KR20080107392A - Cyp2c9 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는cyp2c9 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
유전자 증폭법에 의해, CYP2C9 유전자에 있어서의 CYP2C9*3의 검출 목적 부위를 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머 세트로서, 상기 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다. 서열 번호 4의 염기 서열로 이루어지는 정방향 프라이머(forward primer)와, 서열 번호 17의 염기 서열로 이루어지는 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 한 쌍의 프라이머 세트를 사용한다. 이 프라이머 세트를 사용함으로써, CYP2C9 유전자의 다형 CYP2C9*3을 발생시키는 부분을 포함하는 목적 영역을, 특이적이고 또한 고효율로 증폭할 수 있다.
Description
본 발명은 CYP2C9 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트, 그것을 포함하는 CYP2C9 유전자 증폭용 시약 및 그 용도에 관한 것이다.
시토크롬 P450은 수퍼 패밀리로 분류되는 효소군으로서, 많은 서브 패밀리(예컨대, CYP1A, CYP1B, CYP2C, CYP2D, CYP2E, CYP3A 등)가 존재한다. 그 중에서도, 인간 CYP2C 서브 패밀리의 아이소자임(isozyme)인 CYP2C9를 코드하는 유전자(CYP2C9 유전자)의 변이는, CYP2C9의 기질 약물인 페니토인(항간질제)이나 와파린(warfarin)(항응고약)의 체내 동태나 효과에 영향을 주는 것이 밝혀져 있다. CYP2C9 유전자의 다형인 CYP2C9*3은, 아미노산 359위(엑손 7)의 이소루신이 루신으로 변화한 변이로서 알려져 있다(비특허 문헌 1). 그리고, 이 CYP2C9*3이 존재하는 아미노산 359위는, 기질 약물의 인식 부위이며, 그 아미노산이 변화하여 입체 구조(β-스트랜드)가 변화함으로써, 약제 대사에 관여하는 효소의 기능에 영향을 미치고 있다. 따라서, CYP2C9 유전자에 대해서 다형 CYP2C9*3을 조사하는 것은, 약제 에 의한 부작용을 예측하여, 보다 좋은 효과를 나타내는 약제의 투여 조건을 결정하기 위해서 매우 중요하다.
한편, 모든 질환의 원인이나, 개체 간의 질환 이환(罹患) 용이성(질환의 걸리기 쉬움), 개체 간에 있어서의 약효의 차이 등을 유전자 레벨로 해석하는 방법으로서, 점돌연변이, 소위 일염기다형(SNP)의 검출이 널리 행해지고 있다. 점돌연변이의 일반적인 검출 방법으로서는, (1) 시료의 표적 DNA에 대해서, 검출 대상 서열에 상당하는 영역을 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의해 증폭시키고, 그 전체 유전자 서열을 해석하는 직접 시퀀싱(Direct Sequencing)법, (2) 시료의 표적 DNA에 대해서, 검출 대상 서열에 상당하는 영역을 PCR에 의해 증폭시키고, 상기 검출 대상 서열에 있어서의 목적의 변이의 유무에 의해 절단 작용이 다른 제한 효소에 의해서 그 증폭 산물을 절단하여, 전기영동을 행함으로써 타이핑을 행하는 RFLP 해석, (3) 3' 말단 영역에 목적의 변이가 위치하는 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고, 증폭의 유무에 의해 변이를 판단하는 ASP-PCR법 등을 들 수 있다.
그러나, 이러한 방법들은, 예컨대, 시료로부터 추출한 DNA의 정제, 전기영동, 제한 효소 처리 등이 필수이기 때문에, 시간이나 비용이 든다. 또한, PCR을 행한 후, 반응 용기를 일단 개봉할 필요가 있기 때문에, 상기 증폭 산물이 다음 반응계에 혼입되어, 해석 정밀도가 저하될 우려가 있다. 또한, 자동화가 곤란하기 때문에, 대량의 샘플을 해석할 수 없다. 또한, 상기 (3)의 ASP-PCR법에 대해서는, 특이성이 낮다고 하는 문제도 있다.
이러한 문제로부터, 최근, 점돌연변이의 검출 방법으로서, 표적 핵산과 프로 브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해 온도(Tm: melting temperature)를 해석하는 방법이 실용화되어 있다. 이러한 방법은, 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해 곡선 해석이라고 불리고 있다. 이것은 이하와 같은 방법이다. 즉, 우선, 검출 목적의 점돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 점돌연변이의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 점돌연변이를 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정한다. 상기 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 점돌연변이가 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 점돌연변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다. 그리고, 이 방법에 따르면, 유전자 해석의 자동화도 가능하다.
그러나, 이러한 Tm 해석을 이용한 검출 방법에 대해서도, PCR에 있어서, 검출 목적 부위를 포함하는 영역을 특이적이고 또한 효율적으로 증폭할 수 없으면 안된다고 하는 문제가 있다. 특히, CYP에는 많은 아이소자임이 존재하며, 이들을 코드하는 서열도 매우 유사하기 때문에, PCR에 있어서, CYP2C9 이외의 아이소자임의 코드 유전자까지도 증폭될 우려가 있다. 또한, 이와 같이 다른 아이소자임의 코드 유전자까지도 증폭된 경우에는, 예컨대, 해석 결과의 신뢰성을 저하시키는 원인이 된다. 그리고, 이와 같이, 하나의 샘플을 해석하는 데에도 많은 노력이 들기 때문에, 대량의 샘플을 해석하는 것은 실용적이지 않다고 하는 문제도 있다.
비특허 문헌 1: PMID: 8873220 Pharmacogenetics. 1996 Aug; 6(4): 341-9.
[발명의 개시]
따라서, 본 발명은 유전자 증폭법에 의해 CYP2C9 유전자의 목적 영역을 특이적으로 효율 좋게 증폭할 수 있는 프라이머 세트의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 프라이머 세트는, 유전자 증폭법에 의해 CYP2C9 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트로서, 하기 프라이머 세트 (1)을 포함하는 것을 특징으로 한다:
프라이머 세트 (1)
하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 정방향 프라이머(forward primer) 및 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 한 쌍의 프라이머 세트:
(F1) 서열 번호 1의 염기 서열에 있어서의 52466번째의 아데닌 염기(A)를 1째 염기로 하여 5' 방향을 향해서 14∼18째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 아데닌 염기(A)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드,
(R1) 서열 번호 1의 염기 서열에 있어서의 52631번째의 티민 염기(T)를 1째 염기로 하여 3' 방향을 향해서 19∼36째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 52631번째의 티민 염기(T)에 상보적인 아데닌 염기(A)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
또한, 본 발명의 유전자 증폭용 시약은, 유전자 증폭법에 의해 CYP2C9 유전자를 증폭하기 위한 시약으로서, 상기 본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법은, 유전자 증폭법에 의해 CYP2C9 유전자의 증폭 산물을 제조하는 방법으로서, 하기 (I) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(I) 시료 중의 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트를 이용하여, 반응액 중에서, 상기 CYP2C9 유전자의 증폭을 행하는 공정.
본 발명의 다형 해석 방법은, CYP2C9 유전자에 있어서의 검출 대상 부위의 다형을 해석하는 방법으로서, 하기 (i)∼(iv) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(i) 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의해, CYP2C9 유전자에 있어서의 검출 대상 부위를 포함하는 영역을 반응액 중에서 증폭시키는 공정,
(ii) 상기 (i) 공정에 있어서의 증폭 산물과, 상기 검출 대상 부위에 하이브리드화(hybridize) 가능한 프로브를 포함하는 반응액을 준비하는 공정,
(iii) 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 증폭 산물과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 공정,
(iv) 온도 변화에 따른 상기 시그널값의 변동으로부터, 상기 검출 대상 부위의 다형을 결정하는 공정.
본 발명의 프라이머 세트에 따르면, CYP2C9 유전자에 있어서의 검출 목적의 다형 CYP2C9*3이 발생하는 부위를 포함하는 목적 영역을, 반응액 중에서 특이적이고 또한 고효율로 증폭할 수 있다. 이 때문에, 전술한 바와 같은 종래법과는 달리 시간이나 비용을 저감하는 것이 가능해진다. 또한, 이와 같이 CYP2C9*3이 발생하는 검출 대상 부위를 포함하는 영역을 특이적으로 증폭할 수 있기 때문에, 예컨대, 또한, 검출 대상 부위를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용함으로써, 상기 반응액을 이용하여 그대로 Tm 해석을 행해서, 상기 다형을 타이핑하는 것이 가능해진다. 또한, 1개의 반응액으로, 상기 목적 영역의 증폭 및 다형의 타이핑이 가능하기 때문에, 조작의 자동화도 가능해진다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면, 예컨대, 협잡물이 포함되는 시료(예컨대, 전혈이나 구강 점막 등)여도, 전처리를 생략할 수 있기 때문에, 보다 신속하고 또한 간편하게 증폭 반응을 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면, 종래보다도 우수한 증폭 효율로 증폭 반응을 행할 수 있기 때문에, 증폭 반응도 단축화가 가능하다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트나 이것을 포함하는 시약, 및 이들을 이용한 증폭 산물의 제조 방법 및 다형 해석 방법에 따르면, CYP2C9 유전자의 다형을 신속하고 또한 간편하게 해석할 수 있기 때문에, 의료 분야에 있어서 매우 유효하다고 말할 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 본 발명의 실시예 1에 있어서의 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 상기 실시예 1에 있어서의 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 있어서의 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.
[발명의 실시를 위한 최적의 실시형태]
<CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트>
본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트는, 전술한 바와 같이, 상기 프라이머 세트 (1)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이 프라이머 세트 (1)에 따르면, 전술한 바와 같이, CYP2C9*3이 발생하는 검출 대상 부위를 포함하는 목적 영역을 특이적이고 또한 고효율로 증폭하는 것이 가능하다. 이 때문에, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 이 영역을 증폭하면, 종래보다도 효율적으로, CYP2C9 유전자 다형의 해석을 행할 수 있다. 또한, 이하, 정방향 프라이머를 F 프라이머, 역방향 프라이머를 R 프라이머라고 말하는 경우가 있다.
상기 프라이머 세트 (1)은, 전술한 바와 같이, 하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 정방향 프라이머 및 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 역방향 프라이머를 포함하는 한 쌍의 프라이머 세트이다:
(F1) 서열 번호 1의 염기 서열에 있어서의 52466번째의 아데닌 염기(A)를 1째 염기로 하여 5' 방향을 향해서 14∼18째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 아데닌 염기(A)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드,
(R1) 서열 번호 1의 염기 서열에 있어서의 52631번째의 티민 염기(T)를 1째 염기로 하여 3' 방향을 향해서 19∼36째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 52631번째의 티민 염기(T)에 상보적인 아데닌 염기(A)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
서열 번호 1에 나타내는 염기 서열은, 인간 시토크롬 P450 패밀리 2 서브 패밀리 C 폴리펩티드 9(CYP2C9)의 완전 길이 서열이며, 예컨대, NCBI 수탁 번호 AY702706으로 등록되어 있다.
상기 프라이머 세트 (1)은, 서열 번호 1에 있어서의 52467번째∼52630번째의 영역을 포함하는 DNA쇄 및 그 상보쇄(相補鎖)를 증폭시키기 위한 프라이머 세트이다. 이 영역 내의 52521번째의 염기(서열 번호 1에 있어서의 52521번째의 염기)는, CYP2C9의 기능에 영향을 주는 점돌연변이(52521A, 52521C)의 존재가 알려져 있으며, 이 다형이 전술한 CYP2C9*3이다. 52521번째의 염기가 A이면, CYP2C9 유전자가 단백질로 번역되었을 때, 아미노산 359위는 이소루신(Ile)이 되고, 52521번째의 염기가 C이면, 아미노산 359위는 루신(Leu)이 되는 다형을 나타낸다. 본 발명에 있어서, 이 부위의 다형은, 호모 접합체의 경우, 52521A/A, 52521C/C, 헤테로 접합체의 경우, 52521A/C로 나타낼 수 있다. 이하, 이 프라이머 세트 (1)을, 「CYP2C9*3용 프라이머 세트」라고도 말한다.
본 발명에 있어서, 프라이머 세트 (1)의 F1 프라이머 및 R1 프라이머는, DNA 폴리머라제에 의한 증폭의 개시점을 결정하는 역할을 수행하는 3' 말단의 염기가, 전술한 조건을 만족시키고 있으면 된다. 이와 같이 상기 프라이머의 3' 말단의 염기를 고정함으로써, 프라이머 세트 (1)이, 예컨대, 유사한 다른 아이소자임의 유전자(예컨대, CYP2C8, CYP2C17, CYP2C18, CYP2C19 유전자 등)에 결합하는 것을 충분히 방지할 수 있다.
이와 같이, F1 프라이머 및 R1 프라이머는, 그 3' 말단의 염기가 고정되어 있으면 되기 때문에, 상기 각 프라이머의 길이 자체는 특별히 제한되지 않으며, 일반적인 길이로 적절하게 조정할 수 있다. 프라이머의 길이의 일례로서는, 예컨대, 13∼50 mer의 범위이고, 바람직하게는 14∼45 mer이며, 보다 바람직하게는 15∼40 mer이다. 구체예로서, 상기 F1 프라이머는, 서열 번호 1의 염기 서열에 있어서의 52466번째의 아데닌 염기(A)를 1째 염기로 하여 5' 방향을 향해서 14∼18째 염기(바람직하게는, 14∼17째 염기, 보다 바람직하게는 15∼17째 염기)까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한, 상기 R1 프라이머는, 서열 번호 1의 염기 서열에 있어서의 52631번째의 티민 염기(T)를 1째 염기로 하여 3' 방향을 향해서 19∼36째 염기(바람직하게는, 22∼30째 염기, 보다 바람직하게는 23∼29째 염기)까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한, F1 프라이머와 R1 프라이머의 3' 말단이 고정되어 있기 때문에, 프라이머로부터 신장하는 영역은, 예컨대, 전술한 바와 같이 서열 번호 1에 있어서의 52467번째∼52630번째의 영역이지만, 얻어지는 증폭 산물의 전체의 길이는 사용하는 프라이머의 길이에 따라서 변화한다.
또한, R1 프라이머는, 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열에 대하여, F1 프라이머는, 상기 염기 서열의 상보쇄에 대하여, 각각 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드가 아니어도 좋다. 즉, 상기 각 프라이머에 있어서의 3' 말단의 염기를 제외하는 부분에 있어서, 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드와 1개∼5개의 염기가 달라도 좋다.
이하에, F1 프라이머와 R1 프라이머의 구체예를 나타내지만, 본 발명은, 이것에는 한정되지 않는다. 또한, 이들 F1 프라이머와 R1 프라이머와의 조합은 조금도 제한되지 않으나, 이들 중에서도, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 F1' 프라이머와 서열 번호 14 또는 서열 번호 17의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 R1' 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 (1')가 특히 바람직하다. 또한, 하기 표에 있어서의 「Tm(℃)」은, 하기 표의 서열과 완전히 상보적인 서열이 하이브리드화한 경우의 Tm(℃)이며, MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/)에 의해, 파라미터를 올리고뉴클레오티드 농도 0.2 μM, 나트륨 당량(Na eq.) 50 mM로 해서 산출한 값이다. 상기 Tm값은, 예컨대, 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/) 등에 의해 산출할 수 있고, 또한, 인접법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수도 있다(이하, 동일).
또한, 전술한 프라이머 세트 (1)의 각 프라이머는, 예컨대, 증폭 반응의 반응 온도를 올리기 위해서, 종래 공지의 임의의 서열을 5' 말단에 부가한 것이어도 좋다.
이러한 프라이머 세트 (1)을 포함하는 본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트는, 예컨대, 전혈 시료 등의 생체 시료에 있어서의 CYP2C9 유전자를 증폭시킬 때에 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트를, 후술하는 바와 같은 다형의 검출용 프로브와 함께 사용할 때에는, 유전자 증폭용 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 0.1∼0.5 체적%로 하는 것이 바람직하다. 이 점에 대해서는 후술한다.
<CYP2C9 유전자 증폭용 시약>
본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 시약은, 전술한 바와 같이, 유전자 증폭법에 의해 CYP2C9 유전자를 증폭하기 위한 시약으로서, 본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 시약은, 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 것이 특징이며, 이 이외의 조성 등에 대해서는 조금도 제한되지 않는다.
본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 시약은, 예컨대, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 유전자 증폭법에 의해 얻어지는 증폭 산물을 검출하기 위해서, 프로브를 더 포함해도 좋다. 전술한 바와 같이 본 발명의 프라이머 세트에 따르면, 유전자 증폭법에 의해, CYP2C9*3이 발생하는 검출 대상 부위를 포함하는 목적 영역의 증폭 산물이 얻어진다. 이 때문에, 상기 목적 영역에 있어서의 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 공존시킴으로써, 예컨대, 증폭의 유무나 검출 대상 부위의 유전자형(다형) 등을, 후술하는 방법에 의해 검출하는 것이 가능하다. 이러한 프로브나 그 이용 방법에 대해서는, 이후의 다형의 해석 방법에 있어서 설명한다. 또한, 본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 시약은, 전혈 등의 생체 시료에 있어서의 CYP2C9 유전자를 증폭시킬 때에 사용하는 것이 바람직하고, 특히, 본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 시약을, 전술한 바와 같은 프로브와 함께 사용할 때에는, 유전자 증폭용 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 0.1∼0.5 체적%로 하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, 「검출 대상 서열」이란, 다형이 발생하는 부위(검출 대상 부위)를 포함하는 서열을 의미한다.
본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 시약의 형태는, 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트를 함유하는 액체 시약이어도 좋고, 사용 전에 용매로 현탁하는 건조 시약이어도 좋다. 또한, CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트의 함유량도 특별히 제한되지 않는다.
<증폭 산물의 제조 방법>
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법은, 전술한 바와 같이, 유전자 증폭법에 의해 CYP2C9 유전자의 증폭 산물을 제조하는 방법으로서, 하기 (I) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(I) 시료 중의 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트를 이용하여, 반응액 중에서, 상기 CYP2C9 유전자의 증폭을 행하는 공정.
이와 같이 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 행함으로써, 전술한 바와 같이 CYP2C9 유전자에 있어서의 다형 CYP2C9*3의 검출 대상 부위를 포함하는 목적 영역을 특이적으로 고효율로 증폭시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 있어서는, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하는 것이 특징이며, 유전자 증폭법의 종류나 조건 등은 조금도 제한되지 않는다.
상기 유전자 증폭법으로서는, 전술한 바와 같이 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)법, TMA(Transcription-Mediated Amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법 등을 들 수 있으나, PCR법이 바람직하다. 또한, 이하, PCR법을 예로 들어 본 발명을 설명하지만, 이것에는 제한되지 않는다.
본 발명을 적용하는 시료로서는, 예컨대, 주형이 되는 핵산 서열을 포함하고 있으면 되고, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 협잡물이 포함되는 시료에 적용하는 것이 바람직하다. 상기 협잡물이 포함되는 시료로서는, 예컨대, 전혈, 구강 내 세포(예컨대, 구강 점막), 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식세포, 객담(喀痰), 양수, 파라핀 포매 조직, 뇨, 위액(예컨대, 위 세정액) 등이나, 이들의 현탁액 등을 들 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물의 제조 방법에 따르면, 예컨대, 여러 가지 협잡물이 포함되는 시료(특히, 전혈이나 구강 내 세포 등의 생체 시료)여도, 그 영향을 받기 어려워, CYP2C9 유전자의 상기 영역을 특이적으로 증폭할 수 있다. 이 때문에, 본 발명에 따르면, 종래법에서는 곤란하였던 전혈 등의 협잡물이 많은 시료여도, 예컨대, 정제 등의 전처리를 행하지 않고서, 그대로 사용하는 것이 가능하다. 따라서, 시료의 전처리의 관점에서도, 종래법보다 더욱 신속하게 증폭 산물을 조제하는 것이 가능하다고 말할 수 있다.
상기 반응액에 있어서의 시료의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않는다. 구체예로서, 상기 시료가 생체 시료(예컨대, 전혈 시료)인 경우, 상기 반응액에 있어서의 첨가 비율의 하한이, 예컨대, 0.01 체적% 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05 체적% 이상, 더욱 바람직하게는 0.1 체적% 이상이다. 또한, 상기 첨가 비율의 상한도, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 2 체적% 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1 체적% 이하, 더욱 바람직하게는 0.5 체적% 이하이다.
또한, 후술하는 바와 같은 광학적 검출을 목적으로 하는 경우, 특히, 표식화 프로브를 이용한 광학적 검출을 행하는 경우, 전혈 시료와 같은 생체 시료의 첨가 비율은, 예컨대, 0.1∼0.5 체적%로 설정하는 것이 바람직하다. PCR 반응에 있어서는, 통상, DNA 변성(단일쇄 DNA로의 해리)을 위해서 열처리가 실시되지만, 이 열처리에 의해 시료에 포함되는 당이나 단백질 등이 변성하여, 불용화의 침전물이나 혼탁 등이 발생할 우려가 있다. 이 때문에, 증폭 산물의 유무나 검출 대상 부위의 유전자형(다형)을 광학적 기법에 의해 확인하는 경우, 이러한 침전물이나 혼탁의 발생이 측정 정밀도에 영향을 미칠 가능성이 있다. 그러나, 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 전술한 범위로 설정하면, 메커니즘은 불분명하지만, 예컨대, 변성에 의한 침전물 등의 발생을 충분히 방지할 수 있기 때문에, 광학적 기법에 의한 측정 정밀도를 향상시킬 수 있다. 또한, 전혈 시료 중의 협잡물에 의한 PCR의 저해도 충분히 억제되기 때문에, 증폭 효율을 보다 한층 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트의 사용에 더하여, 또한, 전혈 시료 등의 시료의 첨가 비율을 전술한 범위로 설정함으로써, 시료의 전처리의 필요성을 보다 한층 배제할 수 있다.
또한, 상기 반응액 중의 전혈 시료의 비율은, 전술한 바와 같은 체적 비율(예컨대, 0.1∼0.5 체적%)이 아니라, 헤모글로빈(이하, 「Hb」라고 말한다)의 중량 비율로 나타낼 수도 있다. 이 경우, 상기 반응액에 있어서의 전혈 시료의 비율은, Hb량으로 환산하여, 예컨대, 0.565∼113 g/L의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 2.825∼56.5 g/L의 범위, 더욱 바람직하게는 5.65∼28.25 μg/L의 범위이다. 또한, 상기 반응 중에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율은, 예컨대, 상기 체적 비율과 Hb 중량 비율의 양쪽을 만족시켜도 좋고, 어느 한 쪽을 만족시켜도 좋다.
전혈로서는, 예컨대, 용혈된 전혈, 미용혈의 전혈, 항응고 전혈, 응고 분획(fraction)을 포함하는 전혈 등의 어떠한 것이어도 좋다.
본 발명에 있어서, 시료에 포함되는 표적 핵산은, 예컨대, DNA이다. 상기 DNA는, 예컨대, 생체 시료 등의 시료에 원래 포함되는 DNA여도 좋고, 유전자 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물 DNA여도 좋다. 후자의 경우, 상기 시료에 원래 포함되어 있는 RNA(전체 RNA, mRNA 등)로부터 역전사 반응[예컨대, RT-PCR(Reverse Transcription PCR)에 의해 생성시킨 cDNA를 들 수 있다.
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 있어서, 유전자 증폭 반응의 개시에 앞서, 상기 반응액에 또한 알부민을 첨가하는 것이 바람직하다. 이러한 알부민의 첨가에 의해, 예컨대, 전술한 바와 같은 침전물이나 혼탁의 발생에 의한 영향을 보다 한층 저감시킬 수 있으며, 또한, 증폭 효율도 더욱 향상시킬 수 있다. 구체적으로는, 상기 (I) 공정의 증폭 반응이나, 단일쇄 DNA로의 해리 공정 전에, 알부민을 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 반응액에 있어서의 알부민의 첨가 비율은, 예컨대, 0.01∼2 중량%의 범위이고, 바람직하게는 0.1∼1 중량%이며, 보다 바람직하게는 0.2∼0.8 중량%이다. 상기 알부민으로서는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민, 래트 혈청 알부민, 말 혈청 알부민 등을 들 수 있으며, 이들은 어느 1 종류여도 좋고 2 종류 이상을 병용해도 좋다.
다음으로, 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 관해서, 전혈 시료에 대하여, DNA를 표적 핵산으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의해 CYP2C9 유전자의 상기 목적 영역의 증폭 산물을 제조하는 예를 들어서 설명한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 프라이머 세트를 사용하는 것이 특징이며, 다른 구성 및 조건은 조금도 제한되지 않는다.
우선, PCR 반응액을 조제한다. 본 발명의 프라이머 세트의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 프라이머 세트 (1)의 F 프라이머를, 0.1∼2 μmol/L가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.25∼1.5 μmol/L이며, 특히 바람직하게는 0.5∼1 μmol/L이다. 또한, 프라이머 세트 (1)의 R 프라이머를, 0.1∼2 μmol/L가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.25∼1.5 μmol/L이며, 특히 바람직하게는 0.5∼1 μmol/L이다. 프라이머 세트에 있어서의 F 프라이머와 R 프라이머의 첨가 비율(F:R, 몰비)은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 1:0.25∼1:4가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1:0.5∼1:2이다.
반응액에 있어서의 전혈 시료의 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 전술한 범위가 바람직하다. 전혈 시료는, 그대로 반응액에 첨가해도 좋고, 미리, 물이나 완충액 등의 용매로 희석하고 나서 반응액에 첨가해도 좋다. 전혈 시료를 미리 희석하는 경우, 그 희석률은 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 반응액에서의 최종적인 전혈 첨가 비율이 상기 범위가 되도록 설정할 수 있으나, 예컨대, 100∼2000배이고, 바람직하게는 200∼1000배이다.
상기 반응액에 있어서의 다른 조성 성분은, 특별히 제한되지 않으며, 종래 공지의 성분을 들 수 있고, 그 비율도 특별히 제한되지 않는다. 상기 조성 성분으로서는, 예컨대, DNA 폴리머라제, 뉴클레오티드(뉴클레오시드 삼인산(dNTP)) 및 용매를 들 수 있다. 또한, 전술한 바와 같이 상기 반응액은 또한 알부민을 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 반응액에 있어서, 각 조성 성분의 첨가 순서는 조금도 제한되지 않는다.
상기 DNA 폴리머라제로서는, 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 종래 공지의 내열성 세균 유래의 폴리머라제를 사용할 수 있다. 구체예로서는, 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래 DNA 폴리머라제(미국 특허 제4,889,818호 및 미국 특허 제5,079,352호)(상품명 Taq 폴리머라제), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) 유래 DNA 폴리머라제(WO 91/09950)(rTth DNA polymerase), 피로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 DNA 폴리머라제(WO 92/9688)(Pfu DNA polymerase: 스트라타진사 제조), 써모코커스 리토랠리스(Thermococcus litoralis) 유래 DNA 폴리머라제(EP-A 455 430)(상표 Vent: 바이오랩 뉴 잉글랜드사 제조) 등이 상업적으로 입수 가능하고, 그 중에서도, 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래의 내열성 DNA 폴리머라제가 바람직하다.
상기 반응액 중의 DNA 폴리머라제의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 1∼100 U/mL이고, 바람직하게는 5∼50 U/mL이며, 보다 바람직하게는 20∼30 U/mL이다. 또한, DNA 폴리머라제의 활성 단위(U)는, 일반적으로, 활성화 연어 정자 DNA를 주형 프라이머로 하고, 활성 측정용 반응액 중, 74℃에서, 30분 동안에 10 ㎚ol의 전체 뉴클레오티드를 산 불용성 침전물에 받아들이는 활성이 1 U이다. 상기 활성 측정용 반응액의 조성은, 예컨대, 25 mM TAPS 완충액(pH 9.3, 25℃), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM 머캅토에탄올, 200 μM dATP, 200 μM dGTP, 200 μM dTTP, 100 μM 「α-32P」dCTP, 0.25 ㎎/mL 활성화 연어 정자 DNA이다.
상기 뉴클레오시드 삼인산으로서는, 통상, dNTP(dATP, dCTP, dTTP)를 들 수 있다. 상기 반응액 중의 dNTP의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 0.01∼1 mmol/L이고, 바람직하게는 0.05∼0.5 mmol/L이며, 보다 바람직하게는 0.1∼0.3 mmol/L이다.
상기 용매로서는, 예컨대, Tris-HCl, 트리신(Tricine), MES, MOPS, HEPES, CAPS 등의 완충액을 들 수 있으며, 시판되는 PCR용 완충액이나 시판되는 PCR 키트의 완충액 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 PCR 반응액은, 또한, 헤파린, 베타인, KCl, MgCl2, MgSO4, 글리세롤 등을 포함해도 좋으며, 이들의 첨가 비율은, 예컨대, PCR 반응을 저해하지 않는 범위에서 설정하면 된다.
반응액의 전체 체적은, 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 사용하는 기기[써멀 사이클러(thermal cycler)] 등에 따라서 적절하게 결정할 수 있으나, 통상, 1∼500 μL이고, 바람직하게는 10∼100 μL이다.
다음으로, PCR을 행한다. PCR의 사이클 조건은 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, (1) 전혈 유래 이중쇄 DNA의 단일쇄 DNA로의 해리, (2) 프라이머의 어닐링, (3) 프라이머의 신장(폴리머라제 반응)은, 각각 이하와 같다. 또한, 사이클수도 특별히 제한되지 않으나, 하기 (1)∼(3)의 3 단계를 1 사이클로 해서, 예컨대, 30 사이클 이상이 바람직하다. 상한은 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 합계 100 사이클 이하, 바람직하게는 70 사이클 이하, 더욱 바람직하게는 50 사이클 이하이다. 각 단계의 온도 변화는, 예컨대, 써멀 사이클러 등을 이용하여 자동적으로 제어하면 된다. 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 경우, 전술한 바와 같이 증폭 효율이 우수하기 때문에, 종래의 방법에 따르면 50 사이클에 3 시간 정도를 필요로 하고 있었던 데 비해서, 본 발명에 따르면, 약 1 시간 정도(바람직하게는 1 시간 이내)로 50 사이클을 완료하는 것도 가능하다.
이상과 같이 하여, CYP2C9 유전자에 있어서의 CYP2C9*3의 검출 대상 부위를 포함하는 영역에 상보적인 증폭 산물을 제조할 수 있다.
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법은, 또한, 전술한 증폭 반응에 의해 상기 증폭 산물을 검출하는 공정을 포함해도 좋다. 이에 따라, 증폭 산물의 유무나, CYP2C9 유전자의 상기 목적 영역에 있어서의 유전자형(다형 CYP2C9*3)을 검출할 수도 있다. 증폭 산물의 유무는, 종래 공지의 방법에 의해 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 상기 (I) 공정에 있어서, 상기 반응액에, 또한, 상기 목적 영역에 있어서의 검출 대상 서열에 상보적인 서열인 형광 표식화 프로브를 첨가해 두고, 또한, (II) 공정으로서, 상기 반응액에 대해서, 상기 프로브에 있어서의 형광 표식의 형광 강도를 측정함으로써 확인할 수 있다. 또한, CYP2C9 유전자에 있어서의 다형 CYP2C9*3의 검출에 대해서는, 본 발명의 일 형태로서, 이하에 설명한다.
<CYP2C9 유전자의 다형 해석 방법>
본 발명의 CYP2C9 유전자의 다형 해석 방법은, CYP2C9 유전자에 있어서의 검출 대상 부위의 다형(CYP2C9*3)을 해석하는 방법으로서, 하기 (i)∼(iv) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(i) 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의해, CYP2C9 유전자에 있어서의 검출 대상 부위를 포함하는 영역을 반응액 중에서 증폭시키는 공정,
(ii) 상기 (i) 공정에 있어서의 증폭 산물과, 상기 검출 대상 부위에 하이브리드화 가능한 프로브를 포함하는 반응액을 준비하는 공정,
(iii) 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 증폭 산물과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 공정,
(iv) 온도 변화에 따른 상기 시그널값의 변동으로부터, 상기 검출 대상 부위의 다형을 결정하는 공정.
이와 같이 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 산물을 제조함으로써, 전술한 바와 같이 CYP2C9 유전자에 있어서의 다형 CYP2C9*3의 검출 대상 염기를 포함하는 영역을 증폭할 수 있다.
상기 (ii) 공정에 있어서의 프로브는, 특별히 제한되지 않으며, 다형 CYP2C9*3의 발생 부위를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브(이하, 「CYP2C9*3용 프로브」라고도 말한다)를 들 수 있다. 이 프로브는, 상기 검출 대상 서열을 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브인 것이 바람직하다.
상기 다형을 검출하기 위한 프로브는, 특별히 제한되지 않으며, 종래 공지의 방법에 의해 설정할 수 있다. 예컨대, 다형의 검출 대상 부위를 포함하는 검출 대상 서열로서, CYP2C9 유전자의 센스쇄의 서열에 기초하여 설계해도 좋고, 안티센스쇄의 서열에 기초하여 설계해도 좋다. 또한, 다형의 검출 대상 부위의 염기는, 다형의 종류에 따라서 적절하게 결정할 수 있다. 즉, CYP2C9*3은, 서열 번호 1에 있어서의 52521번째의 염기에 「A」 및 「C」의 다형이 알려져 있기 때문에, 예컨대, 52521번째가 A인 검출 대상 서열, 및 52521번째가 C인 검출 대상 서열 중 어느 하나에 상보적인 프로브(센스쇄의 검출용 프로브)나, 그 안티센스쇄의 서열에 상보적인 프로브(안티센스쇄의 검출용 프로브)를 들 수 있다. 이와 같이, 다형이 발생하는 검출 대상 부위의 염기를 전술한 바와 같은 어느 하나의 염기로 설정하여 프로브를 설계해도, 후술하는 바와 같은 방법에 의해, CYP2C9 유전자의 검출 대상 부위에 있어서 어떠한 다형을 나타내는지를 판단하는 것이 가능하다.
상기 프로브는, 상기 (i) 공정 후, 즉, CYP2C9 유전자의 목적 영역에 대해서 증폭 반응을 행한 후, 증폭 반응액에 첨가할 수도 있으나, 용이하고 또한 신속하게 해석을 행할 수 있다는 점에서, 상기 (i) 공정의 증폭 반응에 앞서, 미리 반응액에 첨가해 두는 것이 바람직하다.
상기 반응액에 있어서의 프로브의 첨가 비율은, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 프로브를 10∼400 ㎚ol의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20∼200 ㎚ol이다. 또한, 프로브의 표식으로서 형광 색소를 이용하고 있는 경우, 예컨대, 검출하는 형광 강도를 조정하기 위해서, 표식화 프로브와 동일한 서열인 미표식 프로브를 병용해도 좋으며, 이 미표식 프로브는, 그 3' 말단에 인산이 부가되어도 좋다. 이 경우, 표식화 프로브와 비표식 프로브의 몰비는, 예컨대, 1:10∼10:1이 바람직하다. 상기 프로브의 길이는, 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 5∼50 mer이고, 바람직하게는 10∼30 mer이다.
Tm값에 대해서 설명한다. 이중쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 가면, 260 ㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 이중쇄 DNA에 있어서의 양쇄 간의 수소 결합이 가열에 의해 풀려서, 단일쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 이중쇄 DNA가 해리하여 단일쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시 시의 흡광도(이중쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이에 따라 융해가 완료되었다고 판단할 수 있다. 이 현상에 기초하여, 융해 온도 Tm이란, 일반적으로, 흡광도가, 흡광도 전체 상승분의 50%에 도달했을 때의 온도로 정의된다.
상기 (iii) 공정에 있어서, 상기 증폭 산물과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널의 측정은, 전술한, 260 ㎚의 흡광도 측정이어도 좋으나, 표식 물질의 시그널 측정이어도 좋다. 구체적으로는, 상기 프로브로서, 표식 물질로 표식화된 표식화 프로브를 사용하여, 상기 표식 물질의 시그널 측정을 행하는 것이 바람직하다. 상기 표식화 프로브로서는, 예컨대, 단독으로 시그널을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표식화 프로브, 또는 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표식화 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널을 나타낸다. 또한, 후자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성함으로써 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 표식에 의한 시그널을 시그널 특유의 조건(흡수 파장 등)으로 검출함으로써, 상기 260 ㎚의 흡광도 측정과 마찬가지로, 융해의 진행 및 Tm값의 결정 등을 행할 수 있다.
상기 표식화 프로브에 있어서의 표식 물질의 구체예로서는, 예컨대, 형광 색소(형광단)를 들 수 있다. 상기 표식화 프로브의 구체예로서는, 예컨대, 형광 색소(형광단)로 표식된, 단독으로 형광을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소(예컨대, 소광)하는 프로브가 바람직하다. 이러한 형광 소광 현상(quenching phenomenon)을 이용한 프로브로서는, 그 중에서도, 올리고뉴클레오티드를 3' 말단 또는 5' 말단이 C가 되도록 설계하고, 그 말단의 C가 G에 접근하면 발광이 약해지는 형광 색소로 표식화한 프로브가 특히 바람직하다. 이 프로브는, 일반적으로 구아닌 소광 프로브라고 불리며, 소위 QProbe(등록 상표)로서 알려져 있다. 이러한 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리드화와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.
상기 형광 색소로서는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있으며, 시판되는 형광 색소로서는, 예컨대, BODIPY FL(상표, 몰레큘러 프로브사 제조), FluorePrime[상품명, 아머샴 파마시아사 제조], Fluoredite(상품명, 밀리포어사 제조), FAM(ABI사 제조), Cy3 및 Cy5(아머샴 파마시아사 제조), TAMRA(몰레큘러 프로브사 제조) 등을 들 수 있다. 검출 조건은, 특별히 제한되지 않으며, 사용하는 형광 색소에 의해 적절하게 결정할 수 있으나, 예컨대, Pacific Blue는 검출 파장 450∼480 ㎚, TAMRA는 검출 파장 585∼700 ㎚, BODIPY FL은 검출 파장 515∼555 ㎚에서 검출할 수 있다.
이하에, 다형 CYP2C9*3을 검출하기 위한 프로브의 서열의 구체예를 나타내지만, 본 발명은 이것에는 제한되지 않는다. 하기 프로브는 센스쇄를 검출하기 위한 프로브이다.
프로브
서열 번호 1에 있어서의 52516번째의 구아닌 염기(G)를 1째 염기로 하여 3' 방향을 향해서 17∼22째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 구아닌 염기에 상보적인 시토신 염기를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
상기 프로브에 있어서, 서열 번호 1의 52521번째에 상보적인 염기는 k로 나타나고, 상기 k는 G 또는 T이다.
또한, 상기 프로브의 구체예를 하기 표에 나타낸다. 또한, 하기 표에 있어서의 「Tm(℃)」은, 하기 표의 서열과 완전히 상보적인 서열이 하이브리드화한 경우의 Tm(℃)이며, MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/)에 의해, 파라미터를 올리고뉴클레오티드 농도 0.2 μM, 나트륨 당량(Na eq.) 50 mM로 해서 산출한 값이다.
상기 표에 있어서의 프로브는, 서열 번호 1에 있어서의 52516번째가 C인 영역에 상보적인 서열로 이루어지며, 대문자의 염기가, 서열 번호 1의 52516번째의 염기에 상보적인 염기를 나타낸다. 또한, 상기 프로브에 있어서, 상기 대문자의 염기는 k로 치환할 수 있으며, 상기 k는 G 및 T 중 어떠한 것이어도 좋다. 본 발명에 있어서의 프로브의 구체예로서는, 예컨대, 전술한 바와 같이, 상기 표에 나타내는 올리고뉴클레오티드의 상보쇄여도 좋다.
상기 프로브는 일례이며, 본 발명은 이것에는 한정되지 않는다. CYP2C9용 프로브로서는, 상기 프로브 중에서도, 서열 번호 28 또는 서열 번호 29의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 예컨대, 상기 표에 나타내는 프로브를 구아닌 소광 프로브로 하는 경우, 3' 말단의 시토신을 전술한 바와 같은 형광 색소(예컨대, BODIPY FL, TAMRA 등)로 표식화하는 것이 바람직하다. 또한, 5' 말단에 형광 색소를 표식화한 프로브는, 예컨대, 프로브 자체가 신장하는 것을 예방하기 위해서, 그 3' 말단에, 또한 인산기가 부가되어도 좋다.
다음으로, 본 발명의 검출 방법에 대해서, 일례로서, 하기 프로브를 이용하여, CYP2C9 유전자에 있어서의 다형 CYP2C9*3을 검출하는 방법을 설명한다. 또한, 본 발명은 이것에는 제한되지 않는다.
(프로브)
CYP2C9*3용 프로브
5'-gggagaaggtcaaggtatc-(BODIPY FL)-3'(서열 번호 28), 또는
5'-ggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPY FL)-3'(서열 번호 29)
우선, 상기 표식화 프로브를 첨가한 반응액을 이용하여, 전술한 바와 같이 PCR을 행해서, 반응액 중에서, CYP2C9 유전자의 상기 목적 영역을 증폭시킨다. 상기 반응액은, 예컨대, 본 발명의 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트, DNA 폴리머라제, dNTP, 주형이 되는 핵산을 포함하는 시료, 및 상기 프로브를 포함한다. 이 외에, 핵산 증폭에 사용할 수 있는 여러 가지 첨가제를 포함해도 좋다.
다음으로, 얻어진 증폭 산물의 해리, 및 해리에 의해 얻어진 단일쇄 DNA와 상기 표식화 프로브와의 하이브리드화를 행한다. 이것은, 예컨대, 상기 반응액의 온도 변화에 의해 행할 수 있다.
상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도는, 상기 증폭 산물이 해리할 수 있는 온도이면 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 85∼95℃이다. 가열 시간도 특별히 제한되지 않으나, 통상, 1초∼10분이고, 바람직하게는 1초∼5분이다.
해리한 단일쇄 DNA와 상기 표식화 프로브와의 하이브리드화는, 예컨대, 상기 해리 공정 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시킴으로써 행할 수 있다. 온도 조건으로서는, 예컨대, 40∼50℃이다.
그리고, 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 증폭 산물과 상기 표식화 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정한다. 구체적으로는, 예컨대, 상기 반응액(상기 단일쇄 DNA와 상기 표식화 프로브와의 하이브리드 형성체)을 가열하고, 온도 상승에 따른 시그널값의 변동을 측정한다. 전술한 바와 같이, 말단의 C 염기가 표식화된 프로브(구아닌 소광 프로브)를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와의 하이브리드화한 상태에서는, 형광이 감소(또는 소광)하고, 해리한 상태에서는, 형광을 발한다. 따라서, 예컨대, 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드 형성체를 서서히 가열하고, 온도 상승에 따른 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.
형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 개시 온도가 실온∼85℃이고, 바람직하게는 25∼70℃이며, 종료 온도는, 예컨대, 40∼105℃이다. 또한, 온도의 상승 속도는, 특별히 제한되지 않으나, 예컨대, 0.1∼20℃/초이고, 바람직하게는 0.3∼5℃/초이다.
다음으로, 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값을 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에 있어서의 단위 시간당의 형광 강도 변화량(-d 형광 강도 증가량/dt)을 산출하고, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또한, 단위 시간당의 형광 강도 증가량(형광 강도 증가량/t)이 가장 높은 점을 Tm값으로서 결정할 수도 있다. 또한, 표식화 프로브로서, 소광 프로브가 아니라, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 프로브를 사용한 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.
그리고, 이 Tm값으로부터, 검출 대상 부위에 있어서의 유전자형을 결정한다. Tm 해석에 있어서, 완전히 상보적인 하이브리드(매치)는, 일염기가 다른 하이브리드(미스매치)보다도, 해리를 나타내는 Tm값이 높아진다는 결과가 얻어진다. 따라서, 미리, 상기 프로브에 대해서, 완전히 상보적인 하이브리드의 Tm값과, 일염기가 다른 하이브리드의 Tm값을 결정해 둠으로써, 상기 검출 대상 부위에 있어서의 유전자형을 결정할 수 있다. 예컨대, 검출 대상 부위의 염기를 변이형(예컨대, 서열 번호 1에 있어서의 52521번째의 염기가 C)이라고 가정하고, 그것을 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용한 경우, 형성한 하이브리드의 Tm값이, 완전히 상보적인 하이브리드의 Tm값과 동일하면, 상기 증폭 산물의 다형은 변이형이라고 판단할 수 있다. 또한, 형성한 하이브리드의 Tm값이, 일염기 다른 하이브리드의 Tm값과 동일(완전히 상보적인 하이브리드의 Tm값보다 낮은 값)하면, 상기 증폭 산물의 다형은 야생형(예컨대, 서열 번호 1에 있어서의 52521번째의 염기가 A)이라고 판단할 수 있다. 또한, 양쪽의 Tm값이 검출된 경우에는, 헤테로 접합체라고 결정할 수 있다. 이렇게 해서, 표식화 프로브에 대한 Tm값으로부터, 다형 CYP2C9*3의 유전자형을 판단할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서는, 전술한 바와 같이, 상기 프로브를 포함하는 반응액의 온도를 상승시키고(하이브리드 형성체를 가열하고), 온도 상승에 따른 시그널 변동을 측정하는 방법을 대신하여, 예컨대, 하이브리드 형성 시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 좋다. 즉, 상기 프로브를 포함하는 반응액의 온도를 강하시켜 하이브리드 형성체를 형성할 때에, 상기 온도 강하에 따른 시그널 변동을 측정해도 좋다.
구체예로서, 단독으로 시그널을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표식화 프로브(예컨대, 구아닌 소광 프로브)를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와 프로브가 해리하고 있는 상태에서는 형광을 발하고 있으나, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예컨대, 상기 반응액의 온도를 서서히 강하하고, 온도 하강에 따른 형광 강도의 감소를 측정하면 된다. 한편, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표식화 프로브를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와 프로브가 해리하고 있는 상태에서는 형광을 발하고 있지 않으나, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광을 발하게 된다. 따라서, 예컨대, 상기 반응액의 온도를 서서히 강하하고, 온도 하강에 따른 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.
다음으로, 본 발명의 실시예에 대해서 설명한다. 단, 본 발명은, 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1
피검자 9명으로부터 헤파린 리튬 채혈관을 이용하여 채혈을 행하였다(샘플 1∼9). 얻어진 혈액 10 μL와 증류수 90 μL를 혼합하고, 또한, 이 혼합액 10 μL와 증류수 90 μL를 혼합하였다. 이들 혼합액 10 μL를, 하기 조성의 PCR 반응액 40 μL에 첨가하고, 써멀 사이클러를 이용하여 PCR을 행하였다. PCR의 조건은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 52℃에서 10초를 1 사이클로 해서 50 사이클 반복하고, 또한 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하였다. 그리고, 계속해서, 온도 의 상승 속도를 1℃/3초로 하여, 상기 PCR 반응액을 40℃에서 95℃로 가열해 가고, 경시적인 형광 강도의 변화를 측정하였다. 측정 파장은, 515∼555 ㎚(형광 색소 BODIPY FL의 검출)로 하였다. 또한, 50 사이클의 PCR에 필요한 시간은 약 1 시간이었다.
(PCR 반응액: 단위 μL) | |
증류수 | 8.75 |
5% NaN3 | 0.5 |
20% BSA | 1 |
40% 글리세롤 | 18.75 |
10x Gene Taq 완충액* | 5 |
2.5 mM dNTP | 4 |
5 μM CYP2C9*3용 프로브 | 1 |
100 μM CYP2C9 F1 프라이머 | 0.5 |
100 μM CYP2C9 R1 프라이머 | 0.25 |
5 U/μL Gene Taq FP* | 0.25 |
총 40 μL | |
* 상품명 Gene Taq FP: 니폰진사 제조 |
(프로브)
CYP2C9*3용 프로브
5'-gggagaaggtcaaggtatc-(BODIPY FL)-3' (서열 번호 28)
(프라이머 세트)
CYP2C9*3 F1 프라이머
5'-gagcccctgcatgcaa-3' (서열 번호 4)
CYP2C9*3 R1 프라이머
5'-gatactatgaatttggggacttcgaa-3' (서열 번호 17)
CYP2C9*3용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은, 59℃, 미스매치의 하이브리드의 Tm값은 54℃이다.
샘플 1∼9의 결과를 도 1 및 도 2에 도시한다. 이들 도면은 온도 상승에 따른 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이며, 세로축의 미분값은 「-d 형광 강도 증가량/dt」를 나타내고, 가로축은 온도를 나타낸다(이하, 동일). 도 1 및 도 2에 도시하는 바와 같이, 시그널의 피크로부터, 각 샘플에 있어서의 CYP2C9*3의 유전자형을 결정하였다. 이들 실시예의 결과를 뒷받침하기 위해서, 피검자 9명에 대해서, RFLP법에 의해, CYP2C9*3의 유전자형을 확인한 결과, 실시예와 동일한 결과가 얻어졌다. 이와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 사용함으로써, 전처리를 실시하지 않은 전혈 시료를 사용하여, CYP2C9 유전자에 있어서의 CYP2C9*3의 검출 대상 부위를 포함하는 목적 영역을, 특이적이고 또한 효율적으로 증폭하여, 다형을 해석할 수 있었다.
실시예 2
피검자 2명으로부터 EDTA 채혈관을 이용하여 채혈을 행하였다(샘플 1∼2). 얻어진 혈액 10 μL와 하기 희석액 A 70 μL를 혼합하고, 또한, 이 혼합액 10 μL와 하기 희석액 B 70 μL를 혼합하였다. 얻어진 혼합액 10 μL를 95℃에서 5분간 가열 처리한 후, 하기 조성의 PCR 반응액 46 μL에 첨가하고, 써멀 사이클러를 이용하여 PCR을 행하였다. PCR의 조건은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 58℃에서 15초를 1 사이클로 해서 50 사이클 반복하고, 또한 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하였다. 그리고, 계속해서, 온도의 상승 속도를 1℃/3초로 하여, 상기 PCR 반응액을 40℃에서 75℃로 가열해 가고, 경시적인 형광 강도의 변화를 측정하였다. 측정 파장은, 515∼555 ㎚(형광 색소 BODIPY FL의 검출)로 하였다.
(희석액 A)
10 mM Tris-HCl(pH 8), 0.1 mM EDTA, 0.05% NaN3, 0.3% SDS
(희석액 B)
10 mM Tris-HCl(pH 8), 0.1 mM EDTA, 0.05% NaN3
(PCR 반응액: 단위 μL) | |
증류수 | 18 |
5% NaN3 | 0.5 |
20% BSA | 0.5 |
40% 글리세롤 | 15 |
10x Gene Taq 완충액* | 5 |
2.5 mM dNTP | 4 |
5 μM CYP2C9*3용 프로브 | 2 |
100 μM CYP2C9 F1 프라이머 | 0.5 |
100 μM CYP2C9 R1 프라이머 | 0.25 |
5 U/μL Gene Taq FP* | 0.25 |
총 46 μL | |
* 상품명 Gene Taq FP: 니폰진사 제조 |
(프로브)
CYP2C9*3용 프로브
5'-ggagaaggtcaaggtatc-(BODIPY FL)-3' (서열 번호 29)
(프라이머 세트)
CYP2C9*3 F1 프라이머
5'-cggagcccctgcatgcaa-3' (서열 번호 2)
CYP2C9*3 R1 프라이머
5'-aatgatactatgaatttggggacttcgaa-3' (서열 번호 14)
CYP2C9*3용 프로브와 매치하는 하이브리드의 Tm값은 56℃, 미스매치의 하이브리드의 Tm값은 50℃이다.
샘플 1∼2의 결과를 도 3에 도시한다. 이 도면은 온도 상승에 따른 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이며, 세로축의 미분값은 「-d 형광 강도 증가량/dt」를 나타내고, 가로축은 온도를 나타낸다. 도 3에 도시하는 바와 같이, 시그널의 피크로부터, 상기 샘플에 있어서의 CYP2C9*3의 유전자형을 결정하였다. 이 실시예의 결과를 뒷받침하기 위해서, 피검자 2명에 대해서, RFLP법에 의해, CYP2C9*3의 유전자형을 확인한 결과, 실시예와 동일한 결과가 얻어졌다. 이와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 사용함으로써, 전처리를 실시하고 있지 않은 전혈 시료를 사용하여, CYP2C9 유전자에 있어서의 CYP2C9*3의 검출 대상 부위를 포함하는 목적 영역을, 특이적이고 또한 효율적으로 증폭하여, 다형을 해석할 수 있었다.
이상과 같이, 본 발명의 프라이머 세트에 따르면, CYP2C9 유전자에 있어서의 다형 CYP2C9*3이 발생하는 부위를 포함하는 영역을, 특이적으로 고효율로 증폭할 수 있다. 이 때문에, 전술한 바와 같은 종래법과는 달리 시간이나 비용을 저감하는 것이 가능해진다. 또한, 이와 같이 다형의 검출 대상 부위를 포함하는 영역이 특이적으로 증폭되기 때문에, 예컨대, 상기 검출 대상 부위를 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 사용함으로써, 상기 반응액을 이용하여 그대로 Tm 해석을 행해서, 상기 다형을 타이핑하는 것이 가능해진다. 또한, 1개의 반응액으로 증폭이나 타이핑이 가능하기 때문에, 조작의 자동화도 가능해진다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면, 예컨대, 협잡물이 포함되는 시료(예컨대, 전혈이나 구강 점막 등)여도, 전처리를 생략할 수 있기 때문에, 보다 신속하고 또한 간편하게 증폭 반응을 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면, 종래보다도 우수한 증폭 효율로 증폭 반응을 행할 수 있기 때문에, 증폭 반응도 단축화가 가능하다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트나 이것을 포함하는 시약, 및 이들을 이용한 증폭 산물의 제조 방법에 따르면, CYP2C9 유전자의 다형을 신속하고 또한 간편하게 해석할 수 있기 때문에, 의료 분야에 있어서 매우 유효하다고 말할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> ARKRAY, Inc.
<120> Primer set and agent for amplification of CYP2C9 gene and use thereof
<130> TF07040-01
<150> JP2006-322959
<151> 2006-11-30
<160> 30
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 60723
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ttgtggagga agtgagtgcc agatctaatc agtaatgttg catcccttca tttgttttta 60
aagtttgttt gctgtaggct gtctctgtgc cacttattag cccaaggtat taacgtaagg 120
tctattcaag accttagtga agactttgct gtggcatgtg tgttaagtgt ctaatttttc 180
ccacatagcc agtttttaaa tgtcttagtc tttaatgtct atctcccaaa agggaaaaaa 240
gagaaacaca aataggagag ggaaaaggtg tcagtccttt aaataccctg gaagtcactt 300
gttgggggag cttgccaaga cttgggggaa ttgtagcaat aatgggttcc caatctgtgt 360
ctgtacctaa gttttcaaaa gcagcagtca tcagaggaca ggtcttcaat attcagaaga 420
taggttcttt tttgcccatc ccagctcctg caagctgtga ataagctgct ccaggaacat 480
gtgtacagct tcctgccagg ggctgaagta tggggcattg gtaggtgcca ctgtgctaag 540
aactgaaatt gacaaaattg gttttttttt ttatagattt ttttaaaatt aatttttatt 600
tttttgagac agagtctcac tctgtcagcc aggctggagt gcagtggtgt gatcttggct 660
cactgcaacc tctgcctcct gggttcaagt gattcttggg cctcagtctc ccaagtagct 720
gggactacag atgtgcacca ccacactggc taattttttg tattttcaga agagacaggg 780
tttcttctta aatcatttta ttaaaaacta ggacacaaaa cacattagcc taggagtatg 840
caaggtcagg atcaccaata tcaccatatt ctactgccac atcttgtccc actgtaaggt 900
tttcaggggc aataacacat atgaagctgt aatcgcctat gtaacattgc cttcttctgg 960
aataactcct gaagtacctg cctgaggttg tttaatagtt aacttaaaag aaaatgagtc 1020
gtagaagaac acaacacttt gaaataacag taaaagtata gtatagtaaa tacataaacc 1080
agtaacagag tcatttacta tagttattga gtattatgta ctgtacctga tatgtgctat 1140
atttttatac aactggcagt gcagtaggtt tgtttacatc agtgtcacca catacacatg 1200
aaaaatgtgt tgtaccaaga tattatgatg agtatgagta tctaggtggc agaaatcatc 1260
tttcagctcc attgtaatct tttttctgag acagagttgc actctgtcac acaggctgaa 1320
gtgcagtggt gtgatcttgg ctcactgcaa cctccatctc tgagtttcaa gctattctcc 1380
tgcctcagcc tccctagtag ctgggactac aggtgcctgc caccacagcc agctaatttt 1440
tgtactttta gtaaaaatga aatttcacca tgttggccag gctgttctcg atctcctgac 1500
ctcaagtgat ccacccgcct tggcctccca aagtgctggg attataggtg tgagccacca 1560
tgcccagcct cagccccatt ataatcttat ggaacaacat agtaaatgaa atcacctgtt 1620
gaacaaaatg ttggtatatg gtgcatgact gtattaaaag tattggaaaa aatcccaccc 1680
atcttgattt gtgtatctgg caaaattctc cttcacaagt gatggagaaa taaagattct 1740
cacacaaaaa aattgagaaa atttatctct agttcctgcc ttgcaaaaaa tgttaaataa 1800
agttcttcag agagaagaaa atggtgtaag tcaatcactg atctacatga ggaaaggaag 1860
ggagttagtg aaggaataat aaaaggaaca taacattttt attttcttat tgattggtct 1920
aacagacaac acttttttca aaataataac aataacatgg ccctgcaaaa gtggctcaca 1980
cctgtaatcc cagcactttg ggagcccgag gagggcggat cacctgaggt caggagttcc 2040
agaccaacct gaccaacata gagaaacact gtctctacta aaaatacaaa attagcaagg 2100
agtggtggca cattcctgta atcccagcta cttgggaggc tgaggcagaa gaattgcttg 2160
aaggcaggag gcagaagttg cagtgagccg agatcatact attgcacttc agcctgtgta 2220
acaagagtga aactccatct caaaaacaaa acaaaacaaa acaaacaaaa cagcaacaac 2280
aaaaatatat atttggtgat tacagtttat ggataaatga aataaatgac agtgatgata 2340
tatgaagaag ggaggaaaga agtaagaata tttttttaca ggtaagtgca ctacctatga 2400
agtagtatag tgctatttta atgtagactt gggttaattg taaacacata ttgcacataa 2460
tacggaaact acaaaaaagt aagaaaaaac aagtaatatt aaggagaaaa agaaaataga 2520
ctcatataac atgctcaatt aaaaccacag aaggcagaaa aagagttgag gacaaaaata 2580
gaaacaacga acaagggcaa tgagtagaaa acagtaacgc atatatggta gataatagtt 2640
caactatatt aaagtcattt taaccgttgg aaagacagag acggtcagag tagataaaaa 2700
aacaagagcc aaatatgtgt atgttgtcta taagagaccc atttgagata taaatataca 2760
tatagatttc aagtaaatga aggagaaaaa tataccatgc taacaccaac caaaaggaaa 2820
tgggaatagc tatattagtt tcagatgaag ccatctccag agtaagaaaa aattattaga 2880
ggttaggaag agtgttatat aatgataaag agttaaattc tctaaggaga aataataaag 2940
tgtatgcacc caacaataag gtcaaaatac atgaggcaaa aactgataga actacaatga 3000
gaaatagatg actccactat tacagctgga gaattaaaca ctcctctatt aaaaatggac 3060
agattcagca tgcagaaaat cattaaagac agatttgaac tgaatagtac catcaatcaa 3120
ctgatttgaa ttggcattta tagaatactt taccctacaa aagcagaata cacattcttc 3180
tcaagctcac atagaacatt caccaatata gaccacattc tgggcaacaa aacatatctt 3240
aggaagttta aaagaatgtg aatcatacaa tgtctgctat gagaccacag ttgaattaaa 3300
ctagaaattg ataacagata ttgagctgga atatcacaaa atacttagag agtaaacagc 3360
acatttctta ataaaatatg ggtaaaataa taaatctcaa gagggattaa aatatttgga 3420
acttaacaaa ataaaaatag aactttaaaa aatttgtagg atgtagtgaa agcagtggtt 3480
agagggaaac ttctagcatt gggggcataa attagaaaag aaaaggatac aaagtcagta 3540
atctaaacat ccaccttagg gaaccagaga aagaaggaca aattatatcc aaagaaagca 3600
gagcaaaaga aacaataaaa gagcagaaat caatgaaatt gaaaacaaga aatcaataga 3660
gaaaattagt aaaaacaaaa gctggttatt tgaaaattat atcaatatat atctagccag 3720
cctaaccaag ataaaaaggg agaatacaga ttttcctatc atcaaaatta aaagaagaac 3780
catcactatt gataccatgg acattaaaag gataataaat gaatattata aagaactcca 3840
tgcccacaga ttatataact tggataaaat ggatcaattc cataaagaaa caatcttcta 3900
agtctcacac aagaagaaat agataatttg aataggcctt tatttattaa agtaataaaa 3960
taaaaaataa ataacctcca aaagagaaaa caccagaccc atataggtcc actggtaaat 4020
tctaccaaac atttatagaa gaattatacc cgttctctac aatctcttct agaagtagta 4080
ccagaggaaa ttcttctatt cttaactcat tttatggggc cagcattact ctaatactca 4140
aatcagacaa ggacattgta agaaagcaaa actatatatc agtatatcta atgaaaatag 4200
gtgcaaacct caataaaaga ttagcaaatt gcatccaatc gtgtagaaaa actgtataca 4260
ccataactaa gtgggattta ttttagaaat gcaagagtta ctcaacatat gaaaatcaaa 4320
tattttactt catcacatta gttactaaag aagaaaagtc tcatcatcat atccacaggt 4380
gcagaaaaaa aatttgccta aatccagcac acattcatga taaaaactct cagcgaacta 4440
agaatagagg aggaactttc tcaatttaat aaagaatatg tgcaaaaaac ctaccgctaa 4500
catcattatt ggtgagaaac ttgaaatttt ctggctaata acaagaataa agtgagatgt 4560
tccatgaaac tactcctatt caacatcgta ctagaaaccc tttttaatga gataacaaga 4620
aaaagaaata aaagtgatac caatcaggaa taaagaaata aaactattgt gtttagatcg 4680
catgattgtt tatgtagaaa atctcaaaga atcaaaaaac ctccaaaaat aaaaaaaaca 4740
aaacaaaaca aaaagaaaac aacaataatg aaaaaactcc taaaagtaat aagctattgt 4800
agtaaggttg caggatacaa ggaaatcaaa ttcttttctc tatattaaca ataaataatt 4860
agaatttgga attaaaaaca tagtatcatt tatattagca ccaaaaatat gaaatcccta 4920
ggtggaagtc tgtcaaaata catatatcac ttgaagaaaa ctacaaaact ctgatgaaag 4980
aaaacaaaga tataaataaa tacacaaata tttcatgttc atggatatga agaccgttgt 5040
tagtcttttt gatttgatct atagatcaac acaataagaa tcaaactcca ggaaagtttt 5100
attattttta ttatttttta tctttagatg ctaacaatct gattgtaaag tttatgtgga 5160
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tattttatgc atgggaaata aatgcctcaa tataggcctg atttctaagc ccattagctc 19380
cctcatcaat gttttttctg ctaaactcca aagccctgtt tctgtaaagt actttgttga 19440
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tttaaaagac attatctcct tctagtaggg agaatatttg ggaccataga agctgccaag 19620
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ttttataatc agagaattac tacatatgta caataaaaat ttccccatca agatatacaa 20220
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tataatttaa cgtttaagca acatatgtta ttttgatatg aaattaatct gtttttcaaa 47460
gacagtaatt tcatgactaa attatatgct tactttatgt tttcaaacat tttattattt 47520
ttatttgtat taattatcat atatactaat gtatatgtat atacatatct tttaattttt 47580
tttaattttt atgggtacaa agtaggtata tatcaatatg tttgggggta catgagatgt 47640
tttgatacag gcatgcaatg tgaaataagc atgtcatgga gaatggggta tctattccct 47700
caagcattta ttctttgagt tacaaacaat tcaattacac tctttaagtt attttaaaac 47760
gtacaattaa gttattattg actatagtca cccttttgtg ctatcatata gtagatctta 47820
ttcatctcca cctcccctcc ccccacacta ccctttcgag tctctggtaa ccatctttct 47880
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cat 60723
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<220>
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Claims (18)
- 유전자 증폭법에 의해 CYP2C9 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트로서, 하기 프라이머 세트 (1)을 포함하는 것을 특징으로 하는 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트:프라이머 세트 (1)하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 정방향 프라이머(forward primer) 및 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 한 쌍의 프라이머 세트:(F1) 서열 번호 1의 염기 서열에 있어서의 52466번째의 아데닌 염기(A)를 1째 염기로 하여 5' 방향을 향해서 14∼18째 염기까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 아데닌 염기(A)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드,(R1) 서열 번호 1의 염기 서열에 있어서의 52631번째의 티민 염기(T)를 1째 염기로 하여 3' 방향을 향해서 19∼36째 염기까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 52631번째의 티민 염기(T)에 상보적인 아데닌 염기(A)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 (1)의 프라이머 세트가, 하기 (1')의 프라이머 세트 인 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트:프라이머 세트 (1')하기 (F1')의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 정방향 프라이머 및 하기 (R1')의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 역방향 프라이머를 포함하는 한 쌍의 프라이머 세트:(F1') 서열 번호 2의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 또는 서열 번호 4의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드,(R1') 서열 번호 14의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드, 또는 서열 번호 17의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트가, 생체 시료 중의 CYP2C9 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트인 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트.
- 제3항에 있어서, 상기 생체 시료가 전혈인 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트.
- 유전자 증폭법에 의해 CYP2C9 유전자를 증폭하기 위한 시약으로서, 제1항에 기재된 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 CYP2C9 유전자 증폭용 시약.
- 제5항에 있어서, CYP2C9 유전자의 검출 대상 부위에 하이브리드화(hybridize) 가능한 프로브를 더 포함하는 CYP2C9 유전자 증폭용 시약.
- 제6항에 있어서, 상기 프로브가 하기 (P1')에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브인 CYP2C9 유전자 증폭용 시약:(P1') 서열 번호 28의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드와, 서열 번호 29의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한 쪽의 올리고뉴클레오티드.
- 제6항에 있어서, 상기 프로브가 형광 표식화 프로브인 CYP2C9 유전자 증폭용 시약.
- 유전자 증폭법에 의해 CYP2C9 유전자의 증폭 산물을 제조하는 방법으로서, 하기 (I) 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭 산물의 제조 방법:(I) 시료 중의 핵산을 주형으로 하고, 제1항에 기재된 CYP2C9 유전자 증폭용 프라이머 세트를 이용하여, 반응액 중에서, 상기 CYP2C9 유전자의 증폭을 행하는 공정.
- 제9항에 있어서, 상기 (I) 공정에 있어서, 상기 반응액에, CYP2C9 유전자의 검출 대상 부위에 하이브리드화 가능한 프로브를 더 첨가하는 것인 증폭 산물의 제 조 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 프로브가 하기 (P1')에 나타내는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브인 증폭 산물의 제조 방법:(P1') 서열 번호 28의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드와, 서열 번호 29의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 한 쪽의 올리고뉴클레오티드.
- 제10항에 있어서, 상기 프로브가 형광 표식화 프로브인 증폭 산물의 제조 방법.
- 제12항에 있어서, 하기 (II) 공정을 더 포함하는 증폭 산물의 제조 방법:(II) 상기 반응액에 대해서, 상기 형광 표식화 프로브에 있어서의 형광 표식의 형광 강도를 측정하는 공정.
- 제9항에 있어서, 상기 시료가 생체 시료인 증폭 산물의 제조 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 생체 시료가 전혈인 증폭 산물의 제조 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율이 0.1∼ 0.5 체적%인 증폭 산물의 제조 방법.
- CYP2C9 유전자에 있어서의 검출 대상 부위의 다형을 해석하는 방법으로서, 하기 (i)∼(iv) 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 다형 해석 방법:(i) 제9항에 기재된 증폭 산물의 제조 방법에 의해, CYP2C9 유전자에 있어서의 검출 대상 부위를 포함하는 영역을 반응액 중에서 증폭시키는 공정,(ii) 상기 (i) 공정에 있어서의 증폭 산물과, 상기 검출 대상 부위에 하이브리드화 가능한 프로브를 포함하는 반응액을 준비하는 공정,(iii) 상기 반응액의 온도를 변화시켜, 상기 증폭 산물과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 공정,(iv) 온도 변화에 따른 상기 시그널값의 변동으로부터, 상기 검출 대상 부위의 다형을 결정하는 공정.
- 제17항에 있어서, 상기 (i) 공정에 있어서, 증폭 반응에 앞서, 상기 반응액에, 상기 검출 대상 부위에 하이브리드화 가능한 프로브를 첨가하는 것인 다형 해석 방법.
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