聚合酶等。另外，与第1实施方式或第2实施方式同样地，还可以进一步并用前述的引物(Y1)、引物(Y2)和引物(Xwt)中的任一种或两种以上。
<扩增试剂>
本发明的扩增试剂为在本发明的靶核酸序列的扩增方法中使用的扩增试剂。本发明的第1扩增试剂的特征在于包含引物(Xmt)和引物(Xwt)，第2扩增试剂的特征在于包含引物(Xmt)和引物(Y1)。
本发明的第1扩增试剂例如能够用于本发明的靶核酸序列的扩增方法中的第1实施方式，本发明的第2扩增试剂例如能够用于本发明的靶核酸序列的扩增方法中的第2实施方式。另外，本发明的第1和第2扩增试剂优选进一步包含引物(Y2)。另外，本发明中，各引物如前所述。
本发明的第3扩增试剂的特征在于包含引物(Xmt)和3’→5’核酸外切酶。本发明的第3扩增试剂例如能够用于本发明的靶核酸序列的扩增方法中的第3实施方式。本发明的第3扩增试剂还可以进一步包含引物(Y1)、引物(Y2)和引物(Xwt)中的任一种或两种以下。
本发明的扩增试剂中，所述各引物与前述相同。本发明的扩增试剂例如可以进一步含有在本发明的靶核酸序列的扩增方法中记载的用于扩增反应的各种成分。本发明的扩增试剂优选在一个反应体系内使用。另外，本发明的扩增试剂可以是在本发明的靶核酸序列的扩增方法中使用的扩增试剂盒，各成分可以分别包含在各自的容器中，也可以适宜组合而包含在同一容器中。所述扩增试剂盒例如优选包含使用说明书。
<突变检测方法>
如前所述，本发明的突变的检测方法，其特征在于，其为检测模板核酸中的检测目标的碱基位点有无突变的方法，包含下述(a)～(c)工序。
(a)通过本发明的靶核酸序列的扩增方法在反应体系中扩增所述模板核酸中包含所述碱基位点的靶核酸序列的工序；
(b)在能够与所述模板核酸中包含所述碱基位点的序列杂交的探针的存在下，改变包含由所述(a)工序得到的扩增产物的所述反应体系的温度，测定显示所述扩增产物与所述探针的杂交产物的熔解状态的信号值的工序；
(c)由与温度变化相伴的所述信号值的变动来确定所述目标碱基位点有无突变的工序。
本发明的特征在于，通过前述的方法扩增靶核酸序列、且进行所谓的Tm分析，其他工序以及条件等没有任何限制。本发明中，“突变”例如可列举出SNP等。
本发明优选适用于包含核酸的试样，作为所述试样，没有特别限制，可列举出与前述同样的试样。另外，模板核酸的种类也没有特别限制，可列举出与前述同样的核酸。
用于检测突变的所述探针(以下，也称为“检测用探针”)没有特别限制，可以根据以往公知的方法设定。例如，在模板核酸为双链的情况下，可以按照与正义链的检测目标序列杂交的方式设计(正义链的检测用探针)，也可以按照与反义链的检测目标序列杂交的方式设计(反义链的检测用探针)。另外，在设计探针时，所述检测目标序列中的检测目标的碱基位点可以设定为正常型碱基，也可以设定为突变型碱基。即，关于检测用探针，在与检测目标序列退火时，与所述检测目标序列中的检测目标的碱基位点对应的碱基例如可以与正常型碱基互补，也可以与突变型碱基互补。本发明中，由于尤其是以突变型的检测为目的，因此例如优选的是，在所述探针中与检测目标的碱基位点对应的碱基与突变型碱基互补、与正常型碱基非互补。
如前所述，本发明中，所述检测用探针只要是能够与包含所述目标碱基位点的检测目标序列杂交的序列即可。所述探针的序列没有特别限制，例如优选的是，在形成杂交体时，除了与检测目标的碱基位点(发生目标突变的位点)成对的位点(碱基)以外，90％～100％的序列相同，尤其优选为100％。
所述反应体系中的探针的添加比例没有特别限制，例如，优选以10～400nmol/L的范围添加所述探针，更优选为20～200nmol/L。另外，在所述探针为用荧光染料等标记物质标记的标记探针时，例如，为了调节所检测的荧光强度等信号强度，可以并用与所述标记探针序列相同的未标记探针。该未标记探针例如可以在其3’末端附加有磷酸。此时，所述标记探针与所述非标记探针的摩尔比例如优选为1∶10～10∶1。所述探针的长度没有特别限制，例如为5～50mer，优选为10～30mer。
所述探针也可以在所述(a)工序之后、即在进行了靶核酸序列的扩增反应后，添加到扩增反应的反应体系中，但由于能够容易且迅速地进行分析，因而优选在所述(a)工序的扩增反应之前预先添加到反应体系中。另外，反应体系中的各种引物的添加比例等如前所述。这样，在扩增反应之前向所述反应体系中添加所述探针时，例如，为了预防探针自身的延伸，可以在其3’末端进一步附加磷酸基，也可以用前述那样的荧光染料标记3’末端。
对于Tm值进行说明。若对包含双链DNA的溶液进行加热的话，260nm处的吸光度会上升。其原因在于，双链DNA中的两个链间的氢键因加热而解开，解离(DNA的熔解)为单链DNA。并且，若全部的双链DNA解离而形成单链DNA的话，其吸光度会显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA的吸光度)的约1.5倍左右，由此能够判断为熔解结束。基于该现象，熔解温度Tm通常被定义为吸光度达到吸光度总上升部分的50％时的温度。
在所述(b)工序中，显示所述扩增产物与所述探针的杂交产物的熔解状态的信号值的测定，如前所述，可以是260nm的吸光度测定，也可以是标记物质的信号测定。具体而言，作为所述探针，优选使用用标记物质进行了标记的标记探针，来进行所述标记物质的信号测定。作为所述标记探针，例如可列举出单独显示信号且通过形成杂交体而不显示信号的标记探针、或单独不显示信号且通过形成杂交体而显示信号的标记探针。若为前者那样的探针，则在与检测目标序列形成杂交体(例如，双链DNA)时不显示信号，通过加热而探针游离时显示信号。另外，若为后者的探针，则通过与检测目标序列形成杂交体(例如，双链DNA)而显示信号，通过加热而探针游离时信号减少(消失)。因此，通过在信号特有的条件(吸收波长等)下检测该标记所产生的信号，能够与所述260nm的吸光度测定同样地进行杂交产物的熔解的进行以及Tm值的确定等。
另外，如前所述，在(a)工序中，能够在同一反应体系中同时扩增两种以上的靶核酸序列。并且，能够对各扩增产物确认各自的目标突变。此时，只要根据包含发生目标突变的碱基位点的检测目标序列准备要杂交的探针即可。作为所述各探针，优选使用分别用在不同条件下被检测的不同的标记物质进行了标记的标记探针。若使用这种探针，即便为同一反应体系，也能够通过改变检测条件来分别检测各突变。
作为所述标记探针中的标记物质的具体例子，例如可列举出荧光染料和荧光团。作为所述标记探针的具体例子，例如优选用荧光染料标记的、单独显示荧光且通过形成杂交体而荧光减少(例如，猝灭)的探针。利用了这种荧光猝灭现象(Quenchingphenomenon)的探针通常被称为荧光猝灭探针。其中，作为所述探针，优选寡核苷酸的3’区域(例如，3’末端)或5’区域(例如，5’末端)的碱基用荧光染料进行标记，被标记的所述碱基优选为胞嘧啶(C)。此时，优选按照如下方式设计所述标记探针的碱基序列：在所述标记探针所杂交的检测目标序列中，与所述标记探针的末端碱基C成对的碱基或者距离所述成对的碱基为1～3碱基的碱基是鸟嘌呤(G)。这种探针通常被称为鸟嘌呤猝灭探针，作为所谓的QProbe(注册商标)而众所周知。若这种鸟嘌呤猝灭探针与检测目标序列杂交，则用荧光染料标记的末端的C接近所述检测目标序列中的G，从而显示出所述荧光染料的发光减弱(荧光强度减少)的现象。若使用这种探针，则能够通过信号的变动来容易地确认杂交与解离。另外，所述标记物质例如通常能够与核苷酸的磷酸基结合。
作为所述荧光染料，没有特别限制，例如可列举出荧光素、磷光体、若丹明、聚甲炔染料衍生物等，作为市售的荧光染料，例如可列举出BODIPY FL(商标，molecular probe公司制)、FluorePrime(商品名，Amersham pharmacia公司制)、Fluoredite(商品名，Millipore公司制)、FAM(ABI公司制)、Cy3和Cy5(Amersham pharmacia公司制)、TAMRA(molecular probe公司制)等。用于多个探针的荧光染料的组合例如只要能够在不同的条件下检测即可，没有特别限制，例如可列举出PacificBlue(检测波长450～480nm)、TAMRA(检测波长585～700nm)和BODIPY FL(检测波长515～555nm)的组合等。
接着，对于本发明的突变检测方法，举出通过PCR扩增核酸、且将标记探针用作检测用探针的一个例子来进行说明。另外，本发明不受该例的限制。
首先，使用添加了含有模板核酸的试样、前述的本发明的各种引物、和与所述检测目标序列杂交的标记探针的反应液，如前所述那样进行PCR。除了所述各种引物和标记探针之外，所述反应液中例如还可以含有DNA聚合酶、dNTP以及其他能够用于核酸扩增的各种添加剂。
所述标记探针的添加时间没有特别限制，例如，可以是扩增反应前、扩增反应途中和扩增反应后的任一者，但为了能够连续地进行所述(a)工序的扩增反应和所述(b)工序，优选在扩增反应前添加。
然后，进行所得到的扩增产物的解离、和由解离得到的单链DNA与所述标记探针的杂交。其例如可以通过改变所述反应液的温度来进行。
所述解离工序中的加热温度只要是所述扩增产物能够解离的温度即可，没有特别限制，例如为85～95℃。加热时间也没有特别限制，通常为1秒～10分钟，优选为1秒～5分钟。
解离后的单链DNA与所述标记探针的杂交，例如，通过在所述解离工序之后降低所述解离工序中的加热温度来进行。作为温度条件，例如为40～50℃。
然后，改变所述反应液的温度，测定显示所述扩增产物与所述标记探针的杂交产物的熔解状态的信号值。具体而言，例如，加热所述反应液、即加热所述单链DNA与所述标记探针的杂交产物，测定与温度上升相伴的信号值的变动。如前所述，例如，在使用了末端的C碱基被标记的探针(鸟嘌呤猝灭探针)的情况下，在与单链DNA杂交的状态下，荧光减少(或猝灭)，在解离的状态下，发出荧光。因此，例如，可以缓缓加热荧光已经减少(或猝灭)的杂交产物，并测定与温度上升相伴的荧光强度的增加。另外，在使用所述标记探针的情况下，所述信号值例如可以在与所述标记探针的标记物质所对应的条件下进行测定。在作为检测目标的碱基为多个、并使用多种探针检测突变时，如前所述那样，可以使用利用不同的检测条件的标记物质进行了标记的探针，在与各探针的标记物质所对应的条件下测定各信号值。
测定荧光强度的变动时的温度范围没有特别限制，例如，起始温度为室温～85℃，优选为25～70℃，结束温度例如为40～105℃。另外，温度的上升速度没有特别限制，例如为0.1～20℃/秒，优选为0.3～5℃/秒。
然后，分析所述信号的变动从而确定Tm值。具体而言，例如从所得到的荧光强度算出各温度下的每单位时间的荧光强度变化量。在将变化量设为(-d荧光强度增加量/dt)时，例如，能够将显示出最低值的温度确定为Tm值。另外，在将变化量设为(d荧光强度增加量/t)时，例如，能够将最高点确定为Tm值。另外，在不使用猝灭探针而使用单独不显示信号且通过形成杂交体而显示信号的探针作为标记探针时，相反地只要测定荧光强度的减少量即可。
所述Tm值例如可以通过以往公知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)等算出，另外，也可以通过最近邻法(Nearest Neighbor Method)确定。
然后，由这些Tm值确定目标碱基位点中的碱基的种类、即突变型或正常型等基因型。在Tm分析中得到如下结果：与有一个碱基不同的杂交体(错配)相比，完全互补的杂交体(匹配)的显示出解离的Tm值更高。因此，通过预先对所述探针确定完全互补的杂交体的Tm值、以及有一个碱基不同的杂交体的Tm值，能够确定目标碱基位点的基因型。例如，在假定目标碱基位点的碱基为突变型、并使用与包含该突变型碱基的检测目标序列互补的探针的情况下，若所形成的杂交体的Tm值与完全互补的杂交体的Tm值相同，则能够判断目标碱基为突变型。另外，若所形成的杂交体的Tm值与有一个碱基不同的杂交体的Tm值相同(与完全互补的杂交体的Tm值相比更低的值)，则能够判断目标碱基为正常型。另外，在检测到两者的Tm值的情况下，例如能够确定显示突变型的核酸与显示正常型的核酸共存。
另外，本发明中，如前所述，也可以代替提高包含所述探针的反应液的温度、即加热杂交产物而测定与温度上升相伴的信号变动的方法，而进行例如形成杂交体时的信号变动的测定。即，可以在降低包含所述探针的反应液的温度而形成杂交产物时，测定与所述温度降低相伴的信号变动。
作为具体例子，在使用单独显示信号且通过形成杂交体而不显示信号的标记探针(例如，鸟嘌呤猝灭探针)的情况下，在单链DNA与所述探针解离的状态下发出荧光，但若因温度的降低而形成杂交体的话，则所述荧光减少(或猝灭)。因此，例如，可以缓缓降低所述反应液的温度从而测定与温度下降相伴的荧光强度的减少。另一方面，在使用单独不显示信号且通过形成杂交体而显示信号的标记探针的情况下，在单链DNA与探针解离的状态下不发出荧光，但若因温度的降低而形成杂交体的话，会发出荧光。因此，例如，可以缓缓降低所述反应液的温度从而测定与温度下降相伴的荧光强度的增加。
本发明中，所述试样中的核酸可以是单链也可以是双链。在所述核酸为双链的情况下，例如，优选包含在所述(b)工序的杂交之前通过加热使所述试样中的双链核酸解离的工序。通过将双链核酸解离为单链核酸，能够在接下来的(b)工序中高效地进行与所述检测用探针的杂交。
<突变检测试剂>
本发明的突变检测试剂的特征在于，其为用于本发明的突变的检测方法的检测试剂，其包括本发明的扩增试剂、和能够与模板核酸中包含检测目标的碱基位点的序列杂交的探针。本发明的扩增试剂优选在一个反应体系内使用。
另外，本发明的突变检测试剂例如可以进一步包含本发明的突变的检测方法中所记载的用于扩增反应的各种成分。另外，本发明的突变检测试剂例如可以是本发明的突变检测试剂盒，优选包含例如使用说明书。
接下来，对本发明的实施例进行说明。然而，本发明不受下述实施例的限制。
实施例
[实施例1]
基于所述第1实施方式，通过Tm分析检测bcr-abl基因的第944位的碱基的点突变(C→T)。
首先，准备插入了第944位的碱基C没有突变的正常型bcr-abl基因序列的正常型质粒(以下，称为“wt”)、和插入了第944位的碱基C突变为T的突变型bcr-abl基因的异常型质粒(以下，称为“mt”)。以规定的比例将两者混合，调制多个核酸试样。所述多个核酸试样中的mt含有比例分别设为100％、10％、5％、3％、1％、0.5％、0.3％、和0％。向管内添加1μL(2×104copies/test)所述核酸试样和24μL下述表1的PCR反应液，使用热循环仪(商品名Mastercycler ep gradient S，eppendorf公司制)进行PCR。关于PCR，在95℃下处理60秒后，以99℃4秒和66℃30秒为1循环，重复50循环。进而，将装有所述PCR反应液的管移至iCycler(商品名，Bio-Rad Laboratories公司制)，在95℃下处理5秒、40℃下处理60秒后，使温度上升1℃，然后孵育15秒，将以上工序作为1循环而重复55循环，将所述PCR反应液从40℃加热至95℃。在所述55循环间，测定从40℃至75℃的各温度下的荧光强度(检测波长515～545nm)的变化，进行Tm分析。
表1
(PCR反应液组成)
H2O                              17.94μL
缓冲液※1                        2.5μL
80％甘油                         1.56μL
2.5mmol/L dNTP                   2.0μL
100μmol/L正义引物(Y2)           0.25μL
100μmol/L正常型引物(Xwt)        0.063μL
100μmol/L突变型引物(Xmt)        0.063μL
5μmol/L检测用探针               0.25μL
20％BSA                          0.25μL
5U/μL Gene Taq FP※2            0.125μL
总计                             24μL
※1 10×Gene Taq Universal Buffer(NIPPON GENE CO.，LTD.制(以下，相同)
※2 NIPPON GENE CO.，LTD.制(以下，相同)
所述引物(Y2)为PCR中的正义引物，正常型引物(Xwt)和突变型引物(Xmt)为PCR中的反义引物。这些引物的序列如下所示。正常型引物(Xwt)为与正常型bcr-abl基因中包含第944位的碱基(C)的区域100％匹配的互补的序列，突变型引物(Xmt)为与第944位的碱基C突变为T的突变型bcr-abl基因中包含第944位的碱基(T)的区域100％匹配的互补的序列。另外，在正常型引物(Xwt)和突变型引物(Xmt)的序列中，3’末端的用大写字母表示的碱基分别与正常型bcr-abl基因和突变型bcr-abl基因的第944位的碱基对应。所述正常型引物(Xwt)、突变型引物(Xmt)和与它们退火的正义链的位置关系、以及所述正义引物(Y2)和与其退火的反义链的位置关系，例如可以参照前述的图6的模式图，但该图终究只是模式图，本发明并不受其限制。
正义引物(Y2)  序列号1
5’-ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3’
正常型引物(Xwt)  序列号2
5’-ttcccgtaggtcatgaactcaG-3’
突变型引物(Xmt)  序列号3
5’-aggttcccgtaggtcatgaactcaA-3’
另外，在Tm分析中使用的所述检测用探针的序列如下所示。所述检测用探针为与第944位的碱基C突变为T的突变型bcr-abl基因(正义链)中包含所述第944位的碱基的区域100％匹配的互补的序列。在下述序列中，用大写字母表示的碱基A与所述第944位的突变的碱基T对应。另外，3’末端的P表示磷酸基。
检测用探针  序列号4
5’-(BODIPY FL)-ctcaAtgatgatatagaacg-P-3’
这些结果示于图1。图1为示出与温度上升相伴的荧光强度的变化的Tm分析的图表。横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化(以下，也称为“荧光变化量”)，单位为“-d荧光强度增加量/dt”。如图1所示，mt100％(wt0％)的峰、即Tm为55℃，wt100％(mt0％)的峰、即Tm为47℃。将它们作为mt和wt的评价基准，对于各试样，确认了mt的Tm值和wt的Tm值处的峰。其结果，对于mt和wt共存的全部试样(mt0.3％～10％)，尽管与wt相比mt的量较少，但在mt的Tm值处能够确认到峰。
[比较例1]
作为反义引物，代替正常型引物(Xwt)和突变型(Xmt)，使用0.126μL 100μmol/L的下述引物，并将PCR的条件设为在95℃下处理60秒后、以99℃4秒和62℃30秒为1循环并进行50循环，除此之外与所述实施例1同样地进行Tm分析。前述的正义引物(Y2)和下述反义引物由于在与bcr-abl基因的第944位的碱基不同的区域退火，因而无论第944位是正常碱基(C)或突变碱基(T)的任一者，包含所述第944位的碱基的区域均被扩增。
反义引物  序列号5
5’-ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3’
这些结果示于图2。图2为示出与温度上升相伴的荧光强度的变化的Tm分析的图表。横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化(以下，也称为“荧光变化量”)，单位为“-d荧光强度增加量/dt”。如图2所示，mt100％(wt0％)的峰、即Tm为55℃，wt100％(mt0％)的峰、即Tm为47℃。将它们作为mt和wt的评价基准，对于各试样，确认了mt的Tm值和wt的Tm值处的峰。其结果，对于mt和wt共存的试样，若mt在10％以上，则能够确认到mt的Tm值处的峰，但若低于10％，则无法确认到峰。由以上的结果可知，根据实施例1，能够实现与比较例1的方法相比更优异的检测灵敏度。
[比较例2]
根据以往的ASP-PCR法，检测bcr-abl基因的第944位的碱基的点突变(C→T)。
在比较例2中，调制了用于扩增第944位的碱基为正常的wt的wt用反应液、和用于扩增所述碱基发生了突变的mt的mt用反应液。这些反应液组成如下所示。wt用反应液使用实施例1的正常型引物(Xwt)作为反义引物，mt用反应液使用实施例1的突变型引物(Xmt)作为反义引物。另外，正义引物与实施例1同样地使用引物(Y2)。
表2
(ASP-PCR反应液组成)
H2O                      16.3125μL
缓冲液※1                2.5μL
80％甘油                 1.5625μL
2.5mmol/L dNTP           2.0μL
100μmol/L正义引物       0.125μL
100μmol/L反义引物       0.125μL
10×SYBR Green※3        1.0μL
20％BSA                  0.25μL
5U/μL Gene Taq FP※2    0.125μL
总计                     24μL
※3 TAKARA BIO INC.制
向管内添加与实施例1同样的1μL(2×104copies/test)核酸试样和24μL所述表2所示的ASP-PCR反应液(wt用或mt用)，使用前述的iCycler进行实时PCR。关于实时PCR，在95℃下处理60秒后，以99℃4秒和66℃30秒为1循环，重复50循环，测定各循环的66℃下的反应液的荧光强度(波长515～545nm)，求出阈值循环(Ct值)。由使用了突变型引物的mt100％的结果，求出各试样的Ct值的理论值。
这些结果示于下述表3。如下述表3所示，在使用正常型引物的情况下，尽管与正常型互补，在mt100％的试样中也检测到了扩增。另外，在使用突变型引物的情况下，尽管与突变型互补，在wt100％的试样中也确认到了扩增。由这些结果可知，在以往的ASP-PCR中，判断为假阳性的可能性很高。另外，与下述表3的理论值进行了比较，结果在实测值中产生了±2左右的偏差，因此认为能够适当地检测出的mt含有比例限定为mt1％～mt3％。由以上的结果可知，根据实施例1，能够实现与比较例2的方法相比更优异的检测灵敏度。另外，在比较例2中的以往的ASP-PCR法中，正常型和突变型的检测需要分别准备各自的反应体系，但根据实施例1，能够在1个反应体系中判断正常型和突变型。因此，可以说也能够减轻突变检测的劳动力和成本。
表3
Figure BPA00001283869400371
[实施例2]
基于所述第1实施方式，通过Tm分析检测bcr-abl基因(正义链)的第944位的碱基的点突变(C→T)。
首先，作为PCR的模板，准备与第944位的碱基C没有突变的正常型bcr-abl基因的部分序列互补的寡核苷酸(反义链，序列号6，以下称为“wt”)、和与第944位的碱基C突变为T的突变型bcr-abl基因的部分序列互补的寡核苷酸(反义链，序列号7，以下称为“mt”)。另外，在正常型寡核苷酸(wt)和突变型寡核苷酸(mt)的序列中，用大写字母表示的碱基分别与正常型bcr-abl基因和突变型bcr-abl基因的第944位的碱基对应。
正常型寡核苷酸(wt)  序列号6
5’-gtaggtcatgaactcaGtgatgatatagaacgggggctcccgggtgcaga-3’
突变型寡核苷酸(mt)  序列号7
5’-gtaggtcatgaactcaAtgatgatatagaacgggggctcccgggtgcaga-3’
以规定的比例将所述两种寡核苷酸混合，调制多个核酸试样。所述多个核酸试样中的mt含有比例分别设为100％、3％、和0％。向管内添加1μL 10μmol/L的核酸试剂和19μL下述表4的引物试剂，在95℃下加热1分钟。加热后，向所述管内进一步添加下述表5的酶试剂5μL，使用热循环仪(商品名Mastercycler epgradient S，eppendorf公司制)进行PCR。关于PCR，以95℃5秒和62℃15秒为1循环并重复5循环。PCR结束后，将所述管加热至95℃，添加2.5μL 10重量％SDS溶液，停止反应。进而，将装有所述PCR反应液的管移至i-densy(商品名，爱科来公司制)，在95℃下处理1秒、40℃下处理60秒后，以1℃/3秒的速度提高温度，从40℃加热至75℃。在该加热之间，测定从40℃至60℃的各温度下的荧光强度(激发波长420～485nm，检测波长520～555nm)的变化，进行Tm分析。
表4
(引物试剂)
dH2O                       12.82μL
缓冲液※1                  2μL
80％甘油                   0.78μL
2.5mmol/L dNTP             2μL
5μmol/L检测用探针         1μL
100μmol/L正常型引物(Xwt)  0.2μL
100μmol/L突变型引物(Xmt)  0.2μL
总计                       19μL
表5
(酶试剂)
dH2O                     3.75μL
缓冲液※1                0.5μL
20重量％BSA              0.5μL
5U/μL Gene Taq FP※2    0.25μL
总计                     5μL
正常型引物(Xwt)和突变型引物(Xmt)为PCR中的正义引物。这些引物的序列如下所示。正常型引物(Xwt)为与在正常型bcr-abl基因的正义链中包含第944位的碱基(C)的区域100％相同的序列，突变型引物(Xmt)为与在第944位的碱基C突变为T的突变型bcr-abl基因的正义链中包含第944位的碱基(T)的区域100％相同的序列。另外，在正常型引物(Xwt)和突变型引物(Xmt)的序列中，3’末端的用大写字母表示的碱基分别与正常型bcr-abl基因和突变型bcr-abl基因的第944位的碱基对应。所述正常型引物(Xwt)、突变型引物(Xmt)和与它们退火的反义链的位置关系，例如可以参照前述的图6的模式图，但该图终究只是模式图，本发明并不受其限制。
正常型引物(Xwt)  序列号8
5’-cccccgttctatatcatcaC-3’
突变型引物(Xmt)  序列号9
5’-ggagcccccgttctatatcatcaT-3’
所述检测用探针使用与所述实施例1相同的检测用探针。
这些结果示于图3。图3为示出与温度上升相伴的荧光强度的变化的Tm分析的图表。横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化(以下，也称为“荧光变化量”)，单位为“d荧光强度增加量/dt”。如图3所示，mt100％(wt0％)的峰、即Tm为52～54℃，wt100％(mt0％)的峰、即Tm为47～48℃。将它们作为mt和wt的评价基准，对于各试样，确认了mt的Tm值和wt的Tm值处的峰。其结果，对于mt和wt共存的试样(mt3％)，尽管mt的量非常少、为3％，但在mt的Tm值处能够确认到与wt的Tm值处的峰同样程度的强度的峰。
[实施例3]
基于所述第3实施方式，通过Tm分析检测bcr-abl基因(正义链)的第944位的碱基的点突变(C→T)。
与实施例1同样地，将所述正常型质粒(wt)和所述突变型质粒(mt)以规定的比例混合，调制多个核酸试样。所述多个核酸试样中的mt含有比例分别设为100％、10％、5％、3％、和0％。向管内添加1μL(2×104copies/test)所述核酸试样和24μL下述表6的PCR反应液，使用热循环仪(商品名Mastercycler ep gradientS，eppendorf公司制)，与实施例1同样地进行PCR。PCR之后，测定35循环间的、从40℃至75℃的各温度下的荧光强度(检测波长515～545nm)的变化，除此之外与所述实施例1同样地进行Tm分析。
表6
(PCR反应液)
H2O                        16.94μL
缓冲液※1                  2.5μL
80％甘油                   1.56μL
2.5mmol/L dNTP             2μL
5μmol/L检测用探针         0.25μL
100μmol/L正义引物(Y2)     0.125μL
100μmol/L反义引物(Y1)     0.125μL
100μmol/L突变型引物(Xmt)  0.125μL
20重量％BSA                0.25μL
5U/μL Gene Taq FP※2      0.125μL
总计                       24μL
所述引物(Y2)为PCR中的正义引物，所述引物(Y1)和突变型引物(Xmt)为PCR中的反义引物。所述正义引物(Y2)和所述突变型引物(Xmt)分别使用与所述实施例1相同的引物。这些引物的序列如下所示。突变型引物(Xmt)为与第944位的碱基C突变为T的突变型bcr-abl基因中包含第944位的碱基(T)的区域100％匹配的互补的序列。另外，在突变型引物(Xmt)的序列中，3’末端的用大写字母表示的碱基与突变型bcr-abl基因的第944位的碱基对应。所述正义引物(Y2)和与其退火的反义链的位置关系、以及所述正常型引物(Xwt)和所述反义引物(Y1)和与它们退火的正义链的位置关系，例如可以参照前述的图7的模式图，但该图终究只是模式图，本发明并不受其限制。
正义引物(Y2)  序列号1
5’-ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3’
反义引物(Y1)  序列号10
5’-gaccgaccgaccccaggaggttcccgtaggtc-3’
突变型引物(Xmt)  序列号3
5’-aggttcccgtaggtcatgaactcaA-3’
所述检测用探针的序列如下所示。所述检测用探针为与第944位的碱基C突变为T的突变型bcr-abl基因的反义链中包含所述第944位的碱基的区域100％匹配的互补的序列。在下述序列中，用大写字母表示的碱基T与反义链中的所述第944位的突变的碱基A对应。另外，3’末端的P表示磷酸基。
检测用探针  序列号11
5’-(BODIPY FL)-cccgttctatatcatcaTtgag-P-3’
[比较例3]
在所述表6的PCR反应液中，代替突变型引物(Xmt)0.125μL，而添加2倍量即0.25μL的反义引物(Y1)，除此之外与所述实施例3同样地进行Tm分析。
所述实施例3的结果示于图4，所述比较例3的结果示于图5。两图为示出与温度上升相伴的荧光强度的变化的Tm分析的图表。横轴表示测定时的温度(℃)，纵轴表示荧光强度的变化(以下，也称为“荧光变化量”)，单位为“-d荧光强度增加量/dt”。如图4和图5中的mt100％(wt0％)和wt100％(mt0％)所示，mt100％(wt0％)的峰、即Tm为59℃，wt100％(mt0％)的峰、即Tm为54℃。将它们作为mt和wt的评价基准，对于各试样，确认了mt的Tm值和wt的Tm值处的峰。其结果，在图4所示的实施例3中，对于mt和wt共存的试样(mt3％～10％)，尽管mt的量很少，但在mt的Tm值处能够确认到峰。与此相对，在图5所示的比较例3中，对于mt和wt共存的试样(mt3％～10％)，均仅在wt的Tm值处确认到峰，而不能在mt的Tm值处确认到峰。由该结果可知，根据本实施例，可以说能够更高灵敏度地检测突变。
产业上的可利用性
如上所述，本发明的特征在于，例如即便是在试样中共存有所述碱基位点为突变型的模板核酸和所述碱基位点为正常型的模板核酸作为模板核酸的情况下，也能够与正常型的靶核酸序列相比优先扩增所述突变型的靶核酸序列。这样，通过优先扩增突变型的靶核酸序列，例如，即便在突变型的模板核酸的比例低于正常型的模板核酸的情况下，通过对本发明的扩增产物进行使用探针的Tm分析，能够以优异的灵敏度以及可靠性检测突变的有无。因此，如前所述，对于包含正常基因和突变基因这两者的试样尤其有用。从以上观点出发，本发明例如在通过基因突变的检测而进行治疗或诊断的近年来的临床领域中极其有用。
Figure IPA00001283868800011
Figure IPA00001283868800021
Figure IPA00001283868800031
Figure IPA00001283868800041

Claims (6)

1.一种靶核酸序列的扩增方法，其特征在于，其为模板核酸中的靶核酸序列的扩增方法，
所述靶核酸序列为所述模板核酸中包含发生作为检测目标的突变的碱基位点的序列，
该方法包括如下扩增工序：在同一反应体系中，与所述碱基位点为正常型碱基的靶核酸序列相比，优先扩增所述碱基位点为突变型碱基的靶核酸序列，其中，所述扩增工序为在所述同一反应体系中使用下述引物Xmt、引物Xwt和引物Y2扩增所述靶核酸序列的工序，
下述引物Xmt对所述碱基位点为突变型的模板核酸的扩增效率高于下述引物Xwt对所述碱基位点为正常型的模板核酸的扩增效率，
引物Xmt：
为与所述模板核酸中包含突变型的所述碱基位点的区域互补、且3’区域具有与所述碱基位点的碱基互补的碱基的引物，
引物Xwt：
为与所述模板核酸中包含正常型的所述碱基位点的区域互补、且3，区域具有与所述碱基位点的碱基互补的碱基的引物，
所述Xmt与碱基位点是突变型的模板核酸互补，并且与Xwt相比在5’末端长1-5碱基，并且Xmt与互补序列的Tm值为比Xmt与互补序列的Tm值更高的值，
引物Y2：
为与所述模板核酸中位于所述碱基位点的5’侧的区域的互补序列互补的引物。
2.根据权利要求1所述的靶核酸序列的扩增方法，其中，在所述引物Xmt和引物Xwt中，3’末端的第1位或第2位的碱基为与所述碱基位点的碱基互补的碱基。
3.根据权利要求1所述的靶核酸序列的扩增方法，其中，在所述扩增工序中，向所述反应体系进一步添加能够与所述模板序列中包含所述碱基位点的序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的靶核酸序列的扩增方法，其中，所述探针为标记探针。
5.一种扩增试剂，其特征在于，其为用于权利要求1所述的靶核酸序列的扩增方法的扩增试剂，
其包含下述引物Xmt、引物Xwt和引物Y2，
所述引物Xmt、引物Xwt和引物Y2用于同一反应体系中，
下述引物Xmt对所述碱基位点为突变型的模板核酸的扩增效率高于下述引物Xwt对所述碱基位点为正常型的模板核酸的扩增效率，
引物Xmt：
为与所述模板核酸中包含突变型的所述碱基位点的区域互补、且3’区域具有与所述碱基位点的碱基互补的碱基的引物，
引物Xwt：
为与所述模板核酸中包含正常型的所述碱基位点的区域互补、且3’区域具有与所述碱基位点的碱基互补的碱基的引物，
所述Xmt与碱基位点是突变型的模板核酸互补，并且在5’末端与Xwt相比长1-5碱基，并且Xmt与互补序列的Tm值为比Xmt与互补序列的Tm值更高的值，
引物Y2
为与所述模板核酸中位于所述碱基位点的5’侧的区域的互补序列互补的引物。
6.一种检测试剂，用于检测模板核酸中的作为检测目标的碱基位点有无突变，其包括：
权利要求5所述的扩增试剂、和
能够与模板核酸中包含作为检测目标的碱基位点的序列杂交的探针。
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