CN101443448A - Cyp2c9基因扩增用引物对、含有其的cyp2c9基因扩增用试剂及其用途 - Google Patents
Cyp2c9基因扩增用引物对、含有其的cyp2c9基因扩增用试剂及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101443448A CN101443448A CNA2007800170481A CN200780017048A CN101443448A CN 101443448 A CN101443448 A CN 101443448A CN A2007800170481 A CNA2007800170481 A CN A2007800170481A CN 200780017048 A CN200780017048 A CN 200780017048A CN 101443448 A CN101443448 A CN 101443448A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- cyp2c9
- probe
- amplification
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
提供用于通过基因扩增法扩增CYP2C9基因中的、含有CYP2C9*3的检测目的位点的区域的引物对,该引物对能够特异性扩增上述区域。使用包括含有序列号4的碱基序列的正向引物和含有序列号17的碱基序列的反向引物的1对引物对。通过使用该引物对,能够特异且高效地扩增CYP2C9基因的含有多态性CYP2C9*3发生位点的目的区域。
Description
技术领域
本发明涉及用于扩增CYP2C9基因的引物对,含有该引物对的CYP2C9基因扩增用试剂及其用途。
背景技术
细胞色素P450是被分类为超家族的酶类,存在多个亚家族(例如,CYP1A、CYP1B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP3A等)。这其中,现已阐明编码人CYP2C亚家族的同工酶CYP2C9的基因(CYP2C9基因)的突变对CYP2C9的底物药物-苯妥英(抗癫痫剂)和华法林(抗凝血药)的处置和效果有影响。已知CYP2C9基因的多态性CYP2C9*3是氨基酸第359位(外显子7)的异亮氨酸变为亮氨酸的突变(非专利文献1)。而且,存在该CYP2C9*3的氨基酸第359位是底物药物的识别位点,由于该氨基酸改变、立体结构(β-链)变化,因此对药物代谢相关的酶的功能有影响。因此,为了预测药物所产生的副作用、确定显示更好效果的给药条件,研究CYP2C9基因的多态性CYP2C9*3十分重要。
另外,作为在基因水平解析所有疾病的原因、个体间的疾病易感性(易患疾病)、个体间的药效的差异等的方法,广泛地进行点突变、所谓的单核苷酸多态性(SNP)的检测。点突变的通常检测方法可以举出:(1)利用PCR(聚合酶链反应)扩增试样的目的DNA的相当于检测对象序列的区域,再对其全基因序列进行解析的直接测序法;(2)利用PCR扩增试样的目的DNA的相当于检测对象序列的区域,通过随上述检测对象序列有无目的突变而切断作用不同的限制酶,将该扩增产物切断,进行电泳从而进行分型的RFLP解析;(3)使用目的突变位于3’末端区域的引物进行PCR,通过有无扩增判断突变的ASP-PCR法等。
但是,这些方法例如必须进行由试样提取的DNA的精制、电泳、限制酶处理等,因此需要功夫和成本。另外,进行PCR后,有必要暂时开启反应容器,因此有上述扩增产物混入到之后的反应体系内、解析精度降低的顾虑。而且,由于自动化困难,因此无法解析大量的样品。另外,上述(3)的ASP-PCR法还存在特异性低的问题。
由该问题出发,近年来作为点突变的检测方法,正在实施对由目的核酸和探针形成的双链核酸的融解温度(Tm)进行分析的方法。这种方法由于通过Tm分析或上述双链的融解曲线的分析来进行,因此称作融解曲线分析。其为如下的方法。即,首先使用与含有检测目的的点突变的检测对象序列互补的探针,形成检测试样的目的单链DNA与上述探针的杂交体(双链DNA)。对该杂交产物实施加热处理,通过吸光度等信号的变动检测随着温度上升的杂交体的解离(融解)。然后,根据该检测结果确定Tm值,从而判断有无点突变。在杂交产物的同源性越高时Tm值越高、同源性越低时Tm值越低。因此,对于含有点突变的检测对象序列和与其互补的探针形成的杂交产物,预先求得Tm值(评价标准值),测定检测试样的目的单链DNA和上述探针的Tm值(测定值)。上述测定值与评价标准值相同时,则可以判断为匹配、即目的DNA存在点突变,测定值低于评价标准值时,则可以判断为错配、即目的DNA不存在点突变。而且,通过该方法还可以实现基因解析自动化。
但是,对于这种利用Tm分析的检测方法而言,存在着在PCR中,必须特异且高效地扩增含有检测目的位点的区域的问题。尤其是,CYP存在许多同工酶,编码这些酶的序列又极为类似,因此就有这样的担忧,即在PCR中连CYP2C9之外的同工酶的编码基因也被扩增。而且,这种连其它同工酶的编码基因也被扩增的情形,也成为例如使分析结果的可信度降低的原因。而且,这样一来,由于分析1个样本时伴随过多劳动力,因此存在着实际上不能实现分析大量试样的问题。
非专利文献:PMID:8873220 Pharmacogenetics.1996 Aug;6(4):341-9。
发明内容
因此,本发明的目的在于提供通过基因扩增法能够特异且高效地扩增CYP2C9基因的目的区域的引物对。
为了实现上述目的,本发明的引物对,其特征在于,其为用于通过基因扩增法扩增CYP2C9基因的引物对,含有以下引物对(1):
引物对(1):
包括含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对
(F1):与序列号1的碱基序列中的、以第52466位的腺嘌呤碱基(A)作为第1个碱基向着5’方向直至第14~18个碱基的区域序列相同的至少一段寡核苷酸,该寡核苷酸以上述腺嘌呤碱基(A)作为3’末端
(R1):与序列号1的碱基序列中的、以第52631位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1个碱基向着3’方向直至第19~36个碱基的区域互补的至少一段寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第52631位的胸腺嘧啶碱基(T)互补的腺嘌呤碱基(A)作为3’末端
而且,本发明的基因扩增用试剂,其特征在于,其是一种用于通过基因扩增法扩增CYP2C9基因的试剂,含有上述本发明的CYP2C9基因扩增用引物对。
本发明的扩增产物的制备方法,其特征在于,其是一种通过基因扩增法制备CYP2C9基因的扩增产物的方法,含有下述(I)步骤:
(I)以试样中的核酸作为模板,使用本发明的CYP2C9基因扩增用引物对,在反应液中扩增上述CYP2C9基因的步骤。
本发明的多态性分析方法,其特征在于,其是分析CYP2C9基因中的检测对象位点的多态性的方法,包括以下步骤(i)~(iv)。
(i)通过本发明的扩增产物的制备方法,在反应液中扩增CYP2C9基因中含有检测对象位点的区域的步骤
(ii)准备含有上述步骤(i)中的扩增产物和能够与上述检测对象位点杂交的探针的反应液的步骤
(iii)改变上述反应液的温度,测定上述扩增产物和上述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤
(iv)根据伴随温度变化的上述信号值的变动,确定上述检测对象位点的多态性的步骤
根据本发明的引物,能够在反应液中特异且高效地扩增CYP2C9基因中的含有发生检测目的多态性CYP2C9*3的位点的目的区域。因此,与上述的现有方法不同,能够减少功夫和成本。另外,由于如此特异地扩增含有发生CYP2C9*3的检测对象位点的区域,再通过使用例如与含有检测对象位点的检测对象序列互补的探针,能够使用上述反应液直接进行Tm分析、将上述多态性分型。另外,由于能在一个反应液中进行上述目的区域的扩增和多态性的分型,因此还能够实现操作的自动化。而且,当使用本发明的引物对时,例如即便是含有杂质的试样(例如全血或口腔粘膜等),也能省略预处理、更为迅速且简单地进行扩增反应。另外,当使用本发明的引物对时,能以优于以往的扩增效率进行扩增反应,因此还能够缩短扩增反应。因此,通过本发明的引物对、含有其的试剂以及使用它们的扩增产物的制备方法和多态性分析方法,能迅速且简单地分析CYP2C9基因的多态性,在医疗领域是非常有效的。
附图说明
图1是表示本发明的实施例1中Tm分析的结果的图。
图2是表示本发明的上述实施例1中Tm分析的结果的图。
图3是表示本发明的实施例2中Tm分析的结果的图
具体实施方式
<CYP2C9基因扩增用引物对>
本发明的CYP2C9基因扩增用引物对,如上所述,其特征在于,其含有上述引物对(1)。根据该引物对(1),如上所述,能够特异且高效地扩增含有CYP2C9*3发生的检测对象位点的目的区域。因此,使用本发明的引物对扩增该区域,能比以往更高效地进行CYP2C9基因多态性的分析。另外,以下有时将正向引物称为F引物,将反向引物称为R引物。
上述引物对(1),如上所述,是包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对。
(F1):与序列号1的碱基序列中的、以第52466位的腺嘌呤碱基(A)作为第1个碱基向着5’方向直至第14~18个碱基的区域序列相同的至少一段寡核苷酸,该寡核苷酸以上述腺嘌呤碱基(A)作为3’末端
(R1):与序列号1的碱基序列中的、以第52631位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1个碱基向着3’方向直至第19~36个碱基的区域互补的至少一段寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第52631位的胸腺嘧啶碱基(T)互补的腺嘌呤碱基(A)作为3’末端
序列号1所示的碱基序列是人细胞色素P450家族第2亚家族C多肽9(CYP2C9)的全长序列,例如,NCBI登录号No.AY702706所登录的序列。
上述引物对(1)是用于扩增序列号1中的、含有第52467位~52630位的区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内第52521位的碱基(序列号1中第52521位的碱基)存在对CYP2C9的功能产生影响的点突变(52521A、52521C),这种多态性就是上述的CYP2C9*3。如果第52521位的碱基为A,则CYP2C9基因被翻译为蛋白质时,氨基酸第359位为异亮氨酸(Ile),第52521位的碱基如果为C,则显示氨基酸第359位为亮氨酸(Leu)的多态性。本发明中,在纯合子时该位点的多态性可以用52521A/A、52521C/C表示,在为杂合子时该位点的多态性可以用52521A/C来表示。以下,也将该引物对(1)称为“CYP2C9*3用引物对”。
在本发明中,引物对(1)的F1引物和R1引物只要决定DNA聚合酶扩增起始点的3’末端的碱基满足上述条件即可。这样一来,通过固定上述引物的3’末端的碱基,能够充分防止引物对(1)与例如类似的其它同工酶的基因(例如CYP2C8、CYP2C17、CYP2C18、CYP2C19基因等)结合。
这样一来,由于只要F1引物和R1引物3’末端的碱基被固定即可,因此各引物的长度自身没有特别的限制,可以适当调整到通常的长度。作为引物长度的一例,例如在13~50mer的范围内,优选14~45mer,更优选15~40mer。作为具体例子,上述F1引物优选如下:与序列号1的碱基序列中的、以第52466位的腺嘌呤碱基(A)作为第1个碱基向着5’方向直至第14~18个碱基(优选第14~17个碱基,更优选第15~17个碱基)的区域序列相同的至少一段寡核苷酸。而且,上述R1引物优选如下:与序列号1的碱基序列中的、以第52631位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1个碱基向着3’方向直至第19~36个(优选第22~30个碱基,更优选第23~29个碱基)的区域互补的至少一段寡核苷酸。而且,由于F1引物和R1引物的3’末端被固定,由引物延伸出的区域如上所述是例如序列号1中第52467位~第52630位的区域,获得的扩增产物的总长根据所使用的引物长度而变化。
而且,R1引物可以是不与序列号1所示的碱基序列完全互补的寡核苷酸,F1引物也可以是不与上述碱基序列的互补链完全互补的寡核苷酸。即,前述各引物中,除3’末端的碱基以外的部分可以与完全互补的寡核苷酸有1~5个碱基不同。
以下,列举F1引物和R1引物的具体例子,本发明不限于此。而且,这些F1引物和R1引物的组合没有任何限制,这其中,特别优选包括含有序列号2或序列号4的寡核苷酸的F1’引物、和含有序列号14或序列号17的寡核苷酸的R1’引物的引物对(1’)。另外,下表中“Tm(℃)”是下表的序列和与其完全互补的序列杂交时的Tm(℃),是用MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)、将参数设为寡核苷酸浓度0.2μM、钠当量(Na eq.)50mM而计算的值。上述Tm值,可以用例如目前已知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)等计算,而且,还可以用临接法(Nearest Neighbor Method)确定(以下相同)。
表1
而且,为了提高扩增反应的反应温度,上述引物对(1)的各引物例如可以在5’末端添加目前已知的任意序列。
含有这种引物对(1)的本发明的CYP2C9基因扩增用引物对优选在扩增全血试样等生物试样中的CYP2C9基因时使用。尤其是,本发明的CYP2C9基因扩增用引物对在与后述的多态性检测用探针一起使用时,基因扩增用反应液中的全血试样的添加比例优选为0.1~0.5体积%。对于这点,后文有述。
<CYP2C9基因扩增用试剂>
本发明的CYP2C9基因扩增用试剂,如上所述,其特征在于,其是用于通过基因扩增法扩增CYP2C9基因的试剂,含有本发明的CYP2C9基因扩增用引物对。本发明的基因扩增用试剂的特征在于含有本发明的引物对,此外的组成等没有任何限定。
为了对使用本发明的引物对、通过基因扩增法获得的扩增产物进行检测,本发明的CYP2C9基因扩增用试剂,还可以含有探针。如上所述,使用本发明的引物对,通过基因扩增法能获得含有出现CYP2C9*3的检测对象位点的目的区域的扩增产物。因此,同时存在有与上述目的区域的检测对象序列互补的探针,由此能够使用后述的方法检测例如扩增的有无、检测对象位点的基因型(多态性)等。对于这种探针及其利用方法,在之后的多态性分析方法中说明。而且,本发明的CYP2C9基因扩增用试剂优选在扩增全血等生物试样中的CYP2C9基因时使用。尤其是,本发明的CYP2C9基因扩增用试剂在与上述的探针一起使用时,基因扩增用反应液中的全血试样的添加比例优选为0.1~0.5体积%。而且,在本发明中,所谓“检测对象序列”是指含有多态性发生位点(检测对象位点)的序列。
本发明的CYP2C9基因扩增用试剂的形态没有特别限定,例如可以是含有本发明的CYP2C9基因扩增用引物对的液体试剂,也可以是使用前用溶剂悬浮的干燥试剂。而且,CYP2C9基因扩增用引物对的含量也没有特别的限制。
<扩增产物的制备方法>
本发明的扩增产物的制备方法,如上所述,,其特征在于,其是通过基因扩增法制备CYP2C9基因的扩增产物的方法,含有下述步骤(I)。
(I)以试样中的核酸作为模板,使用本发明的CYP2C9基因扩增用引物对在反应液中扩增上述CYP2C9基因的步骤
这样一来,通过使用本发明的引物对进行扩增反应,如上所述,能够特异且高效地扩增CYP2C9基因中含有多态性CYP2C9*3的检测对象位点的目的区域。而且,本发明的扩增产物的制备方法,特征在于使用本发明的引物对,对基因扩增法的种类、条件等没有任何限制。
上述基因扩增法如上所述并无特别限定,例如可以举出PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)法、NASBA(Nucleic acid sequence based amplification,基于核酸序列的扩增)法、TMA(Transcription mediated amplification,转录介导扩增)法、SDA(Strand Displacement Amplification,链置换扩增)法等,优选PCR法。另外,以下以PCR法为例说明本发明,但并非局限于此。
作为使用本发明的试样,例如只要含有成为模板的核酸即可,并无特别限定,例如优选应用于含有杂质的试样。作为上述含有杂质的试样例如可以举出全血、口腔内细胞(例如口腔粘膜)、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、吐出的痰液、羊水、石蜡包埋组织、尿、胃液(例如胃洗涤液)等、它们的悬浮液等。通过使用本发明引物对的扩增产物的制备方法,例如即便是含有各种杂质的试样(特别是全血或口腔细胞等生物试样),也不易受杂质影响、能够特异地扩增CYP2C9基因的上述目的区域。因此,通过本发明,即便是通过以往方法较难测定的全血等杂质多的试样,例如也可以不进行精制等预处理直接使用。因此,从试样的预处理的观点出发,可以较以往方法更为迅速地制备扩增产物。
上述反应液中的试样添加比例并无特别限定。作为具体例,当上述试样为生物试样(例如全血试样)时,上述反应液中的添加比例的下限例如优选为0.01体积%以上、更优选为0.05体积%以上、进一步优选为0.1体积%以上。上述添加比例的上限并无特别限定,例如优选为2体积%以下、更优选为1体积%以下、进一步优选为0.5体积%以下。
另外,以后述的光学检测为目的时,特别是使用标记探针进行光学检测时,全血试样这类生物试样的添加比例例如优选设定为0.1~0.5体积%。在PCR反应中,通常为了使DNA变性(解离成单链DNA)而实施加热处理,但由于该加热处理,试样所含的糖、蛋白质等变性,有产生不溶沉淀物、混浊等的顾虑。因此,在利用光学方法确认扩增产物的有无、检测对象位点的基因型(多态性)时,这种沉淀物、混浊的发生有可能对测定精度造成影响。但是,通过将反应液中的全血试样的添加比例设定在上述范围内,虽然原理不明,但能充分防止变性所产生的沉淀物等,因此能够提高光学方法的测定精度。另外,由于还可充分地抑制全血试样中的杂质对PCR的干扰,因此能够进一步提高扩增效率。因而,在使用本发明的引物对的基础上,通过进一步将全血试样等试样的添加比例设定在上述范围内,可以进一步排除试样预处理的必要性。
另外,上述反应液中的全血试样的比例不仅可以用上述体积比例(例如0.1~0.5体积%),还可以用血红蛋白(以下称作“Hb”)的重量比例表示。此时,上述反应液中的全血试样的比例换算为Hb例如优选为0.565~113g/L的范围、更优选为2.825~56.5g/L的范围、进一步优选为5.65~28.25g/L的范围。另外,上述反应液中的全血试样的添加比例例如可以满足上述体积比例和Hb重量比例两者,也可以满足任一者。
作为全血,例如可以是溶血的全血、未溶血的全血、抗凝固全血、含有凝固部分的全血等的任一种。
本发明中,试样所含的目的核酸例如为DNA。上述DNA例如可以是生物试样等试样中原本含有的DNA,还可以是通过基因扩增法扩增出的扩增产物DNA。为后者时,可以举出利用逆转录反应(例如RT-PCR,逆转录PCR)由上述试样原本含有的RNA(总RNA、mRNA等)产生的cDNA。
本发明的扩增产物的制备方法中,优选在基因扩增反应开始前,向上述反应液中添加白蛋白。通过这种白蛋白的添加,例如能够进一步降低上述沉淀物、混浊的产生所带来的影响,且能够进一步提高扩增效率。具体地说,优选在上述(I)工序的扩增反应或解离为单链DNA的工序前添加白蛋白。
上述反应液中白蛋白的添加比例例如为0.01~2重量%的范围、优选为0.1~1重量%、更优选为0.2~0.8重量%。上述白蛋白并无特别限定,例如可以举出牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、马血清白蛋白等,这些物质可以使用任一种,还可以并用两种以上。
然后,对于本发明的扩增产物的制备方法列举如下的例子进行说明,上述例子为:对全血试样,以DNA作为目的核酸,使用本发明的引物对,利用PCR制备CYP2C9基因的上述目的区域的扩增产物。本发明是以使用本发明的引物对为特征,对其它的构成和条件没有任何限定。
首先,制备PCR反应液。本发明的引物对的添加比例并无特别限定,优选按照引物对(1)的F引物达到0.1~2μmol/L的方式进行添加、更优选为0.25~1.5μmol/L、特别优选为0.5~1μmol/L。另外,优选按照引物对(1)的R引物达到0.1~2μmol/L的方式进行添加、更优选为0.25~1.5μmol/L、特别优选为0.5~1μmol/L。引物对中的F引物和R引物的添加比例(F:R,摩尔比)并无特别限定,例如优选为1:0.25~1:4、更优选为1:0.5~1:2。
反应液中全血试样的比例并无特别限定,优选上述的范围。全血试样可以直接添加在反应液中,也可以预先用水或缓冲液等溶剂稀释后添加至反应液中。预先稀释全血试样时,其稀释率并无特别限定,例如稀释率可以按照反应液中最终全血添加比例达到上述范围来进行设定,例如设定为100~2000倍、优选为200~1000倍。
上述反应液中的其它组成成分并无特别限定,可以举出目前已知的成分,其比例也无特别限定。上述组成成分例如可以举出DNA聚合酶、核苷酸(核苷三磷酸(dNTP))和溶剂。另外,如上所述,优选上述反应液中进一步含有白蛋白。另外,上述反应液中,各组成成分的添加顺序并无任何限定。
上述DNA聚合酶并无特别限定,例如可以使用目前已知的耐热性细菌来源的聚合酶。具体例子有可以商业地获得的来自栖热水生菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(美国专利第4,889,818号以及美国专利第5,079,352号)(商品名Taq聚合酶)、来自极端嗜热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合酶(WO91/09950)(rTth DNA polymerase)、来自强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的DNA聚合酶(WO 92/9689)(Pfu DNA polymerase:Stratagenes公司产)、来自嗜热球菌(Thermococcus litoralis)的DNA聚合酶(EP-A 455 430)(商标Vent:New England Biolabs公司产)等,其中,优选来自栖热水生菌(Thermus aquaticus)的耐热性DNA聚合酶。
上述反应液中DNA聚合酶的添加比例并无特别限定,例如为1~100U/mL、优选为5~50U/mL、更优选为20~30U/mL。另外,DNA聚合酶的活性单位(U)一般是将如下的活性作为1U:以活化鲑鱼精子DNA为模板引物,在活性测定用反应液中、74℃下、30分钟内,将10nmol的总核苷酸吸收到酸不溶性沉淀物中的活性。上述活性测定用反应液的组成例如为25mM TAPSbuffer(pH9.3、25℃)、50mM KCl、2mM MgCl2、1mM巯基乙醇、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dTTP、100μM“α-32P”dCTP、0.25mg/mL活化鲑鱼精子DNA。
上述核苷三磷酸通常可以举出dNTP(dATP、dCTP、dTTP)。上述反应液中的dNTP的添加比例并无特别限定,例如为0.01~1mmol/L、优选为0.05~0.5mmol/L、更优选为0.1~0.3mmol/L。
上述溶剂例如可以举出Tris-HCl、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、MES、MOPS、HEPES、CAPS等缓冲液,可以使用市售的PCR用缓冲液或市售的PCR试剂盒的缓冲液等。
另外,上述PCR反应液还可以含有肝素、甜菜碱、KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等,它们的添加比例例如可以设定为不干扰PCR反应的范围。
反应液的总体积并无特别限定,例如可以根据所用机器(热循环仪)等适当地设定,通常为1~500μL、优选为10~100μL。
接着,进行PCR。PCR循环条件并无特别限定,例如(1)全血来源的双链DNA解离成单链DNA、(2)引物的退火、(3)引物的延伸(聚合酶反应)分别如下上述。另外,循环数也无特别限定,以下述(1)~(3)的3步骤为1个循环,例如优选为30个循环。上限并无特别限定,例如共计100个循环以下、优选70个循环以下、更优选50个循环以下。各步骤的温度变化例如可以使用热循环仪等自动地控制。使用本发明的引物对时,如上所述由于扩增效率优异,因此与利用以往方法时50个循环需要3小时左右相比,利用本发明能够在约1小时左右(优选1小时以内)完成50个循环。
表2
按上述方式,能够制备与CYP2C9基因中含有CYP2C9*3的检测对象位点的区域互补的扩增产物。
本发明的扩增产物的制备方法还可以包括检测通过上述扩增反应而得的上述扩增产物的步骤。通过该步骤,能够检测扩增产物的有无、CYP2C9基因的上述目的区域的基因型(多态性CYP2C9*3)。扩增产物的有无可以按照目前已知的方法来确认。具体来说,在上述(I)工序中,在上述反应液中预先添加作为能够与上述目的区域的检测对象序列互补的序列的荧光标记探针,进而,可以通过(II)工序,即对于上述反应液测定上述探针的荧光标记的荧光强度来确认。而且,下文将CYP2C9基因中的CYP2C9*3的检测作为本发明的一个方式来进行说明。
<CYP2C9基因的多态性分析方法>
本发明的CYP2C9基因的多态性分析方法,其特征在于,其是分析CYP2C9基因中的检测对象位点的多态性(CYP2C9*3)的方法,含有以下步骤(i)~(iv)。
(i)通过本发明的扩增产物的制备方法,在反应液中扩增CYP2C9基因中含有检测对象位点的区域的步骤
(ii)准备含有上述步骤(i)中的扩增产物和能够与上述检测对象位点杂交的探针的反应液的步骤
(iii)改变上述反应液的温度,测定上述扩增产物和上述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤
(iv)根据伴随温度变化的上述信号值的变动,确定上述检测对象位点的多态性的步骤
这样,通过使用本发明的引物对来制备扩增产物,如上所述,能够扩增CYP2C9基因中的含有多态性CYP2C9*3的检测对象位点的目的区域。
上述步骤(ii)中的探针没有特别的限定,可以列举例如与含有多态性CYP2C9*3的发生位点的检测对象序列互补的探针(以下也称为“CYP2C9*3用探针”)。该探针优选为与含有上述检测对象位点的检测对象序列互补的探针。
用于检测上述多态性的探针,没有特别的限定,可以通过目前已知的方法设定。例如,可以将CYP2C9基因的正义链的序列作为含有多态性的检测对象位点的检测对象序列,基于此设计探针;或将反义链的序列作为含有多态性的检测对象位点的检测对象序列,基于此设计探针。而且,多态性的检测对象位点的碱基可以根据多态性的种类适当确定。即,CYP2C9*3已知序列号1中第52521位的碱基有“A”和“C”的多态性,据此可以列举例如与第52521位为A的检测对象序列和第52521位为C的检测对象序列中的任一条序列互补的探针(正义链的检测用探针)、与其反义链的序列互补的探针(反义链的检测用探针)。这样,不论在设计探针时将发生多态性的检测对象位点的碱基设定为上述那样的哪一种碱基,都可以通过后述的方法判断CYP2C9基因的检测对象位点呈现哪种多态性。
上述探针可以在上述步骤(i)后,即对CYP2C9基因的目的区域进行扩增反应后,添加到扩增反应液中,但为了容易且迅速地进行分析,优选在上述步骤(i)的扩增反应前预先添加到反应液中。
上述反应液中探针的添加比例并无特别限定,例如优选按照探针达到10~400nmol/L的范围的方式进行添加,更优选为20~200nmol/L。另外,使用荧光染料作为探针的标记时,例如为了调整所检测的荧光强度,可以同时使用与标记探针序列相同的未标记探针,该未标记探针可以在其3′末端添加有磷酸。此时,标记探针与未标记探针的摩尔比例如优选为1:10~10:1。上述探针的长度并无特别限定,例如为5~50mer、优选为10~30mer。
对于Tm值进行说明。当持续加热含有双链DNA的溶液时,260nm的吸光度上升。这是由于双链DNA双链间的氢键通过加热而打开,解离成单链DNA(DNA的融解)。而且,当全部双链DNA解离、变为单链DNA时,其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA时的吸光度)的约1.5倍左右,由此可以判断融解结束。根据该现象,融解温度Tm一般定义为吸光度到达吸光度总上升量的50%时的温度。
在上述(iii)工序中,测定上述扩增产物与上述探针的杂交产物显示融解状态的信号,既可以是上述260nm的吸光度的测定,还可以是标记物的信号的测定。具体地说,优选如下:使用被标记物标记的标记探针作为上述探针,测定上述标记物的信号。上述标记探针例如可以举出单独显示信号、由于杂交而不显示信号的标记探针;或者单独不显示信号、由于杂交而显示信号的标记探针。为前者的探针时,在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时不显示信号,通过加热而使探针游离时,则显示信号。另外,为后者的探针时,在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时显示信号,通过加热而使探针游离时,则信号减少(消失)。因此,通过利用信号特有的条件(吸收波长等)检测该标记所产生的信号,可以与上述260nm的吸光度测定同样,在融解进行的同时确定Tm值等。
上述标记探针的标记物的具体例子,例如可以举出荧光染料(荧光团)。上述标记探针的具体例子例如优选用荧光染料进行标记、单独显示荧光、且由于杂交荧光减少(例如猝灭)的探针。这种利用荧光猝灭现象(Quenching phenomenon)的探针中,特别优选将寡核苷酸设计成3’末端或5’末端为C、且当其末端的C与G靠近时发光减弱的被荧光染料标记的探针。这种探针一般被称作鸟嘌呤猝灭探针,已知有所谓的QProbe(注册商标)。使用这种探针时,利用信号的变动能够容易地确认杂交和解离。
上述荧光染料并无特别限定,例如可以举出荧光染料、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等,作为市售的荧光染料例如可以举出BODIPY FL(商标、manufactured by Molecular ProbeInc.社制)、FluorePrime(商品名、Amersham Pharmacia制)、Fluoredite(商品名、Milipore社制)、FAM(ABI社制)、Cy3和Cy5(Amersham Pharmacia制)、TAMRA(manufactured byMolecular Probe Inc.社制)等。检测条件没有特别限定,可以根据所用的荧光染料适当确定,例如太平洋蓝(Pacific Blue)的检测波长为450~480nm、TAMRA的检测波长为585~700nm、BODIPY FL的检测波长为515~555nm。
以下,列举用于检测CYP2C9*3的探针序列的具体例子,但本发明不限于此。下述探针是用于检测正义链的探针。
探针
与序列号1中的、以第52516位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1个碱基向着3’方向直至第17~22个碱基的区域互补的至少一段寡核苷酸,该寡核苷酸以上述鸟嘌呤碱基作为3’末端
在上述探针中,与序列号1的第52521位互补的碱基用k表示,上述k是G或T。
进而,上述探针的具体例子示于下表。而且,下表中“Tm(℃)”是下表的序列和与其完全互补的序列杂交时的Tm(℃),是用MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)、将参数设为寡核苷酸浓度0.2μM、钠当量(Na eq.)50mM而计算的值。
表3
探针 | 序列 | Tm(℃) | 序列号 |
5’-gtggggagaaggtcaaGgtatc-3’ | 55.7 | 25 | |
5’-tggggagaaggtcaaGgtatc-3’ | 54.4 | 26 | |
探针 | 5’-ggggagaaggtcaaGgtatc-3’ | 52.8 | 27 |
CYP2C9*3用 | 5’-gggagaaggtcaaGgtatc-3’ | 50.2 | 28 |
5’-ggagaaggtcaaGgtatc-3’ | 47.3 | 29 | |
5’-gagaaggtcaaGgtatc-3’ | 44.1 | 30 |
上表中探针含有与序列号1中第52521位为C的区域互补的序列,大写的碱基表示与序列号1第52521位的碱基互补的碱基。而且,在上述探针中,上述大写的碱基可以被k替代,上述k可以是G和T的任意一个。本发明中探针的具体例子,例如还可以是上述表中所示的寡核苷酸的互补链。
上述探针是一个例子,本发明不限于此。CYP2C9用探针优选上述探针中含有序列号28或序列号29的碱基序列的寡核苷酸。例如,将上表中所示的探针制成鸟嘌呤猝灭探针时,优选用上述那样的荧光染料(例如BODIPY FL、TAMRA等)标记3’末端的胞嘧啶。而且,对于5’末端标记了荧光染料的探针,例如为了防止探针自身伸长,可以在其3’末端上再添加磷酸基。
然后,列举一个例子来说明本发明的检测方法,上述例子为:使用下述探针来检测CYP2C9基因中的多态性CYP2C9*3。而且,本发明不限于此。
(探针)
CYP2C9*3用探针
5’-gggagaaggtcaaggtatc-(BODIPY FL)-3’(序列号28),或5’-ggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPY FL)-3’(序列号29)
首先,使用添加了上述标记探针的反应液,如上所述地进行PCR,扩增CYP2C9基因的上述目的区域。上述反应液含有例如本发明的CYP2C9基因扩增用引物对、DNA聚合酶、dNTP、含有作为模板的核酸的试样和上述探针。此外还可含有可以用于核酸扩增的各种添加剂。
接着,进行所得的扩增产物的解离、以及通过解离获得的单链DNA与上述标记探针的杂交。这可以通过例如改变上述反应液的温度来进行。
上述解离工序的加热温度只要是上述扩增产物能够解离的温度则无特别限定,例如为85~95℃。加热时间也无特别限定,通常为1秒~10分钟、优选1秒~5分钟。
解离的单链DNA和上述标记探针的杂交例如可以在上述解离工序后,通过降低上述解离工序的加热温度来进行。温度条件例如为40~50℃。
然后,改变上述反应液的温度,测定上述扩增产物与上述标记探针的杂交产物显示融解状态的信号值。具体地说,例如加热上述反应液(上述单链DNA与上述标记探针的杂交产物),测定随温度上升的信号值的变动。如上所述,当使用末端的C碱基被标记的探针(鸟嘌呤猝灭探针)时,在与单链DNA杂交的状态下,荧光减少(或者猝灭),在解离的状态下发出荧光。因此,例如可以慢慢加热荧光减少(或者猝灭)的杂交产物,测定随温度上升的荧光强度的增加。
测定荧光强度变动时的温度范围并无特别限定,例如开始温度为室温~85℃、优选为25~70℃,终止温度例如为40~105℃。另外,温度的上升速度并无特别限定,例如为0.1~20℃/秒、优选为0.3~5℃/秒。
接着,分析上述信号的变动来确定Tm值。具体地说,可以从所得荧光强度求得各温度下每单位时间的荧光强度变化量(-d荧光强度增加量/dt),将显示最低值的温度作为Tm值。另外,可以将每单位时间的荧光强度增加量(荧光强度增加量/t)最高的点作为Tm值。另外,不使用猝灭探针,而是使用单独不显示信号且由于杂交显示信号的探针作为标记探针时,相反地可以测定荧光强度的减少量。
然后,由该Tm值确定检测对象位点的基因型。Tm分析中,可以获得如下的结果:与有一个碱基不同的杂交体(错配)相比,完全互补的杂交体(匹配)其表示解离的Tm值增高。因此,通过对上述探针预先确定完全互补的杂交体的Tm值和有一个碱基不同的杂交体的Tm值,能够确定前述检测对象位点的基因型。例如,在将检测对象位点的碱基假设为突变型(例如假定序列号1的第52521位碱基为C)、使用与含有其的检测对象序列互补的探针时,所形成的杂交体的Tm值若与完全互补的杂交体的Tm值相同,则可判定上述扩增产物的多态性为突变型。另外,所形成的杂交体的Tm值若与有一个碱基不同的杂交体的Tm值相同(低于完全互补的杂交体的Tm值),则可判定上述扩增产物的多态性为野生型(例如序列号1的第52521位的碱基为A)。而且,当检测到两种Tm值时,可以判断为杂合子。如此,由与标记探针相应的Tm值,可以判断CYP2C9*3的基因型。
另外,本发明中,还可以测定杂交时的信号变动来代替如上所述的升高含有上述探针的反应液的温度(加热杂交产物)、测定伴随温度上升的信号变动的方法。即,也可以在降低含有上述探针的反应液的温度以形成杂交产物时,测定伴随上述温度降低的信号变动。
作为具体例,当使用单独显示信号、且由于杂交而不显示信号的标记探针(例如鸟嘌呤猝灭探针)时,在单链DNA和探针解离的状态下发出荧光,但由于温度降低而形成杂交体时,上述荧光减少(或者猝灭)。因此,例如可以慢慢降低上述反应液的温度,测定伴随温度降低的荧光强度的减少。另外,使用单独不显示信号、且由于杂交而显示信号的标记探针时,在单链DNA和探针解离的状态下不发出荧光,但由于温度降低而形成杂交体时,则发出荧光。因此,例如可以慢慢降低上述反应液的温度,测定伴随温度降低的荧光强度的增加。
下面,对本发明的实施例进行说明。但是,本发明不受下述实施例限制。
实施例1
对9名待测者用肝素锂采血管进行采血(试样1~9)。将10μL获得的血液与90μL蒸馏水混合,再将10μL该混合液与90μL蒸馏水混合。将10μL该混合液添加到40μL的下述组成的PCR反应液中,用热循环仪进行PCR。PCR的条件为95℃处理60秒后,以95℃下1秒和52℃下10秒作为1个循环,重复50个循环,再于95℃处理1秒、40℃处理60秒。接着,将温度的上升速度设为1℃/3秒,将上述PCR反应液由40℃加热到95℃,测定随着时间的荧光强度的变化。检测波长为515~555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)。而且,50个循环的PCR所需要的时间约为1个小时。
表4
*商品名Gene Taq FP:Nippongene公司制
(探针)
CYP2C9*3用探针
5’-gggagaaggtcaaggtatc-(BODIPY FL)-3’(序列号28)
(引物对)
CYP2C9*3 F1引物
5’-gagcccctgcatgcaa-3’(序列号4)
CYP2C9*3 R1引物
5’-gatactatgaatttggggacttcgaa-3’(序列号17)
与CYP2C9*3用探针匹配的杂交体的Tm值为59℃,错配的杂交体的Tm值为54℃。
试样1~9的结果示于图1和2。这些图是表示伴随温度上升的荧光强度的变化的Tm分析的图,纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”,横轴表示温度(以下相同)。如这些图所示,根据信号的峰确定各试样中的CYP2C9*3的基因型。为了支持这些实施例的结果,对9名待测者通过RFLP法确认CYP2C9*3的基因型,获得了与实施例相同的结果。这样,通过使用本发明的引物对,可以使用未实施预处理的全血试样,特异且高效地扩增CYP2C9基因中含有CYP2C9*3的检测对象位点的目的区域,并且分析多态性。
实施例2
对2名待测者用EDTA采血管进行采血(试样1~2)。将10μL获得的血液与70μL下述稀释液A混合,再将10μL该混合液与70μL下述稀释液B混合。将10μL所得的混合液于95℃加热处理5分钟后,再添加到46μL下述组成的PCR反应液中,用热循环仪进行PCR。PCR的条件为95℃处理60秒后,以95℃下1秒和58℃下15秒作为1个循环,重复50个循环,再于95℃处理1秒、40℃处理60秒。接着,将温度的上升速度设为1℃/3秒,将上述PCR反应液由40℃加热到75℃,测定随着时间的荧光强度的变化。检测波长为515~555nm(荧光染料BODIPYFL的检测)。
(稀释液A)
10mM Tris-HCl(pH8),0.1mM EDTA,0.05%NaN3,0.3%SDS
(稀释液B)
10mM Tris-HCl(pH8),0.1mM EDTA,0.05% NaN3
表5
*商品名Gene Taq FP:Nippongene公司制
(探针)
CYP2C9*3用探针
5’-ggagaaggtcaaggtatc-(BODIPY FL)-3’(序列号29)
(引物对)
CYP2C9*3 F1引物
5’-cggagcccctgcatgcaa-3’(序列号2)
CYP2C9*3 R1引物
5’-aatgatactatgaatttggggacttcgaa-3’(序列号14)
与CYP2C9*3用探针匹配的杂交体的Tm值为56℃,错配的杂交体的Tm值为50℃。
试样1~2的结果示于图3。该图是表示伴随温度上升的荧光强度的变化的Tm分析的图,纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”,横轴表示温度。如该图所示,根据信号的峰确定上述试样中的CYP2C9*3的基因型。为了支持该实施例的结果,对2名待测者通过RFLP法确认CYP2C9*3的基因型,获得了与实施例相同的结果。这样,通过使用本发明的引物对,可以使用未实施预处理的全血试样特异且高效地扩增CYP2C9基因中含有CYP2C9*3的检测对象位点的目的区域,并且分析多态性。
工业上利用的可能性
如上所述,通过本发明的引物对,能够特异且高效地扩增CYP2C9基因中含有多态性CYP2C9*3发生位点的区域。因此,与上述的以往的方法不同,能地减少麻烦和成本。而且,由于这样特异性扩增出含有多态性的检测对象位点的区域,通过使用例如与含有上述检测对象位点的检测对象序列互补的探针,则可以使用上述反应液直接进行Tm分析,能对上述多态性进行分型。而且,由于能在一个反应液中扩增和分型,因此能使操作自动化。再者,使用本发明的引物对,即使是例如含有杂质的试样(例如全血或口腔粘膜等),也可以省略预处理,因此能够更迅速且更简便地进行扩增反应。而且,使用本发明的引物对,则能够以比以往更优异的扩增效率进行扩增反应,因此能够缩短扩增反应。因此,通过本发明的引物对和含有其的试剂、以及使用它们的扩增产物的制备方法,能够快速且简便地分析CYP2C9基因的多态性,因此可以认为在医疗领域中极为有效。
序列表
<110>爱科来株式会社(ARKRAY,Inc.)
<120>CYP2C9基因扩增用引物对、含有其的CYP2C9基因扩增用试剂及其用途
<130>TF07040-01
<150>JP2006-322959
<151>2006-11-30
<160>30
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>60723
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>2
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>3
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>4
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>5
<210>6
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>6
<210>7
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>7
<210>8
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>8
<210>9
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>9
<210>10
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>10
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>11
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>12
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>13
<210>14
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>14
<210>15
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>15
<210>16
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>16
<210>17
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>17
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>18
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>19
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>20
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>21
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>22
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>23
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>24
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>25
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>26
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>27
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>28
<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>29
<210>30
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>30
Claims (18)
1.一种CYP2C9基因扩增用引物对,其特征在于,其为用于通过基因扩增法扩增CYP2C9基因的引物对,含有以下引物对(1):
引物对(1):
包括含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对,
(F1):与序列号1的碱基序列中的、以第52466位的腺嘌呤碱基(A)作为第1个碱基向着5’方向直至第14~18个碱基的区域序列相同的至少一段寡核苷酸,该寡核苷酸以上述腺嘌呤碱基(A)作为3’末端,
(R1):与序列号1的碱基序列中的、以第52631位的胸腺嘧啶碱基(T)作为第1个碱基向着3’方向直至第19~36个碱基的区域互补的至少一段寡核苷酸,该寡核苷酸以与上述第52631位的胸腺嘧啶碱基(T)互补的腺嘌呤碱基(A)作为3’末端。
2.根据权利要求1所述的CYP2C9基因扩增用引物对,上述(1)的引物对为下述(1’)的引物对:
引物对(1’):
包括含有下述(F1’)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1’)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对,
(F1’)含有序列号2的碱基序列的寡核苷酸或含有序列号4的碱基序列的寡核苷酸,
(R1’)含有序列号14的碱基序列的寡核苷酸或含有序列号17的碱基序列的寡核苷酸。
3.根据权利要求1所述的CYP2C9基因扩增用引物对,所述CYP2C9基因扩增用引物对是用于扩增生物试样中的CYP2C9基因的引物对。
4.根据权利要求3所述的CYP2C9基因扩增用引物对,所述生物试样是全血。
5.一种CYP2C9基因扩增用试剂,其特征在于,其为用于通过基因扩增法扩增CYP2C9基因的试剂,含有权利要求1所述的CYP2C9基因扩增用引物对。
6.根据权利要求5所述的CYP2C9基因扩增用试剂,其还含有能够与CYP2C9基因的检测对象位点杂交的探针。
7.根据权利要求6所述的CYP2C9基因扩增用试剂,所述探针是含有下述(P1’)所示的寡核苷酸的探针:
(P1’)含有序列号28的碱基序列的寡核苷酸和含有序列号29的碱基序列的寡核苷酸中的至少一个寡核苷酸。
8.根据权利要求6所述的CYP2C9基因扩增用试剂,所述探针是荧光标记探针。
9.一种扩增产物的制备方法,其特征在于,其为通过基因扩增法制备CYP2C9基因的扩增产物的方法,含有下述步骤
(I):
(I)以试样中的核酸作为模板,使用权利要求1所述的CYP2C9基因扩增用引物对,在反应液中扩增所述CYP2C9基因的步骤。
10.根据权利要求9所述的扩增产物的制备方法,其在所述步骤(I)中,还向所述反应液中添加能够与CYP2C9基因的检测对象位点杂交的探针。
11.根据权利要求10所述的扩增产物的制备方法,所述探针是含有下述(P1’)所示的寡核苷酸的探针:
(P1’)含有序列号28的碱基序列的寡核苷酸和含有序列号29的碱基序列的寡核苷酸中的至少一个寡核苷酸。
12.根据权利要求10所述的扩增产物的制备方法,所述探针是荧光标记探针。
13.根据权利要求12所述的扩增产物的制备方法,其还含有下述步骤(II):
(II)对于所述反应液,测定所述荧光标记探针的荧光标记的荧光强度的步骤。
14.根据权利要求9所述的扩增产物的制备方法,所述试样是生物试样。
15.根据权利要求14所述的扩增产物的制备方法,所述生物试样是全血。
16.根据权利要求15所述的扩增产物的制备方法,所述反应液中全血试样的添加比例为0.1~0.5体积%。
17.一种多态性分析方法,其特征在于,其为分析CYP2C9基因中的检测对象位点的多态性的方法,包括以下步骤(i)~(iv):
(i)通过权利要求9所述的扩增产物的制备方法,在反应液中扩增CYP2C9基因中含有检测对象位点的区域的步骤;
(ii)准备含有所述步骤(i)中的扩增产物和能够与所述检测对象位点杂交的探针的反应液的步骤;
(iii)改变所述反应液的温度,测定所述扩增产物和所述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤;
(iv)根据伴随温度变化的所述信号值的变动,确定所述检测对象位点的多态性的步骤。
18.根据权利要求17所述的多态性分析方法,在所述步骤(i)中,在扩增反应前向所述反应液中添加能够与所述检测对象位点杂交的探针。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP322959/2006 | 2006-11-30 | ||
JP2006322959 | 2006-11-30 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101443448A true CN101443448A (zh) | 2009-05-27 |
Family
ID=39467949
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2007800170481A Pending CN101443448A (zh) | 2006-11-30 | 2007-11-30 | Cyp2c9基因扩增用引物对、含有其的cyp2c9基因扩增用试剂及其用途 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090208956A1 (zh) |
EP (1) | EP2055775A4 (zh) |
JP (1) | JPWO2008066163A1 (zh) |
KR (1) | KR20080107392A (zh) |
CN (1) | CN101443448A (zh) |
WO (1) | WO2008066163A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108998512A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-12-14 | 上海芯超生物科技有限公司 | 免提取的用于cyp2c19基因多态性检测的试剂盒及检测方法 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2009081967A1 (ja) * | 2007-12-26 | 2011-05-06 | アークレイ株式会社 | 標的核酸配列の増幅方法およびそれに用いるプローブ |
WO2010001969A1 (ja) * | 2008-07-02 | 2010-01-07 | アークレイ株式会社 | 標的核酸配列の増幅方法、それを用いた変異の検出方法、および、それに用いる試薬 |
US9284603B2 (en) | 2010-01-21 | 2016-03-15 | Arkray, Inc. | Target sequence amplification method, polymorphism detection method, and reagents for use in the methods |
US8758997B2 (en) | 2010-06-01 | 2014-06-24 | Arkray, Inc. | Method for detecting polymorphism at nucleotide position-1639 of VKORC1 gene, and nucleic acid probe and kit therefor |
TWI600766B (zh) | 2012-08-09 | 2017-10-01 | 財團法人工業技術研究院 | 用於偵測一目標核苷酸序列中之一特定區域的一突變及/或多形性的套組 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4889818A (en) | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
US5079352A (en) | 1986-08-22 | 1992-01-07 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
SG46627A1 (en) | 1989-12-22 | 1998-02-20 | Hoffmann La Roche | Recombinant expression vectors and purification methods for thermus thermophilus dna polymerase |
US5322785A (en) | 1990-04-26 | 1994-06-21 | New England Biolabs, Inc. | Purified thermostable DNA polymerase obtainable from thermococcus litoralis |
WO1992009689A1 (en) | 1990-12-03 | 1992-06-11 | Stratagene | PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS) |
GB0021286D0 (en) * | 2000-08-30 | 2000-10-18 | Gemini Genomics Ab | Identification of drug metabolic capacity |
JP4454265B2 (ja) * | 2003-08-13 | 2010-04-21 | アークレイ株式会社 | 融解曲線解析法 |
JP4437206B2 (ja) * | 2004-01-20 | 2010-03-24 | アークレイ株式会社 | Cyp2c9の変異の検出法ならびにそのための核酸プローブおよびキット |
JP4437207B2 (ja) * | 2004-01-21 | 2010-03-24 | アークレイ株式会社 | Cyp2d6の変異の検出法ならびにそのための核酸プローブおよびキット |
EP1781812A4 (en) * | 2004-06-30 | 2008-10-15 | Tm Bioscience Pgx Inc | PROCEDURE FOR DETECTING MUTATIONS IN GENERATING CYTOCHROM P450-2C9 GEN |
US7914990B2 (en) * | 2005-01-13 | 2011-03-29 | Progenika Biopharma, S.A. | Methods and products for in vitro genotyping |
-
2007
- 2007-11-30 KR KR1020087020756A patent/KR20080107392A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-11-30 JP JP2008517254A patent/JPWO2008066163A1/ja active Pending
- 2007-11-30 EP EP07832871A patent/EP2055775A4/en not_active Withdrawn
- 2007-11-30 CN CNA2007800170481A patent/CN101443448A/zh active Pending
- 2007-11-30 WO PCT/JP2007/073206 patent/WO2008066163A1/ja active Application Filing
- 2007-11-30 US US12/307,516 patent/US20090208956A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108998512A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-12-14 | 上海芯超生物科技有限公司 | 免提取的用于cyp2c19基因多态性检测的试剂盒及检测方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2008066163A1 (fr) | 2008-06-05 |
KR20080107392A (ko) | 2008-12-10 |
EP2055775A4 (en) | 2011-04-13 |
JPWO2008066163A1 (ja) | 2010-03-11 |
EP2055775A1 (en) | 2009-05-06 |
US20090208956A1 (en) | 2009-08-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102168141B (zh) | Ugt1a1基因扩增用引物对、含有其的ugt1a1基因扩增用试剂及其用途 | |
CN102076850B (zh) | 靶核酸序列的扩增方法、使用该方法的突变检测方法、以及用于该方法的试剂 | |
CN101646786A (zh) | 目标核酸序列的扩增方法和用于该方法的探针 | |
CN101568646B (zh) | 基因扩增用引物对、含有其的基因扩增用试剂及其用途 | |
CN102277424A (zh) | Cyp2c19基因扩增用引物对、含有其的cyp2c19基因扩增用试剂及其用途 | |
CN101443448A (zh) | Cyp2c9基因扩增用引物对、含有其的cyp2c9基因扩增用试剂及其用途 | |
CN101501223A (zh) | Cyp2c19基因扩增用引物对、含有其的cyp2c19基因扩增用试剂及其用途 | |
CN102666852A (zh) | Mthfr基因扩增用引物对、含有其的mthfr基因扩增用试剂及其用途 | |
CN102471771B (zh) | 靶序列的扩增方法、多态性检测方法以及其中使用的试剂 | |
CN102199662B (zh) | Sult1a1基因扩增用引物对,含有其的sult1a1基因扩增用试剂及其用途 | |
CN102154272B (zh) | 肥胖基因扩增用引物对、含有其的肥胖基因扩增用试剂及其用途 | |
KR101110425B1 (ko) | Nat2 유전자 증폭용 프라이머 셋트, 그것을 포함하는 nat2 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 | |
CN101448936A (zh) | Sult1a1基因扩增用引物对,含有其的sult1a1基因扩增用试剂及其用途 | |
CN101490255A (zh) | Nat2基因扩增用引物对、含有其的nat2基因扩增用试剂及其用途 | |
CN101517080A (zh) | 肥胖基因扩增用引物对、含有其的肥胖基因扩增用试剂及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090527 |