JP2774192B2 - サーマス サーモフィルス ｄｎａポリメレースの発現ベクターと精製に関する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Thermus thermophilusより精製された耐熱
性DNAポリメレースの精製方法と、本酵素を生成するた
めの組換法に関して記したものである。耐熱性DNAポリ
メレースは数多くの組換DNA技術、特にポリメレース連
鎖反応（PCR）による核酸の増幅に有用である。

大腸菌E.coliのような中温性細菌からのDNAポリメレ
ースの分離に関しては、数多くの研究がなされている。
これらについては、以下の文献を参照されたい。Bassma
nら。1957年J.Biol.Chem.233巻、171−177。及びButtin
and Kornberg、1966年J.Biol.Chem.241巻、5419−524
7。

これに比べると、Thermus thermophilusのような好熱
性細菌よりDNAポリメレースを分離、精製する試みは、
それほど行なわていない。Kaledinらが1980年Biokhymiy
a45巻644−651にT.aquaticusのYT−１株よりDNAポリメ
レースを分離、精製する６ステップの方法を発表してい
る。このステップには、粗抽出物の分離、DEAEセルロー
スクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトによる
分画、DEAEセルロースによる分画及びDNAセルロースク
ロマトグラフィーから成っている。それぞれのステップ
での回収産物でのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌク
レアーゼの混入は調べられていない。精製された酵素の
分子量は１モノマー当たり約62,000ダルトンと報告され
ている。

T.aquaticusよりポリメレースを精製する第二の方法
がChienらによって1976年J.Bacteriol.127巻1550−1557
に記載されている。この方法では、粗抽出物をDEAEセフ
ァデックスカラムにかけている。透析後の回収画分は次
にフォスフォセルロースカラムにかけられる。回収画分
は透析後にポリメレース活性が失活しないように牛血清
アルブミン（BSA）が加えられる。次にこれをDNAセルロ
ースカラムにかける。回収物は再び透析を行ない、ゲル
濾過法により、分子量約63,000ダルトン、ショ糖密度勾
配遠心法によって約68,000ダルトンと決定された。

Chienら及びKaledinらによって精製された耐熱性酵素
を用いて、特定の核酸の配列を、反応前に存在する量に
比較して大量に増幅させる方法が米国特許第4,683,195
号及び4,965,188号にPCR法として記載されている。プラ
イマー、テンプレート（鋳型）、ヌクレオチド、適当な
反応バッファ（緩衝液）、反応条件及びポリメレースが
PCR反応に用いられる。この反応とは、ターゲットとな
るDNAの変性、変性ターゲットDNAとプライマー間でのハ
イブリダイゼーション（雑種形成）、そして相補鎖の生
成である。それぞれのプライマーからの伸長物は、次に
は目的となる核酸配列を生成するためのテンプレートと
なる。特許では次の点が公表されている、即ち、もし用
いられるポリメレースが熱にたいして安定であるなら
ば、それぞれの熱変性ステップ毎に新たにポリメレース
を加える必要がなくなること、すなわち加熱によってポ
リメレースが変性あるいは失活することがなくなる。

欧州特許公報第258,017号、PCT出版第89/06691号及び
米国特許第4,889,818号でT.aquaticusより耐熱性DNAポ
リメレース（分子量94KDa）の精製、その組換体の発現
及びこの酵素のPCR法への応用について記載されてい
る。T.aquaticus DNAポリメレースはPCR法及び他の組換
DNA技術への応用に有用であるが、他の種の耐熱性ポリ
メレースの必要も要求されている。

従って、前述したPCR法を更に改良できるような耐熱
性ポリメレース、あるいはDNA塩基配列決定、ニックト
ランスレーション法、更に逆転写反応に用いてよりよい
結果を引き出せるような耐熱性ポリメレースの精製が技
術界で望まれている。本出願の発明は、Thermus thermo
philus DNAポリメレースの発現ベクターと精製プロトコ
ルを提示してその要求に答えようとするものである。

従って本出願の発明は、与えられたテンプレートの核
酸鎖よりヌクレオチドを組み合わせて、テンプレートに
相補的な核酸を合成する反応を触媒する耐熱性酵素を精
製する方法について述べている。精製酵素は、Thermus
thermophilus由来のDNAポリメレースで遺伝子の塩基配
列より予想される分子量は約96Kダルトンである。この
精製物は、温度循環式増幅反応に使われ、この反応で、
予め与えられた塩基配列をもつ核酸が反応前に存在する
量より増幅されて、大量に作り出される。その結果、こ
の増幅された核酸の配列を、それ以後の反応に利用した
りあるいはその解析を行なうことが容易に成る。

Thermus thermophilus由来のTth DNAポリメレース酵
素をコードする遺伝子の同定とクローニングを行ない耐
熱性酵素を調製するあたらしい方法も実現した。

本発明ではまた、前述の精製した耐熱性Tth酵素が、
非イオン性ポリマー変性剤を含むバッファー中で安定な
酵素活性を保つことを明らかにした。

結局、本発明は、耐熱性ポリメレースの精製法につい
て提示している。精製は以下の過程から成っていて、す
なわちThermus thermophilus細胞から粗抽出物の調製、
粗抽出物中の核酸とDNAポリメレースが解離するように
イオン強度を調製すること、抽出物を疎水結合性クロマ
トグラフィにかけ、つぎにDNA結合蛋白アフィニティク
ロマトグラフィにかけ、最後に抽出物を陽イオン、陰イ
オン交換カラムあるいはハイドロキシアパタイトカラム
にかける操作から成っている。実際には、これらのステ
ップは前述した順序で連続的に行なうことが望ましく、
DNA結合蛋白アフィニティクロマトグラフィにかける前
に抽出物に非イオン性変性剤を加えておくのが望まし
い。核酸結合蛋白アフィニティクロマトグラフィは、DN
Aポリメレースとエンドヌクレースの分離をおこなうた
めに望ましいステップである。

本発明ではTth DNAポリメレースとその発現ベクター
のDNAシーケンスを提示している。本発明の理解の手助
けとして、いくつかの用語を以下のように定義する“細
胞”、“細胞株”、“細胞培養”はそれぞれ同義で互い
に変換可能であり前駆細胞の意味も含めるとする。従っ
て、“形質転換体”、“形質転換細胞”は初期の形質転
換細胞及び、それからの由来株の含めることとし、その
継代数は考慮しないこととする。すべての前駆細胞は、
由来株あるいは変異によって、そのDNAの内容が全く同
一であることはない。変異体であってもオリジナルの形
質転換株と機能的に同一であるものは同じ“形質転換
株”にふくめることとする。

“制御配列”とは、特定の宿主器官で、機能的に結合
したコーディング配列が発現するうえで必要とされるDN
A配列である。原核生物に必要な制御配列としては、プ
ロモーターあるいはオペレータ配列、リボソーム結合サ
イト、またその他の配列が上げられる。真核生物では、
プロモーター、ポリアデニル化シグナル配列、エンハン
サー配列が使われることが知られている。

“発現系”とは、要求されるコーディング配列と制御
配列が機能的に結合したDNAシーケンスで、このDNAシー
ケンスで形質転換された宿主細胞がそのコードされた蛋
白を生産しうるようなDNAシーケンスである。形質転換
を実現するためには発現系はベクター上に組み込まれた
形となるが、このDNAシーケンスは宿主細胞の染色体DNA
に組み込まれる可能性もある。

“遺伝子”とは生理活性を持つポリペプタイドあるい
はその前駆体をコードするDNAシーケンスをさす。ポリ
ペプタイドは、遺伝子の全長あるいはその遺伝子のうち
酵素活性を保ちうるような部分のDNAシーケンスからコ
ードされる。

“機能的に結合した”とは、コーディング配列によっ
てコードされた蛋白が発現するとき、制御配列が機能す
るようにコーディング配列が配置されていることを意味
する。すなわちあるコーディング配列が“機能的に制御
配列と結合している”こととは、コーディング配列が制
御配列の下で発現しうるような構成となっている状態を
示す。

“混合物”とは、Tthポリメレースを含んだ混合物を
示し、Tthポリメレース及び他の蛋白を含む集合体を示
す。Tthポリメレースが組換宿主細胞由来であれば、他
の蛋白とは、通常宿主に関連した蛋白質である。宿主が
バクテリアであれば、混ざっている蛋白とは、もちろん
バクテリアの蛋白である。

“オリゴヌクレオタイド”とはここではデオキシリボ
核酸あるいはリボ核酸が２ないしそれ以上つながったも
のをさすが、現実には３以上、普通10以上の場合を指し
ている。実際必要とされる長さは、多くの要因に左右さ
れるが、オリゴヌクレオタイド自身の機能あるいはその
利用法によって決定される。オリゴヌクレオタイドは合
成あるいはクローニングで求めることができる。

“プライマー”とはここではオリゴヌクレオタイドを
指し、制限酵素消化物の精製あるいは合成することで得
られる。プライマーはある塩基配列に相補的なプライマ
ー伸張産物が合成されるような条件で、その合成の開始
点として働く。このような条件とはすなわち４種のヌク
レオチドと耐熱性Tth酵素が、適切なバッファ（バッフ
ァには至適PH、至適イオン強度、補助因子等が実現され
ている）、適切な反応温度にあることを指す。Tthポリ
メレースの場合、バッファーには１−3mMのマグネシウ
ム塩、MgCl₂、50−200μＭ各ヌクレオチド、0.5−１μ
Ｍ各プライマー、50mM KCl、10mMトリスバッファー、PH
8−8.4、そして100μg/mlのゼラチンからなる。（ゼラ
チンは必ずしも必要でなく、またDNAシーケンスなどの
場合はむしろ必要としない。） プライマーは増幅反応では一本鎖の場合最も有効だ
が、二本鎖である場合もある。二本鎖の場合、伸張反応
に先だって一本鎖に分ける処理が必要となる。プライマ
ーは通常オリゴヌクレオタイドである。プライマーはポ
リメレース酵素存在下で伸長物合成反応を開始させうる
に十分な長さをもっている必要がある。必要とされるプ
ライマーの長さは多くのファクターに左右されるが、プ
ライマーのソースあるいは要求される結果の内容で決ま
る。プライマーがテンプレートとアニールするためには
プライマーの長さに依存しているため、それによって反
応温度も調節する必要がある。ターゲットとなるシーケ
ンスは多様なためオリゴヌクレオチドプライマーは通常
15−35ヌクレオチド長にわたっている。短いプライマー
長の場合、テンプレートと安定なコンプレックスを形成
するためにはより低い温度条件が要求される。

プライマーは、テンプレートのシーケンスと“本質的
には”相補的となるように選ばれる。プライマーはプラ
イマー伸張が起こるようにテンプレートとハイブリダイ
ズするために十分にテンプレートと相補的である必要が
ある。しかし完全な相補性をそなえている必要はない。
例えば、プライマーの残りの部分が十分テンプレートに
対して相補的であれば、プライマーの５′端に非相補的
な塩基断片が付加されても良い。またプライマーがテン
プレートとハイブリダイズするのに十分な相補性をそな
えていてプライマーとテンプレートがコンプレックスを
形成し、プライマーから伸張産物を合成するのであれ
ば、非相補的な塩基あるいはそれより長い配列がプライ
マー内部に存在しても差しつかえない。

“制限エンドヌクレアーゼ”あるいは“制限酵素”と
は二本鎖DNAの特定のシーケンス部あるいはその近傍を
特異的に切断するバクテリアの酵素である。

“耐熱性酵素”とは、熱に対して安定もしくは熱に対
して抵抗性をしめし、核酸配列に相補的なプライマー伸
長産物を（基質となる）ヌクレオチドを組み合わせて合
成する反応を触媒する酵素である。即ち、プライマーの
３′端よりプライマー伸長産物の合成を、テンプレート
鎖にそって５′端方向へ合成が停止するまですすめる反
応である。

本出願発明のTth耐熱性酵素は、ポリメレース連鎖反
応として知られる増幅反応を有効に行なうのに必要とさ
れる条件を満たす酵素である。Tth酵素はPCR反応でキー
ステップとなる、二本鎖核酸の熱変性に十分な時間高温
下にさらされても、酵素の不可逆的な変性（あるいは失
活）をおこさない。不可逆的な変性とは、恒久にあるい
は完全に酵素活性をうしなうことをさす。核酸を変性さ
せるに必要な加熱条件はバッファの塩濃度、変性される
核酸の塩基構成、長さによるが、温度は通常90−105℃
の間で、時間はその温度、核酸の長さに依存し、数秒か
ら４分位までの間となっている。バッファの塩濃度およ
び核酸内のGC塩基成分が増すに従って、より高い温度が
必要となる。Tth酵素は90−100℃の温度範囲内で比較的
短時間さらされる限り、不可逆的な変性は受けない。

Tth耐熱性酵素はそれが機能する至適温度は50℃より
上である。プライマーのテンプレートへのハイブリダイ
ゼーションは50℃以下でより促進される。しかし塩の成
分、濃度、プライマーの塩基構成、長さにもよるがプラ
イマーのテンプレートへのハイブリダイゼーションはよ
り高い温度でも進み（45−75℃）、その結果プライマー
の伸長反応の特異性は促進され、酵素の至適温度が高い
ほど、プライマー伸長反応の特異性、選択性が上がる。
Tth耐熱性酵素の酵素活性の至適温度は50−90℃にわた
っている。

本出願では、Thermus thermophilus耐熱性DNAポリメ
レースの全長をコードするDNA塩基配列を提示した。こ
のDNA塩基配列とこれより予想されるアミノ酸残基配列
を以下に示す。便宜を図ってThポリメレースのアミノ酸
配列の番号付けを行なってある。これより別の形の耐熱
性酵素のデザインを本来のシーケンス全長をもとにして
行なった。

うえに示したDNA配列、アミノ酸配列およびこれらシ
ーケンスをコードするDNA化合物が広い宿主細胞にわた
ってTth DNAポリメレース活性を発現しうるような、組
換発現ベクターの設計、構築をするために利用された。
うえに示したDNA配列の全長あるいはその一部分をコー
ドするDNA化合物は他種の生物より耐熱性ポリメレース
をコードするDNAの同定の目的に使用されるし、アミノ
酸配列は耐熱性ポリメレースを同定し精製するときに使
われる抗体をつくるための抗原として利用される。

うえのアミノ酸配列をコードする組換ベクターあるい
は本来のThermus thermophilus細胞から用意するにして
も、Tth DNAポリメレースを組換DNA技術に応用するため
にはまずTth DNAポリメレースを精製しなければならな
い。本発明ではこの精製方法について提示する。生の蛋
白を回収するために、細胞はそれに適した方法で増殖さ
せた。簡単に述べれば細胞を以下の組性の１リッターの
培地中で繁殖させた。ニトリロトリアセティクアシッド
（100mg）、トリプトン（3g）、イースト抽出物（3
g）、コハク酸（5g）、亜硫酸ナトリウム（50mg）、リ
ボフラビン（1mg）、K₂HPO₄（522mg）、MgSO₄（480m
g）、CaCl₂（222mg）、NaCl（20mg）、および他の微量
元素。培地のpHはKOHで8.0±0.2に調製した。70℃で激
しく振とうして培養した場合１リッターあたり20g以上
の細胞が得られた。後期対数増殖期（550nmの吸光度で
判定）の細胞を集めてバッファーであらい−20℃で保存
した。

細胞増殖の他の方法としては、ミネラル濃度を定めた
0.3％グルタミン、0.1mg/lビオチン、0.1mg/lチアミン
入り培地を用いる方法がある。この塩にはニトリロトリ
アセティクアシッド、CaSO₄、MgSO₄、NaCl、KNO₃、NaNO
₃、ZnSO₄、H₃BO₄、CuSO₄、NaMoO₄、CoCl₂、FeCl₃、MnSO
₄とNa₂HPO₄である。培地のpHはNaOHで8.0に調製した。
細胞は最初75℃の温浴ちゅうで振とうしながら培養し
た。一定の細胞濃度に達したとき、14Lのファーメンタ
ーに移す。滅菌空気を吹き込んで75℃でさらに培養を続
けた。８時間後遠心して回収した。

細胞培養後、酵素の分離精製を６段階のステップで行
なった、これらのステップは、室温より低い温度、実際
は４℃付近でおこなわれるのが望ましい。最初に、細胞
は、凍結されている場合は、溶解後、Aminco French pr
essure cell（18,000psi）つぶしたのちpH7.5のバッフ
ァーにサスペンドし遠心した。つぎに上清を回収し、乾
燥硫安のような塩と核酸をのぞくためにポリミンＰを加
えて画分化した。沈殿物（0.2M濃度硫安）は廃棄した。

第２ステップで得られた上清は続いて、0.2M （NH₄）
₂SO₄ 50mM Tris−HCl、pH7.5、0.5mM DTTを含むバッフ
ァーで平衡化したフェニールセファロースカラムにかけ
た。つぎにカラムをバッファー1:0.5mM DTT、0.2M（N
H₄）₂SO₄を含むTEバッファー、で洗いさらにバッファー
2:0.5mM DTTを含むTEバッファー、で洗いさらにバッフ
ァー3:20％エチレングリコールを含むバッファー２で洗
った。最後に蛋白をバッファー4:2M尿素を含むバッファ
ー３で流出させた。

第４ステップでは、第３ステップで得られた流出回収
物を0.15M KClで平衡化したヘパリンセファロースカラ
ムにかけた。カラムは同じバッファーで洗ったのち、蛋
白を0.15Mから0.75M KClの線形濃度勾配バッファーを用
いて流出させた。活性を示すピークは0.31Mから0.355M
KClのあいだにあった。

第５ステップでは、前ステップの流出画分を集め、ア
フィゲルブルーバッファーで濾過透析を行なった。沈殿
物は遠心によって取り除き、上清を0.1M KClで平衡化し
たアフィゲルブルーカラムにかけた。カラムを0.1M KCl
で洗ったのち0.1−0.5M KCl線形勾配のバッファーで酵
素の流出を行なった。この画分には耐熱性酵素活性があ
り、DNAse（エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアー
ゼ）の混入を適当な方法を用いて調べた。即ち、エンド
ヌクレアーゼ活性はλDNAあるいはスーパーコイルプラ
スミドDNAと過剰量のDNAポリメレースをミックスしてイ
ンキュベート後、その分子量の変化を電気泳動で確かめ
た。同様に、エキソヌクレアーゼ活性は予め制限酵素で
数箇所切断したDNAを基質としてその分子量の変化を調
べた。この画分にはDNAse活性がないことが確かめら
れ、（ポリメレース活性のピークは0.28M−0.455M KCl
にあった）この画分を回収しCM−トリスアクリルバッフ
ァー中で透析した。沈殿物は遠心によって取り除いた。

第６ステップで上清を50mM NaClで平衡化したCM−ト
リスアクリルカラムにかけた。カラムを50mM NaClで洗
ったのち、酵素を0.05−0.4M NaCl線形勾配のバッファ
ーで流出させた。ポリメレース活性をもちDNAse活性を
持たない画分が0.16−0.20M NaClの部分に流出されてき
た。

透析を行なったのち蛋白分子量マーカーを使ってSDS
−PAGE法などで分子量の解析を行なった。Thermus ther
mophilus由来のDNAポリメレースの分子量は上の方法な
どで約94KDaと決定された。同じDNAポリメレースの予想
されるアミノ酸配列より計算された分子量は、おおよそ
94,016ダルトンであった。

Tth DNAポリメレース生蛋白の精製プロトコルの詳細
は例１に示した。本発明中の組換Tthポリメレースの精
製も同様の方法で行なわれた。

本発明における重要な点は組換Tthポリメレースを作
ることにある。前に述べたように、この酵素をコードす
る遺伝子をThermus thermophilus遺伝子DNAよりクロー
ニングを行なった。2.5Kb長のTthポリメレースの完全の
コーディングシーケンスはpBSM:Tth10の3.7Kb HInd III
−BstE II制限酵素断片中より容易に得られたが、この
3.7Kb断片内部にはHInd IIIの認識サイトが含まれてい
た。このプラスミドは宿主細胞大腸菌E.coli K12株DG10
1に感染させたかたちで登録番号68195として1989年、12
月21日Americann Type Culture Collection（ATCC）に
預け入れた。

この耐熱性Tthポリメレース酵素をコードする遺伝子
の完全なコーディングシーケンスとアミノ酸シーケンス
を前に述べた。しかし、DNAポリメレースとしての生理
活性をたもった遺伝子産物を得るためには、Tthポリメ
レース酵素をコードする遺伝子全部が必要であるわけで
はない。Tthポリメレース酵素をコードする遺伝子シー
ケンスを使って、DNAポリメレース活性をもつ変異蛋白
をつくるようにコーディングシーケンスに修飾を加える
ことも可能となる。３分の１以上のアミノ末端の蛋白を
欠失させても残りの部分にポリメレース活性を持つとさ
れていて、実際アミノ末端より10分の１の欠失させてつ
くった組換蛋白はポリメレース活性を保っていた。この
ようにアミノ末端を欠失させたポリメレース活性を保っ
ていることにより、これらのポリメレースを発現する遺
伝子構築物としてコーディングシーケンスを短縮した形
のものも含められる。

Ｎ末端の欠失に加え、Tthポリメレースのペプチドチ
ェーンの個々のアミノ酸残基に、酸化還元その他の修飾
によって蛋白が切断されるが、活性を保持した断片も得
られる。活性を失わないような修飾は、Tthポリメレー
ス活性を有する蛋白という定義から外れず、したがっ
て、これらの修飾も本出願発明に含まれるといえる。そ
の蛋白の高温度でのDNAポリメレース活性を失わない様
にTthポリメレース遺伝子の一次構造を欠失、付加ある
いは翻訳時に取り込まれるアミノ酸がかわるように変更
を加えることが可能である。DNAにコードされるアミノ
酸配列をもつ蛋白の産生の結果生じるこれらの置換ある
いは他の修飾も本発明に含まれるものと思われる。ま
た、Tthポリメレース遺伝子の、クローニングされた遺
伝子配列あるいは、相同な合成された配列はTth DNAポ
リメレース活性をもつ融合蛋白を発現させるために利用
されたり、本来のTth DNAポリメレースとアミノ酸配列
が完全に一致した蛋白を発現させるために利用すること
もできる。さらに、この発現の制御も、Tth DNAポリメ
レース遺伝子の制御シーケンスによるか、宿主内で機能
するような制御シーケンスによるかを選択することも可
能である。

本発明では、多くの種の宿主細胞で利用可能な発現ベ
クターの構築およびそのコーディングシーケンスの発現
をさせるためのTth DNAポリメレース遺伝子の完全なシ
ーケンスを提示した。Tth DNAポリメレース遺伝子の一
部分も種々の生物種より耐熱性ポリメレースをコードし
ているシーケンスを取り出すためのプローブとして、有
用である。即ち、少なくとも、４−６個のアミノ酸をコ
ードしている遺伝子DNAの一部分は大腸菌E.coliのなか
で複製できて、それを変性させてプローブとして使うこ
とも可能であるし、少なくとも４−６個のアミノ酸をコ
ードするオリゴデオキシヌクレオチドプローブを化学合
成して、耐熱性ポリメレースをコードしているほかのDN
Aシーケンスを得ることも可能である。Thermus thermop
hilusの耐熱性ポリメレース遺伝子と他の種の相当する
遺伝子の核酸配列は完全に一致していることはおそらく
ありえないので、約12−18塩基からなるオリゴマー（４
−６個のアミノ酸をコード）を、十分なストリンジェン
シーの条件で使えば、偽陽性のないハイブリダイゼーシ
ョンを行なうことが可能であろう。６個のアミノ酸をコ
ードする配列があれば、プローブ（を設計するため）の
十分な情報が得られる。

本発明では、Tth DNAポリメレースのコーディング配
列とアミノ酸配列を提示し、他の種の耐熱性ポリメレー
ス酵素を分離しそのコーディング配列を同定することを
可能にする。TaqおよびTth DNAポリメレース遺伝子のコ
ーディングシーケンスは非常に類似していて、この類似
性によってTth DNAポリメレース遺伝子を同定、分離す
ることが容易になった。しかしながら、TaqおよびTth D
NAポリメレース遺伝子のコーディングシーケンスの間で
類似性のない部分も、プローブとして、Taqポリメレー
スとは全く異なるが、Tth DNAポリメレースとは相同性
を示すような他の種の耐熱性ポリメレースを同定する目
的に使える。

TaqおよびTth DNAポリメレース遺伝子の間の異なって
いる領域がいくつかある。これらの領域はシーケンスコ
ドンの225−230;238−246;241−249;335−343;336−34
4;337−345;338−346;339−347の部分にある。９コドン
長を持っているような領域に対しては、これらの領域に
対応するプローブは、そのプローブと連続して最低５個
のコドンが一致（あるいはそれに相補的な）するような
耐熱性ポリメレースをコードするDNAシーケンスを同
定、あるいは分離に用いることが可能であろう。６コド
ン長を持っているような領域に対しては、これらの領域
に対応するプローブは、そのプローブと連続して最低４
個のコドンが一致（あるいはそれに相補的な）するよう
な耐熱性ポリメレースをコードするDNAシーケンスを同
定、あるいは分離に用いることが可能であろう。

このような耐熱性ポリメレースをコードするDNA配列
はその相同性が保たれているかぎり分離する種は、Ther
mus thermophilus種由来である必要はなく、さらにTher
mus属である必要もない。

本来のTth DNAポリメレース酵素、あるいはその酵素
の誘導体、相同体いずれかを生産するにしても、Tth DN
Aポリメレースの組換え、すなわち発現ベクターを構築
し、宿主細胞をそのベクターで形質転換し、発現がおこ
るような条件でその形質転換した宿主を培養するといっ
た操作を行なうことになる。発現ベクターを構築するに
は、マチュアーな蛋白をコードしているDNAシーケンス
あるいは活性を失わないようなシーケンスがTth DNAポ
リメレースに加わった融合DNAシーケンスあるいは適当
な条件で切断されて（ペプチダーゼ処理など）活性を生
じさせるようなシーケンスが付け加わったDNAシーケン
スを得る必要がある。このコーディングシーケンスを、
発現ベクター内で適当な制御配列と機能的にリンクした
形となるように配置する。またベクターは、宿主細胞内
で、自律的に複製したり、宿主細胞の染色体DNAに組み
込まれるようにデザインすることもできる。ベクター
は、そのベクター系に適切な宿主を形質転換するために
用い、形質転換体は組換Tth DNAポリメレースが発現す
るように適当な条件で培養される。Tth DNAポリメレー
スは培地中あるいは細胞自身から分離する、しかし蛋白
の回収および精製は、いくらかの不純物が含まれても構
わないような場合は、必ずしも必要でない。

これから述べるそれぞれのステップには様々な方法で
行なわれる。例えば、必要とするコーディングシーケン
スは遺伝子DNAより取り出して直接に適当な宿主内に導
入して使う場合もありうる。様々な種の宿主内で機能す
るような発言ベクターを構築するには、後に概略で述べ
るような、適切なレプリコンおよび制御配列を使う。目
的とするコーディング配列と制御配列をもつベクターを
構築するためには技術界で良くしられた標準的なテクニ
ックであるライゲーションと制限酵素切断によって行な
う。分離したプラスミド、DNA、合成オリゴヌクレオチ
ドは切断され、修飾され目的の形に再び連結される。発
現ベクターの構築を容易におこなうために、適当な制御
酵素認識サイトを、常に可能な訳ではないが、コーディ
ングシーケンスの末端に付け加えることも、のちに例示
するように可能である。

特定のサイトでDNAを切断することは、適当な制限酵
素で適当な条件で反応を行なってなされ、この条件は技
術界で一般にしられている方法かあるいは使用する制限
酵素の供給先の推奨する方法にしたがって行なう。

New England Biolabs社の製品カタログを見ていただ
きたい。一般には、約１μｇのプラスミドあるいはDNA
は20μｌの反応液中で１ユニット量の制限酵素で切断さ
れるが、後に示すように完全なDNAを切断するために
は、より過剰量の酵素が使われる。反応インキュベート
の時間は普通37℃で１−２時間であるが、場合により変
わることもありうる。反応終了後、蛋白（酵素）はフェ
ノール、クロロホルム抽出により取り除かれ、この抽出
物は続いてエーテルで抽出され、水相中のDNAはエタノ
ール沈殿操作によって回収される。もし必要ならば、切
断断片の大きさによる分離が、標準的なポリアクリルア
ミドゲルあるいはアガロースゲル電気泳動法によって行
なわれる。これについては、Methods in Enzymology198
0年、65巻、499−560ページを参照されたい。

一本鎖突出末端を持った制限酵素切断断片は、４種の
デオキシヌクレオシド３リン酸（dNTP）存在下で、大腸
菌E.coli DNAポリメレースＩラージフラグメント（クレ
ノーフラグメント）を使って、50mM Tris−HCl pH7.6、
50mM NaCl、10mM MgCl₂、10mM DTT、５−10μM dNTPの
組性を反応液で15−25分20−25℃インキュベートして、
平滑末端（二本鎖末端）に変えることができる。クレノ
ー酵素は４種のdNTP存在下でも、５′突出末端は埋め
て、３′突出末端は削る性質がある。したがって、突出
末端の性質により制限はあるが、dNTPのうちただひとつ
あるいは（２−３種）選んで使うことによって、修復を
選択的に行なうことができる。クレノー酵素処理の後、
反応液はフェノール／クロロホルム抽出を行ない、エタ
ノール沈殿する。S1ヌクレースで適当な条件で処理する
と核酸と一本鎖の部分が加水分解されて切断されるの
で、同様の結果がSIヌクレースを使っても行なえる。

合成オリゴヌクレオタイドは1981年のJ.Am.Chem.Soc.
103巻3185−3191ページに記載されているMatteuchiらの
トリエステル法か、自動合成法によって作ることが可能
である。アニーリングに先だって、あるいは標識の目的
で一本鎖核酸のリン酸化を行なうには過剰量即ち約10ユ
ニットのポリヌクレオタイドキナーゼと0.5μＭの基質D
NAを50mM Tris−HCl、pH7.6、10mM MgCl₂、5mM DTT、１
−２μM ATPの組性の反応液インキュベートする。もし
標識を目的としたリン酸化であれば、ATPは高比活性の
γ−³²Pを含んでいるものを使用する。

ライゲーションは15−30μｌ容積中で以下の標準的な
条件と温度で行なう:20mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgC
l₂、10mM DTT、33μg/ml BSA、10−50mM NaClと、一本
鎖末端が互いに相補的である場合は40μM ATP、0.01−
0.02（weiss）ユニットT4DNAライゲースを０℃で、平滑
末端の場合は1mM ATP、0.3−0.6（weiss）ユニットTD4N
Aライゲースを14℃で行なう。相補末端を持つ断片での
分子間ライゲーションには33−100μg/mlDNA濃度（５−
100nM末端濃度）、平滑末端の分子間ライゲーションに
は（普通10−30倍リンカーの分子数が過剰となるよう
に）１μＭ末端濃度で行なう。

ベクターの構築にあたっては、ベクター断片は普通バ
クテリア由来あるいは牛小腸由来のアルカリフォスファ
ターゼ（BAP、CIAP）で、ベクター自身の再凍結を防ぐ
ために５′端の脱リン酸化を行なう。BAPおよびCIAP消
化の条件は技術界でよくしられているが、入手できるBA
P、CIAP酵素にプロトコルが付属してくる。核酸断片を
回収するにはフェノールクロロホルムで抽出し、エタノ
ール沈殿を行なって、アルカリフォスファターゼを取り
除きDNAを精製する。そのほかに再凍結を防ぐ方法とし
て、必要とするベクターのライゲーション反応の前後
に、不要なベクター断片の制限酵素消化を行なう方法も
ある。

ベクターあるいはコーディングシーケンスの部分で塩
基配列の修飾が必要な部分に対しては、種々のサイト特
異的なプライマーによる変異導入法（site−specific p
rimer−directed mutagenesis）が利用できる。ポリメ
レース連鎖反応法（PCR法）はサイト特異的変異導入に
も応用される。技術界で標準となっているほかのテクニ
ックとして、必要とする変異をコードした合成オリゴヌ
クレオタイドをプライマーとして、pBS13＋のような一
本鎖DNAベクターを鋳型として、変異プライマーからの
伸長産物を構築する方法がある。変異DNAは宿主バクテ
リアに形質導入され、形質転換したバクテリアはを培養
し、プレートにまいて同定を行なう。修飾したベクター
を同定するためには、選択された形質転換体からのDNA
をニトロセルロースフィルターあるいは他のメンブラン
に移し、その“リフト”をリン酸化した合成プライマー
を使って修飾したシーケンスとは完全に一致してハイブ
リダイズし、もとのシーケンスの配列とはハイブリダイ
ズしないような温度条件でハイブリダイゼーション反応
を行なう。プローブとハイブリダイズするシーケンスを
含む形質転換体を培養し、修飾DNAをリザーバーとす
る。

以下で述べる構築について、プラスミドの構築が正し
く行なわれたかについては、最初にライゲーション反応
液で大腸菌E.coli DG101株あるいは他の適当な宿主の形
質転換を行なうことによって確認される。形質転換され
たものは、プラスミドの構築の様式によるが、アンピリ
シン、テトラサイクリン、あるいはその他の抗生物質に
対する抵抗性感受性あるいは他の選択マーカーで選択さ
れ、これは技術界で良くしられているところである。次
に形質転換体からのプロスミドの調製は1969年Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA62巻、1159ページのClewellの方法に従
い、場合により、クロラムフェニコールによる増幅を加
える（Clewell、1972年、J.Bacteriol.110巻、667）。
プラスミドDNAを得る他の方法はBethesda Research Lab
oratoriesで出版しているFocus第５巻、２号の11ページ
に報告されている“Base−Acid"抽出法で、このステッ
プ12から17をセシウムクロライド／エチジウムブロマイ
ドDNA超遠心法に置き換えると非常に純度の高いプラス
ミドDNAが得られる。分離されたDNAは制限酵素消化ある
いはシーケンスを行なって解析される、ここでシーケン
スは、Sangerらによる1977年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
74巻、5463記載のダイデオキシ法、より詳細には1981年
Nucl.Acids.Res.9巻309、あるいは1980年Methods.in En
zymology65巻499のマキサム法などで行なう。

制御配列、発現ベクター、形質転換法は遺伝子を発現
させるために使用する宿主細胞の種類に依存する。一般
に原核細胞、酵母、昆虫あるいは哺乳類の細胞が宿主と
して用いられる。原核生物の宿主が一般に、組換蛋白の
産生に最も有効で便利であり、Tthポリメレースの発現
の目的で好んで用いられた。

組換蛋白の発現のためにもっとも多く使われる原核生
物種は大腸菌E.Coliである。クローニング、シーケンス
さらに多くのバクテリアのプロモータの制御の下で発現
するベクターの構築のために、大腸菌E.Coli K12株MM29
4、（請求番号）GCSC＃6135で大腸菌Genetic Stock Cen
terより入手可能、を宿主体として使用する。P_LN_RBS制
御配列を持つ発現ベクターを使う場合は大腸菌E.Coli K
12株MC1000ラムダライジェン、N₇N₅₃cI 857SusP80,ATCC
39531,を宿主として使用する。大腸菌E.Coli DG116株は
ATCCよりATCC53606として1987年４月７日より供給され
ていて、大腸菌E.Coli KB2株もATCCよりATCC33075とし
て1985年３月29日より供給されていてどちらも宿主細胞
として利用できる。M13ファージ組換体には、大腸菌E.C
oli K12株DG18のようなファージ感染を受ける株を使用
する。DG18株はATCCよりATCC39768として1984年６月13
日より供給されている。

しかしながら、大腸菌以外の微生物株も使用されてい
て、たとえばバチルス属のBacillus subtilisや、種々
のPseudomonas属、その他の微生物株が組換Tthポリメレ
ース発現のために使用されている。このような原核生物
の系では、複製サイトや制御配列は宿主由来のものある
いは宿主と互換性のある種由来のものを含むプラスミド
ベクターを使うのが普通である。

例えば、大腸菌E.Coliは、Bolivarらによる1977年Gen
e2巻95ページに記載されている方法によって、普通プラ
スミドpBR322の誘導体を使って形質転換される。プラス
ミドpBR322はアンピシリンとテトラサイクリン耐性遺伝
子を持っている。これらの薬剤耐性マーカーは目的のベ
クターを構築する際に保存したままあるいは破壊するこ
とによって目的の組換体の存在をしることができる。普
通使われる原核生物の制御配列は、転写開始のプロモー
ターで、場合によってオペレータも付随し、リボソーム
結合サイトが続き、ベーターラクタマーゼ（ベニシリナ
ーゼ）、ラクトース（lac）プロモーターシステム（Cha
ngら1977年Nature198巻1056ページ）、トリプトファン
（trp）プロモータシステム（Goeddelら、1980年Nuc.Ac
ids Res.8巻4057ページ）、λ由来P_Lプロモータシステ
ム（Shimatakeら1981年Nature292巻128ページ）、Ｎ遺
伝子リボソーム結合サイト（N_RBS）が含まれる。ポータ
ブルな制御配列のカセットが米国特許第4,711,845号で1
987年12月８日付けで発表されている。このカセットはP
_LプロモータシステムがN_RBSと機能的に連結して、その
下流に第３のDNAシーケンスでN_RBS3′端より6BP以内の
位置で切断されるような制限酵素認識サイトをもつもの
が配置されている。欧州特許公報第196,864号1986年10
月８日出版にChabgらが記載しているフォスファターゼ
Ａ（phoA）システムも有用である。しかしながら原核生
物に互換性をもつプロモータシステムであればどれでも
Tth発現ベクターの構築に使えるだろう。

バクテリアに加えて、酵母のような微小な真核生物も
組換宿主細胞として使える。多くの種類の株が利用でき
るが、実験系の株Saccharomyces cerevisiae、パン酵母
が最も多く使われている。２μｍ複数開始点をもつ、ベ
クターが最も普通に使用されるが（Broch、1983年Meth.
Enz.101巻307ページ）、酵母で発現させるに適した他の
プラスミドベクターもしられている（Stincombら、1979
年Nature282巻39ページ、Tschempeら、1980年Gene10巻1
57ページ、Clarkeら、1983年Neth.Enz.101巻、300ペー
ジなどを参考されたい。） 酵母ベクターの制御配列には糖分解酵素の合成を制御
するプロモータが含まれている（Hessら、1968年J.Adv.
Enzyme Reg.7巻、149ページ、Hollandら、1978年Biotec
hnology17巻、4900ページ）。その他の技術界でしられ
たプロモーターとしては、３−phosphoglycerate kinas
eのプロモータ（Hitzemaら、1980年、J.Biol.Chem.255
巻、2073ページ）や他の糖分解酵素すなわち、glyceral
dehyde−３−phosphatedehydrogenase,hexokinase,pyru
vate decarboxylase,hposphofructokinase,glucose−６
−phosphate isoerase,3−phosphoglycerate mutase,py
ryvaate kinase,triosephosphate isomerase,phosphogl
ucose isomerase,glukokinaseなどのプロモータ配列が
ある。培養の条件で転写を制御できる利点をそなえてい
る他のプロモーターとして、alchol dehydrogenase 2,i
socytochrome C,acid phosphatase、窒素代謝と関係し
た分解酵素、マルトース、ガラクトースの利用に関係し
た酵素のプロモーターがある。（Holland,supra） 転写終了配列（ターミネータ配列）もコーディング配
列の３′端に配置されたとき発現を増強させる作用を利
用される。このようなターミネーターは、酵母由来の遺
伝子でコーディング配列の３′側の非翻訳領域に見いだ
される。多くのベクターでは、プラスミドpeno46（Holl
andら、1981年、J.Biol.Chem.256巻、138ページ）のエ
ノラーゼ遺伝子由来の制御配列や、YEp13（Broachら、1
978年Gene8巻、121ページのLEU2遺伝子を含んでいる
が、しかしながら酵母に互換性をもつプロモータシステ
ム、複製開始点、その他の制御配列が酵母に互換性をも
つものであればどれでもTth発現ベクターの構築に使え
るだろう。

Tth遺伝子はまた多細胞系の真核細胞を宿主として発
現させることも可能である。このような例として、Cruz
とPatterson編集のAcademic出版社のTissue Culture（1
973年）を参考にされたい。有用な宿主細胞株として、C
OS−７、COS−A2、CV−１、齧歯類の細胞としてマウス
骨髄腫細胞NC51,VERO,HeLa細胞、チャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞（CHO）などがある。このような細胞にたい
する発現ベクターには普通哺乳類細胞に共通なプロモー
ターと制御配列が含まれていて、例えばジミアンウィル
ス40（SV40）のアーリープロモータ（Fiersら、1978年N
asure、273巻、113ページ）、レイトプロモータ、ある
いは他のウィルス由来のプロモータすなわちポリオー
マ、アデノウィルス２型、牛パピローマウィルス（BP
V）、トリ肉腫ウィルスなど、また免疫グロブリンのプ
ロモータや熱ショックプロモータが使われる。

BPVプロモータを使った哺乳類細胞中でDNAを発現させ
る系については、米国特許第4,419,446号に発表されて
いる。またこの系の修飾を加えたものについても、米国
特許第4,601,978号に発表されている。哺乳類細胞系で
の形質転換に関する概論は米国特許第4,399,216号にAxe
lが発表している。“エンハンサー”の領域もまた発現
を最適化するものとして重要であり；これは普通プロモ
ーターの上流に位置している。もし必要であれば、ウィ
ルスより複数開始点を得ることも可能である。しかしな
がら、真核細胞ではDNAの複製機構としては染色体へ組
み込まれて行なわれることが普通である。

植物細胞も宿主細胞として利用可能であり、植物細胞
で共通な制御配列すなわちノパリン合成酵素のプロモー
タやポリアデニル化シグナル配列（Depickerら、1982
年、J.Mol.Appl.Gen.1巻、561ページ）が使われる。バ
キュロウィルスベクターの制御配列を使用した昆虫細胞
での発現系についても報告されている（Millerら、Plen
um出版社、Stelowら編集Genetic Engineering 8巻、277
−297ページ）。昆虫細胞をベースにした発現系はSpodo
ptera frugipeidaを用いて行なわれている。これらの系
でも組換Tthポリメレースの産生に成功している。

使う宿主細胞によるが、形質転換はその宿主に適した
標準的な方法で行なわれる。Cohenらによる1972年、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA69巻2110ページに記載されてい
る、塩化カルシウムによるカルシウム処理法が、原核生
物その他の細胞膜をもっている細胞に対して行なわれ
る。ある種の植物細胞に対してはAgrobacterium tumefa
ciens（Shawら、1983年、Gene、23巻、315ページ）を用
いた感染法も行なわれている。哺乳類細胞に対しては、
Grahamとvan der Ebによる、1978年Virology、52巻546
ページのリン酸カルシウム沈殿法が好んで用いられてい
る。酵母での形質転換は、Van Solingenらの、1977年J.
Bact.、130巻946ページとHsiaoらの、1979年Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、76巻3829ページ、の方法に従って行なわ
れる。

宿主細胞内でのTthポリメレース遺伝子が発現できる
ようになると、その蛋白の精製が必要になる。前述した
精製方法により組換耐熱性ポリレメースの精製を行なえ
るが、疎水結合性クロマトグラフィによる精製が望まし
い。疎水結合性クロマトグラフィは、疎水性のグループ
を含んだ電荷をもたないカラムベッド材を使用して、疎
水結合力の差に基づいて物質を分離する方法である。普
通、カラムは最初疎水結合がおきるような条件すなわち
高イオン強度の条件で平衡化される。塩濃度を下降させ
ることによってサンプルの流出を行なう。

本発明では、水性の混合物（元々の、あるいは組換た
TtDNAポリメレースを含んでいる）を、フェニールセフ
ァロース（ファルマシア社より購入）やフェニールTSK
（東洋ソーダ社より購入）などの比較的疎水性の強いゲ
ルをつめたカラムにのせる。フェニールセファロースカ
ラムとの疎水結合を促進するために、0.2M以上（0.2Mが
望ましいが）の硫安を含む溶媒を使用する。カラムとサ
ンプルを、1mM DTTを含む50mM Tris−HCl,pH7.5、1mM E
DTAバッファー（TEバッファー）中で0.2M硫安濃度に調
節し、サンプルをカラムにかける。次にカラムを0.2M硫
安バッファーで洗う。次に、疎水結合を弱めるような溶
媒系即ち、塩濃度を下降させたり、エチレン、プロピレ
ングリコール、尿素などで洗いだすことで酵素が流出さ
れてくる。組換TtDNAポリメレースに対しては、カラム
をTrit−EDTAバッファーと20％エチレングリコール入り
Tris−EDTAバッファーで連続して洗うのが望ましい。Tt
DNAポリメレースは続いて、カラムを０−4M濃度勾配のT
ris−EDTAエチレングリコールバッファーで流出されて
くる。

長期間にわたって安定させるためには、TtDNAポリメ
レースを一種ないしそれ以上の非イオン性ポリマー性の
変性剤の入ったバッファー内に保存する。このような変
性剤としては分子量が100から250,000ダルトン位、好ま
しくは4,000から200,000ダルトンくらいでpHが3.5から
9.5、好ましくは４から8.5くらいで酵素を安定化させる
ものが一般に使われている。このような変性剤は1983年
MC出版社（175Rock Road,Glen Rock,NJ（USA）McCutheo
n部門より出版されたMcCutheon's Emulsifiers＆deterg
ents北米版の295−298ページに特集が組まれている、こ
こにすべて参考書類として付属してある。変性剤は以下
のようなグループから選ぶのが良い、エトキシ化脂肪酸
アルコールエーテル、ラウリルエーテル、エトキシ化ア
ルキルフェノール、オクチルフェノキシポリエトキシエ
タノール複合物、オキシエチル化直鎖アルコールあるい
はオキチプロピル化直鎖アルコール、ポリエチレングリ
コールモノオレート複合物、ポリソルベート複合物、フ
ェノリック脂肪酸アルコールエーテルなど。さらに推奨
するものとして、Tween20、ポリオキシエチル化（20）
ソルビタンモノラウリエート（ICI Americas社、Wilmin
gton,D.E.）とNP40、エトキシル化アルキルフェノール
（ノニル）（BASF Pyandotte社Parsippany,NJ）があ
る。

本発明のTtDNAポリメレースは、この酵素の活性が必
要あるいは望まれるような目的にたいして使用すること
が可能である。特にこの酵素はPCRとして良く知られて
いる核酸の増幅反応を触媒する。この核酸のシーケンス
を増幅させるプロセスは米国特許第4,683,202号、1987
年７月28日付けに、発表請求がされていて、これは参考
として付随してある。PCR核酸増幅法は、核酸あるいは
核酸の混合物中の少なくとも一種以上の核酸配列を増幅
して二本鎖DNAを作り出す方法である。

わかりやすくするために、以下で述べるプロトコルで
は、増幅される特定のシーケンスとは二本鎖核酸である
とする。しかしながら、この方法は、mRNAのような一本
鎖核酸を増幅するにも同様に有効な方法である。ただ最
終的な産物は二本鎖DNAであるが。一本鎖核酸の増幅で
は、最初のステップはその相補鎖の合成で（２つの増幅
用プライマーのうちの１つがこの目的で使われる）、続
いていかに述べる二本鎖核酸の増幅過程が連続して行な
われる。

この増幅の過程は以下のステップから構成される； （ａ）各々の核酸鎖と、４種のヌクレオシド３リン酸
と、各々の核酸鎖の特定の増幅させるシーケンスに対す
るオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させる過程
で、ここでそれぞれのプライマーは特定のシーケンスに
対して十分相補性をもっていて、プライマーより伸長産
物が合成され、伸長産物がその相補鎖より離れると、次
に別のプライマーからの伸長産物合成の鋳型となり、こ
こで接触とは各々のプライマーとそれの相補鎖がハイブ
リダイゼーションを行ないえるような温度であって、 （ｂ）各々の核酸鎖とThermus thrmophilus由来のDNAポ
リメレースとを、同時にあるいはステップ（Ａ）のあと
で、接触させ各々の核酸鎖の特定のシーケンスに相補的
なプライマー伸長産物を４種のヌクレオシド３リン酸の
組み合わせで産生し； （ｃ）ステップ（ｂ）の混合物を、各々の核酸鎖に相補
的なプライマーからの伸長産物すなわち増幅されるシー
ケンスを合成するように酵素活性を高めるために、有効
な温度に有効な時間、ただし各々の伸長産物が鋳型鎖よ
り離れてしまうほどの高温にはせず、保って、； （ｄ）ステップ（ｃ）の混合物を、鋳型鎖とその伸長産
物とが離れて一本鎖分子となるように十分な時間十分な
温度で、ただし酵素が不可逆的に変性を起こさないほど
の温度で、加熱し； （ｅ）ステップ（ｄ）の混合物を、プライマーとステッ
プ（ｄ）の一本鎖分子とがハイブリダイゼーションを形
成するのに必要な温度に必要な時間冷却し； （ｆ）ステップ（ｅ）の混合物を、ステップ（ｄ）でつ
くられた鋳型鎖に相補的なプライマーからの伸長産物す
なわち増幅されるシーケンスを合成するように酵素活性
を高めるために、有効な温度に有効な時間、ただし各々
の伸長産物が鋳型鎖より離れてしまうほどの高温にはせ
ず、保つ。ステップ（ｅ）、（ｆ）にある有効な温度、
時間とは同じ値であって、したがってステップ（ｅ）、
（ｆ）は同時に行なえるものである。ステップ（ｄ）−
（ｆ）は必要とされる増幅レベルに達するまで反復して
行なわれる。

増幅反応は、シーケンスのわかっている特定の核酸を
大量に増殖させるだけでなく、存在することはわかって
いるが、まだ完全に明らかになっていない核酸シーケン
スを増やすのに有効である。特定の核酸の両端のシーケ
ンスのある程度の塩基配列が、ある程度の正確さでわか
っていれば、各々の核酸鎖の目的のシーケンスで必要な
位置にハイブリダイズする２本のプライマーが用意でき
て、プライマーからの伸長産物が合成され、その伸長産
物が鋳型鎖より分離すると別のプライマーからの伸長産
物の鋳型鎖となって決められた長さの核酸シーケンスと
なる。シーケンス両端の塩基配列に関する情報が多いほ
ど、ターゲットとなる核酸に対する特異性は増加し反応
の効率も高くなる。いずれにしても、増幅すべきシーケ
ンスの最初のコピー（複製物）は得られるので、核酸シ
ーケンスは精製あるいはある一定の分子量が必要される
ことはない。一般的に、増幅反応は反応ステップ数に応
じて指数的に産生する連続反応であり、その反応は最低
１つの特定の核酸シーケンスが与えられ、（ａ）その両
端のシーケンスの情報がそれとハイブリダイズするプラ
イマーを合成するにじゅうぶんな程度わかっていて、
（ｂ）その連鎖反応を開始するための小量の核酸があつ
て引き起こされる。連鎖反応の産生物は、その両端に使
用した特異的プライマーの構造を反映したシーケンスを
持った特定の二本鎖核酸である。

反応開始における核酸としては、その核酸が含まれて
いるものあるいは含まれていると思われるものであれ
ば、精製されていても精製されていなくても構わない。
増幅するための核酸は任意の材料が使用可能で、例えば
プラスミドpBR322や、クローン化したDNA,RNA、バクテ
リア、酵母、ウィルス、微生物、より高等な植物、動物
など任意の原材料からのDNA,RNAから得ることができ
る。DNA,RNAは血液あるいは絨毛、羊水細胞などの組織
から種々の技術を用いて抽出することも可能である。こ
れについては、Maniatisらのsupra280−281頁を参照さ
れたい。このようにこの過程はDNAあるいはメッセンジ
ャーRNAをふくむRNAを取り扱うもので、DNA,RNAは一本
鎖あるいは二本鎖いずれの構造でも良い。あるいはDNA
−RNAのハイブリッドでも利用可能である。これらの任
意の核酸がミックスされたものでも増幅反応によって核
酸が産生される（プライマーは同じであっても、異なっ
てもよい）。増幅される特定の核酸配列は、出発材料の
ほんの一部分であっても良いし、最初からある一定の
量、出発材料全部であっても良い。

増幅されるシーケンスは反応開始時精製された形であ
る必要はなく、混合物中小量あればよく、全ヒトDNA中
のベータグロビン遺伝子（Saikiら、1985年Science、23
0巻、1530−1534ページ）やある微生物の一部分の核酸
配列でその微生物が生物材料中に極く一部しか含まれて
いないような場合が例にあげられる。細胞は低張バッフ
ァーに浮遊させ90−100℃の熱処理を、細胞が溶解し細
胞内成分が一様にとけるまで（普通１−15分）行なうこ
とによって、直接に増幅反応に使用できる。熱処理の
後、増幅反応のための試薬を直接細胞溶解液中に加え
る。反応開始時の核酸は目的の核酸配列以外のものが加
わっていても構わない。増幅反応は一種の核酸シーケン
スを大量に増幅させるだけでなく、同じ核酸上あるいは
別の核酸にのっている一種以上の異なった核酸シーケン
スを同時に増幅させることも可能である。

PCR反応ではプライマーが重要な役割を担っている。
“プライマー”という語はこの増幅反応の記述において
は一つ以上のプライマーの集まりを指すこととし、とく
に増幅される核酸断片の端部に関する情報に曖昧さがあ
るとき適応される。例えば、核酸シーケンスが蛋白シー
ケンスの情報より類推されるような場合、DNA遺伝子コ
ードの縮退によるすべての可能性のコドンの組み合わせ
をふくむプライマーのセットを各々の鎖に使うことを指
す。これらのセットのうちの一つが目的の核酸シーケン
スの端部と十分なホモロジーを持っていれば、このプラ
イマーの増幅反応で有効に働くことになる。

更に適当な数の異なったプライマーを使えば、数種の
核酸シーケンスが、最初の反応開始液中の核酸あるいは
核酸のミックスされたものから増幅されてくる。例え
ば、２種類の異なった核酸シーケンスを増幅させようと
すれば、４つのプライマーを使用すれば良い。このよう
にして、２種類の異なった核酸シーケンスがこの方法で
指数的に産生される。

より反応の特異性を増すために、あるシーケンス内の
特定のシーケンスを、一定の反応サイクル後に増幅する
ことも行なわれ、すなわち少なくとも１回以上の反応サ
イクルを行なった後、増幅させるべき内部シーケンス
（最初の増幅反応での端部のシーケンスとは異なる）に
相補的なプライマーの組を加えて行なわれる。このよう
なプライマーは任意の反応のステージで加えても良く、
その結果より短い増幅断片が産生される。これとは別
に、前に使用したプライマーとオーバーラップする部分
をもつが５′端では非相補的なシーケンスを持つプライ
マーを使用した場合は、より長い断片が増幅されてく
る。

プライマーはまた、増幅反応をインビトロ変異導入法
（in vitro mutagenesis）に応用するときも重要な役割
を果たす。使われプライマーが完全にオリジナルの鋳型
と相補性を持っていないとき、増幅反応でできる産物
は、鋳型ではなくプライマーのシーケンスを含んでいて
従って、in vitorの変異が導入されたことになる。この
先のサイクルになると、ミスマッチをおこしたプライミ
ング反応はもはや起きないので、導入された変異が効率
を下げることなく増幅されてくる。上述したDNAシーケ
ンスを変えるプロセスは、プライマーを変えることによ
って、変わったDNAシーケンスにたいし繰り返し行なっ
て、さらにDNAシーケンスに変更を加えることができ
る。このようにして、一連の変異シーケンスを、それぞ
れ新たな変更を加えることによって、一つ前のプロセス
と比べると微小な変化だがもとのDNAシーケンスとくら
べると大きな違いとなるように、段階的に作り出すこと
ができる。

プライマーは、増幅させる鎖に対する相補性をある程
度含んでいれば、一部分に非相補性の部分を含んでいて
もよいので、ほかの有益な応用も達成できる。例えば、
鋳型鎖とは非相補的な塩基配列（プロモータ、リンカ
ー、コーディング配列など）をプライマーの片方あるい
は両方の５′端に加えて、増幅反応で生産物にそのシー
ケンスを付け加えることができる。伸長プライマーを加
えた後、十分な反応サイクルをおこなって、非相補的な
挿入配列をもった新しい鋳型を必要な量つくることがで
きる。この結果、簡単な方法で比較的短時間に（２時間
あるいはそれ以内）、組み合わされた断片を大量に作る
ことができる。

オリゴヌクレオタイドプライマーは適当な方法を用い
て用意することができるが、たとえば前述したようなフ
ォソフォトリエステル、フォスフォダイエステル法や、
あるいはそれを自動化した方法で作られる。自動化した
方法の一つとして、ジエチルフォスフォアミダイトを材
料として、合成する方法がBeaucageら、1981年Tetrahed
ron Letters22巻、1859−1862ページに記載されてい
る。また、改良した固相支持体を使ってオリゴヌクレオ
タイドを合成する方法が米国特許第4,458,066号に発表
されている。またプライマーは生物材料より分離するこ
ともできる（制限酵素消化による断片など） どのようなプライマーを使うにしろ、反応液中にはPC
R反応が起きるために鋳型が入っていなくてはならな
い、というのは特定のシーケンスは、その特定のシーケ
ンスを含む核酸を鋳型として増幅されてくるからであ
る。最初のステップでは各々の核酸鎖が４種のヌクレオ
シド３リン酸と増幅されるそれぞれの核酸鎖に対するオ
リゴヌクレオタイドプライマーとの接触が起こる。もし
増幅されてくる核酸がDNAであるならば、ヌクレオシド
３リン酸は普通dATP,dCTP,dGTP,dTTPであるが、種々の
誘導体もこの反応で使用可能である。ヌクレオシド３リ
ン酸の濃度は広い範囲にわたって選べる。普通、50−20
0μＭ各dNTP濃度が増幅反応として選ばれ、１−3mM MgC
l₂が反応の効率と精度を上げるためにバッファーに加え
られる。しかしながらDNAシーケンスのような場合はdNT
P濃度は１−20μＭが望ましい場合もある。

ターゲットとなる核酸鎖は、さらに核酸を合成する際
の鋳型として働く。この合成は適した方法によって行な
えるが、普通緩衝化した水性の溶液中で行なわれ、pHは
７−９が好ましいが、約８付近が最も望ましい。合成を
行なうにはモル数過剰の（クローン化した核酸の場合10
00:1＝プライマー：テンプレート、遺伝子核酸の場合10
⁸:1＝プライマー：テンプレート）２つのオリゴヌクレ
オタイドプライマーを鋳型鎖が含まれているバッファー
中に加える。実際には、加えるプライマー量は、増幅さ
れるシーケンスが種々の長い核酸のミックスされたもの
のなかにあるような場合は鋳型鎖にくらべモル数過剰と
する。反応を効率良く進めるには大モル数過剰とするの
が望ましい。

鋳型、プライマー、ヌクレオシド３リン酸の混合物
は、増幅あるいは検出する核酸が一本鎖か二本鎖かによ
って、それぞれ処理される。もし核酸が一本鎖であるな
らば熱変性のステップは必要でなく、反応液はプライマ
ーと鋳型とがハイブリダイゼーションを形成するような
温度条件にされる。この温度とは普通35−65℃あるいは
それ以上であるが、37−60℃位が好ましく、有効な時間
は普通２、３秒から５分であるが30秒から１分が望まし
い。TthDNAポリメレースでは、ハイブリダイゼーション
温度は45−58℃で行なわれ、15merあるいはそれ以上の
長さのプライマーがハイブリダイゼーションの正確さを
あげるために使われる。より短いプライマーを使う際に
は、ハイブリダイゼーション温度を、より低くする必要
がある。もとの一本鎖核酸を相補鎖を合成するには、適
当なバッファー、dNTP、１種以上のプライマーにTthDNA
ポリメレースを加えればよい。適当な１種のプライマー
が加えられると、一本鎖核酸に相補的なプライマー伸長
物ができ、核酸鎖とハイブリダイズして同じ長さあるい
は異なったながさのデュプレックスを形成し（プライマ
ーが鋳型鎖のどこにハイブリダイズしたかによるが）、
つぎに前述したように２本の分離した、互いに相補的な
一本鎖となる。変法として、２ないしそれ以上のプライ
マー（ひとつを、他のプライマーからの伸長産物を鋳型
として、プライム合成用に使用する）を一本鎖核酸に加
えて反応を行なうこともできる。

もし核酸中に２つの鎖が含まれているとき、すなわち
ターゲットが二本鎖か、ターゲットが一本鎖で二回目の
増幅反応の時、核酸鎖はプライマーとのハイブリダイゼ
ーションに先立って、その鎖（ストランド）の分離（セ
パレーション）を行なわなければならない。このストラ
ンドセパレーションは、物理的、化学的あるいは酵素的
な方法を含む任意の適切な変性方法で行なえる。核酸の
鎖を分離する物理的な方法の一つで薦められる方法は、
核酸を加熱して完全に（99％以上）変性させる方法であ
る。熱変性の典型的な方法は、核酸のサイズ構成による
が、温度は90−105℃、時間は２、３秒から５分かけて
行なう。有効な変性温度は90−100℃で10秒から３分が
望ましい。ストランドセパレーションは、ヘリカーゼと
してしられる酵素群あるいはリボATPの存在下でヘリカ
ーゼ活性をしめしDNAを変性するRecAによっても行なう
ことが可能である。ヘリカーゼによるストランドセパレ
ーションの最適な反応条件はKuhnHoffmann−Berling、1
978年、CSH−Quantitave Biology、43巻、63ページに記
載されていて、RecAを使った技術はRadding、1982年Gen
etics、16巻、405−437ページにレビューとして記載さ
れている。変性されてできた２本の相補鎖は長さが等し
い場合と等しくない場合がある。

二本鎖核酸が熱で変性されると、反応液はプライマー
とそれに対する相補的な鋳型鎖がハイブリダイズするよ
うな温度まで冷却される。この温度とは、試薬にもよる
が、普通35−65℃あるいはそれ以上であるが、37−60℃
位が好ましく、有効な時間は普通30秒から５分である
が、１分から３分が望ましい。実際は、単に温度を95℃
から37℃付近まで下げる間にハイブリダイゼーションが
起こる。

核酸が一本鎖か二本鎖いずれでも、Thermus thremoph
ilus由来のDNAポリメレースを、変性ステップ、温度を
下げているとき、あるいはハイブリダイゼーションを促
進しているとき、いずれのときにも反応液に加えること
ができる。耐熱性TthDNAポリメレースは反応液にいつで
も加えることが可能であるが、厳しい条件で（stringen
t）でハイブリダイゼーションをさせるに必要な温度よ
り低い温度に反応液があるときはポリメレースを加えな
いほうが、非特異的な増幅反応を防止できる。ハイブリ
ダイゼーション後、反応液は、酵素がプライマーとテン
プレートのハイブリダイズしたものから伸長物を合成す
る酵素活性を促進し最適にするような温度に上げられ
て、その温度に維持される。温度はそれぞれの核酸鎖に
相補的なプライマーからの伸長産物が合成されるような
温度でなくてはならないが、それぞれの伸長産物がその
相補鎖より変性されて離れてしまうほど高い温度であっ
てはならない（即ち、温度は普通80−90℃よりは低
い）。

使われる核酸によるが、合成反応に対する有効な温度
は40−80℃で、50−75℃が好ましい温度である。Thermu
s thremophilus DNAポリメレースでは、65−75℃がより
望ましい。この合成に必要とされる時間は0.5−40分あ
るいはそれ以上であるが、それは温度、核酸の長さ、酵
素、核酸混合物の複雑さに主に依存する。伸長に要する
時間は普通30秒から３分である。もし核酸長が長けれ
ば、相補鎖の合成にはより長い時間が必要となる。

新たに合成された鎖と相補鎖は二重鎖分子を形成し、
次の増幅過程で使われることになる。次のステップで、
二本鎖分子の鎖は、変性させるに十分な温度と時間で、
しかし耐熱性酵素を不可逆的に変性あるいは失活させる
ほどの高温、長時間でなく、熱変性され、分けられる。
鋳型鎖の変性後、プライマーと相補的な一本鎖分子（鋳
型）とのハイブリダイゼーションが進むような温度に、
前述したように下げられる。

ハイブリダイゼーションのステップの後、あるいはハ
イブリダイゼーションのステップと同時に、新たに合成
された鎖と、もとからある鎖の両方を鋳型として使っ
て、プライマー伸長物を合成できるに耐熱性酵素の活性
が促進するように温度を調節する。温度は前述したよう
に、伸長産物がその相補鎖より変性されて離れてしまう
ほど高い温度であってはならない。このような場合、同
時に反応を起こさせるステップでは、50−70℃の温度範
囲が適当である。

加熱と冷却のステップ中には、１サイクルのストラン
ドセパレーション、ハイブリダイゼーション、伸長産物
の合成が含まれていて、特定の核酸シーケンスを目的の
量まで増やすまで繰り返すことができる。制限を与える
のは、プライマー、耐熱性酵素、ヌクレオシド３リン酸
の量である。普通、15から30サイクルが行なわれる。増
幅したDNAを診断の目的に検出しようとするなら、必要
とするサイクル数はサンプルの性質に依存する。例え
ば、増幅されるサンプルが精製されたものであれば、サ
イクル数は少なくてすむ、もしサンプルが核酸の混合物
であるならば、検出に必要なシグナルをえるにはより多
くのサイクル数を必要とする。一般的な増幅および検出
には約15回のサイクルを繰り返す。増幅されたシーケン
スを、標識したシーケンス特異的なプローブで検出し、
ヒトの遺伝子DNAが増幅のターゲットの場合、明瞭なシ
グナルを検出可能な、すなわちバックグラウンドノイズ
が検出の妨げとならないためには15−30回のサイクルの
反復が必要である。

ヌクレオタイド、プライマー、耐熱性酵素は反応開始
時に加えられれば、消費されたり、酵素が不可逆的に変
性したり失活しないかぎり、更に加える必要はなく、も
しそのような場合は、反応を続けるためにポリメレース
あるいは他の試薬を加えればよい。しかしながら、各ス
テップでそのような材料を加えても、それほど反応を進
めるわけではない。適当な数の反応サイクルが実行さ
れ、必要な量の特定の核酸シーケンスが産生されれば、
反応は普通に行なわれている方法、すなわちEDTA、フェ
ノール、SDS、クロロホルムなどを加えて酵素を失活さ
せるか、反応を分けることによって、停止する。

増幅反応は連続して行なわれるべきである。自動化を
実現したものの一つとして、反応溶液を、温度が一定の
レベルで一定の時間制御するようにプログラム化して、
温度循環を行なう方法がある。この目的のための機械と
して、増幅反応を自動的に行なう機械がPerkin−Elmer
Cetus社によって開発、販売されている。この装置でPCR
を行なうための詳細なインストラクションは装置を購入
すると入手できる。

Tth DNAポリメレースは、ポリメレース連鎖反応によ
る核酸シーケンスの増幅が有用な様々な反応を実行する
に際して、非常に有用である。増幅反応は特定の核酸シ
ーケンスをクローン化して適当な発現ベクターに挿入す
るのに利用され、米国特許第4,800,159号に記載されて
いる。ベクターは標準的な組換DNA技術によって適当な
宿主に形質転換されシーケンスに対応する遺伝子産物の
生産が行なわれる。このようなクローニングには、平滑
末端ライゲーションによって直接ベクターに連結させる
方法と、制限酵素を使ってプライマー内のサイトを切断
して行なう方法がある。他の、Tth DNAポリメレースに
適した方法としては、米国特許第4,683,194号、4,683,1
95号4,683,202号、欧州特許公報第229,701号、237,362
号、258,017号に記載されており、参考として付けてあ
る。さらに本出願の酵素は非対称PCR（Gyllensten dnd
Erlich,1988年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85巻、7652−
7656ページ、参考として付けてある）、反転PCR（Ochma
nら、1988年Genetics、120巻、621ページ、参考として
付けてある）、DNAシーケンシング（Innsら、1988年Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA、85巻、9436−9440ページ、MaCon
logueら、1988年、Nuc.Acids.Res.、16巻（20号）、986
9ページ）に有用である。Tth DNAポリメレースはまた逆
転写酵素活性を持っている。

いかに示す例は、単に説明するために提示しているも
ので、本発明の出願範囲に制限を加えようとしているも
のではない。これらの例の中で使われている用語は特に
断わりがないかぎり、パーセントは固体の場合は重量パ
ーセント、溶液の場合は体積パーセント、温度は摂氏で
ある。

例１ Thermus thremophilus DNAポリメレースの精製 本例では、Thermus thremophilusよりTth DNAポリメ
レースを分離することについて述べている。Tth DNAポ
リメレースは、精製の各段階で、LawyerらにJ.Biol.Che
m.1989年、264巻（11号）6427−6437に、Taqポリメレー
スについて記載されている方法にしたがってその活性の
アッセイを行なった。この文献は参考文献としてつけて
ある。

定型的には、このアッセイは以下の組性からなる反応
混合液中で行なわれる。:25mM TAPS−HCl、pH9.5（20
℃）;50mM KCl;2mM MgCl₂;1mMβメルカプトエタノール;
200μＭ各dATP、dGTP、dTTP;100μＭα−³²P−dCTP（0.
03−0.07μCi/nmol）;12.5μｇサケ精子DNA;およびポリ
メレース。反応は希釈液中の酵素を入れて開始し、74℃
で行なわれる（希釈液の組性は10mM Tris−HCl、pH8.
0、50mM KCl、0.1mM EDTA、1mg/ml滅菌ゼラチン、0.5％
NP−40、0.5％TWEEN20、1mMβメルカプトエタノー
ル）。10分間の反応後、60mM EDTAを10μｌ加えて、反
応を停止する。遠心後、50μｌの反応液を、1Mlの50μg
/ml、2mM EDTA溶液中に移す（０℃）。等量（1Ml）の20
％TCA溶液と２％ピロリン酸ナトリウム液を加え混ぜ
る。混合液を０℃で15−20分反応させ、ワットマンGF/C
フィルターで濾過し５％TCA溶液と１％ピロリン酸ナト
リウム混合液で十分に洗い（5ml×６回）、さらに95％
冷エタノールで洗う。フィルターを乾燥後放射能活性を
計測する。バックグランド（酵素なしで行なった反応）
は通常最初に加えた放射活性の0.001％から0.01％以内
である。ユニットの計算のため、スタンダードして50−
250pmolの₃₂P−dCTPをスポットする。１ユニットは74℃
30分の反応で10nmolのdCTPが取り込まれたとき１ユニッ
トする。ユニットは次式に従って計算する。

酵素活性は反応時間と完全に比例関係にあるわけでは
ない。精製した酵素の場合、30分のアッセイでは10分の
アッセイの2.5倍の活性を示す。

約202gの凍結したThermus thremophilusのHB8株（ATC
C、27、634）を100mlの３×TE−DTTバッファー（150mM
Tris−HCl、pH7.5、3mM EDTA、3mM DTT.、2.4mM PMSF
（PMSFは144mM濃度でDMFに溶解したストック溶液より使
用））で溶かし、ブレンダーで低速でホモジェナイズす
る。全ての操作はことわらないかぎり０℃−４℃で行な
う。ガラス器具は全て乾燥滅菌し、精製に使う溶液はオ
ートクレーブ可能なものは全てオートクレーブする。溶
解した細胞はAminco French pressure cell（18,000ps
i）で溶菌し、等量の2.4mM PMSFを含む１×TE−DTTバッ
ファーで希釈し、次に、粘性が低下するまで超音波処理
で行なう（アリコット1/3、80％出力、10分間、デュー
ティーサイクル50％）。ライゼートを2.4mM PMSFを含む
１×TE−DTTバッファーで湿重量の5.5倍となるように希
釈する。得られた分画、分画Ｉ（１、100ml）には、15.
6gの蛋白が含まれていて活性は46.8×10⁴ユニットであ
った。

0.2M（29.07g）となるように硫安を加え、氷上で30分
撹拌した。硫安を加えることで沈殿が形成されるが、こ
の沈殿はのちにのべるPEI沈殿操作まで取り除かないで
おく。硫安を加えることにより粗溶液中でポリメレース
とDNAが結合すること及びポリメレートと他の蛋白間で
のイオン相互作用を減少させる。精製操作を迅速に行な
うこと（フェニール−セファロースカラムにサンプルを
のせ、流出すること）と、蛋白分解酵素阻止剤（2.4mM
PMSF）をくわえることはDNAポリメレースの蛋白分解を
防ぐうえで重要である。さらに良い結果を望むなら、硫
安沈殿後、沈殿物を遠心で除く装置の前に、大部分の核
酸を取り除くためにポリミンＰ（BOHより購入）沈殿操
作を行なうのがよい。同様に、ポリミンP/硫安ペレット
のうえの柔らかい、粘凋なペレットもこれには核酸を含
んでいないので、画分IIに含めて構わない。アガロース
ゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色によって、ポ
リミンＰ上清には、大分子量のDNA、RNAは90％以上除か
れていることがわかる。粘凋なペレットをくわえた場合
は、その蛋白量が増した分、フェニール−セファロース
カラムを、後述するより10％程度のスケールアップする
のが望ましい。

経験的に、0.2％ポリミンＰ（ポリエチレニミン、PE
I）沈殿中には全核酸の90％以上が沈殿している。ポリ
ミンＰ（pH7.5）を0.2％となるようにゆっくりと加え
（10％PEI22ml）スラリーを氷上でゆっくり撹拌し、30,
000g4℃で45分遠心する。920mlの上清をすてたのち、PE
Iペレット上の柔らかい、粘凋なペレットを再度遠心す
る。粘凋物を186,000g2℃で１時間遠心すると40mlの上
清と非常に大きなゼラチン状のペレットが得られる。こ
のペレット中には画分Ｉで見られる活性の２％以下が認
められ、1.96gあるいは画分Ｉの12.5％の蛋白が含まれ
ている。上清を回収し（画分II、960ml）ここには10.5g
の蛋白と42.6×10⁴ユニットの活性が認められた。

画分IIを3.2×6.5cm（52ml）のフェニール−セファロ
ースCL−4Bカラム（ロット番号MIO2547、Pharmacia−LK
Bより購入）（0.2M硫安、0.5mM DTTを含むTEバッファー
で平衡化）にのせ80ml/hr（10ml/cm²/hr）で流した。レ
ジンは全て推奨されている方法にしたがって平衡化、再
生した。カラムを同じバッファー240mlで洗ったのち（A
280がベースラインにおちるまで）、220mlの0.5mM DTT
を含むTEバッファー（硫安は含まない）であらいTthポ
リメレース以外の蛋白を外した。次にカラムを270mlの2
0％エチレングリコール（0.5mM DTT、TEバッファー）で
洗ってその他の混入蛋白を洗い、2M尿素を含む20％エチ
レングリコール（0.5mM DTT、TEバッファー）洗って、
ポリメレース活性を流出させた。ポリメレース活性を示
す画分（5ml）を回収した。（画分III a、84ml）。活性
試験でフロースルー画分と洗いだし画分を調べた結果、
カラムのキャパシティを越えた場合、のせたポリメレー
ス活性の50％程度しかカラムに結合しなかったことがわ
かった。カラムのキャパシティを越えないようにするた
めに、より大きいカラム（最低２倍以上の）を使用すべ
きである。同じ程度の活性を持ったフロースルー画分と
洗いだし画分を回収し、（画分II b、685ml）、0.2M硫
安濃度に調製後、平衡化、再生したカラムに再度かけ
た。

ポリミンＰを含む画分（フェニール−セファロースカ
ラムのフロースルー画分）ちゅうの低レベルのポリメレ
ース活性の定量は10mM EDTA存在化、比存在化両条件で
行なうべきである。EDTAが存在することで、ポリミンＰ
に結合しているヌクレオチド基質による放射活性のバッ
ググランドの上昇を是正できる可能性があるからであ
る。

前述したように、Tthポリメレース活性は2M尿素と共
に流出されてくる。（画分III a）。画分II bを再度フ
ェニール−セファロースカラムにかけている間、この2M
尿素流出画分はヘパリンセファロースローディングバッ
ファーで透析し、尿素に長時間さらさないようにすべき
である（カルバミル化をふせぐため）。透析画分III a
には42％の活性を示し（179、213ユニット）、3.5％の
蛋白が存在し（351mg）、したがって精製度は12倍であ
った。回収したフロースルー画分と2M尿素流出画分中に
はカラムにかけた量の42.6％（181、555ユニット）の活
性と40.8％（４、110mg）の蛋白が、結合しなかったTth
ポリメレース（画分II b）として見られた。最初のバッ
ファーで平衡化、再生したカラムに画分II bを再度かけ
た。

画分II bを、フェニール−セファロースカラムに11時
間78mlの速度でのせた。カラムを270mlの0.2M硫安、0.5
mM DTT、をふくむTEバッファーで洗い、次に170mlの0.5
mM DTTを含むTEバッファー（硫安を含まず）で洗い、最
後に260mlの20％エチレングリコール、0.5mM DTTを含む
TEバッファーで洗った。Tthポリメレースを再度、20％
エチレングリコール、0.5mM DTT、2M尿素を含むTEバッ
ファーで流出させた。このポリメレース活性を含む画分
（4.3ml）を回収した。（画分III b） 2M尿素流出画分（画分III b）にはカラムにのせたう
ちの、87％の活性が認められ（159、132ユニット）、8.
3％の蛋白が含まれていた、したがって精製度は9.7倍で
あった。

画分III b（116.4ml）は、0.15M KCl濃度に調節され
画分III aと共に回収され、50mMトリス、pH7.5、0.1mM
EDTA、0.2％Tween20、0.5mM DTT、0.15M KClで活性を保
ったまま透析し、４℃にて、貯留した。この画分III（2
43ml）の中には特異的あるいは非特異的なTthエンドヌ
クレース、エキソヌクレースのかなりの量の混入を認め
た。この合わせた画分IIIには326、009ユニットの活性
と725mgの蛋白が存在していた。

画分IIIを2.2×12cm（45ml）ヘパリンセファロースCL
−6Bカラム（Pharmacia−LKBより購入）にのせ、0.15M
KCl、50mMトリス、pH7.5、0.1mM EDTA、0.2％Tween20、
0.5mM DTTで45ml/hrの速度で平衡化した。のせたうち全
ての活性がカラムに捕捉された。カラムは最初175mlの
同じバッファーで洗われ（吸光度A₂₈₀がベースラインに
落ちるまで）、次に670mlの150−750mM KCl線形濃度勾
配バッファーで流出した。0.31−0.355mM KCl濃度勾配
部に流出さてきた画分（5.25ml）を回収した（画分IV、
149ml）。Taq DNAポリメレースは0.33M KCl濃度の流出
ピークを示すが、同様にTth DNAポリメレースは0.33M K
Cl濃度でTth HB81エンドヌクレース（Taq Iエンドヌク
レース〔TCCA〕とイソシゾマーの関係）と共に流出され
てくる。

画分IVはアミコンYM30メンブランで約10倍に濃縮さ
れ、続いて25mMトリス、pH7.5、0.1mM EDTA、0.2％Twee
n20、0.5mM DTT、100mM KClバッファーで透析を行なっ
た。透析ちゅうに形成された沈殿物は遠心によって取り
除いた。（12,000g、10分、４℃）が活性は失われなか
った。ヘパリンセファロースカラムを含むこれら一連の
ステップで27倍の濃縮度すなわちヘパリンセファロース
カラムにのせたうちの95％の活性をリカバーすることが
できた。

Tth DNAポリメレースはそのシーケンスがTaq DNAポリ
メレースと88％の一致（93％の類似性）を示すにもかか
わらず、これら蛋白間の10％の違いがフォスフォセルロ
ースによる精製の特性に重大な差を生じさせている。Ta
q DNAポリメレースでは、pH7.5のトリスバッファーでカ
ラムの流出を行なうと、フォスフォセルロースより0.2M
KClのときに流出してきて、混在するエンドヌクレース
は0.6−0.8M KClの濃度で流出してくるのに対し、Tth D
NAポリメレースと混在するエンドヌクレースはフォスフ
ォセルロースカラムでは容易に分離しえない。Tth DNA
ポリメレースは約0.45M KClの濃度ピーク付近に流出さ
れるのに対し、Tthエンドヌクレースは0.58M KCl濃度ピ
ークで流出される。アフィゲルブルー（Biorad Laborat
ories）はTth DNAポリメレースとTthエンドヌクレース
を分離するのに有効なレジンである。アフィゲルブルー
は塩基結合サイトを有する酵素をアフィニティ精製する
ために用いられる色素結合レジンである。

画分IVの遠心後の上清（16.8ml）を、1.6×10cm（20m
l）アフィゲルブルーカラム（25mMトリス、pH7.5,0.1mM
EDTA、0.2％Tween20、0.5mM DTT、100mM KClバッファ
ーで平衡化）に20ml/hrの速度でのせた。カラムにかえ
たTth DNAポリメレース活性の全てがレジンに結合し
た。カラムを30mlの同じバッファーで洗ったのち（吸光
度A₂₈₀がベースラインに落ちるまで）、300mlの0.1M−
0.5M KCl線形勾配濃度のバッファーで流出した。0.28−
0.455M KCl濃度間に流出した画分（3.05ml）で二本鎖あ
るいは一本鎖DNAエンドヌクレース混入のないことを確
かめた、すなわち５−20ユニットのTth DNAポリメレー
ス活性と600ng共役閉環プラスミドpLSG1あるいは850ngM
13mg18一本鎖DNAを60℃で１時間間から11時間反応さ
せ、特異的あるいは非特異的なDNA断片の低分子化がな
いことを確かめた。KCl濃度勾配を加えると、Tth DNAポ
リメレースは約0.35M KCl付近にややひろがったピーク
で流出され、エンドヌクレースは0.5M KCl以上の濃度で
流出されてくる。アフィゲルブルーカラムを0.15M KCl
で洗い、0.15M−0.6M KClの濃度勾配バッファーで流出
を行なうとより良い分離が行なえるであろう。

SDS−PAGE泳動パターンにもとずいて、二通りのプー
ルを行なった。画分Vaはピーク画分（61ml）から、画分
Vbはその両脇の画分から（72.5ml）プールした。画分Va
には22.2×10⁴ユニットの活性と蛋白で5.5mgが、画分Vb
には、5.2×10⁴ユニットの酵素活性と蛋白が3.5mg含ま
れていた。それぞれの回収物は別々にYM30メンブランで
濃縮、透析濾過された。画分VbはアミコンYM30メンブラ
ンで約10倍に濃縮される50mM NaClを含むCM−トリスア
クリルバッファー（25mM酢酸ナトリウム、pH5.0、0.5mM
DTT、0.1mM EDTA、0.2％Tween20）で透析した。透析中
に形成された沈殿物は再度遠心して取り除いたが（12,0
00g、10分、４℃）わずかな活性を失ったにすぎず（２
％以下）1.4倍の精製度が得られた。上清（8.6ml、5.1
×10⁴ユニット活性、2.3mg蛋白）を１×3.8cm（3ml）CM
−トリスアクリルカラム（CM−トリスアクリルバッファ
ーで平衡化）に3ml/hrの速度でかけた。カラムにのせた
活性は全てカラムに捕捉された。カラムを17mlの同じバ
ッファーで洗ったのち50mlの0.05−0.7M NaClの線形段
階状の濃度勾配バッファーで流出を行なった。0.175−
0.25M濃度で流出された画分（1ml）を、画分Vaと共にプ
ールする前にSDS−PAGE電気泳動での解析を行なった。T
th DNAポリメレース活性は0.21M NaCl濃度に鋭いピーク
を持って流出されてきた。この画分のSDS−PAGE電気泳
動解析より、ポリメレースは高度に濃縮されているがな
お35KDa、25KDa、18KDa付近に混在するバンドが認めら
れた。画分Ｖ（11.4ml）、画分Vaと画分VbをCM−トリス
アクリルカラム処理したピーク画分をミックスしたも
の、を50mM NaCl wo含むCM−トリスアクリルバッファー
で透析した。形成した沈殿物は遠心によって取り除いた
が（12,000g、10分、４℃）活性はほとんど失われなか
った。沈殿物には0.91mgの蛋白と（約20％）、２、227
ユニットの活性が認められた（１％以下）。

得られた上清（12.8ml、5.18mg蛋白、24.8×10⁴ユニ
ット活性）を1.6×60cm（12ml）のCM−トリスアクリル
カラム（50mM NaClを含むCM−トリスアクリルバッファ
ーで平衡化）12ml/hrでのせた。カラムを20mlの同じバ
ッファーで洗ったのち、27mlの100mM NaClを含むCM−ト
リスアクリルバッファーで洗った。フロースルー画分に
はポリメレース活性は検出されなかった。技術上の問題
より（カラムアダプターの破損）100−400mM NaCl線形
濃度勾配をかけたとき、400mM NaCl濃度ですぐに流出が
始まった。カラムにのせたうちの28％の活性（19.4×10
4ユニット、49mg蛋白）を回収し、同じ大きさのCM−ト
リスアクリルカラムに再度かけた。

カラムにのせる画分（35ml）を、50mM NaCl濃度に調
製した結果、2.7倍希釈された。カラムを33mlの同じバ
ッファーで洗ったのち、180mlの50−400mM NaCl線形濃
度勾配バッファーで流出した。0.16−0.2M NaCl濃度に
流出されてきた画分（1.4ml）をセントリコン30メンブ
レンで2.5×ストレージバッファー（50mMトリス、pH7.
5、0.25mM EDTA、2.5mM DTT、0.5％Tween20（（ピアー
ス社、Surfact−Amps））濃縮、透析濾過を行なった。T
th DNAポリメレース活性は0.183M NaCl濃度に流出ピー
クを示したが、トライアルにくらべ若干早く流出されて
きた。Taq DNAポリメレース活性の場合は、CM−トリス
アクリルカラムに同じ酢酸ナトリウムバッファーpH5.0
で流出すると、0.19−0.205M NaCl濃度に流出されてく
る。濃縮、透析濾過を行なったサンプルは1.5倍の80％
グリセロール（フィッシャー社、スペクトル分析グレー
ド、オートクレーブ滅菌）で希釈後、−20℃に保存し、
それぞれの画分のSDS−PAGE電気泳動による解析を行な
った。Tth DNAポリメレースを含む画分はSDS−PAGE電気
泳動による解析で約85−90％の純度であった。主要なバ
ンドは約90KDa蛋白として泳動されていたが、若干の混
入物のバンドもあった。実際、観察されて分子量約90KD
aと計算による分子量94KDa（遺伝子配列より）の差は、
泳動ゲル内の異常な移動によるか、精製過程での分解に
よるものと考えられる。それぞれの画分の染色のパター
ンは同じであり、全ての画分を一つにまとめた（画分V
I、21.5ml） 画分VIを更に アミコンYM30メンブレンで2.5×ストレージバッファ
ー中で濃縮、透析濾過を行なった。このとき容積は7ml
で、内2mlをアミノ酸成分と配列の解析に使用した。残
りの6.8mlを1.6mlに濃縮し80％グリセロール2.4mlで希
釈した。最終産物（4ml）中には、蛋白が2.17mg、活性
が162、789ユニット（34.8％産出）で、比活性は75、01
8ユニット/mg蛋白であった。精製の各ステップの結果を
テーブルにして次に示す。

例２ Thermus themophilus Tth DNAポリメレースＩ遺伝子の
クローニング 本例では、Thermus themophilusのTth DNAポリメレー
スＩ（Tth Pol I遺伝子クローニングのすすめかた、方
法についてのべる。T.aquaticus DNAポリメレースＩ（T
aq Pol I）遺伝子からPCR増幅したDNA断片をプローブと
してTth Pol I遺伝子の制限酵素認識サイトとそれをは
さむ領域についてジェノミックDNAブロットを行なっ
た。Taq Pol I遺伝子特異的なプライマーを使ってTth P
ol I遺伝子のPCR増幅を行なうと、Tth Pol I遺伝子につ
いてより詳しい制限酵素認識サイトと核酸配列の情報が
得られた。この情報にもとずいて、Tth Pol I遺伝子を
プラスミドpBS13＋（ストラタジーン社、このプラスミ
ドはBSM13＋としてもしられている）に２段階でクロー
ニングした。

A.プローブの用意 ４種類の認識プローブを、T.aquaticus DNAとビオチ
ン化dUTP）ビオチン−11−dUTP、Bethesda Research La
boratories）とのPCRでつくり、Thermus themophilus D
NAのサザンブロットのプローブとして使用した。プロー
ブＡはCMO7とEK194から作り、Taq Pol I遺伝子５′端の
−230から＋207塩基部の438bpを覆う。プローブＢはMK1
38とMK124から作り、Taq Pol I遺伝子のHind/IIIサイト
をまたがって＋555から＋879をおおう355bp長のプロー
ブである。プローブＣはMK143とMK131から作り、Taq Po
l I遺伝子のテンプレート−プライマー結合部位のコー
ディング配列とBam HIサイトの＋1313から＋1819をおお
う579bp長のプローブである。プローブＤはMK130とMK15
1から作り、Taq Pol I遺伝子の３′端＋2108から＋3384
塩基部をおおう473bp長のプローブである。

これらプローブを作成するのに使用したプライマーの
配列を以下に示す。

Taq Pol I遺伝子の配列はLawyerらの論文および米国
特許出願第143,441号、1988年１月12日出願、で発表さ
れていて、両者とも参考資料として付けられている。

プローブはおのおの以下の組性からなる100μｌの反
応混合液で作制された： 10mM Tris−HCl、pH9.0（pHは混合液中のビオチン化d
UTPのpHと中和するように9.0に設定されている；ビオチ
ン化dUTPは100mM Tris−HCl、pH7.4内に溶解）、50mM K
Cl、1.0mM MgCl2、100μg/mgゼラチン、２ユニットTaq
Pol I（Perkin−Elmer Cetus社より市販）、50μM dAT
P、50μM dCTP、50μM dGTP、37.5μM dTTP、12.5μM b
iotin−11−dTUP、50pmol各プライマー、および鋳型DN
A。鋳型DNAは同じプライマーを使って25サイクルのPCR
産物を100倍希釈したものの１μｌを用いていて、この
ときの反応混合液は次の組性からなっている；、10mM T
ris−HCl、pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、200μＭ各d
NTP、M biotin−11−dUTPはふくまず、1.0ngのTaq DNA
は３分間ボイルして氷上で冷やして用いた。PCRはPerki
n−ElmerCetus社のサーマルサイクラーを使用した。プ
ローブを作製するために、プローブとテンプレート以下
の15回のサイクルで作った;98℃まで１分45秒で到達、9
8℃で15秒（チューブ内の温度は96.5℃）、55℃まで45
秒で到達、55℃で20秒、45秒で72℃で到達、72℃で30
秒、そして最後のサイクル終了後72℃で５分間反応を行
なった。

Lawyerらが記述しているように、プローブとハイブリ
ダイズしたジェノミックDNAを分離し、Maniatisの記述
にしたがってサザンブロットを行なったがニトロセルロ
ースフィルタのかわりにMSI Magnagraph^TMナイロンメン
ブランフィルターを用い、DNAの固定も熱固定の替わり
に紫外線固定を行なった。（UV.Stratalinker^TM1800、S
tratagene社より販売） フィルターブロットは42℃２時間で以下の組性の溶液
中でプレハイブリダイゼーションを行なった;5×SSPE、
５×デンハルト溶液、0.5SDS、５％デキストランサルフ
ェート、150μg/mlキャリアーDNA、50％フォルマミド。
フィルターブロットに対するプローブのハイブリダイゼ
ーションは同じ溶液中に10ng/mlのプローブを入れて42
℃１晩で行なった。ハイブリダイゼーション後、メンブ
ランフィルターを洗って、結合していないプローブを取
り除いた。

４種類のプローブはそれぞれThermus thermophilus D
NAとハイブリダイズした。Tth Pol I遺伝子領域の制限
酵素切断地図はTth DNAを制限酵素Pst I、BamH I、Sac
II、Asp718でそれぞれ切断してサザンブロットをおこな
い作製した。さらにTth DNAをHind III/Asp718、Hid II
I/BstE II、Hind III/Nhe I、BamH I/Asp718、BamH I/B
stE II、BamH I/Sph I、BamH I/Nhe Iの組み合わせで二
重消化を行ない、そのサザンブロットを行なった。この
結果、Tth Pol I遺伝子のクローニングに利用する制限
酵素地図の作製が行なえた。

B.Tth Pol I遺伝子のテンプレート−プライマー結合部
位のPCR増幅 Tth遺伝子DNAを鋳型として、Taq Pol I遺伝子のテン
プレート−プライマー結合部位をコードする領域に一致
するプライマーを使って、一連のPCR増幅反応を行なっ
た。数種のプライマーをさまざまな組み合わせでPCR反
応に用い、Taq Pol I遺伝子の293−1891塩基に相当する
Taq Pol I遺伝子の種々の領域を増幅しようと試みた。
１つのプライマーの組み合わせ、MK143とMK131が増幅物
を合成した。

増幅反応は10mM Tris−HCl、pH8.3、50mM KCl、1.5mM
MgCl₂、２ユニットTaq Pol I（Perkin−Elmer Cetus社
より市販）、200μＭ各dNTP、1ng熱変性Tth DNA、50pmo
l各プライマーちゅうで行なわれた。増幅は前述したの
と同じ熱サイクルプログラムを25回行ない、PCR産物は
ポリアクリルアミドゲルで解析した。

満足のいく増幅ができなかったプライマーの多くは、
のちにシーケンスされたTth Pol I遺伝子と比較した結
果多くのミスマッチを持っていたり、あるいはプライマ
ーの３′端に戦略上のミスマッチがあった。プライマー
MK143はTth Pol I遺伝子と比較し３つのミスマッチがあ
ったがそれは５′端にあって続く15ベースは一致してい
た。プライマーMK131は２つのミスマッチがあったが、
そのミスマッチはプライマーのなかほどにあった。

プライマーMK143/MK131によるTth遺伝子からの増幅物
は、ポリアクリルアミトゲルで泳動するとTaq遺伝子を
鋳型とした反応でつくられたものと同じ移動度を示し
た。TaqとTth遺伝子からの増幅物の制限酵素地図を作製
すると、BamH I、Sac I、Xho Iに関しては同じであった
が、Sac II、Pst Iでは異なっていた。プライマーMK143
/MK131によるTth遺伝子からの増幅物はさらに同じプラ
イマーを使いGyllnestenとEhlichの1987年Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA85巻（20号）7652−7656あるいはInnisらの1
988年Proc.Natl.Acad.Sci.USA85巻（20号）9436−9440
に記載している非対称PCR法を用いてDNAのシーケンス解
析を行なった。

C.Tth Pol I遺伝子５′端のクローニング サザンブロット法およびPCR法の解析によりTth Pol I
遺伝子クローニングを２ステップで進める方法を開発し
た。Tth DNAの約3Kb長のHind III断片がプローブＡ、
Ｂ、ＣとはハイブリダイズしてプローブＤとはハイブリ
ダイズしなかったことからこの3Kb長のHind III断片Bam
H I認識サイトを含んでいて、この遺伝子の５′端のク
ローニングに有用であることがわかった。

Tth Pol I遺伝子５′端のクローニングのため、Hind
III消化Tth DNAを0.5インチ円筒ゲルで泳動中に５分毎
に250μｌずつ分画化して、約3Kbの長さの断片をゲルよ
り流出させて回収した。プローブとのドットブロットの
結果この分画には目的とするDNA断片が含まれていた。
このDNA断片をBamH I制限酵素で消化したのち、小牛小
腸アルカリフォスファターゼ（CIAP）処理を行なった。
CIAPはBoehringer Mannheim社より入手し、指定の方法
で使用した。これらの実験で使用した制限酵素、E.coli
DNAポリメレース、ライゲースの酵素はNew England Bi
olabs、Boeringer Mannheim（Asp718）、Promega（Csp4
5;Asu IIのイソシゾマー）より入手でき、指定の方法で
用いる。

プラスミドpBS13＋（Stratagene社より入手）同様に
制限こうそBamH IとHind IIIで消化し、つぎにBamH I消
化CIAP処理3Kb長Hind III断片とライゲーション反応を
行なった。ライゲーション反応後の混合液をHanahanら
の方法にしたがって、大腸菌E.coli K12株DG98（thi−
１、endA1、hsdR17,lacIQ、lacZΔM15、proC::Tn10、su
pE44/F′、lacZΔM15、proC＋、：登録番号39、768とし
てATCCより入手可能）の形質転換に用いた。アンピシリ
ン耐性形質転換体（AmpR）から、Ｘ−gal寒天プレート
上で青色示さないコロニーを選択し、形質転換細胞のDN
Aと32P標識した（γ−32P−ATPによるリン酸化反応）プ
イマーMK143でハイブリダイゼーションを行なった。（W
oodらの1982年Proc.Natl.Acad.Sci.USA79巻5661による
レプリカプレーテイング法とレプリカされた細胞の溶解
法にしたがって。）１つのコロニーがプラスミドを含ん
でいて、それをpBSM:Tth5′と命名した。これは約2.5Kb
長のHind III−BamH I制限酵素断片がpBS13＋のHind II
I−BamH I断片と連結してできたものである。

D.Tth Pol I遺伝子３′端のクローニング Tth Pol I遺伝子の３′端をプラスミドpBSM:Tth5に挿
入しベクターpBSM:Tthを作製した、これには完全なTth
Pol I遺伝子コーディング配列を含んでいる。サザンブ
ロットおよびDNAシーケンス解析によりTth遺伝子の12Kb
長のBamH I断片はAsp718で切断されて5.6Kb長断片がつ
くられそれはプローブＤとハイブリダイズする（この断
片はプローブＣともハイブリダイズするはずである）。
5.6Kb BamH I−Asp718制限酵素断片を作り出すBamH Iサ
イトはプラスミドpBSM:Tth5′作製に用いられた2.5Kb H
ind III−BamH IをつくりだすBamH Iサイトと同一のも
のであることもわかっていた。

Tth DNAはBamH Iで完全消化され、前述した方法でサ
イズによって分画し、12Kb長を含む画分を同定し集め
た。ビオチン化したプローブＤとＣとのドットブロット
でハイブリダイズする画分を回収しAsp718で消化し、CI
AP処理を行ない、BamH I−Asp718で消化したプラスミド
pBSM:Tth5′とライゲーション反応を行なった。連結さ
れたDNAは大腸菌E.coli K12株DG101（thi−１、endA1、
hsdR17、lacIQ、lacZΔM15、proC::Tn10）の形質転換を
行なった。

アンピシリン耐性形質転換体（AmpR）より上述した方
法で32−Ｐ標識したプライマーMK132を用いプラスミド
を含む形質転換体を得、pBSM:Tthと名付けた。これには
5.6Kb BamH I−Asp718断片と2.5Kb Hind III−BamH I断
片が正規の向きで配列し完全なTth Pol I遺伝子を構成
していた。オリゴヌクレオタイドMK132のシーケンスは
完全にTth Pol I遺伝子と一致していた。プローブとハ
イブリダイズするコロニーで制限酵素消化により予想さ
れる断片が生じるいくかのコロニーを選んでIPTGで誘導
を行ない、Taq Pol Iに対するポリクローナル抗体で、
誘導をおこったサンプルと誘導を行なわなかったサンプ
ルのウェスタンブロッティングを行ないIPTGによって発
現が誘導される蛋白はTaq Pol Iとおなじ分子量であっ
た。（約94KDa）このうちの１つのコロニーをATCCへ登
録したので承認番号ATCC68195で入手が可能である。こ
の株を維持するに際しては、プラスミドDNAの逸失をふ
せぐためアンピシリンを使用し続けるべきである。ATCC
68195はしたがって非形質転換体DG101細胞を得るために
使用することが可能である。

例３ プラスミドpLSG21の構築 ３′非コーディング領域（“下流”）配列をけずると
大腸菌E.coli内で組換Thermus DNAポリメレースの発現
が増強されることが報告されている。pBSM:TthをBstE I
IとKpn Iで二重消化を行ない、４種のdNTP存在下でクレ
ノー酵素による修復を行なったのち、分子間内のライゲ
ーション反応がおこるのに適した希釈した条件でライゲ
ーション反応をさせると３′非コーディング領域配列が
けずられたTth DNAポリメレースが作られる。制限酵素B
stE IIはプラスミドpBSM:TthのTth DNAポリメレース
３′非コーディング領域内を切断し、Kpn Iはベクター
のポリリンカー領域を切断する。

上の欠失を行ない作られたプラスミドをプラスミドpL
SG21と命名した。欠失操作によって制限酵素BestE IIサ
イトはなくなった。しかしながら、プラスミドpLSG21は
プラスミドpBSM:Tthで形質転換した大腸菌宿主細胞で発
現しているTth DNAポリメレース量をさらに増強させる
わけではなかった。

例 ４ プラスミドpLSG22、pLSG23、pLSG24の構築 Tth Pol I遺伝子にはその５′端、３′端に都合の良
い制限酵素のサイトがない。このような制限酵素サイト
は多くの種類の発現ベクターを構築するうえで役立つ。
更に、５′端のコドンは高度にGCに富んだ配列で、大腸
菌E.coli内で発現および蛋白の翻訳を効率的に開始する
のを阻止する作用がある。オリゴヌクレオタイドを使っ
た、サイトダイレクテッドミュータジェネシス（Sitedi
rected mutagenesis）法によりTth Pol I遺伝子のコー
ディングシーケンス内および、５′３′非コーディング
領域内、に多くの有用な変更を加えることができる。

プラスミドpBS13＋の誘導体、すなわちpBSM:Tthは、L
awyerらおよびプラスミドpBS13＋の供給社であるStrata
gene社のプロトコルにしたがって、一本鎖DNAのかたち
で取り出すことができる。プラスミドpBS13＋およびプ
ラスミドpBS13＋の誘導体の一本鎖DNAを作り出すには、
プラスミドで形質転換されている宿主細胞をヘルパーフ
ァージ（R408など）で感染させて、ファージDNAが生産
されるような条件で培養を行えば良い。ファージDNAを
回収すれば目的の一本鎖DNAと小量のヘルパーファージ
由来のファージDNAが得られる。目的の一本鎖DNAは、そ
のサイズの違いより、電気流出法などでヘルパーファー
ジDNAを取り除くことができる。

次に示すプラスミドの構築を行なうについて、pBSMΔ
Pvu IIの使用が便利である。pBSMΔPvu IIはpBS13＋よ
り382bpのPvu II断片を欠失させたものである。サイト
ダイレクテッドミュータジェネシスのプロトコルは以下
のステップからなっている。：（１）一本鎖DNApBSM:Tt
h（あるいは他のpBS13＋誘導体）と二本鎖Pvu II消化プ
ラスミドpBSMΔPvu IIを分子比１−2.5（pBSM:Tth/pBSM
ΔPvu II）でクレノーバッファー中で３分間沸騰させて
アニーリングを行ない、さらに65℃で５分間インキュベ
ートする；（２）ミューテーションを導入したオリゴヌ
クレオチドを燐酸化し、オリゴヌクレオチドを95℃１分
で熱変性後、分子量５−１の割合でギャップ形成デュプ
レックスにくわえて75℃に保ち、ギャップ形成デュプレ
ックスとアニーリングを行なう。；（３）この反応ミッ
クスチュアを75℃２分間インキュベートし室温まで徐々
に冷却する。；（４）このアニールしたミックスチュア
を４種のdNTP（各200μＭ）存在下でクレノウ酵素で37
℃15分間伸張させ、次に40μMATPとライゲースを加え
る。この反応物をE.coli K12 DG101株の形質転換に使用
する。

アンピシリン耐性株を適当なプライマーでスクリーニ
ングする。プラスミドDNAを保持していて、プローブと
ハイブリダイズするコロニーをR66培地（0.6％牛肉抽出
物、0.6％酵母抽出物、２％ペプトン、0.5％NaCl、40mM
KPO₄、pH7.2、0.2％ブドウ糖、100μg/mlアンピシリ
ン）3mlに入れて、37℃８時間インキュベートし、Brinb
oimとDolyの方法にしたがって、プラスミドDNAを調製し
て使用する。得られたプラスミドDNAは制限酵素消化と
シーケンシングを行なって、目的とするプラスミドが得
られたか確認する。

A.プラスミドpLSG22の構築 オリゴヌクレオチドDG122を用いて、前述の方法でTth
Pol I遺伝子コーディングシーケンスのTGAストップコ
ドンの下流にEcoR V、Bgl III制限酵素認識サイトをプ
ラスミドpBSM:Tth内に変異を加えて作り出し、オリゴヌ
クレオチドDG123でプローブハイブリダイゼーションに
よってかくにんした。これらオリゴヌクレオチドのシー
ケンスは下の通りである。

得られたプラスミドはpLSG22と命名した。

B.プラスミドpLSG23の構築 プラスミドpLSG22に変異を導入して、Tth Pol I遺伝
子コーディングシーケンスのATGスタートコドン部にBst
XI、Ase I（Csp451）制限酵素認識サイトを導入した。
これに加え、コドン２、３及び５−７をアミノ酸残基を
替えないようによりATに富んだシーケンスとなるように
変異させた。変異生成に用いたオリゴヌクレオチドDG18
9は次に示す。

得られたプラスミドをpLSG23と命名した。プラスミド
pLSG23を持った形質転換体は、アンピシリン耐性の形質
（AmpR）およびオリゴヌクレオチドDG118とのハイブリ
ダイゼーションによって同定した。オリゴヌクレオチド
DG118は次の通りである。

C.プラスミドpLSG24の構築 プラスミドpLSG22に変異を導入して、Tth Pol I遺伝
子コーディングシーケンスのATGスタートコドン部にBst
XI、Nde I制限酵素認識サイトを導入した。これに加
え、コドン２、３及び５−７をアミノ酸残基を替えない
ようによりATに富んだシーケンスとなるように変異させ
た。変異生成に用いたオリゴヌクレオチドDG190は次に
示す。

得られたプラスミドをpLSG24と命名した。プラスミド
pLSG24を持った形質転換体は、アンピシリン耐性の形質
（AmpR）およびオリゴヌクレオチドDG118とのハイブリ
ダイゼーションによって同定した。

例 ５ プラスミドpLSG27およびpLSG28の構築 A.プラスミドpBSM:TthΔStu I/Hind IIIの構築 プラスミドpLSG27、pLSG28は一部は欠失したTth Pol
I遺伝子を発現させるためのベクターである。欠失はTth
Pol I遺伝子コーディングシーケンスのアミノ末端より
約80コドンをけずってつくられた。このベクターを構築
するため、最初プラスミドpBSM:Tth5′を制限酵素Stu I
とHind IIIで完全消化された。消化後、プラスミドは４
種のdNTP存在下でクレノー酵素処理され、次にライゲー
ション反応によって環状プラスミドに戻された。この処
理で、Tth Pol I遺伝子の５′非コーディング領域から
コドン78まで（Stu Iサイトはコドン77−79にまたがっ
ている）欠失された。pBSM:Tth5′はまたTth Pol I遺伝
子コーディングシーケンスの３′端の部分を欠失してい
る。得られたプラスミドをpBSM:TthΔStu I/Hind IIIと
命名した。

B.プラスミドpLSG25の構築 プラスミドpBSM:TthΔStu I/Hind IIIに、オリゴヌク
レオチドDG191を用いて、前述の方法で変異を導入しプ
ラスミドpLSG25を作った。プラスミドpLSG25では、一部
が欠失したTth Pol I遺伝子を、lacプロモータより発現
するように、その位置を変えている。更に、lacZαコー
ディングシーケンスをけずり、Ase I制限酵素認識サイ
トをATGスタートコドンに作製した。変異を導入するオ
リゴヌクレオチドDG191は次の通りのシーケンスであ
る。

プラスミドpLSG25を持った形質転換体は、アンピシリ
ン耐性の形質（AmpR）およびオリゴヌクレオチドDG193
とのハイブリダイゼーションによって同定した。オリゴ
ヌクレオチドDG193は次の通りである。

C.プラスミドpLSG26の構築 プラスミドpLSG26の構築は、pLSG25と同様にDG191の
代わりにDG192を変異導入のリンカーとして用いて行な
った。DG192のシーケンスは次の通りである。

プラスミドpLSG26は、プラスミドpLSG25でATCスター
トコドンに作製したAae I制限酵素認識サイトがNde Iサ
イトである以外はプラスミドpLSG25と同じである。プラ
スミドpLSG26を持った形質転換体は、アンピシリン耐性
の形質（AmpR）およびオリゴヌクレオチドDG193とのハ
イブリダイゼーションによって同定した。

D.プラスミドpLSG27とプラスミドpLSG28の最終構築 前述したように、pBSM:Tth5′はTth Pol I遺伝子コー
ディングシーケンスの３′端の部分を欠失しているの
で、プラスミドpLSG25とプラスミドpLSG26も同様にこの
部分のシーケンスを欠いている。Tth Pol I遺伝子コー
ディングシーケンスの３′端の部分をプラスミドpLSG25
とプラスミドpLSG26内に正しいリーディングフレームで
入れるために、それぞれのプラスミドをBamH I、EcoR I
で完全に消化した。次にプラスミドpLSG25のBamH I−Ec
oR I断片の大きい断片とプラスミドpLSG22の約1.2Kb Ba
mH I−EcoR I断片とをライゲーションさせてpLSG27を作
った。プラスミドpLSG22の約1.2Kb BamH I−EcoR I断片
にはTth Pol I遺伝子コーディングシーケンスの３′端
の部分が含まれている。同じようにして、プラスミドpL
SG26をBamH I、EcoR Iで完全消化しプラスミドpLSG22の
約1.2Kb BamH I−EcoR I断片とをライゲーションさせて
pLSG28を作った。プラスミドpLSG27とプラスミドpLSG28
の大腸菌内での、活性をもった欠失型Tth Pol I酵素の
発現量は低かった。

例 ６ プラスミドpLSG29からpLSG34までの構築 pBSM:Tth5、pLSG21、pLSG22、pLSG23、pLSG24、pLSG2
7、pLSG28は大腸菌内でTth Pol I酵素活性を発現させる
ために、lacプロモータを持っているが、lacプロモータ
より強力なプロモータを使用することで、Tth Pol I酵
素活性の発現のレベルを上げることが期待できるのは、
技術界では良く知られたことである。有名な強力なプロ
モータの１つは、ラムダファージ由来のPLプロモータで
ある。更により高いレベルの発現あるいはより効率的な
産生は、Tth Pol I酵素発現ベクターのリボソーム結合
サイト、転写終了シーケンス、複製開始点（あるいは、
それに関係したエレメント）に変更を加えることによっ
て可能である。本例ではTth Pol I酵素発現のため、発
現ベクター内にどのようにしてラムダPLプロモータ、バ
クテリオファージT7遺伝子10、ラムダ遺伝子のＮリボソ
ーム結合サイトを配置したかを示した。

A.発現ベクターpDG160およびpDG161の構築 プラスミドpDG160は以下の性質を備えたλP_Lクローニ
ング用および発現ベクターである：ラムダPLプロモー
タ、ラムダ遺伝子のＮリボソーム結合サイト（米国特許
第4,711,845号を参照されたい。参考書類として付属）
を持つ、ポリリンカー内にクローニングされたシーケン
スがラムダPL−N_RBSの制御のもとで発現できるように制
限酵素認識配列サイトポリリンカーを配置している、Ba
cillus thuringensisの転写終結配列（米国特許第4,66
6,848号を参照されたい。参考書類として付属）を持
つ。プラスミドpDG160はまた変異RNA II遺伝子を有し、
このプラスミドをコピー数に対して温度感受性としてい
る（米国特許第4,631,257号を参照）。これらのエレメ
ントは共同で働いて、プラスミドpDG160を非常に有用で
強力な発現ベクターとしている。30−32℃では、このプ
ラスミドのコピー数は低く、温度感受性のλリプレッサ
ー遺伝子（CI857など）を持っている宿主細胞内では、P
Lプロモータは機能していない。37−41℃ではプラスミ
ドのコピー数は25−50倍となり、CI857リプレッサーは
不活性化し、PLプロモータが機能するようになる。プラ
スシドpDG160はアンピシリン耐性マーカ（AmpR）を持っ
ている。プラスミドpDG161はプラスミドpDG160と同じで
あるが、アンピシリン耐性マーカー（AmpR）の代わりに
テトラサイクリン耐性マーカ（TetR）を持っている。

このようにして、プラスミドpDG160とプラスミドpDG1
61はColE I cop^tsベクター内に、AmpR、TetRマーカー、
ラムダPLプロモータ、ラムダ遺伝子のＮリボソーム結合
サイト、ポリリンカー、BT cry PRE（BTボジティブ レ
トロウィルス調節エレメント、米国特許第4,666,848
号）をもった発現ベクターである。これらのプラスミド
は、前述したプラスミドと合成二本鎖オリゴヌクレオタ
イドDG31、DG32から構築された。DG31/DG32合成二本鎖
オリゴヌクレオタイドはその５′端にHind IIIの突出末
端を持ち、続いてSac I、Nco I、Kpn I/Asp718、Xma I/
Sma Iサイトがあり３′端にBamH Iの突出末端を持つ。
この二本鎖リンカーのシーケンスを下に示す。

この二本鎖リンカーとプラスミドpFC54.tをプラスミ
ドpDG160の構築に用いた。

プラスミドpFC54.tは5.96Kb長のプラスミドで米国特
許第4,666,848号に発表されていて、承認番号ATCC39789
でATCCより入手可能な大腸菌、プロファージλN₇N₅₃cI
857をもったE.coli K12株DG95を宿主として利用可能で
あり、Hind IIIとBamH Iで消化したのち、分離したベク
ター断片を、分子数で５倍以上の脱リン酸化したDG31/D
G32合成二本鎖とライゲーションを行なった。

ライゲーション後、DNAをXba Iで消化し（ベクターpF
C54.t DNA断片を不活化するため）E.coli K12株DG116
（ATCC53、606）をアンピシリン耐性株にするために用
いた。コロニーのスクリーニングは制限酵素消化を行な
ってdes−ala−ser125IL−２変異蛋白シーケンスがなく
なりDG31/DG32ポリリンカーシーケンスが生じたものを
選んだ。アンピシリン耐性株のひとつのプラスミド（pD
G160と命名した）のポリリンカー部分のシーケンス決定
を行なって、望んだ構築が達成されていることを確認し
た。

プラスミドpAW740CHB（承認番号ATCC67、605としてAT
CCより大腸菌E.coli K12 DG116として入手可能）はBamH
I、Hind IIIサイトのなくなったテトラサイクリン耐性
遺伝子の供給源として使われるが、これにはColEl cop
^tsベクター内にラムダPLプロモータ、ラムダ遺伝子のＮ
リボソーム係合サイト、BT cry PREを持っているが、Hi
nd IIIとBamH Iで完全に消化され、4.19Kbのベクター断
片をアガロース電気泳動で精製した。精製したベクター
DNA断片は分子数で５倍以上の脱リン酸化したDG31/DG32
合成二本鎖とライゲーションを行なった。大腸菌E.coli
K12 DG116株をこのDNAで形質転換し、4.2Kbプラスミド
を持つものをテトラサイクリン耐性のコロニーから選択
した。いくつかの形質転換体をさらに制限酵素消化ある
いはサンガー法によるシーケンス決定を行なって、スク
リーニングを行なった。いくつかの形質転換体は望んだ
シーケンスを持つプラスミドを含んでいて、そのプラス
ミドをpDG161と命名した。

B.発現プラスミドpDG164からpDG181までの構築 Tthの発現を容易にし、翻訳開始の効率をあげるため
にpDG160とpDG161のラムダPLプロモータ、ラムダ遺伝子
のＮリボソーム結合サイト（RBS）に変更を加えた。こ
の変更のため、プラスミドpDG160とpDG161をBspM IIとS
ac Iで消化し、短い合成リンカーでプラスミド内のBspM
II−Sac I断片部をこの合成リンカーで置き換えた。こ
こで使用したいくつかの二本鎖リンカーは異なった構造
と性質を持ったものである。合成二本鎖DG106/DG107は
バクテリオファージT7遺伝子10のRBSとATGスタートコド
ン内に制限酵素Nde Iサイトをコードするようになって
いて、次の構造となっている。

合成二本鎖DG108/DG109は修飾されたT7遺伝子10のRBS
とATGスタートコドン内に制限酵素Ase Iサイトをコード
するようになっていて、次の構造となっている。

合成二本鎖DG110/DG111はλN_RBSとATGスタートコドン
内に制限酵素Nde Iサイトをコードするようになってい
て、次の構造となっている。

合成二本鎖DG112/DG113はλN_RBSとATGスタートコドン
内に制限酵素Ase Iサイトをコードするようになってい
て、次の構造となっている。

これらの合成二本鎖とBspM II−Sac Iで消化したプラ
スミドpDG160とpDG161をしたのテーブルの組み合わせて
ライゲーションし、プラスミドpDG164からpDG171まで作
成した。

これらのプラスミドは、プラスミドpDG160とpDG161と
共にTth Pol I遺伝子コーディングシーケンスに挿入す
る前にさらに修飾を加えて、プラスミドpDG172からpDG1
81まで作成した。

この修飾により、プラスミドpDG160とpDG161およびプ
ラスミドpDG164からpDG171までのCsp451（Asu II）制限
酵素認識サイトが破壊された。本発明中の多くのベクタ
ーはTth Pol I遺伝子コーディングシーケンスの５′端
にCsp451（Asu II）制限酵素認識サイトを持っている。
これらのCsp451欠失ベクターは制限酵素Csp451（Asu I
I）で作成した断片のクローニングベクターとして有用
である。Csp451はプラスミドのコリシン^IMM遺伝子内で
ありCsp 451で消化して、４種のdNTP存在下で、クレノ
ー酵素により平滑末端二本鎖DNAとして、ライゲーショ
ンして再び環状プラスミドにして、Csp451サイトを削っ
た。得られたプラスミドをpDG172からpDG181と命名し次
のテーブルに示す。

pDG172からpDG181は次に、本発明のTth Pol I遺伝子
がλP_Lプロモータの制御の下で発現するためのベクター
の作成に使われた。

C.Tth Pol I発現ベクターpLSG29からpLSG36までの構築 Tth Pol I遺伝子を発現ベクターpDG172からpDG181内
にクローニングすればTth Pol I発現ベクターを作成す
ることができる。いくつかのプラスミドの構築を次のテ
ーブルに示す。

発現ベクターpLSG29からpLSG36までを大腸菌K12株DG1
16に導入し、Tth Pol I遺伝子が発現するような条件で
培養した。すべての形質転換体はほぼ同程度のポリメレ
ース活性を産生したが、T7RBSをもつベクターに比べ、N
RBSを持つベクターのほうが若干産生が多いようであっ
た。λP_Lプロモータを持つベクターもTth Pol Iを産生
しそのレベルはlacプロモータを持つ発現ベクターより
すくなくとも１オーダー高かった。

例 ７ 大腸菌での組換Tth Pol I活性の産生 λP_Lプロモータを持つTth Pol I発現プラスミドを持
つ大腸菌K12株DG116（ATCC53,606）を、0.5％ブドウ
糖、10μg/mlチアミン、0.25％（W/V）Difco社カゼイ
ン、アンピシリン（100μg/ml）あるいはテトラサイク
リン（100μg/ml）の入ったBonner−Vogel最小塩培地で
32℃で培養した。細胞は吸光度A₆₀₀が0.8に達したとこ
ろでλP_Lプロモータを制御するため（cI857リプレッサ
を不活性化）温度を37℃に変えベクタープラスミドのCo
lEl cop^tsのコピー数を増加させた。37℃で増殖後６時
間から９時間後、細胞を回収し、遠心してペレットを−
70℃に保存した。

別の方法として、大腸菌K12株KB2（ATCC53,075）をtr
p（トリプトファン）プロモータ／オペレータの制御の
下でTth Pol Iを発現するプラスミドを導入して、その
大腸菌を0.5％ブドウ糖、５μg/mlトリプトンファン、1
0μg/mlチアミン、0.25％（W/V）Difco社カゼンイン、
アンピシリン（100μg/ml）あるいはテトラサイクリン
（100μg/ml）の入ったBonner−Vogel最小塩培地で32℃
で培養し、吸光度A₆₀₀が3.0に達するまで培養する方法
もある。細胞はこのあと前述した方法で回収する。

細胞のペレットは50mM Tris−HCl pH7.5 1mM EDTA,2.
4mM PMSF,0.5μg/mlリュウペプチンでO.D.が５から10と
なるように再浮遊させ超音波で細胞を溶解する。超音波
処理した抽出物をSDS−PAGEにかけクーマシー染色ある
いはラビット抗Taqポリメレース抗体によるウェスタン
免疫ブロッティング法で解析した。

ウェスタン免疫ブロッティング法により、Tth発現プ
ラスミドを導入された細胞で約94KDaのTth DNAポリメレ
ースが顕著に合成されていることがわかった。SDS−PAG
Eで分離した細胞蛋白のクーマシー染色でも、細胞中で
約94KDaの新たなポリペプチドが誘導発現されているこ
とがわかった。最終的に、高温下での活性のアッセイに
より顕著な量の組換Tth DNAポリメレースが大腸菌で産
生されていることが確かめられた。

例 ８ Tth DNAポリメレースにおるPCR反応 例１で示された、約1.25ユニットの精製したTth DNA
ポリメレースをつかって、Tth遺伝子内にコードされて
いるTthのrRNAシーケンスの増幅を行なった。反応液の
容積は50μｌで、反応ミックスには50pmolのプライマー
DG73、10⁵から10コピーのTth遺伝子（約２×10⁵遺伝子
コピー/ngDNA）、50pmolのプライマーDG74,200μＭ各dN
TP,2mM MgCl₂,10mM Tris−HCl,pH8.3,50mM KCl,100μg/
mlゼラチン（入れなくてもよい）が入っている。

反応はPerkin−Elmer Cetus社のDNA Thermal Cycler
で行なった。96℃15秒、50℃30秒、75℃30秒を１サイク
ルとして25−30サイクルを行なった。20サイクルの反応
でゲルのエチヂウムブロマイド染色でかすかなバンドが
認められ、30サイクルではエチヂウムブロマイド染色し
たゲルを紫外線で照らして生産物をはっきりと見ること
ができた。

Tth DNAポリメレースのユニット数が少ないときは
（0.31ユニット/50μｌ）小量の非特異的な産物が作ら
れていた。また、laureth−12のような非イオン性の界
面活性を反応混合液中に最終濃度１％となるように加え
ておくと、PCR産物が増える。

プライマーDG73とプライマーDG74を下に示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ストッフェル，スザンヌ アメリカ合衆国94530 カリフォルニア 州エル セリト，ガルビン ドライブ 935 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．264（11) Ｐ．6427−6437（1989) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．149 （10）Ｐ．41−46（1985) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/12 C12N 15/54 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヌクレオシド三リン酸の結合について触媒
   作用をし、核酸テンプレート鎖に対して相補的な核酸鎖
   を形成する熱安定性DNAポリメレース酵素をコードするD
   NAであって、前記ポリメレースがアミノ末端からカルボ
   キシ末端までの下記アミノ酸配列： 又は上記全配列中のおよそ79位のアミノ酸からおよび70
   0位のアミノ酸までのアミノ酸配列、又は上記全配列の
   Ｎ−末端から約３分の１までが除去されたアミノ酸配
   列、を有する熱安定性DNAポリメレース酵素をコードす
   るDNA。
2. 【請求項２】配列： 又は上記塩基配列によりコードされるアミノ酸配列中の
   およそ79位のアミノ酸からおよそ700位のアミノ酸まで
   のアミノ酸配列をコードする上記配列の部分配列、又は
   上記塩基配列によりコードされるアミノ酸配列のＮ−末
   端から約３分の１までが除去されたアミノ酸配列をコー
   ドする上記配列の部分配列である請求の範囲第１項に記
   載のDNA。
3. 【請求項３】前記熱安定性DNAポリメレース酵素が、サ
   ーマス サーモフィルス（Thermus thermophilus）由来
   である請求の範囲第１項または第２項の何れか１項に記
   載のDNA。
4. 【請求項４】前記熱安定性DNAポリメレース酵素が、
   ５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求の範
   囲第１項〜第３項の何れか１項に記載のDNA。
5. 【請求項５】前記熱安定性DNAポリメレース酵素が、逆
   転写酵素活性を有する、請求の範囲第１項〜第４項の何
   れか１項に記載のDNA。
6. 【請求項６】前記熱安定性DNAポリメレース酵素が、単
   一ポリペプチド鎖を有してなる請求の範囲第１項〜第５
   項の何れか１項に記載のDNA。
7. 【請求項７】前記熱安定性DNAポリメレース酵素が、約9
   4kDaの分子量を有する請求の範囲第１項〜第６項の何れ
   か１項に記載のDNA。
8. 【請求項８】熱安定性DNAポリメレース活性を有し、サ
   ーマス サーモフィルス ポリメレースの一次構造に対
   して蛋白質のアミノ酸配列を変化させるべく、欠失、付
   加又は変更等の修飾を含む蛋白質をコードし、前記蛋白
   質が、請求の範囲第１項に定義されるアミノ酸配列中の
   ９個のアミノ酸の少なくとも５個の連続配列に対して10
   0％の相同性を有し、前記９個のアミノ酸の連続配列
   が、アミノ酸位置238−246,241−249,335−343,336−34
   4,337−345,338−346,339−347からなる群から選択され
   る請求の範囲第１項〜第７項の何れか１項に記載のDN
   A。
9. 【請求項９】熱安定性DNAポリメレース活性を有し、サ
   ーマス サーモフィルス ポリメレースの一次構造に対
   して蛋白質のアミノ酸配列を変化させるべく、欠失、付
   加又は変更等の修飾を含む蛋白質をコードし、前記蛋白
   質が、請求の範囲第１項に定義されるアミノ酸配列中の
   ６個のアミノ酸の少なくとも４個の連続配列に対して10
   0％の相同性を有し、前記６個のアミノ酸の連続配列
   が、アミノ酸位置225−230である請求の範囲第１項〜第
   ７項の何れか１項に記載のDNA。
10. 【請求項１０】請求の範囲第１項〜第９項の何れか１項
    に記載のDNAを含んでなる組換えDNAベクター。
11. 【請求項１１】寄託株ATCC No.68195から得ることがで
    きるプラスミドpBSM:Tthである請求の範囲第10項に記載
    の組換えDNAベクター。
12. 【請求項１２】請求の範囲第10〜11項のいずれか一つに
    記載の組換えDNAベクターにより形質転換された組換え
    宿主細胞。
13. 【請求項１３】大腸菌（E.coli）である請求の範囲第12
    項に記載の宿主細胞。
14. 【請求項１４】E.coli K12/pBSM:Tth（ATCC No.68195）
    である請求の範囲第13項に記載の宿主細胞。