JP2584198B2 - サーモトガ・マリチマ由来の熱安定性核酸ポリメラーゼをコードする遺伝子 - Google Patents

サーモトガ・マリチマ由来の熱安定性核酸ポリメラーゼをコードする遺伝子

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、超好熱性ユーバクテリ
ア（eu bacteria)サーモトガ・マリチマ（Thermotoga
maritima）由来の熱安定性 DNAポリメラーゼをコードす
る遺伝子に関する。熱安定性 DNAポリメラーゼは、多数
の組換え DNA技術、ことにポリメラーゼ連鎖反応（PCR)
による核酸の増幅において有用である。
【０００２】
【従来の技術】バクテリアであるサーモトガ・マリチマ
（Thermotoga maritima）の分離は Huberら、1986, Ar
ch.Microbiol. , 144 :324-333に記載されている。サー
モトガ・マリチマ（T. maritima）は、偏性嫌気性、桿
形、発酵性、超好熱性であり、そして55℃〜90℃におい
て増殖し、至適な増殖温度は約80℃である。このユーバ
クテリウムは、イタリーおよびアゾレスにおける地熱で
加熱された海底から単離された。
【０００３】サーモトガ・マリチマ（Thermotoga mari
tima）細胞は鞘様構造および単毛の鞭毛を有する。サー
モトガ・マリチマ（T. maritima）はムレインおよび脂
肪酸含有脂質、ジフテリア毒素抵抗性延長因子２、 RNA
ポリメラーゼサブユニットのパターン、および抗生物質
に対する感受性によりユーバクテリア界に分類される。
広範な研究が中温性微生物、例えば、大腸菌（E. col
i）からの DNAポリメラーゼの単離について実施されて
きている。例えば、 Bessmanら、1957, J.Biol.Chem.,
223 :171-177、およびButtinおよびKornberg, 1996, J.
Biol.Chem., 241:5419-5427を参照のこと。好熱性細
菌、例えば、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga mari
tima）からの DNAポリメラーゼの単離および精製につい
てなされている研究は非常に少ない。
【０００４】サームス・アクアチクス（Thermus aqua
ticus ) YT−１菌株の細胞からの DNAポリメラーゼ活性
についての６工程の単離および濃縮が、 Kaledinら、19
87,Biokhymiya, 45:644-651に開示されている。これら
の工程は、粗製の抽出物の単離、DEAE−セルロースのク
ロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトによる分別、
DEAE−セルロースによる分別、および一本鎖 DNA−セル
ロースのクロマトグラフィーを包含する。精製された酵
素の分子量は、Kaledin らにより62,000ダルトン／モノ
マー単位として報告された。
【０００５】サームス・アクアチクス（Thermus aqua
ticus ) からのポリメラーゼの第２の濃縮のスキーム
は、 Chienら、1976, J.Bacteriol., 127 : 1550-1557
に記載されている。この方法においては、粗製の抽出物
をDEAE−セファデックス（Sephadex）カラムに適用す
る。次いで、プールし透析した分画をホスホセルロース
のカラムで処理する。プールした分画を透析し、そして
ウシ血清アルブミン（BSA)を添加してポリメラーゼ活性
の損失を防止する。生ずる混合物を DNA−セルロースカ
ラムに負荷する。カラムからプールした物質を透析す
る。精製されたタンパク質の分子量は約63,000〜68,000
であると報告されている。
【０００６】熱安定性酵素、例えば、 Chienらおよび K
aledinらにより記載されている酵素を使用して、現存す
る核酸配列を最初に存在する量と比較して大量に増幅す
ることは、米国特許第 4,683,195号；米国特許第 4,68
3,202号および米国特許第 4,965,188号に記載されてお
り、これらは PCR法を記載しており、それら開示の各々
を引用によってここに加える。プライマー、鋳型、ヌク
レオシド三リン酸、適当な緩衝液および反応条件、およ
びポリメラーゼを PCR法において使用し、この方法は標
的 DNAの変性、プライマーのハイブリダイゼーション、
および相補的鎖の合成を包含する。
【０００７】各プライマーの伸長生成物は、所望の核酸
配列の生成のための鋳型となる。これらの特許が開示す
るように、使用するポリメラーゼが熱安定性酵素である
場合、ポリメラーゼは各変性工程後に添加することは必
要ではない。なぜなら、熱はポリメラーゼ活性を破壊し
ないからである。米国特許第 4,889,818号、欧州特許公
開第 258,017号、および PCT公開No. 83／06691 号（そ
れらの開示をここに引用によって加える）は、サームス
・アクアチクス（Thermus aquaticus ) からの約94kD
a の熱安定性 DNAポリメラーゼの単離および組み換え発
現および PCRにおけるそのポリメラーゼの使用を記載し
ている。サームス・アクアチクス（T. aquaticus ) の
DNAポリメラーゼは PCRおよび他の組み換え DNA技術に
おける使用のためにことに好ましいが、他の熱安定性ポ
リメラーゼが要求されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】したがって、前述の P
CR法を改良し、そして他の組換え技術、例えば、 DNAの
配列決定、ニック翻訳、およびなお逆転写において熱安
定性 DNAポリメラーゼを使用するとき、得られる結果を
改良するために使用することができる、精製された、熱
安定性 DNAポリメラーゼを生産することはこの分野にお
いて望まれている。本発明は、サーモトガ・マリチマ
（Thermotoga maritima）の DNAポリメラーゼのための
組み換え発現ベクターおよび精製のプロトコルを提供す
ることによって、その要求を満足することを促進する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、ヌクレオシド
三リン酸の組合による、核酸鋳型鎖に対して相補的であ
る核酸鎖の形成を触媒する、精製された熱安定性 DNAポ
リメラーゼＩ酵素を提供する。精製された酵素はサーモ
トガ・マリチマ（Thermotoga maritima）(Tma) からの
DNAポリメラーゼＩであり、そして SDS−PAGEにより測
定して約97キロダルトン（kDa)の分子量および、102kDa
の、 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列か
ら推定される分子量有する。この精製された物質は PCR
において使用して、最初に存在する量と比較して大きい
量の所定の核酸配列を生産することができるので、これ
らの配列を容易に操作および／または分析することがで
きる。
【００１０】サーモトガ・マリチマ（Thermotoga mari
tima）からの Tma DNAポリメラーゼ酵素をコードする遺
伝子も同定され、クローニングされ、配列決定され、そ
して高いレベルで発現され、そしてなお本発明の熱安定
性酵素を調製するための他の手段を提供する。完全な遺
伝子および Tma酵素のためのコード配列に加えて、 Tma
DNAポリメラーゼのためのコード配列の誘導体もまた提
供される。本発明はまた、１種または２種以上の非イオ
ン性ポリマーの洗剤を含有する緩衝液中の前述の精製さ
れた熱安定性 Tma酵素を含んでなる安定な酵素組成物を
包含する。
【００１１】最後に、本発明は本発明の熱安定性ポリメ
ラーゼを精製する方法を提供する。この方法は、サーモ
トガ・マリチマ（Thermotoga maritima）の細胞から粗
抽出物を調製し、 DNAポリメラーゼが抽出物中のすべて
の核酸から解離するように、粗抽出物のイオン強度を調
節し、該抽出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに
かけ、該抽出物を DNA結合性タンパク質アフィニティー
クロマトグラフィーにかけ、該抽出物をアニオン交換ク
ロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィ
ーまたはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにか
けることを包含する。
【００１２】好ましい実施態様において、これらの工程
は順次に前述の順序で実施される。ヌクレオチド結合性
タンパク質アフィニティークロマトグラフィーの工程
は、 DNAポリメラーゼをエンドヌクレアーゼのタンパク
質から単離するために好ましい。
【００１３】
【発明を実施するための態様】本発明は、 Tma DNAポリ
メラーゼをコードする DNA配列および発現ベクター、Tm
a DNAポリメラーゼの精製のプロトコル、精製された Tm
a DNAポリメラーゼの調製、および Tma DNAポリメラー
ゼを使用する方法を提供する。本発明の理解を促進する
ために、多数の用語を下に定義する。
【００１４】用語「細胞」または「細胞系」は互換的に
使用し、そしてすべてのこのような表示は子孫を包含す
る。こうして、語「形質転換体」または「形質転換され
た細胞」は、転移の数に無関係に、一次形質転換細胞、
およびその細胞から誘導された培養物を包含する。すべ
ての子孫は、意図的のまたは偶発的突然変異のために、
DNA含有が正確に同一でないことがある。もとの形質転
換された細胞についてスクリーニングしたとき同一の機
能有する突然変異子孫は、形質転換体の定義の中に含め
られる。
【００１５】用語「コントロール」は、特定の宿主生物
体における作用可能に連鎖したコード配列の発現に必要
な DNA配列を呼ぶ。例えば、原核生物に適当なコントロ
ール配列はプロモーター、必要に応じて、オペレーター
配列、リボソーム結合部位、および可能ならば他の配
列、例えば、転写停止配列を包含する。用語「発現系」
は、所望のコード配列およびコントロール配列を作用可
能な連鎖で含有する DNA配列を呼び、こうしてこれらの
配列で形質転換された宿主はコードされたタンパク質を
生産することができる。形質転換を実施するために、発
現系をベクター上に含めることができる；関係する DNA
はまた、宿主の染色体の中に組み込むことができる。
【００１６】用語「遺伝子」は、回収可能な生物活性ポ
リペプチドまたは前駆体の発現をコードする DNA配列を
呼ぶ。こうして、 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子はポリメ
ラーゼおよび Tma DNAポリメラーゼのコード配列を含
む。ポリペプチドは、全長のコード配列によるか、ある
いは所望の酵素活性が保持されるかぎりコード配列の一
部分によりコードされることができる。用語「作用可能
に連鎖した」は、コントロール配列がコードされたタン
パク質の発現を推進するために機能するように、コード
配列の位置を決定することに関する。こうして、コント
ロール配列に「作用可能に連鎖した」コード配列は、コ
ード配列がコントロール配列の指令下に発現されること
ができるようなコンフィグレーションに関する。
【００１７】用語「混合物」は、それが Tmaポリメラー
ゼを含有する混合物に関係するとき、 Tmaポリメラーゼ
を含むが、さらに他のタンパク質を含むことができる、
物質の集まりを呼ぶ。 Tmaポリメラーゼが組換え宿主細
胞に由来する場合、他のタンパク質は通常宿主細胞に関
連するであろう。宿主が細菌である場合、汚染するタン
パク質は細菌のタンパク質であろう。用語「非イオン性
ポリマー洗剤」は、イオンの電荷もせず、そして、本発
明の目的のために、約 3.5〜約 9.5のpH範囲で Tma酵素
を可溶化する能力により特徴づけられる表面活性剤を意
味する。適当な非イオン性ポリマー洗剤の多数の例は、
米国特許同時継続出願第 387,003号、1989年７月28日提
出（その開示をここに引用によって加える）に記載され
ている。
【００１８】用語「オリゴヌクレオチド」は、ここで使
用するとき、２またはそれより多く、好ましくは３また
はそれより多くの、通常10より多いデオキシリボヌクレ
オチドまたはリボヌクレオチドから構成された分子とし
て定義される。正確な大きさは多数の因子に依存し、次
いでこれらの因子はオリゴヌクレオチドの究極の機能ま
たはその使用に依存する。オリゴヌクレオチドは合成的
にまたはクローニングにより誘導することができる。
【００１９】用語「プライマー」は、ここで使用すると
き、プライマーの発現が開始される条件下に配置された
とき、合成の開始点として作用することができるオリゴ
ヌクレオチドを呼ぶ。オリゴヌクレオチドの「プライマ
ー」は、精製された制限消化物におけるように、天然に
存在することができるか、あるいは合成的に生成するこ
とができる。核酸鎖に対して相補的であるプライマーの
発現生成物の合成は、４つの異なるヌクレオシド三リン
酸および Tma熱安定性酵素の存在下に適当な緩衝液の中
で適当な温度において開始される。
【００２０】「緩衝液」は、所望のpHに調節された、コ
ファクター（例えば、２価の金属イオン）および塩（適
当なイオン強度を与えるために）を含む。 Tmaポリメラ
ーゼについて、緩衝液は好ましくは１〜３mMのマグネシ
ウム塩、好ましくは MgCl2、50〜 200μＭの各ヌクレオ
シド三リン酸、および 0.2〜１μＭの各プライマー、な
らびに50mMの KCl、10mMのトリス緩衝液（pH 8.0〜8.
4)、および 100μｇ／mlのゼラチン（しかしゼラチンは
要求されず、そしてある応用において、例えば、DNAの
配列決定において回避すべきである）を含有する。
【００２１】プライマーは増幅における効率を最大とす
るためには一本鎖であるが、二本鎖であることができ
る。二本鎖である場合、プライマーをまず処理してその
鎖を単離した後、発現生成物の調製のために使用する。
プライマーは通常オリゴデオキシリボヌクレオチドであ
る。プライマーは、ポリメラーゼ酵素の存在下に伸長生
成物の合成をプライミングするために十分に長くなくて
はならない。
【００２２】プライマーの正確な長さは多数の因子、例
えば、プライマー源および所望の結果に依存し、そして
反応温度は鋳型へのプライマーの適切なアニーリングを
保証するためのプライマーの長さに依存して調節しなく
てはならない。標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌ
クレオチドプライマーは典型的には15〜35ヌクレオチド
を含有する。短いプライマー分子は、一般に、十分に安
定な鋳型との複合体を形成するために、より下い温度を
必要とするであろう。
【００２３】プライマーは、鋳型の特定の配列の鎖に対
して「実質的に」相補的であるように選択すべきであ
る。プライマーは、十分に相補的であって、プライマー
の延長が起こるように鋳型の鎖とハイブリダイゼーショ
ンしなくてはならない。プライマーの配列は、鋳型の正
確な配列を反映することは必要ではない。例えば、非相
補的ヌクレオチドの断片は、プライマーの５′末端に結
合することができ、プライマーの配列の残部はその鎖に
対して実質的に相補的である。
【００２４】非相補的塩基またはより長い配列をプライ
マーの中に介在させることができるが、ただしプライマ
ーは鋳型の配列と十分に相補的であって、ハイブリダイ
ゼーションし、これによりプライマーの伸長生成物の合
成のための鋳型／プライマー複合体を形成することを条
件とする。用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制
限酵素」は、二本鎖 DNAを特定のヌクレオチド配列でま
たはその付近で切断する細菌酵素を呼ぶ。
【００２５】用語「熱安定性酵素」は、加熱に対して安
定でありかつ耐熱性であり、そしてヌクレオチドの結合
を適切な方法で触媒（促進）して、核酸鎖に対して相補
的である伸長生成物を形成する酵素を意味する。一般
に、プライマー伸長生成物の合成は、プライマーの３′
末端において開始し、そして合成が停止するまで鋳型の
配列の５′末端に向かって進行する。熱安定性酵素は、
80℃〜 105℃の温度に短時間（すなわち、５〜30秒）暴
露した後、復元しかつ活性を再び獲得しなくてはなら
ず、そして60℃以上の至適温度をもたなくてはならな
い。
【００２６】本発明の Tmaの熱安定性 DNAポリメラーゼ
酵素は、ポリメラーゼ連鎖反応または PCRとして知られ
ている増幅反応における有効な使用のための要件を満足
する。 Tma DNAポリメラーゼ酵素は、 PCR法において主
要な工程である、二本鎖の核酸の変性を実施するために
必要な時間の間、高温に暴露したとき、不可逆的に変性
（不活性化）しない。ここにおける目的のため、酵素の
不可逆的変性は、酵素的活性の永久的かつ完全な損失を
意味する。
【００２７】核酸の変性を実施するために必要な加熱条
件は、例えば、緩衝液の塩濃度および組成、変性される
核酸の長さおよび量に依存するが、典型的には変性温度
は数秒〜数分間で約80℃〜約 105℃である。緩衝液の塩
濃度および／または核酸のGC組成が増加するにつれて、
より高い温度を必要とすることがある。 Tma酵素は約80
℃〜 105℃の温度に比較的短い暴露で不可逆的に変性し
ない。
【００２８】Tmaの熱安定性酵素は、約60℃より高い、
それが機能する至適温度有する。60℃より低い温度はプ
ライマーの鋳型へのハイブリダイゼーションを促進する
が、塩の組成および濃度およびプライマーの組成および
長さに依存して、鋳型へのハイブリダイゼーションはよ
り高い温度（例えば、60℃〜80℃）において起こること
ができ、これはプライマー延長反応の特異性を促進する
ことができる。酵素のための至適温度が高くなればなる
ほど、プライマー指令の伸長反応の特異性および／また
は選択性はより大きくなるであろう。 Tma酵素は約45℃
〜90℃の広い温度範囲にわたって活性を示す；好ましい
至適温度は75℃〜80℃である。
【００２９】本発明はまた、サーモトガ・マリチマ（Th
ermotoga maritima）の熱安定性 DNAポリメラーゼＩ活
性をコードする DNA配列を提供する。この配列によりコ
ードされるアミノ酸配列は、サームス・アクアチクス
（Thermus aquaticus ) およびサームス・サーモフィ
ルス（Thermus thermophilus）の熱安定性 DNAポリメ
ラーゼの部分に対する相同性有する。 Tma DNAポリメラ
ーゼ遺伝子の５′−ATG開始コドンから TGA−３′停止
コドンへの完全なコード配列は下に記載されており、そ
して配列を列挙する節において配列番号：１として列挙
されている。この配列に参照のために番号を付してあ
る。
【００３０】
【化７】
【００３１】
【化８】
【００３２】
【化９】
【００３３】
【化１０】
【００３４】Tma DNAポリメラーゼ遺伝子の完全なコー
ド配列、およびコードされた３文字の略号で表されるア
ミノ酸配列の両者は、配列番号：１として配列表の節に
記載されている。便宜上、 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子
配列によりコードされたアミノ酸配列をまた、１文字の
略号でアミノ末端からカルボキシ末端に、下記に示す。
この配列に参照のための番号が付されている。
【００３５】
【化１１】
【００３６】
【化１２】
【００３７】アミノ酸のための１文字の略号を便宜上下
に示す。 Ｆ＝フェニルアラニン Ｈ＝ヒスチジン Ｌ＝ロイシン Ｑ＝グルタミン Ｉ＝イソロイシン Ｎ＝アスパラギン Ｍ＝メチオニン Ｋ＝リジン Ｖ＝バリン Ｄ＝アスパラギン酸 Ｓ＝セリン Ｅ＝グルタミン酸 Ｐ＝プロリン Ｃ＝システイン Ｔ＝スレオニン Ｗ＝トリプトファン Ａ＝アラニン Ｒ＝アルギニン Ｙ＝チロシン Ｇ＝グリシン
【００３８】Tma DNAポリメラーゼＩのためのコード配
列は、「縮重（degen erate)プライマー」法により同定
され、この方法は広い実用性を有し、そして本発明の重
要な面である。縮重プライマー法において、既知の熱安
定性 DNAポリメラーゼの保存されたドメインに対応する
任意の熱安定性ポリメラーゼのコード配列の DNA断片を
同定することができる。
【００３９】縮重プライマー法の１つの態様において、
対応する保存されたドメインは、Taq, TmaおよびTth の
熱安定性 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列のためのコー
ド配列からのものである。縮重プライマー法は、Taq, T
th, Ｔおよび種々の保存された領域が同定されたE.coli
からの DNAポリメラーゼＩのタンパク質のアミノ酸配列
を比較することによって開発された。次いで、これらの
保存された領域に相当するプライマーが設計された。本
発明の Tma配列を使用して他の縮重プライマーを設計す
ることができる。縮重プライマー法の一般的実用性を、
ここで、 Tma遺伝子のクローニングに適用された方法を
特別に参照して例示する。
【００４０】Tma DNAポリメラーゼＩ遺伝子をクローニ
ングするために、保存されたアミノ酸配列をアミノ酸の
各々のための可能なコドンのすべてに転換した。遺伝コ
ードの縮重性のために、所定のアミノ酸はいくつかの異
なるコドンにより表示することができる。所定のアミノ
酸のためのコドンの中に複数の塩基が存在できる場合、
その配列は縮重性をもつと言われる。次いで、所定のア
ミノ酸配列をコードすることができる、すべての可能な
DNA配列のプールとして、プライマーを合成した。所定
のプライマーのプールについての縮重の量は、各位置に
おける可能なヌクレオチドの数を掛けることによって決
定することができる。
【００４１】プライマーのプールがより縮重性をもつよ
うになるほど（すなわち、プール内の個々のユニークプ
ライマー DNA配列の数がより大きくなるほど）、ユニー
クプライマー配列の１つが所望のもの以外の標的染色体
DNAの領域に結合する確率はより大きくなり−それゆ
え、生ずる増幅の特異性はより少なくなる。縮重プライ
マーを使用して増幅の特異性を増加するために、プール
をサブセットとして合成し、こうしてサブセットの全体
の群が所定のアミノ酸配列をコードするすべての可能な
DNA配列を含むが、各個々のサブセットは一部分のみを
含むようにする：例えば、１つのプールはＧまたはＣを
特定の位置に含有することができるが、他のものは同一
位置にＡまたはＴを含有する。これらのサブプールの各
々はDG番号で表示される。
【００４２】前方プライマー（非コード鎖に対して相補
的である、遺伝子の５′−領域から３′−領域に向う方
向）および逆プライマー（コード鎖に対して相補的であ
る、遺伝子の３′−領域から５′−領域に向う方向）の
両者を、これらの保存された領域の大部分について設計
して Tmaポリメラーゼをクローニングした。５′−末端
に制限部位をもつプライマーを設計して、クローニング
を促進した。前方プライマーは BalII制限部位（AGATC
T）を含有したが、逆プライマーは EcoRI制限部位（GAA
TTC）を含有した。さらに、プライマーは５′−末端に
２ヌクレオチドを含有して、その制限部位における切断
効率を増加した。
【００４３】次いで、縮重プライマーを PCR法において
使用し、ここで標的核酸はサーモトガ・マリチマ（Ther
motoga maritima）からの染色体 DNAであった。１系列
の温度プロフィルと組み合わせて、前方プライマーおよ
び逆プライマーのプールの組み合わせを使用する PCR法
の生成物を比較した。 Taq染色体 DNAを使用して発生さ
せた生成物に対して特異的な同一の大きさの生成物を生
成したとき、 PCR断片をゲル精製し、再増幅し、そして
ベクターBSM13H：BglII の中にクローニングした（スト
ラタジーン（Stratagenc) のベクターpBSM＋の誘導体、
ここでpBSM＋のHindIII部位は BglII部位に転換されて
いる）。
【００４４】配列がポリメラーゼタンパク質とくに Taq
ポリメラーゼおよび Tthポリメラーゼの中の他の既知の
アミノ酸配列に対して相同性であるアミノ酸配列をコー
ドすることが見出された場合、その配列は可能性ある熱
安定性 DNAポリメラーゼコード配列として同定された。
次いで、 Tma DNAポリメラーゼ酵素の部分が、サザン−
ブロット分析により、サーモトガ・マリチマ（Thermoto
ga maritima）の染色体 DNA中に同定された。Tma染色
体 DNAを種々の酵素で消化し、そしてニトロセルロース
のフィルターに移した。32Ｐまたはビオチン−dUTPで標
識したプローブを、クローニングした PCR生成物からの
遺伝子の種々の領域について発生させた。
【００４５】プローブをニトロセルロースに結合したゲ
ノム DNAにハイブリダイゼーションさせ、プローブにハ
イブリダイゼーションする染色体 DNA断片の大きさの同
定を可能とした。遺伝子の5 ′および3 ′領域をカバー
するプローブの使用により、１または２以上の DNA断片
がポリメラーゼのための構造遺伝子の全部でないにして
も大部分を含有することが保証される。クローニングを
促進するために、単一の DNA断片またはいくつかの DNA
断片中に構造遺伝子を含有する断片を生成するために使
用することができる制限酵素を同定することができる。
【００４６】いったん同定した後、 Tma DNAポリメラー
ゼ遺伝子をコードする染色体の DNA断片をクローニング
した。染色体 DNAを同定された制限酵素で消化し、そし
て大きさで分別した。所望の大きさの領域を含有する分
画を濃縮し、脱塩し、そしてBSM13H：BglII のクローニ
ングベクター中にクローニングした。前にクローニング
した PCR生成物から発生した標識したプローブを使用す
るハイブリダイゼーションによりクローンを同定した。
次いで、 PCR生成物をポリアクリルアミドゲル上で分析
した。
【００４７】上に示した DNA配列およびアミノ酸配列並
びにそれらの配列をコードする DNA化合物を使用して、
組み換え DNA発現ベクターを設計および構成して、広範
な種類の宿主細胞中での Tma DNAポリメラーゼ活性の発
現を推進することができる。上に示した DNA配列のすべ
てまたは一部分をコードする DNA化合物もまた、プロー
ブとして使用して、他の生物体からの熱安定性ポリメラ
ーゼをコードする DNAを同定することができ、そして上
に示したアミノ酸配列を使用して、熱安定性ポリメラー
ゼの同定および精製に使用できる抗体の調製における免
疫原として使用するためのペプチドを設計することがで
きる。
【００４８】しかしながら、上のアミノ酸配列をコード
する組み換えベクターによるか、あるいは天然サーモト
ガ・マリチマ（T. maritima）細胞により生産されたか
どうかにかかわらず、 Tma DNAポリメラーゼは、典型的
には、精製した後、組み換えDNA技術において使用す
る。本発明はこのような精製法を提供する。天然タンパ
ク質を回収するために、細胞を任意の適当な技術を使用
して増殖させる。簡単に述べると、細胞は次の成分を含
有する「 MMS」培地の中で増殖させる（１リットル当た
り）：NaCl (6.93ｇ) ；MgSO4 ・7H2O (1.75ｇ）；MgCl
2 ・6H2O (1.38ｇ）；KCl(0.16ｇ）：NaBr (25mg）；H3
BO3(7.5mg)；SrCl2 ・6H2O(3.8mg）；KI(0.025mg）；Ca
Cl2(0.38ｇ）；KH2PO4(0.5ｇ）；Na2S(0.5Ｇ）；(NH4)2
Ni(SO4)2(2mg）；微量のミレラル(Balchら、Microbiol.
Rev., 43:260-296)(15ml) ；レサズリン（１mg) ；およ
び澱粉（５ｇ）、pH6.5(H2SO4 で調節した）。
【００４９】固体培地上での増殖のために、 0.8％の寒
天（Oxoid)を培地に添加することができる。細胞の合理
的増殖はまた、 0.5％の酵母エキスを補充した「 SME」
培地(Stetterら、1983, Syst.Appl.Microbiol., ４：53
5-551)中で、あるいはマリンブロス（marine broth)(Di
fco2216)の中で起こる。細胞の増殖後、酵素の単離およ
び精製を６段階で実施し、それらの各々は、特記しない
限り、室温以下の温度、好ましくは約０℃〜約４℃にお
いて実施する。第１段階または工程において、細胞を、
それが凍結されている場合は、融解し、アミンコ・フレ
ッシュ・プレッシュアー・セル（Aminco fresh pressur
e cell(8〜20,000psi)の中で溶解し、緩衝液（約pH 7.
5) 中に懸濁させ、そして超音波処理して粘度を減少さ
せる。
【００５０】第２段階において、硫酸アンモニウムをリ
ゼイトに添加して、 Tma DNAポリメラーゼが DNAまたは
細胞リゼイトのタンパク質に結合するのを防止する。ま
た、第２段階において、ポリミン（Polymin)Ｐ（ポリエ
チレンイミン、PEI)をリゼイトに添加して、核酸を沈澱
させ、そしてリゼイトを遠心する。第３工程において、
硫酸アンモニウムを上澄み液に添加し、そして上澄み液
を0.3Ｍの硫酸アンモニウムおよび 0.5mMのDTT(ジチオ
スレイトール）を含有するTE（50mMのトリス−Cl、pH7.
5)により平衡化したフェニルセファローズ（Sepharose)
カラム上に負荷する。次いでこのカラムを同一の緩衝液
で、第２にTE−DTT(硫酸アンモニウムを含まない）で、
第３にエチレングリコール−TE−DTT で、そして最後に
エチレングリコールを含有するTE−DTT 中２Ｍの尿素で
洗浄する。
【００５１】フェニルセファローズの容量を越える（す
なわち、約20〜30mgのタンパク質／mlの樹脂より多くを
負荷することによって）ことがないかぎり、 Tmaポリメ
ラーゼ活性のすべてはカラムにより保持され、そしてエ
チレングリコールを含有するTE−DTT 中の２Ｍの尿素で
溶出される。第４段階において、尿素の溶離液を、0.08
ＭのKCl 、50mMのトリス−Cl(pH 7.5)、0.1mM のEDTA、
0.2％のツイーン20および 0.5mMの DTTにより平衡化し
たヘパリンセファローズカラムに適用する。次いで、カ
ラムを同一の緩衝液で洗浄し、そして酵素を0.08Ｍ〜
0.5Ｍの KClの直線の勾配で溶出する。ピーク活性分画
は 0.225Ｍ〜 0.275Ｍの KClにおいて見いだされた。
【００５２】第５段階において、第４段階において集め
られた分画を KClを含まないアフィゲル（affigel)−ブ
ルー緩衝液で希釈し、そして25mMのトリス−Cl(pH 7.
5)、 0.1mMのEDTA、 0.2％のツイーン20、 0.5mMの DT
T、および0.15Ｍの KClの中で平衡化したアフィゲル−
ブルーカラムに適用する。このカラムを同一の緩衝液で
洗浄し、そして同一の緩衝液中の0.15Ｍ〜 0.7Ｍの KCl
の直線勾配で溶出する。ピーク活性分画は勾配の 0.3Ｍ
〜0.55Ｍの KClにおいて見いだされた。次いでピーク活
性のこれらの分画を、任意の適当な手順を使用して汚染
デオキシリボヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼおよび
エキソヌクレアーゼ）について試験する。
【００５３】１例として、エンドヌクレアーゼ活性は、
過剰の DNAポリメラーゼとのインキュベーション後、フ
ァージλ DNAまたはスーパーコイルドのプラスミド DNA
の分子量の変化から電気泳動的に決定することができ
る。同様に、エキソヌクレアーゼ活性は、過剰の DNAポ
リメラーゼとのインキュベーション後、制限酵素で消化
した DNAの分子量の変化から電気泳動的に決定すること
ができる。デオキシリボヌクレアーゼ活性をもたない分
画をプールし、そして50mMの KClを含有するホスホセル
ロースの緩衝液の中に透析濾過する。
【００５４】最後に、第６段階において、第５段階から
の透析濾過したプールを、25mMのトリス−Cl(pH 7.5)、
50mMの KCl、 0.1mMのEDTA、 0.2％のツイーン20および
0.5mMの DTTの正しいpHおよびイオン強度に平衡化し
た、ホスホセルロースのカラム上に負荷する。次いで、
このカラムを同一の緩衝液で洗浄し、そして0.05Ｍ〜
0.5Ｍの KClの直線勾配で溶出する。ピーク分画は 0.21
5Ｍ〜0.31Ｍの KClにおいて溶出された。これらの分画
からの、分解していない精製された DNAポリメラーゼ
は、イン−シチユ活性ゲルにおける変化しない移動パタ
ーンにより証明される。
【００５５】サーモトガ・マリチマ（Thermotoga mari
tima）から精製された DNAポリメラーゼの分子量は、任
意の技術により、例えば、タンパク質の分子量マーカー
を使用する SDS−PAGEによるか、あるいはコード配列の
計算により決定することができる。サーモトガ・マリチ
マ（Thermotoga maritima）の精製された DNAポリメラ
ーゼの分子量は、 SDS−PAGEにより、約97kDa であると
決定される。予測されたアミノ酸配列に基づいて、分子
量は約102kDaで推定される。天然 Tma DNAポリメラーゼ
の精製のプロトコルは、実施例１により詳細に記載され
ている。本発明の組換え Tmaポリメラーゼの精製は、同
様な方法により実施することができる。
【００５６】種々の分子量の生物学的に活性な組換え T
maポリメラーゼは、本発明の方法およびベクターにより
調製することができる。 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子の
完全なコード配列が大腸菌（E. coli）中の発現ベクタ
ーの中に存在するときでさえ、細胞は、位置 140におけ
るメチオニンのコドンで開始する翻訳により形成された
切頭されたポリメラーゼを生産する。
【００５７】また、 Tmaのコード配列の位置 284におけ
るメチオニンのコドンにおいて翻訳を開始することによ
って生産されるタンパク質に相当する切頭ポリメラーゼ
の生産のために、組み換え手段を使用することができ
る。アミノ酸１〜139 を欠如するポリメラーゼ（約86kD
a)および野生型 Tmaポリメラーゼのアミノ酸１〜 283を
欠如するポリメラーゼ（約70kDa)は、ポリメラーゼ活性
を保持するが、弱化した５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性を有する。さらに、70kDa のポリメラーゼは天然 T
maポリメラーゼより有意にいっそう熱安定性である。
【００５８】こうして、完全な Tma DNAポリメラーゼＩ
酵素の全体の配列は活性のために要求されない。組換え
DNA技術において、 Tma DNAポリメラーゼＩのコード配
列の部分を使用して、 DNAポリメラーゼ活性をもつ生物
学的に活性な遺伝子生産物を生産することができる。 T
ma DNAポリメラーゼの配列をコードする DNAの入手可能
性はまた、 DNAポリメラーゼ活性を有するムテイン（突
然変異タンパク質）の形態を発生させるためにコード配
列を修飾する機会を提供する。
【００５９】Tmaポリメラーゼのアミノ（Ｎ）−末端部
分はポリメラーゼ活性に不必要であり、むしろタンパク
質の５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をコードする。
組換え DNA法を使用して、 Tma遺伝子のＮ−末端のコー
ド配列のほぼ１／３を欠失し、クローニングし、そして
ポリメラーゼのアッセイにおいて非常に活性である遺伝
子生産物を発現することができるが、欠失の程度に依存
して、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する。ポ
リメラーゼのある種のＮ−末端の短縮された形態は活性
であるので、これらのポリメラーゼの発現のために使用
する遺伝子構成体はコード配列の対応する短縮された形
態を含むことができる。
【００６０】Ｎ−末端の除去に加えて、 Tmaポリメラー
ゼのペプチド鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還
元、または他の誘導体化により修飾することができ、そ
してタンパク質を切断して活性を保持する断片を得るこ
とができる。活性を破壊しないこのような変更は、その
タンパク質を Tmaポリメラーゼ活性をもつタンパク質の
定義から除外せず、それゆえ本発明の範囲内に包含され
る。
【００６１】Tma DNAポリメラーゼのコード配列の一次
構造を欠失、付加または変更して、そのコード配列から
生成されたmRNAの翻訳の間に Tma DNAポリメラーゼの中
に組み込まれるアミノ酸配列を変化させることは、タン
パク質の高温の DNAポリメラーゼ活性を破壊しないで、
実施することができる。このような置換または他の変更
は、本発明の考えられる範囲内に入る DNAによりコード
されるアミノ酸配列を有するタンパク質を生成する。な
お、特許請求の範囲において、アミノ酸配列（Ｉ）に対
して１個又は数個のアミノ酸の付加が、欠失及び／又は
置換により修飾されており且つ Tmaポリメラーゼ活性を
有するアミノ酸配列とは、アミノ酸配列（Ｉ）に対し
て、部位特定変異誘発法、PCR 法等、自体周知の方法に
よりアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換が可能な程度
に修飾されており、且つ Tmaポリメラーゼ活性を有する
アミノ酸配列を意味する。
【００６２】同様に、 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子のク
ローニングされたゲノム配列または相同の合成配列を使
用して、 Tma DNAポリメラーゼ活性をもつ融合ポリペプ
チドを発現すること、あるいは天然 Tma DNAポリメラー
ゼのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をもつタンパク
質を発現することができる。さらに、このような発現
は、 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子のコントロール配列に
よるか、あるいは Tma DNAポリメラーゼを発現するため
に選択された宿主中で（その宿主がなにであろうと）機
能するコード配列により、指令されることができる。
【００６３】こうして、本発明は、種々の宿主系に適用
可能な発現ベクターを構成することができる Tma DNAポ
リメラーゼのためのコード配列および発現されるコード
配列を提供する。 Tmaポリメラーゼをコードする配列の
部分はまた、種々の種における他の熱安定性ポリメラー
ゼをコードする配列を回復するプローブとして有用であ
る。したがって、少なくとも４〜６つのアミノ酸をエン
コードするオリゴヌクレオチドのプローブを合成し、そ
して熱安定性ポリメラーゼをエンコードする追加の DNA
を探索するために使用することができる。
【００６４】サーモトガ・マリチマ（Thermotoga mari
tima) の熱安定性 DNAポリメラーゼの遺伝子のヌクレオ
チド配列と他の種の対応する遺伝子との間に正確な合致
は存在しないであろうから、誤った陽性を排除するため
に十分なストリンジェンシーの条件下にハイブリダイゼ
ーションを得るために、ほぼ12〜18ヌクレオチドを含有
するオリゴマー（４〜６アミノ配列をコードする）が通
常必要である。６アミノ酸をコードする配列は、このよ
うなプローブのために十分な情報を供給する。このよう
なオリゴヌクレオチドのプローブを、本発明の縮重プラ
イマー法においてプライマーとして使用して、熱安定性
ポリメラーゼをコードする解読配列を得ることができ
る。
【００６５】したがって、本発明は、 Tma DNAポリメラ
ーゼのためのコード配列およびアミノ酸配列を提供する
ことによって、他の熱安定性ポリメラーゼ酵素およびそ
れらの酵素のためのコード配列の単離を可能とする。 T
ma DNAポリメラーゼＩタンパク質のアミノ酸配列は、 T
aqおよび Tthの熱安定性 DNAポリメラーゼのアミノ酸配
列に非常に類似する。これらの類似性は、 Tma DNAポリ
メラーゼのコード配列の同定および単離を促進した。こ
れらの３つの熱安定性 DNAポリメラーゼのコード配列に
おける類似領域は、配列を整列させることによって容易
に観察することができる。
【００６６】しかしながら、３つの熱安定性 DNAポリメ
ラーゼのコード配列の間の不一致の領域をプローブとし
て使用しても、熱安定性ポリメラーゼの酵素をコードす
る他の熱安定性ポリメラーゼのコード配列を同定するこ
とができる。例えば、 Taqのいくつかの性質およびTma
の他の多様な性質を有する熱安定性ポリメラーゼのコー
ド配列を、 Taqと Tmaとの間の非類似性の領域をコード
する配列に向けられたプローブを使用することによって
同定することができる。
【００６７】詳しくは、このような領域は、アミノ酸配
列コーデネートにより同定される、次の任意の１または
２以上領域からの４またはそれ以上の隣接するアミノ酸
のストレッチを包含する（番号を包含する）：5-10, 73
-79, 113-119, 134-145, 191-196, 328-340, 348-352,
382-387, 405-414, 467-470, 495-499, 506-512, 555-5
59, 579-584, 595-599, 650-655, 732-742, 820-825, 8
50-856。これらの領域は「ホールマークのモチーフ（ha
llmark motifs)」として考えられ、そして熱安定性 DNA
ポリメラーゼの機能（例えば、５′→３′エキソヌクレ
アーゼ活性、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性、およ
び DNAポリメラーゼ活性）のために重要なアミノ酸のシ
グネチュアー（signature)配列の追加の領域を定める。
【００６８】Tma DNAポリメラーゼの中に見いだされる
が、天然 Taq DNAポリメラーゼおよび天然 Tth DNAポリ
メラーゼにおいて欠如する１つの性質は、３′→５′エ
キソヌクレアーゼ活性である。この３′→５′エキソヌ
クレアーゼ活性は、一般に望ましいと考えられる。なぜ
なら、合成された核酸配列の誤って組み込まれたまたは
不一致の塩基がこの活性により排除されるからである。
したがって、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性をもつ
ポリメラーゼ（例えば、 Tma DNAポリメラーゼ）を利用
する PCRの信頼性は増加する。
【００６９】Tma DNAポリメラーゼの中に見いだされる
３′→５′エキソヌクレアーゼ活性はまた、 PCRにおけ
るプライマー／２量体複合体の形成の確率を減少する。
３′→５′エキソヌクレアーゼ活性は、事実、非鋳型依
存性の方式で結合されたヌクレオチドを除去することに
よって、非鋳型依存性の方式でのプライマーの３′末端
への余分のdNTPの結合を防止する。３′→５′エキソヌ
クレアーゼ活性は、一本鎖の DNA、例えば、プライマー
または一本鎖の鋳型を排除することができる。
【００７０】本質的に、一本鎖のプライマーまたは鋳型
の各ヌクレオチドは不一致として酵素により処理され、
したがって分解される。 PCRにおけるプライマーの分解
を回避するために、ホスホロチオエートをプライマーの
３′末端に付加することができる。ホスホロチオエート
で修飾されたヌクレオチドは３′→５′エキソヌクレア
ーゼによる除去に対していっそう抵抗性である。熱安定
性 DNAポリメラーゼにおける３′→５′エキソヌクレア
ーゼ活性のために重要なアミノ酸の「モチーフ」または
特徴ある「シグネチュア配列」は、３つの短いドメイン
からなるとして定義することができる。下において、こ
れらのドメインはＡ，ＢおよびＣとして定義され、重要
なアミノ酸残基は１文字の略号で示されておりそして重
要でない残留は「ｘ」として識別されている。
【００７１】
【表１】
【００７２】領域Ａと領域Ｂとの間の距離は55−65アミ
ノ酸である。領域Ｂと領域Ｃとの間の距離は67−75アミ
ノ酸、好ましくは約70アミノ酸である。 Tma DNAポリメ
ラーゼにおいて、重要なモチーフのシグネチュア配列を
定めないアミノ酸配列は、ドメインＡにおいて、それぞ
れ、Ｌおよび TSS；ドメインＢにおいて、それぞれ、LK
Fおよび YKV；およびドメインＣにおいて SCEである。
【００７３】したがって、 Tma DNAポリメラーゼＩにお
いて、ドメインＡは DLETSSLであり；ドメインＢは NLK
FDYKVLであり；そしてドメインＣは YSCEDである。こう
して、本発明は、ドメインＡ，ＢおよびＣを含んでな
り、そして、さらに具体的には、Ｄ−Ｘ−Ｅ−Ｘ3 −Ｌ
−Ｘ55-65 −Ｎ−Ｘ8 −Ｄ−Ｘ3 −Ｌ−Ｘ85-76 −Ｙ−
Ｘ3 −Ｄを含んでなる３′→５′エキソヌクレアーゼ活
性を有する熱安定性 DNAポリメラーゼを提供し、ここで
１文字の略号を使用し、そしてＸN は特定したアミノ酸
の間の重要でないアミノ酸の番号（Ｎ）を表す。
【００７４】熱安定性３′→５′エキソヌクレアーゼの
ドメインは、 Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸 291− 4
84により表される。したがって、「ドメインのシャフリ
ング（domain shuffling) 」または「熱安定性キメラ D
NAポリメラーゼ」の構成を使用して、新規な性質を有す
る熱安定性 DNAポリメラーゼを得ることができる。例え
ば、コドン約 291−約 484を含んでなる Tma DNAポリメ
ラーゼのコード配列によりサーマス・アクアチクス（Th
ermus aquaticus ) DNAポリメラーゼのコドン 289−
422を置換すると、 Taq DNAポリメラーゼの５′→３′
エキソヌクレアーゼのドメイン（１−289)、 Tma DNAポ
リメラーゼの３′→５′エキソヌクレアーゼのドメイン
(291−481)、および Taq DNAポリメラーゼ(423−832)の
DNAポリメラーゼのドメイン(423−832)を含有する新規
な熱安定性 DNAポリメラーゼが生成するであろう。
【００７５】あるいは、 Tma DNAポリメラーゼの５′→
３′エキソヌクレアーゼのドメインおよび３′→５′エ
キソヌクレアーゼのドメイン（約コドン１−484)を、 T
aq DNAポリメラーゼの DNAポリメラーゼの（dNTP結合性
およびプライマー／鋳型結合性ドメイン）部分（約 423
〜 832コドン）に融合することができる。ドナーおよび
レシピエントは Taqおよび Tma DNAポリメラーゼに限定
することは必要ではない。 Tth DNAポリメラーゼは Taq
DNAポリメラーゼと類似するドメインを提供する。さら
に、 Tth DNAポリメラーゼの増強した／好ましい逆転写
酵素の性質は、上に例示した３′→５′エキソヌクレア
ーゼのドメインを付加することによってさらに増強する
ことができる。
【００７６】種々の手段の任意のものを使用してキメラ
DNAポリメラーゼのコード配列（新規な性質を有する）
を発生することができるが、好ましい方法は「オーバー
ラップ」 PCRを使用する。この方法においては、意図す
る連結部配列を PCRプライマー（それらの５′−末端）
にデザインして入れる。個々のドメインの最初の増幅の
後、種々の生成物を希釈し（約 100〜1000倍）そして組
み合わせ、変性し、アニーリングし、伸長し、次いで最
終の前方プライマーのおよび逆プライマーをそれ以外は
標準の PCRのために添加する。
【００７７】こうして、 Tma DNAポリメラーゼの３′→
５′エキソヌクレアーゼをコードする配列を Tma DNAポ
リメラーゼから除去するか、あるいは組換え DNA法によ
りこの活性を欠如する他のポリメラーゼに付加すること
ができる。非熱安定性 DNAポリメラーゼにおいて、３′
→５′エキソヌクレアーゼ活性のドメインを Tmaポリメ
ラーゼの熱安定性３′→５′エキソヌクレアーゼのドメ
インで置換することさえ可能である。
【００７８】同様に、非熱安定性 DNAポリメラーゼの
３′→５′エキソヌクレアーゼ活性のドメインを使用し
て、 Tmaポリメラーゼ（または任意の他のポリメラー
ゼ）の３′→５′エキソヌクレアーゼのドメインを置換
して本発明の有用なポリメラーゼをつくることができ
る。当業者が認識するように、上記のキメラポリメラー
ゼは組換え DNA技術により最も容易に構成される。同様
なキメラポリメラーゼは１つの DNAポリメラーゼの５′
→３′エキソヌクレアーゼのドメインを他の DNAポリメ
ラーゼに移動させることによって構成することができ
る。
【００７９】天然 Tma DNAポリメラーゼと同一の酵素ま
たはその酵素の誘導体または相同体を生産しようとする
かどうかにかかわらず、 Tmaポリメラーゼの組換え形の
生産は、典型的には、発現ベクターの構成、そのベクタ
ーによる宿主細胞の形質転換、および発現が起こる条件
下での形質転換された宿主細胞の培養を包含する。発現
ベクターを構成するために、成熟（ここで、すべてのキ
メラまたは変異タンパク質を包含するように使用する）
酵素あるいは活性を破壊しない追加の配列への、または
活性タンパク質を生成するコントロールされた条件（例
えば、ペプチダーゼによる処理）下に切断可能な追加の
配列への Tmaポリメラーゼの融合体をコードする DNAを
得る。
【００８０】次いで、コード配列を発現ベクターの中の
適当なコントロール配列と作用可能な連鎖で配置する。
ベクターは宿主細胞の中で自律的に複製するように、あ
るいは宿主細胞の染色体 DNAの中に組み込むように設計
することができる。このベクターを使用して適当な宿主
を形質転換し、そして形質転換された宿主を組換え Tma
ポリメラーゼの発現のために適当な条件下で培養する。
この Tmaポリメラーゼを培地または細胞から単離する
が、タンパク質の回収および精製はある場合において必
要でないことがある。
【００８１】前記の工程の各々は種々の方法で実施する
ことができる。例えば、所望のコード配列をゲノムの断
片から獲得し、そして適当な宿主において直接使用する
ことができる。種々の宿主において作用可能な発現ベク
ターの構成は、一般に後述するように、適当なレプリコ
ンおよびコントロール配列を使用して実施する。所望の
コード配列およびコントロール配列を含有する適当なベ
クターの構成は、この分野においてよく理解されている
標準的連結および制限技法を使用する。単離されたプラ
スミド、 DNA配列または合成されたオリゴヌクレオチド
を切断し、修飾し、そして所望の形態に再連結する。適
当な制限部位を、通常存在しない場合、下に例示するよ
うに、コード配列の末端に付加して発現ベクターの構成
を促進することができる。
【００８２】部位特異的な DNAの切断は、一般にこの分
野において理解されておりかつ商業的に入手可能な酵素
の製造業者により特定されている条件下に、適当な１種
または２種以上の制限酵素で処理することによって実施
する。例えば、ニュー・イングランド・バイオラブス
（New England Biolabs)の製品カタログを参照のこと。
一般に、約１μｇのプラスミドまたは他の DNAを約20μ
ｌの緩衝液の中で１単位の酵素により切断する；下記の
実施例において、過剰の制限酵素を一般に使用して DNA
の完全な消化を保証する。
【００８３】約37℃において約１〜２時間のインキュベ
ーション時間が適当であるが、変更も許容されうる。各
インキュベーション後、タンパク質をフェノールまたは
クロロホルムを使用する抽出により取り除く；この抽出
に引き続いて、エーテルの抽出およびエタノール沈澱に
より水性分画からの DNAの回収を実施することができ
る。必要に応じて、切断された断片のサイズ分離を、標
準的技術を使用して、ポリアクリルアミドゲルまたはア
ガロースゲルの電気泳動により実施することができる。
例えば、Methods in Enzymology , 1980, 65：499 −56
0 を参照のこと。
【００８４】一本鎖の「オーバーラッピング」末端をも
つ制限切断された断片は、４種類のデオキシヌクレオシ
ド三リン酸（dNTP) の存在下に約15〜25分のインキュベ
ーション時間を使用して20℃〜25℃において、50mMのト
リスpH 7.6、50mMのNaCl、10mMの MgCl2、10mMの DTTお
よび５〜10μＭのdNTPの中で、大腸菌（E. coli) DNA
ポリメラーゼＩ（クレノー）の大断片で処理することに
よって平滑末端化（二本鎖の末端）することができる。
【００８５】必要に応じて、突出する末端の性質により
決定される制限内で１のみのまたは選択されたdNTPを供
給することによって、選択的修復を実施することができ
る。クレノーによる処理後、この混合物をフェノール／
クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱させる。
同様な結果はS1ヌクレアーゼを使用して達成することが
できる。なぜなら、適当な条件下のS1ヌクレアーゼによ
る処理は核酸の一本鎖部分の加水分解を生ずるからであ
る。
【００８６】合成のオリゴヌクレオチドは、 Matteucci
ら、J.Am.Chem.Soc., 103 ：3185-3191 のトリエステル
法、または自動化された合成法を使用して調製すること
ができる。アニーリングの前のまたは標識化のための一
本鎖のキナーゼ処理は、50mMのトリス（pH 7.6）、10mM
の MgCl2、５mMのジチオスレイトール（DTT)および１〜
２μＭの ATPの存在下に 0.5μＭの基質に対して過剰
の、例えば、ほぼ10単位のポリヌクレオチドキナーゼを
使用して達成される。キナーゼ処理がプライマーの標識
化のためである場合、 ATPは高い比活性のγ−32Ｐを含
有するであろう。
【００８７】連結は15〜30μｌの体積で次の標準的条件
および温度で実施される：20mlのトリス−Cl（pH 7.5)
、10mMの MgCl2、10mMの DTT、33μｇ／mlの BSA、10m
M〜50mMのNaCl、および０℃において40mMの ATPおよび
0.01〜0.02（Weiss)単位の T4DNAリガーゼ（相補的一本
鎖の末端をもつ断片の結合のため）あるいは14℃におい
て１mMの ATPおよび 0.3〜 0.6単位の T4DNAリガーゼ
（「平滑末端」の結合のため）。相補的末端をもつ断片
の分子相互の結合は、通常、33〜 100μｇ／mlの合計 D
NA濃度（５〜 100nMの合計末端濃度）で実施する。分子
相互の平滑末端の結合（必要に応じて、20〜30倍のモル
過剰のリンカーを使用する）は１μＭの合計末端濃度に
おいて実施する。
【００８８】ベクターの構成において、ベクターの断片
を細菌のまたは仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(BAP
またはCIAP）で処理して５′のホスフェートを除去し、
そしてベクターの再結合および再構成を防止する。 BAP
およびCIAPの消化条件はこの分野においてよく知られて
おり、そして発表されたプロトコルは通常商業的に入手
可能な BAPおよびCIAP酵素に伴う。核酸断片を回収する
ために、調製物をフェノール−クロロホルムで抽出し、
そしてエタノール沈澱させてAPを除去し、そして DNAを
精製する。あるいは、再結合は、所望のベクターとの結
合の前後に、不必要なベクターの制限酵素消化により防
止することができる。
【００８９】配列の修飾を必要とするベクターまたはコ
ード配列の部分のために、種々の部位特異的プライマー
指令変異誘発法を利用することができる。ポリメラーゼ
連鎖反応（PCR)を使用して部位特異的変異誘発を実施す
ることができる。現在この分野において標準的である他
の技術において、所望の突然変異をコードする合成オリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、変異原プ
ライマーの伸長生産物の構成のための鋳型として働く一
本鎖ベクター、例えば、 pBS13＋の相補的核酸配列の合
成を指令する。
【００９０】変異原された DNAを宿主細菌中に形質転換
し、そして形質転換された細菌の培養物をプレートし、
そして同定する。修飾されたベクターの同定は、ニトロ
セルロースのフィルターまたは他の膜への選択された形
質転換体の転移、および修飾された配列への正確な合致
を許すが、もとの鎖へのハイブリダイゼーションを防止
する温度においてキナーゼ処理した合成プライマーとハ
イブリダイズした「リフト（lifts)」を包含する。次い
で、プローブとハイブリダイゼーションする DNAを含有
する形質転換体を培養し、そして修飾された DNAの溜め
として使用する。
【００９１】下に記載する構成において、プラスミドの
構成のために正しい連結は、大腸菌（E. coli） DG101
株または他の適当な宿主をまず連結混合物で形質転換す
ることによって確認される。適当な形質転換体を、この
分野において理解されているように、プラスミドの構成
のモードに依存して、アンピシリン、テトラサイクリン
または他の抗生物質耐性によるか、あるいは他のマーカ
ーを使用することによって選択する。
【００９２】次いで、形質転換体からのプラスミドを、
Clewellら、1969, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 62：115
9、の方法に従い、必要に応じてクロランフェニコール
増幅（Clewell, 1972, J.Bacteriol., 110： 667）後
に調製する。プラスミド DNAを得る他の方法は、ベセス
ダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research La
boratoies)の刊行物の Focus, Vol.5, No.2 、のページ
11に「Base−Acid」として記載されており、そして非常
に純粋なプラスミド DNAはそのプロトコルの工程12〜17
を DNAのCsCl／臭化エチジウムの超遠心で置き換えるこ
とによって得ることができる。
【００９３】単離された DNAは、制限酵素の消化により
分析し、そして／またはSangerら、1977, Proc. Natl.A
cad.Sci.USA,74：5463、さらに Messingら、1981，Nuc
l.Acids Res. , ９：309 、に記載されているジデオキ
シ法によるか、または Maxamら、1980, Methods in Enz
ymology, 65：499 の方法により配列決定する。コント
ロール配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子
の発現に使用する宿主細胞のタイプに依存する。一般
に、原核生物、酵母菌、昆虫、または哺乳動物の細胞を
宿主として使用する。原核生物の宿主は、一般に、組換
えタンパク質の生産に最も効率よくかつ便利であり、し
たがって Tmaポリメラーゼの発現のために好ましい。
【００９４】組換えタンパク質の発現のために最も頻繁
に使用されている原核生物は大腸菌（E. coli) であ
る。クローニングおよび配列のために、および大部分の
細菌プロモーターのコントロール下の構成体の発現のた
めに、大腸菌（E. coli) ジェネティック・ストック・
センター（Genetic Stock Center) からGCSC＃6135のも
とに入手可能な、大腸菌（E. coli) K12 MM294株を宿
主として使用することができる。
【００９５】PL NRHS コントロール配列をもつ発現ベ
クターのために、大腸菌（E. coli）K12 菌株MC1000ラ
ムダ溶系株、N7N53CI857SusP80, ATCC39531 を使用する
ことができる。1987年４月７日にATCCに（ATCC53606)と
して受託された大腸菌（E. coli) DG116および1985年３
月29日にATCCに（ATCC53075)として受託された大腸菌
（E. coli) KB2もまた、有用な宿主である。M13 ファ
ージ組換え体のために、ファージに感染されやすい大腸
菌（E. coli) 菌株、例えば大腸菌（E. coli) K12菌
株DG98を使用する。DG98菌株は1984年７月13日にATCCに
(ATCC39768)として受託された。
【００９６】しかしながら、 Tma DNAポリメラーゼの組
換え発現のために、大腸菌（E. coli) 以外の微生物の
菌株、例えば、バチルス、例えば、枯草菌（Bacillus
subtilis) 、シュードモナス属（Pseudomonas ) の種々
の菌株、および他の細菌の菌株をまた使用することがで
きる。このような原核生物系において、典型的には、宿
主または宿主と適合性の種から誘導された複製起点およ
びコントロール配列を含有するプラスミドのベクターを
使用する。
【００９７】例えば、大腸菌（E. coli) は、典型的に
は、 Bolivarら、1977、Gene, ２：95に記載されている
pBR322の誘導体を使用して形質転換される。プラスミド
pBR322はアンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性
のための遺伝子を含有する。これらの薬物耐性のマーカ
ーは、所望のベクターを構成するとき、保持または破壊
することができ、それゆえ所望の組換え体の存在の検出
を促進することができる。
【００９８】普通に使用される原核生物のコントロール
配列、すなわち、リボソーム結合部位の配列と共に、必
要に応じてオペレーターを伴う、転写開始のためのプロ
モーターは次のものを包含する：β−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ）およびラクトース（lac)プロモーター系
(Changら、1977, Nature, 198 ：1056) 、トリプトファ
ン（trp)プロモーター系(Goeddelら、1980, Nucl.Acids
Res. , ８：4057) およびラムダ由来ＰL プロモーター
(Shimatakeら、1981, Nature, 292 ：128)およびＮ−遺
伝子リボソーム結合部位（ＮRBS ) 。
【００９９】ポータブルのコントロールシステムのカセ
ットは、米国特許第 4,711,845号（1987年12月８日発
行）に記載されている。このカセットは、ＮRBS 配列の
６bpの３′内で切断可能とする少なくとも１つの制限部
位を有する第３ DNA配列より上流に位置するＮRBS に作
用可能に連鎖したＰL プロモーターを含む。また、 Cha
ngら、欧州特許公開第196,864 号（1986年10月８日発
行）に記載されているホスファターゼＡ(phoA)は有用で
ある。しかしながら、原核生物と適合性の任意の入手可
能なプロモーター系を使用して、本発明の Tma発現ベク
ターを構成することができる。
【０１００】Tmaインサートのヌクレオチド配列は、上
流のリボソーム結合部位の効率にマイナスに影響を与
え、低いレベルの翻訳されたポリメラーゼを生ずること
ができる。 Tma遺伝子の翻訳は、発現ベクターの「翻訳
的にカップリングされた」誘導体の構成により増強する
ことができる。短いコード配列のための停止コドンが T
ma遺伝子コード配列のための ATG開始コドンと「カップ
リング」するように、 Tma遺伝子のコード配列からちょ
うど上流に第２翻訳開始シグナルおよび短いコード配列
をもつ発現ベクターを構成することができる。
【０１０１】翻訳を効率よく開始する第２の翻訳開始シ
グナルを、 Tma遺伝子の開始コドンの上流に挿入するこ
とができる。例えば、１つの発現系は、TrpEの最後の６
コドンにイン−フレームで融合されたＴ７バクテリオフ
ァージの主要キャプシドタンパク質（遺伝子10）の最初
の10コドンおよび翻訳開始シグナルを利用することがで
きる。TrpEのための TGA（停止）コドンを、 Tma遺伝子
のコード配列のためのATG（開始）コドンと「カップリ
ング」させて、 TGATGを形成する。短いコード配列の翻
訳と Tmaのコード配列の翻訳との間に、１塩基のフレー
ム−シフトが要求される。これらの誘導体の発現ベクタ
ーは組換え DNA法により構成することができる。
【０１０２】遺伝コードの重複もまた、低い翻訳効率に
関係づけることができる。典型的には、同一のアミノ酸
をコードする多数のコドンが存在するとき、可能なコド
ンの１つが生物体において優先的に使用される。しばし
ば生物体は稀に使用されるコドンに相当するものより高
いレベルで好ましいコドンに相当するtRNA種を蓄積す
る。コドン使用のパターンがサーモトガ・マリチマ（Th
ermotoga maritima) と宿主細胞との間で異る場合、 T
maポリメラーゼの遺伝子の翻訳に必要なtRNA種は豊富で
ない場合がある。
【０１０３】Tmaのコード配列において、アルギニンは
「 AGA」コドンにより最も頻繁にコードされるが、この
コドンは大腸菌（E. coli) の遺伝子において低い頻度
で使用され、そして対応するtRNAは大腸菌（E. coli)
宿主細胞において低い濃度で存在する。結局、「 AGA」
コドンのための「ArgU」tRNAの大腸菌（E. coli) 宿主
細胞における低い濃度は、大腸菌（E. coli) 宿主細胞
における Tmaポリメラーゼ遺伝子の RNAの翻訳効率を制
限することがある。大腸菌（E. coli) 宿主細胞内の T
maのコード配列の翻訳効率は、このtRNA遺伝子の多数の
コピーを宿主細胞の中で発現させることによって、この
ArgtRNAの濃度を増加することによって改良することが
できる。
【０１０４】細菌に加えて、真核性微生物、例えば、酵
母菌もまた組換え宿主細胞として使用することができ
る。サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces
cerevisiae）の実験室株のパン酵母は最も頻繁に使用さ
れるが、他の多くの菌株が普通に入手可能である。２ミ
クロン複製起点を使用するベクターが普通である(Broac
h, 1983, Methods Enzymol., 101 ：307)が、酵母菌の
発現に適当な他のプラスミドベクターが既知である（参
照、Stinchcombら、1979, Nature, 282 ：39； Tchempe
ら、1980, Gene, 10：157;およびClarkcら、1983, Meth
ods Enzymol., 101 ：300)。酵母ベクターのためのコン
トロール配列は、解糖系酵素の合成のためのプロモータ
ーを包含する(Hess ら、1968, J.Adv.Enzyme Reg. ,
７：149; Hollandら、1978, Biotechnology , 17：490
0；およびHolland ら、1981, J.Biol.Chem., 256: 138
5)。
【０１０５】この分野において知られている追加のプロ
モーターは、次のものを包含する：３−ホスホグリセレ
ートキナーゼのためのプロモーター(Htzcmanら、1980,
J.Biol.Chem., 255 ：2073) および他解糖系酵素、例え
ば、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ、ヘキドキナーゼ、ピルベートデカルボキシラー
ゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリセホスフェートイソメラ
ーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキ
ナーゼのためのプロモーター。増殖条件によりコントロ
ールされる転写の追加の利点を有する他のプロモーター
は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソサイトクロム
Ｃ、酸性ホスフェターゼ、窒素の代謝に関連する分解系
酵素、並びにマルトースおよびガラクトースの利用に関
係する酵素のためのプロモーターである。
【０１０６】コード配列の３′末端に配置するとき、タ
ーミネーター配列もまた使用して発現を増大することが
できる。このようなターミネーターは、酵母誘導遺伝子
の中でコード配列の後の３′非翻訳領域において見いだ
される。酵母と適合性のプロモーター、複製起点、およ
び他の調節配列を含有する任意のベクターは、酵母菌の
Tmaの発現ベクターを構成するときの使用に適する。Tm
a遺伝子はまた、多細胞の生物体から誘導された真核生
物の宿主細胞の培養物の中で発現させることができる。
例えば、Tissure Culture , Academic Press, Cruzおよ
び Patterson編（1973）参照のこと。通常な宿主細胞系
は、 COS-7,COS-A2, CV-1、ネズミの細胞、例えば、ネ
ズミの骨髄腫 N51およびVERO, Hela細胞、およびチャイ
ニーズハムスター卵巣（CHO)細胞を包含する。
【０１０７】このような細胞のための発現ベクターは通
常、次のものを包含する：哺乳動物細胞と適合するプロ
モーターおよびコントロール配列、例えば、シミアンウ
イルス40（SV40) からの普通に使用される前期および後
期プロモーター(Fiersら、1978, Nature, 273 ：133)、
または他のウイルスのプロモーター、例えば、ポリオー
マ、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイルス（BPV)、ま
たは鳥類の肉腫ウイルスから誘導されたプロモーター、
または免疫グロブリンのプロモーターおよびヒートショ
ックプロモーター。
【０１０８】哺乳動物の系において BPVベクター系を使
用して DNAを発現するための系は、米国特許第 4,419,4
46号に開示されている。この系の変更は米国特許第 4,6
01,978号に記載されている。哺乳動物細胞の一般的面
は、Axel、米国特許第 4,399,216号に記載されている。
「エンハンサー」領域もまた、発現を最適化するために
重要である；これらは、一般に、プロモーター領域の上
流に見いだされる配列である。複製起点は、必要に応じ
て、ウイルス源から得ることができる。しかしながら、
染色体の中への組み込みは真核生物における DNAの複製
のための普通のメカニズムである。
【０１０９】植物の細胞もまた宿主として使用すること
ができ、そして植物の細胞と適合するコントロール配
列、例えば、ノパリンシンサーゼプロモーターおよびポ
リアデニル化シグナル配列、（Depickerら、1982, J.Mo
l.Appl.Genet. , １：561)が入手可能である。バキュロ
ウイルスベクターにより提供される制御系を利用する昆
虫を使用する発現系もまた、記載されている（Miller
ら、1986, Genetic Engeneering (Setlowら、編、Plen
um Publishing)８： 277−297)。昆虫に基づく発現はス
ポドプテラ・フルギペイダ（Spodoptera frugipeida)
において達成することができる。これらの系を使用して
も組み換え Tmaポリメラーゼを生産することができる。
【０１１０】宿主細胞に依存して、形質転換はこのよう
な細胞に適当な標準的技術を使用して実施される。Cohe
n, 1972, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 69：2110に記載さ
れているような、塩化カルシウムを使用するカルシウム
処理は原核生物または実質的な細胞壁のバリヤーを含有
する他の細胞のために使用される。アグロバクテリウム
・ツムファシエンス（Agrobacterium tumfaciens) に
よる感染（Shawら、1983, Gene, 23：315)は、ある種の
植物細胞について使用される。哺乳動物細胞について、
Grahamおよびvan der Eb, 1978, Virology, 52：546 の
リン酸カルシウム沈澱方法が好ましい。酵母の中への形
質転換は、Van Solingenら、1977, J.Bacteriol., 130
：946 および Hasioら、1979, Proc.Natl.Acad.Sci.US
A, 76：3829の方法に従い実施される。
【０１１１】一旦 Tma DNAポリメラーゼが組み換え宿主
細胞の中で発現されると、タンパク質の精製が望ましい
ことがある。種々の精製手順を使用して本発明の組み換
え熱安定性ポリメラーゼを精製することができるが、よ
り少ない工程を使用して等しい純度の発現調製物を製造
する必要があろう。大腸菌（E. coli) 宿主のタンパク
質は感熱性であるので、組換え熱安定性 Tma DNAポリメ
ラーゼを粗製のリゼイトを加熱不活性化することによっ
て実質的に濃縮することができる。
【０１１２】この工程は、宿主 DNAからの Tma DNAポリ
メラーゼの解離を確実にしかつ TmaDNAポリメラーゼと
他の細胞リゼイトのタンパク質とのイオンの相互作用を
減少するために十分な量の塩（典型的には0.03Ｍの硫酸
アンモニウム）の存在下に実施する。さらに、 0.3Ｍの
硫酸アンモニウムの存在はフェニルセファローズカラム
との疎水性相互作用を促進する。疎水性相互作用のクロ
マトグラフィーは分離技術であり、ここで物質は疎水性
基を含有する非帯電ベッド材料との疎水性相互作用の異
なる強さに基づいて分離される。典型的には、カラムを
まず疎水性結合に好適な条件、例えば、高イオン強度の
下で平衡化する。その時、下降する塩の勾配を使用して
試料を溶出することができる。
【０１１３】本発明によれば、水性混合物（組み換え T
ma DNAポリメラーゼを含有する）を、比較的強い疎水性
ゲル、例えば、フェニルセファローズ(Pharmacia製）ま
たはフェニル（Phenyl) TSK(東洋ソーダ製）を含有する
カラムに負荷する。フェニルセファローズのカラムとの
相互作用を促進するために、例えば、 0.3Ｍより高い
か、あるいは低い、好ましい 0.3Ｍの硫酸アンモニウ
ム、あるいは 0.5Ｍの高いか、あるいは低いNaClを含有
する溶媒を使用する。カラムおよび試料を、また、0.5m
Mの DTTを含有する50mMのトリス（pH 7.5) および 1.0m
MのEDTA（「TE」）緩衝液中の 0.3Ｍ硫酸アンモニウム
に調節し、そして試料をカラムに適用する。
【０１１４】このカラムを 0.3Ｍの硫酸アンモニウム緩
衝液で洗浄する。次いで、酵素を疎水性相互作用を弱く
する溶媒、例えば、減少する塩の勾配、エチレンまたは
プロピレングリコール、または尿素で溶離することがで
きる。天然 Tma DNAポリメラーゼについて、好ましい態
様はTE-DTT中の２Ｍの尿素および20％のエチレングリコ
ールでカラムを洗浄することを包含する。長期間の安定
性のために、 Tma DNAポリメラーゼ酵素を１種または２
種以上の非イオン性ポリマー洗剤を含有する緩衝液の中
に貯蔵することができる。このような洗剤は、一般に、
ほぼ 100〜250,000 ダルトン、好ましくは約 4,000〜 2
00,000ダルトンの範囲の分子量を有し、そして酵素を約
3.5〜約 9.5、好ましくは約４〜 8.5のpHにおいて安定
化するものである。
【０１１５】このような洗剤の例は、次の文献に特定さ
れているものを包含する：McCutchconのEmulsifiers &
Detergents, North American編：1983), MC Publishing
Co.のMcCutcheon Divison発行、米国ニュージャージイ
州グレンロック、ロックロード175 、の 295〜 298ペー
ジおよび同時継続出願第 387,003号、1989年７月28日提
出、その開示をここに引用によって加える。
【０１１６】好ましくは、洗剤はエトキシル化脂肪酸ア
ルコールエーテルおよびラウリルエーテル、エトキシル
化アルキルフェノール、オクチルフェノキシポリエトキ
シエタノール化合物、変性オキシエトキシル化および／
またはオキシプロピル化直鎖状アルコール、ポリエチレ
ングリコールモノオレエート化合物、ポリソルベート化
合物、およびフェノール系脂肪族アルコールエーテルか
ら成る群より選択される。ツイーン20、ポリオキシエチ
ル化（20）ソルビタンモノラウレート（ICI Americas I
nc. 、デラウェア州ウィルミントン）およびIconol NP-
40、エトキシル化アルキルフェノール（ノニル）（BASF
Wyandotte Corp. 、ニュージャージイ州パルシパニイ
製）は、さらに一層好ましい。
【０１１７】本発明の熱安定性酵素は、このような酵素
が必要であるか、あるいは望ましい、任意の目的に使用
することができる。とくに好ましい態様において、酵素
は PCRとして知られている核酸増幅反応を触媒する。こ
の核酸配列を増幅する方法は、米国特許第 4,683,202号
および米国特許第 4,865,188号（それらの各々をここに
引用によって加える）に開示および特許請求されてい
る。 PCR核酸増幅法は、核酸または核酸の混合物の中に
含有されている少なくとも１つの特定の核酸配列を増幅
することを包含し、そして最も普通の態様において、二
本鎖 DNAを生成する。
【０１１８】説明を容易とするために、下に記載するプ
ロトコルは増幅すべき特定の配列が二本鎖の核酸の中に
含有されていると仮定する。しかしながら、この方法は
一本鎖の核酸、例えば、mRNAの増幅においても同様に有
用であるが、好ましい実施態様において究極の生成物は
なお二本鎖 DNAである。一本鎖の核酸の増幅において、
第１工程は相補的鎖の合成（２つの増幅プライマーの１
つをこの目的に使用することができる）を包含し、そし
て連続する工程は下に記載する二本鎖の増幅法における
ように進行する。
【０１１９】増幅は、工程： （ａ）各核酸鎖を、４つの異なるヌクレオシド三リン酸
および増幅されるべき各特定の配列のための２つのオリ
ゴヌクレオチドのプライマーと接触させ、ここで各プラ
イマーを、特定の配列の異なる鎖に対して相補的であり
１つのプライマーから合成された伸長生成物がその相補
的体から分離されたとき、他のプライマーの伸長生成物
の合成のための鋳型として働くように選択し、前記接触
を各プライマーが相補的核酸鎖に対してハイブリダイゼ
ーションすることができるような温度において実施し、
【０１２０】（ｂ）各核酸鎖を、工程（ａ）と同時にま
たはその後に、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga ma
ritima) からの DNAポリメラーゼと接触させ、前記 DNA
ポリメラーゼはヌクレオシド三リン酸を結合させて特定
の核酸配列の各鎖に対して相補的であるプライマー伸長
生成物を形成することができるものであり、（ｃ）工程
（ｂ）からの混合物を、酵素の活性を促進しかつ、増幅
される各異なる配列について、各核酸鎖の鋳型に対して
相補的である各プライマーの伸長生成物を合成するため
に有効であるが、各伸長生成物を相補的鎖の鋳型から分
離するほど高くない温度において有効な時間の間維持
し、
【０１２１】（ｄ）工程（ｃ）からの混合物を、プライ
マー伸長生成物をそれらがその上で合成されて一本鎖の
分子を生成する鋳型から分離するために有効であるが、
酵素を不可逆的に変性するほど高くない温度に有効な時
間の間加熱し、（ｅ）工程（ｄ）からの混合物を、工程
（ｄ）において生成された一本鎖の分子の各々へのプラ
イマーのハイブリダイゼーションを促進するために有効
な温度に有効な時間の間冷却し、そして
【０１２２】（ｆ）工程（ｅ）からの混合物を、酵素の
活性を促進しかつ、増幅される各異なる配列について、
工程（ｄ）において生成された各核酸鎖の鋳型に対して
相補的である各プライマーの伸長生成物を合成するため
に有効であるが、各伸長生成物を相補的鎖の鋳型から分
離するほど高くない温度に有効な時間の間維持する、こ
とを含んでなる。工程（ｅ）および（ｆ）における有効
な時間および温度を一致させて、工程（ｅ）および
（ｆ）を同時に実施できるようにすることができる。工
程（ｄ）〜（ｆ）は、所望のレベルの増幅が得られるま
で、反復する。
【０１２３】この増幅方法は既知配列の特定の核酸配列
を大量に生産するために有用であるばかりでなく、かつ
また存在することが知られているが、完全には特定され
ていない核酸配列を生産するために有用である。配列の
両端における十分な数の塩基を十分に詳細に知り、こう
して配列に沿った相対的位置における所望の配列の異な
る鎖にハイブリダイゼーションする２つのオリゴヌクレ
オチドのプライマーを調製できるようにし、こうして一
方のプライマーから合成された伸長生成物が、鋳型（相
補的）から分離されたとき、定義された長さの核酸配列
への他方のプライマーの伸長のための鋳型として働くこ
とができるようにする。配列の両端における塩基につい
ての知識が深くなればなるほど、標的核酸配列に対する
プライマーの特異性およびこの方法の効率をより大きく
することができる。
【０１２４】いずれの場合においても、増幅すべき配列
の初期のコピーは入手可能でなくてはならないが、配列
は純粋である必要はなく、あるいは個別の分子である必
要はない。一般に、増幅方法は連鎖反応を包含し、この
連鎖反応は、（ａ）要求される配列の末端が十分に詳細
に知られていて、それらにハイブリダイゼーションする
オリゴヌクレオチドを合成することができ、且つ（ｂ）
連鎖反応を開始するために少量の配列が入手可能である
と、関係する反応工程の数に関して指数的な量で、少な
くとも１つの特定の核酸配列を生産する。連鎖反応の生
産物は、使用された特定のプライマーの５′末端に対応
する末端をもつ個別の核酸二重鎖であろう。
【０１２５】任意の核酸配列を、精製されたまたは精製
されない形態で出発核酸として利用することができる
が、ただしそれは増幅しようとする特定の核酸配列を含
有するか、あるいは含有すると思われるものであること
を条件とする。増幅すべき核酸は、任意の源、例えば、
プラスミド、例えば、pBR322から、クローニングした D
NAまたは RNAから、あるいは、細菌、酵母菌、ウイル
ス、細胞小器官、および高等生物、例えば、植物および
動物を包含する任意の源からの天然 DNAまたは RNAから
得ることができる。
【０１２６】DNAまたは RNAは、血液、組織材料、例え
ば、絨毛膜の絨毛、または羊膜細胞から種々の技術によ
り抽出することができる。例えば、Maniatisら、前掲、
pp.280−281 を参照のこと。この方法は、例えば、メッ
センジャー RNAを包含する DNAまたは RNAを使用するこ
とができ、前記 DNAまたは RNAは一本鎖または二本鎖で
あることができる。さらに、各々の１つの鎖を含有する
DNA− RNAハイブリッドを利用することができる。
【０１２７】これらの核酸の任意の混合物もまた、使用
することができ、また前の増幅反応から核酸を生成する
ことができる（同一であるか、あるいは異なるプライマ
ーを使用する）。増幅すべき特定の核酸配列は大きい分
子の一部分のみであるか、あるいは特定の配列が全体の
核酸を構成するように、個別の分子として最初から存在
することができる。
【０１２８】増幅すべき配列は最初に純粋な形態で存在
することは必要ではない；配列は複雑な混合物の小さい
部分、例えば、全ヒト DNAの中に含有されるβ−グロブ
リン遺伝子の一部分(Saikiら、1985, Science,230 ：15
30−1534において例示されているように）または特定の
微生物のために核酸配列の一部分（この生物体は特定の
生物学的試料の非常に小さい部分のみを構成するであろ
う）であることができる。
【０１２９】細胞の溶解および細胞内の成分の分散が起
こるまで（一般に１〜15分）低張緩衝液の中の懸濁およ
び約90℃〜 100℃の熱処理後、細胞を増幅法において直
接使用することができる。加熱工程後、増幅試薬を溶解
した細胞に直接添加することができる。出発核酸配列は
１より多い所望の核酸配列を含有することができる。増
幅方法は大量の１つの特定の核酸配列の生産のためにば
かりでなく、かつまた同一であるか、あるいは異なる核
酸分子上に位置する１より多い異なる特定の核酸配列を
同時に増幅するために有用である。
【０１３０】プライマーは PCR法において主要な役割を
演ずる。語「プライマー」は、増幅法の説明において使
用するとき、とくに増幅すべき断片の末端の１または２
以上の配列に関する情報が多少不明瞭である場合、ある
いは本発明の縮重プライマー法を使用する場合、１より
多いプライマーを意味する。例えば、核酸配列をタンパ
ク質配列の情報から推理される場合、遺伝コードの縮重
性に基づいてすべての可能なコドンの多様性を表す配列
を含有する１集団のプライマーを各鎖のために使用す
る。この集団からの１つのポリメラーゼは、増幅すべき
所望の配列の末端と十分に相同性であって、増幅のため
に有用であろう。
【０１３１】さらに、適当な数のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを利用するかぎり、１より多い特定の核酸配列
を最初の核酸または核酸の混合物から増幅することがで
きる。例えば、２つの異なる特定の核酸配列を生成しよ
うとするとき、４つのプライマーを利用する。プライマ
ーのうちの２つは特定の核酸配列の１つに対して特異的
であり、そして他の２つのプライマーは第２の特定の核
酸配列に対して特異的である。このようにして、２つの
異なる特定の配列の各々を本発明の方法により指数的に
生産することができる。
【０１３２】所定の配列内の配列は、反応においてより
大きい特異性をえるための所定の増幅サイクル後、少な
くとも１つの増幅サイクル後、増幅すべき配列の内部の
配列（すなわち、末端上に存在しない配列）に対して相
補的であるプライマーの組を添加することにより増幅す
ることができる。このようなプライマーは任意の段階に
おいて添加することができ、そしてより短い増幅された
断片を与えるであろう。あるいは、より長い断片は、非
相補性の末端をもつが増幅において前に利用したプライ
マーと多少のオーバーラップを有するプライマーを使用
することによって調製することができる。
【０１３３】プライマーはまた、増幅法をin vitroの突
然変異誘発のために使用するとき、主要な役割を演ず
る。使用するプライマーがもとの鋳型に正確に相補的で
ない、増幅反応の生産物は、鋳型よりむしろプライマー
の配列を含有し、それゆえin vitroの突然変異を導入す
るであろう。それ以上のサイクルにおいて、それ以上の
誤対合のプライミングが要求されないので、突然変異は
減少しない効率で増幅されるであろう。
【０１３４】前述したように変更された DNA配列をつく
る方法を、異なるプライマーを使用して、変更された D
NAについて反復して、それ以上の配列の変化を導入する
ことができるであろう。このようにして、１系列の突然
変異した配列を徐々に生成することができ、ここでその
系列への各新しい付加は最後のものと小さい程度に異な
るが、もとの DNA源の配列と非常に大きく異なる。
【０１３５】プライマーはその配列の一部分として非相
補的配列を含有できるので、プライマーの十分な量が増
幅すべき鎖に対して相補的である配列を含有するかぎ
り、多数の他の利点を実現することができる。例えば、
鋳型の配列に対して相補的でないヌクレオチド配列（例
えば、プライマー、リンカー、コード配列など）をプラ
イマーの１つまたは両方の５′末端に取り付けることが
でき、それゆえ増幅法の生成物に付加することができ
る。伸長プライマーを添加した後、十分なサイクルを実
施して、非相補的ヌクレオチドのインサートを含有する
所望の量の新しい鋳型を得る。これにより、簡単な技術
を使用して比較的短い時間（例えば、２時間以内に）
で、大量の組み合わされた断片を生産することができ
る。
【０１３６】オリゴヌクレオチドのプライマーは、任意
の適当な方法、例えば、前述のホスホトリエステルまた
はホスホジエステルの方法、またはそれらの自動化され
た態様を使用して調製することができる。１つのこのよ
うな自動化された態様において、ジエチルホスホルアミ
ダイトを出発物質として使用し、そしてBeaucageら、19
81, Tctrahedron Letters , 22：1859−1862、に記載
されているようにして合成することができる。固体支持
体上でオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法は、米
国特許第 4,458,066号に記載されている。また、生物学
的源（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物）から単
離されたプライマーを使用することができる。
【０１３７】しかしながら、どのプライマーを使用して
も、反応混合物は PCRが起こすための鋳型を含有しなく
てはならない。なぜなら、特定の核酸配列は鋳型として
その配列を含有する核酸を使用して生成されるからであ
る。第１工程は、増幅または検出されるべき各特定の核
酸配列について、各核酸鎖を４つの異なるヌクレオシド
三リン酸および２つのオリゴヌクレオチドのプライマー
と接触することを包含する。
【０１３８】増幅または検出すべき核酸が DNAである場
合、ヌクレオシド三リン酸は通常dATP, dCTP, dGTPおよ
びdTTPであるが、種々のヌクレオチドの誘導体もまたこ
の方法において使用することができる。ヌクレオシド三
リン酸の濃度は広く変化することができる。典型的に
は、濃度は増幅のための緩衝液の中で各dNTPにおいて50
〜 200μＭであり、そして MgCl2は緩衝液の中に１〜３
mMの量で存在して、ポリメラーゼを活性化しかつこの反
応の特異性を増加する。しかしながら、１〜20μＭのdN
TPの濃度がいくつかの応用、例えば、 DNAの配列決定ま
たは高い比活性の放射線標識したプローブの発生のため
に好ましいことがある。
【０１３９】標的核酸の核酸鎖は、プライマーの伸長生
成物である追加の核酸鎖の合成のための鋳型として働
く。この合成は任意の適当な方法を使用して実施できる
が、一般に緩衝化された溶液の中で、好ましくはpH７〜
９において、最も好ましくはpH約８において起こる。合
成を促進するために、モル過剰の２つのオリゴヌクレオ
チドプライマーを鋳型鎖を含有する緩衝液に添加する。
実際には、増幅すべき配列は複雑な長鎖核酸鎖の混合物
の中に含有される場合、プライマーの添加量は相補的鎖
（鋳型）の量を越えたモル過剰である。大モル過剰がこ
の方法の効率を改良するために好ましい。したがって、
少なくとも 100：１またはそれ以上のプライマー：鋳型
の比を一般にクローニングされた DNAの鋳型について使
用し、そして約108 ：１またはそれ以上のプライマー：
鋳型の比を一般に複雑なゲノムの混合物について使用す
る。
【０１４０】次いで、鋳型、プライマーおよびヌクレオ
シド三リン酸の混合物を、増幅または検出されるべき核
酸が一本鎖または二本鎖であるかどうかに従い、処理す
る。核酸が一本鎖である場合、第１伸長サイクルの前に
変性工程は不必要であり、そして反応混合物をプライマ
ーのその相補的標的（鋳型）配列へのハイブリダイゼー
ションを促進する温度に保持する。
【０１４１】このような温度は、一般に、有効な時間、
一般に数秒〜５分、好ましくは30秒〜１分について、約
35℃〜65℃またはそれ以上、好ましくは約37℃〜60℃で
ある。35℃〜70℃のハイブリダイゼーション温度を Tma
DNAポリメラーゼについて使用することができる。長さ
が15ヌクレオチドまたはそれより長いプライマーを使用
して、プライマーのハイブリダイゼーションの特異性を
増加する。より短いプライマーはより低いハイブリダイ
ゼーション温度を必要とする。
【０１４２】もとの一本鎖核酸に対する相補体は、適当
な緩衝液、dNTPおよび１または２以上のオリゴヌクレオ
チドのプライマーの存在下に Tma DNAポリメラーゼを添
加することによって合成することができる。適当な単一
のプライマーを添加する場合、プライマー伸長生成物は
一本鎖核酸に対して相補的であり、そして等しいか、あ
るいは等しくない長さ（プライマーが鋳型にハイブリダ
イゼーションするかどうかに依存する）の鎖の二重鎖と
なって核酸鎖とハイブリダイゼーションし、次いでこれ
を前述したように一本鎖に分離して、２つの単一の、分
離された、相補的な鎖を生産することができる。
【０１４３】次いで第２プライマーを添加し、こうして
プライマーの伸長の引き続くサイクルを鋳型としてもと
の一本鎖の核酸および第１プライマーの伸長生成物の両
者を使用して実施する。あるいは、２またはそれ以上の
適当なプライマー（それらの１つは他の伸長生成物を鋳
型として使用して合成をプライミングするであろう）を
一本鎖の核酸に添加し、そして反応を実施することがで
きる。
【０１４４】二本鎖の増幅または一本鎖標的の第２サイ
クルの増幅の場合におけるように、核酸が２つの鎖を含
有する場合、プライマーのハイブリダイゼーションの前
に、核酸の鎖を分離しなくてはならない。この鎖の分離
は、物理的、化学的または酵素的手段を包含する、任意
の適当な変性法により達成することができる。核酸の鎖
を分離する１つの好ましい物理的方法は、核酸を完全な
（＞99％）変性が起こるまで加熱することを包含する。
【０１４５】典型的な加熱変性は、核酸の組成および大
きさに依存して、一般に約数秒〜数分の範囲の時間の
間、約80℃〜 105℃の温度を用いる。好ましくは、有効
な変性温度は数秒〜１分間について90℃〜 100℃であ
る。鎖の分離はまた、ヘリカーゼ（Helicases)として知
られている酵素または酵素RccA（これらはヘリカーゼの
活性を有しそして riboATPの存在下に DNAを変性するこ
とが知られている）のクラスからの酵素により誘発する
ことができる。
【０１４６】ヘリカーゼにより核酸鎖を分離するために
適当な反応条件はKuhn Hoffmann-Berling, 1978,CSH-Qu
natitative Biology, 43：63に記載されており、そして
RecAを使用する技術はRadding, 1982,Annu.Rev.Genet.
, 16：405-437 において概観されている。この変性は
等しいか、あるいは等しくない長さの２つの分離された
鎖を生成する。
【０１４７】二本鎖の核酸を熱により変性する場合、反
応混合物を各プライマーの相補的標的（鋳型）配列への
ハイブリダイゼーションを促進する温度に冷却する。こ
の温度は、試薬に依存して、通常約25℃〜65℃、好まし
くは37℃〜60℃である。ハイブリダイゼーション温度は
有効な時間、一般に数秒〜数分、好ましくは10秒〜１分
の間維持される。実際には、温度は単に約95℃から37℃
程度に低く低下させ、そしてハイブリダイゼーションは
この範囲内の温度において起こる。
【０１４８】核酸が一本鎖または二本鎖であるかどうか
にかかわらず、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga ma
ritima) からの DNAポリメラーゼを、変性の前にまたは
その間に、あるいは温度がハイブリダイゼーションを促
進する範囲に低下しつつあるとき、あるいはその範囲に
あるとき、添加することができる。 Tmaポリメラーゼの
熱安定性は任意の時間における Tmaポリメラーゼの反応
混合物への添加を可能とするが、混合物がストリンジェ
ントのハイブリダイゼーション温度以下に冷却されない
時点において、ポリメラーゼを反応混合物に添加するこ
とによって、非特異的増幅を実質的に阻止することがで
きる。
【０１４９】ハイブリダイゼーション後、酵素の活性が
促進されまたは最適化される温度、すなわち、ハイブリ
ダイズしたプライマーおよび鋳型からのプライマー伸長
生成物の合成を促進するにあたり酵素の活性を増加する
ために十分な温度に、反応混合物を加熱するか、あるい
は維持する。温度は、実際に、各核酸の鋳型に対して相
補的である各プライマーの伸長生成物を合成するために
十分であるが、その相補的鋳型からの各伸長生成物を変
性するほど高くあってはならない（すなわち、温度は一
般に約80℃〜90℃以下である）。
【０１５０】使用する１または２以上の核酸に依存し
て、この合成反応に有効な典型的な温度は一般に約40℃
〜80℃、好ましくは50℃〜75℃の範囲である。サーモト
ガ・マリチマ（Thermotoga maritima) の DNAポリメラ
ーゼについて、温度はより好ましくは約65℃〜75℃の範
囲である。この合成に要求される時間は、温度、核酸の
長さ、酵素、および核酸混合物の複雑さに依存して、約
10秒〜数分またはそれ以上の範囲であることができる。
伸長時間は、通常、約30秒〜数分である。核酸がより大
きい場合、より長い時間が相補的鎖の合成に要求され
る。
【０１５１】新しく合成された鎖および相補的核酸鎖
は、増幅法の次の工程において使用される二本鎖の分子
を形成する。次の工程において、二本鎖の分子の鎖は加
熱変性により分離され、この加熱変性はその分子を変性
するために有効な温度および時間の間実施されるが、熱
安定性酵素が完全にかつ不可逆的に変性または不活性化
される温度ではなくかつそれほど時間は長くてはならな
い。この鋳型の変性後、温度は、前述したように、前の
工程から生成した相補的一本鎖の核酸（鋳型）へのプラ
イマーのハイブリダイゼーションを促進するレベルに低
下させる。
【０１５２】このハイブリダイゼーション工程後、ある
いはハイブリダイゼーション工程と同時に、温度は、熱
安定性酵素の活性を促進して、新しく合成された鎖およ
びもとの鎖の両者を鋳型として使用するプライマー伸長
生成物の合成を可能とするために有効な温度に調節され
る。温度はやはり前述したように、伸長生成物をその鋳
型から分離（変性）するほど高くあってはならない。ハ
イブリダイゼーションはこの工程において起こることが
できるので、変性後の冷却の前の工程は不必要である。
このような場合において、同時の工程を使用して、好ま
しい温度範囲は50℃〜70℃である。
【０１５３】鎖の分離、ハイブリダイゼーション、およ
び伸長生成物の合成の１サイクルに関係する加熱および
冷却の工程を、所望の量の特定の核酸配列を生成するた
めに必要な回数だけ反復することができる。唯一の制限
は存在するプライマー、熱安定性酵素およびヌクレオシ
ド三リン酸の量である。通常、15〜30サイクルが完了す
る。増幅された DNAの診断的検出について、サイクルの
数は試料の性質および試料の中標的の濃度に依存するで
あろう。例えば、増幅される試料が純粋である場合、よ
り少ないサイクルが要求される。
【０１５４】試料が核酸の複雑な混合物である場合、よ
り多いサイクルが検出のために十分なシグナルを増幅す
るために要求されるであろう。一般の増幅および検出の
ために、この方法は約15回反復される。増幅を使用し
て、標識された配列特異的プローブで検出すべき配列を
発生するとき、およびヒトゲノム DNAが増幅の標的であ
るとき、明瞭に検出可能なシグナルを生成するために、
すなわち、バックグラウンドのノイズが検出を妨害しな
いようにするために十分に配列を増幅するためには、こ
の方法を15〜30回反復する。
【０１５５】主要な試薬が使い尽くされず、そして酵素
が変性されるかあるいは不可逆的に不活性化されないこ
とを条件して、追加のヌクレオシド、プライマー、また
は熱安定性酵素は初期の添加後に不必要であるが、その
ようになった場合において、追加のポリメラーゼまたは
他の試薬を反応を続けるために添加しなくてはならない
であろう。しかしながら、各工程におけるこのような物
質の添加は反応に悪影響を及ぼさないであろう。適当な
数のサイクルを完結して、所望の量の特定の核酸配列を
生成した後、通常の方法で、例えば、EDTA、フェノー
ル、 SDS、またはCHCl3を添加して酵素を不活性化する
か、あるいは反応の成分を分離することによって、反応
を停止させることができる。
【０１５６】増幅の方法は連続的に実施することができ
る。自動化された方法の１つの態様において、温度があ
る時間の間あるレベルでコントロールされるように、反
応混合物を温度サイクルすることができる。この目的の
ための１つのこのような機器は、パーキン−エルマー・
セツス・インスツルメンツ（Perkin-Elmer Cetus Instr
uments) により開発されかつ市販されている、増幅反応
を取り扱うための自動化された機械である。この計器を
使用して PCRを実施するための詳細なインストラクショ
ンは、この機器の購入するとき入手可能である。
【０１５７】Tma DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼ連
鎖反応による核酸配列の増幅が有用である多様な方法に
おいて非常に有用である。増幅方法を米国特許第 4,80
0,159号に記載するように利用して、適当な発現ベクタ
ー中への挿入のための特定の核酸配列をクローニングす
ることができる。このベクターを使用して、組み換え D
NA技術の標準的方法により、適当な宿主生物体を形質転
換して遺伝子生産物を生成することができる。このよう
なクローニングは、平滑末端の結合を使用するベクター
の中への直接の結合、または制限酵素を使用するプライ
マー内に含有された部位における切断を包含することが
できる。
【０１５８】Tmaポリメラーゼに適当な他の方法は、米
国特許第 4,683,195号および米国特許第 4,683,202号並
びに欧州特許公開第 229,701号；欧州特許公開第 237,3
62号；および欧州特許公開第 258,017号（これらの開示
をここに引用によって加える）に記載されているものを
包含する。さらに、本発明の酵素は非対称の PCR（参
照、GyllenstenおよびErlich, 1988, Proc.Natl.Acad.S
ci.USA, 85：7652−7656、その開示をここに引用によっ
て加える）：逆 PCR（Ochmanら、1988, Gentics, 120
：621 、その開示をここに引用によって加える）にお
いて；および DNAの配列決定（参照、 Innisら、1988,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85：9436−9440、およびMcCo
nlogueら、1988, Nuc.Acids Res., 16(20)：9869) のた
めに有用である。
【０１５９】Tmaポリメラーゼはまた、逆転写酵素活性
を有すると信じられる； PCT特許公開第91／09944 号、
1991年７月11日公開を参照のこと、その開示をここに引
用によって加える。Tma DNAポリメラーゼの逆転写酵素
活性は、 RNAを転写および増幅する方法におけるこの酵
素の使用を可能とする。このような方法の改良は単一の
酵素の使用にあるが、従来の方法は１より多い酵素を必
要とした。
【０１６０】改良された方法は、工程：（ａ） RNA鋳型
と適当なプライマーとを、該プライマーが対応する RNA
鋳型にアニーリングする条件下に組み合わせ；そして
（ｂ）アニーリングされたプライマー− RNA鋳型の混合
物を Tma DNAポリメラーゼと、その DNAポリメラーゼが
デオキシヌクレオシド三リン酸の重合を触媒して RNA鋳
型の配列に対して相補的な DNA配列を形成するために十
分な条件下に、インキュベーションすることによって、
RNAを逆転写する、ことを含んでなる。
【０１６１】上記の方法の他の面において、 RNA鋳型に
アニーリングするプライマーはまた、 PCRによる増幅の
ために適当であることがある。 PCRにおいて、逆転写さ
れたcDNA鎖に対して相補的である第２プライマーは伸長
生成物の合成の開始部位を提供する。既に述べたよう
に、 Tma DNAポリメラーゼはcDNA鋳型上のこの伸長反応
を触媒することができる。Tma DNAポリメラーゼによる
RNA分子の増幅において、第１伸長反応は逆転写であ
り、ここで DNA鎖は RNA／cDNAハイブリッドの分子の形
態で生成される。 DNA鎖を鋳型として使用する第２伸長
反応は、二本鎖 DNA分子を生成する。こうして、 Tma D
NAポリメラーゼを使用する RNA鋳型からの相補的 DNA鎖
の合成は、 PCRによる増幅のための出発物質を提供す
る。
【０１６２】Tma DNAポリメラーゼを RNA鋳型からの核
酸の転写に使用するとき、Mg2+を含有する緩衝液の使用
は、従来使用されたMg2+を含有する逆転写緩衝液と比較
して、 Tma逆転写酵素活性の改良された刺激を提供す
る。結局、増加したcDNAの収量はまたこれらの方法から
生ずる。前述したように、 Tma DNAポリメラーゼによる
RNA転写の生成物は RNA／cDNAハイブリッドの分子であ
る。この RNAを加熱変性あるいはアルカリ、熱、または
酵素処理を包含する任意の他の既知の方法により除去す
る。次いで残留するcDNA鎖は自己相補的鎖の重合のため
の鋳型として働き、これにより増幅または他の取り扱い
に適当二本鎖cDNA分子を提供する。第２鎖の合成は配列
特異的プライマーおよび Tma DNAポリメラーゼを必要と
する。
【０１６３】第２cDNA鎖の合成後、生ずる二本鎖cDNA分
子は、 DNA配列決定、 PCRによる増幅または特定の核酸
配列の検出を包含する、ある数の目的に役立つことがで
きる。cDNAのセグメントの増幅に有用な特定のプライマ
ーを、逆転写後に、添加することができる。また、第１
組のプライマーを使用して特定のcDNAを合成し、そして
第２の入れ子の組のプライマーを使用して所望のcDNAセ
グメントを増幅することができる。これらの反応のすべ
ては Tma DNAポリメラーゼにより触媒される。
【０１６４】Tma DNAポリメラーゼはまた、試料の中の
RNA標的分子を検出する方法を簡素化および改良するた
めに使用できる。これらの方法において、 Tma DNAポリ
メラーゼは次の反応を触媒する：（ａ）逆転写；（ｂ）
第２鎖cDNAの合成；および必要に応じて（ｃ） PCRによ
る増幅。単一の酵素のみを必要とする改良に加えて、記
載する方法における Tma DNAポリメラーゼの使用は、各
手順の工程のために異なる酵素の使用のために必要であ
った、２組のインキュベーション条件の従来の要件を排
除する。 Tma DNAポリメラーゼの使用は、RNA の転写お
よび相補的 DNAの増幅を増強された特異性をもって、従
来の RNAのクローニングおよび診断的方法より工程の数
を少なくして提供する。これらの方法は実験室および臨
床的分析のためのキットにおける使用に適合可能であ
る。
【０１６５】上の方法において転写されそして増幅され
た RNAは、多数の源に由来することができる。 RNA鋳型
は、任意の生物体からの核酸の調製物、例えば、ウイル
スまたはバクテリアの核酸の調製物の中に含有されてい
ることができる。この調製物は細胞の破片および他の成
分、精製された RNA、または精製されたmRNAを含有する
ことができる。 RNA鋳型はまた試料の中の不均一な RNA
分子の集団であることができる。さらに、標的 RNAは生
物学的試料の中に含有されることがあり、そして試料は
RNAがほんの小さい部分である、異種の試料であること
ができる。このような生物学的試料の例は、血液の試料
およびバイオプシーの組織試料を包含する。
【０１６６】上の方法の逆転写工程における使用するプ
ライマーは RNA鋳型に対して一般に完全に相補的である
が、プライマーは完全に相補的である必要はない。 PCR
におけるように、逆転写が起こるためにはプライマーの
すべてが鋳型にアニーリングしなくてもよい。例えば、
非相補的snはプライマーの５′末端に存在することがで
き、プライマーの残部は RNAに対して相補的である。あ
るいは、非相補的塩基がプライマーの中に介在すること
ができるが、ただしプライマーの配列はハイブリダイゼ
ーションが起こりかつ相補的 DNA鎖の合成を可能とする
ために十分な RNA鋳型と相補性をもつことを条件とす
る。
【０１６７】以下の実施例は例示のみに提供され、そし
て特許請求される本発明の範囲をいかなる方法において
も限定することを意図しない。これらの実施例におい
て、特記しない限り、すべての百分率は固体について重
量により、そして液体について容量により、そしてすべ
ての温度は℃である。
【０１６８】実施例１ サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima) の DNAポ
リメラーゼの精製 この実施例は、サーモトガ・マリチマ (Thermotoga ma
ritima) からの Tma DNAポリメラーゼの単離を記載す
る。 DNAポリメラーゼは、Lawyerら、1989，J. Biol. C
hem., 264 (11) : 6427-6437(その開示をここに引用に
よって加える）の中に Taq DNAポリメラーゼについて記
載されている１つの変更（１mMのMgCl2)を有する方法に
従い精製の間に、種々の時点で測定した。
【０１６９】典型的には、この測定は25mMのTAPS-HCl，
pH9.5 (20℃) ; 50mMのKCl ; １mMのMgCl2 ; １mMのβ
−メルカプトエタノール；20μＭの各々のdATP, dCTP,
dGTPおよびTTP ; 10mMのα−32Ｐ−cCTP（0.03〜0.07μ
Ci／nM）；12.5μｇの活性化サケ精子 DNA；並びにポリ
メラーゼから構成された反応混合物の50μｌの合計体積
で実施する。反応を、希釈物（希釈物は10mMのトリス−
HCl, pH8.0, 50mMのKCl, 0.1mMのEDTA, １mg／mlのオー
トクレーブ処理したゼラチン、 0.5％のNp40，0.5％の
ツイーン20および１mMのβ−メルカプトエタノールから
構成されている）中のポリメラーゼの添加により開始
し、そして反応を75℃において実施する。
【０１７０】下に示す計算のために、添加したポリメラ
ーゼ（および希釈物）の体積を５μｌであり、そして合
計反応体積を50μｌであると仮定する。10分間のインキ
ュベーション後、10μｌの60mMのEDTAの添加により反応
を停止させる。反応混合物を遠心し、そして50μｌの反
応混合物を10mlの２mMのEDTA中50μｇ／mlのキャリヤー
DNA（０℃）に移す。等しい体積（１ml）の20％の TC
A，２％のピロリン酸ナトリウムを添加し、そして混合
する。
【０１７１】この混合物を０℃において15〜20分間イン
キュベーションし、次いでワットマン(Whatman) GF／Ｃ
フィルターで濾過し、そして５％の TCAおよび１％のピ
ロリン酸ナトリウムを含有する混合物（６×５ml）でよ
く洗浄し、次いで冷95％のエタノールで洗浄する。次い
でフィルターを乾燥し、そして放射能を計数する。バッ
クグラウンド（酵素なし）は通常インプット cpmの 0.0
01％〜0.01％である。約50〜 250ピコモルの32Ｐ−dCTP
標準を単位の計算のためにスポッティングする。１単位
は75℃において30分間で組込まれた10nMのdNTPに等し
い。単位は次のようにして計算する；
【０１７２】
【数１】 4.167の係数は、停止溶液の添加後の反応体積（60μ
ｌ）の５／６（50μｌ）のみを計数することから生ず
る。すべての操作は、特記しない限り、０℃〜４℃にお
いて実施した。すべてのガラス器は使用前にベーキング
し、そして精製に使用した溶液は、可能ならば、使用前
にオートクレーブ処理した。
【０１７３】約50ｇの凍結したサーモトガ・マリチマ
(Thermotoga maritima) 菌株MSB8の細胞（教授 K. O.
Stettcr博士、ドイツ国レゲンスバーグ、により提供さ
れた）を、 2.4mMのPMSF(DMF中 144mMのストックから）
を含有する25mlの３×TE-DTT緩衝液(150mMのトリス−Cl
(pH7.5),３mMのEDTA、および３mMのジチオスレイトー
ル）の中で融解し、そして磁気撹拌機により低速で均質
化した。融解した細胞をアミンコ（Aminco）フレンチ圧
力セル（８〜20,000psi)の中で溶解した。リゼイトを追
加の 2.4mMのPMSFを含有する１×TE-DTT緩衝液で最終
5.5×細胞湿潤重量に希釈し、そして超音波処理して粘
度を減少させた（40〜 100％のアウトプット、９分、50
％の使用サイクル）。
【０１７４】生ずる分画、分画Ｉ(275ml) は5.31ｇのタ
ンパク質および15.5×104 単位の活性を含有した。硫酸
アンモニウムを 0.2Ｍ（7.25ｇ）に添加し、そしてリゼ
イトを氷上で15分間撹拌した。硫酸アンモニウムは Tma
DNAポリメラーゼが粗製のリゼイトの中の DNAに結合す
るのを防止し、そして DNAポリメラーゼと他の細胞リゼ
イトのタンパク質とのイオン性相互作用を減少する。実
験的試験は、 0.2％のポリミン(Polymin) Ｐ（ポリエチ
レンイミン、PEI)が全核酸の≧92％を沈澱させることを
示した。ポリミンＰ(pH7.5) を 0.2％（5.49mlの10％の
PEI)にゆっくり添加し、そしてこのスラリーを氷上で30
分間撹拌し、次いで30,000×ｇで４℃において30分間遠
心した。上澄み液を分画II(246ml）と表示し、そして3.
05ｇのタンパク質および12.5×105 単位の活性を含有し
た。
【０１７５】分画IIを3.24ｇの固体硫酸アンモニウムの
添加により 0.3Ｍ硫酸アンモニウムに調製し、 DNAポリ
メラーゼのフェニルセファローズへの完全な結合を保証
した。次いで分画IIを 2.2×6.6cm (25ml)のフェニルセ
ファローズCL−４Ｂ（ロットOM08012, Pharmacia-LKBか
ら購入した）カラム(0.3Ｍの硫酸アンモニウムおよび0.
5mMの DTTを含有するTEの中で平衡化したもの）上に38m
l／時（10ml／ cm2／時）で負荷した。すべての樹脂は
製造業者のインストラクションに従い平衡化しそして再
循環した。
【０１７６】カラムを 150mlの同一の緩衝液で洗浄し
（基線に対してＡ280)、次いで 0.6mMの DTTを含有する
（硫酸アンモニウムを含まない）90mlのTEで洗浄し、次
いで 0.5mMのDTT を含有するTE中20％のエチレングリコ
ール95mlで洗浄し、そして最後に20％のエチレングリコ
ールおよび 0.5mMの DTTを含有するTE中２Ｍの尿素で溶
出した。カラムの分画を測定するとき、活性の大きい比
率が流過分画および洗浄分画の中に見いだされ、カラム
の容量を越えたことを示した。この最初のフェニルセフ
ァローズのカラムに結合した DNAポリメラーゼのほぼ70
％は低い塩において溶出され（TE-DTT洗浄液で）、そし
て結合した物質の残部は２ＭのTE-DTT洗浄液中20％のエ
チレングリコール中２Ｍの尿素で溶離された。
【０１７７】第１フェニルセファローズのカラムからの
流過液の活性はPSII負荷と表示し(226ml）、そして1.76
ｇのタンパク質を含有した。分画PSII負荷を第２フェニ
ルセファローズカラム（同一のロットおよび寸法）に適
用し、そして実験を同一の方法で反復した。再び、カラ
ムの容量を越え、そして活性は低い塩および２Ｍの尿素
の洗浄液の両者で溶出されることがわかった。結合した
DNAポリメラーゼのわずかに10％がTE-DTT洗浄液で溶離
された；主要な部分（約90％）はTE-DTT洗浄液中20％の
エチレングリコール中２Ｍの尿素で溶出された。
【０１７８】第２フェニルセファローズカラムからの流
過液の活性を第１および第２のフェニルセファローズの
カラムからのTE-DTT溶出液と一緒にし、そして 0.3Ｍの
硫酸アンモニウムに調節した。この分画(PSIII負荷、 2
59.4ml）は 831mgのタンパク質を含有し、そして50mlの
ベッド体積の第３フェニルセファローズカラムに10ml／
cm2／時で適用した。この時、適用した活性のすべては
このカラムにより保持され、そしてTE-DTT洗浄液中20％
のエチレングリコール中の２Ｍの尿素でのみ溶出され
た。
【０１７９】３つのすべての尿素溶出液を別々にアミコ
ン（Amicon）YM30上で約３〜４倍に濃縮し、そして溶出
後短時間でヘパリンセファローズ負荷緩衝液の中に透析
して、尿素への延長された暴露を回避した（カルバミル
化を回避するために）。透析しかつ濃縮した尿素溶出液
をタンパク質濃度について測定し、そしてそれらの比活
性が大きく変化することが発見された。第２フェニルセ
ファローズカラムからの尿素溶出液は他の２つの溶出液
に比べて、有意に高い比活性（約 100単位／mgのタンパ
ク質において約８×104 単位の活性）で活性の大部分を
含有したので、これをそれらと別に処理した。
【０１８０】透析しそして濃縮したフェニルセファロー
ズII尿素溶出液を、0.08Ｍの KCl，50mMのトリス−Cl，
pH7.5 ， 0.1mMのEDTA， 0.2％のツイーン20および 0.5
mMのDTTにより平衡化した５mlのベッド体積のヘパリン
セファローズCL6B(Pharmacia-LKBから購入した）カラム
に適用した。このカラムおよびすべての引き続くカラム
を１ベッド体積／時で展開した。適用した DNAポリメラ
ーゼ活性のすべてはこのカラムにより保持された。この
カラムを17mlの同一緩衝液で洗浄し（基線に対してＡ
280)そして60mlの同一緩衝液中80〜 500mMの KClの直線
勾配で溶出した。
【０１８１】0.21〜 0.315Ｍの KClで溶出する分画（0.
53ml）をSDS-PAGEにより分析した。0.25〜 0.275Ｍの K
Clで溶出するピーク分画を別々に集めた。前後の分画を
後に他の分画と一緒にするために保持した。ピーク分画
（アフィゲルＩ負荷）のプールを KClを含まないアフィ
ゲル−ブルー緩衝液で希釈して、そのイオン強度を0.15
Ｍの KClに減少した。
【０１８２】アフィゲルＩ負荷の分画は 3.4mgのタンパ
ク質を含有しそして、25mlのトリス−Cl, pH7.5， 0.1
ＭのEDTA， 0.2％のツイーン20， 0.5mlの DTTおよび0.
15Ｍの KClの中で平衡化した 4.3mlのアフィゲル−ブル
ーカラム（BioRadから購入した）に適用した。適用した
Tma DNAポリメラーゼのすべては保持された。このカラ
ムを15mlの同一緩衝液で洗浄し、そして66mlの同一緩衝
液中0.15〜 0.7Ｍの KClの直線勾配で溶出した。
【０１８３】0.35〜0.55Ｍの KClで溶出する分画（0.58
ml）をSDS-PAGEにより分析し、そして＞90％の純度であ
るように思われた。ポリメラーゼのピーク分画は部位特
異的エンドヌクレアーゼで汚染されていなかった（65℃
において２単位の Tmaポリメラーゼと 600ngのプラスミ
ドpLSGl (ccc-DNA) を使用して１または２時間インキュ
ベーションした後、低分子量の特定の DNA断片の不存在
により示された）。0.3 〜 0.5Ｍで溶出するポリメラー
ゼのピークをプールし、そしてアミコンYM30膜上で約20
倍に濃縮した。次いでこの分画を 2.5×貯蔵緩衝液（50
mMのトリス−Cl，pH7.5 ， 250mMの KCl，0.25mMのEDT
A， 2.5mMの DTTおよび 0.5％のツイーン20 [Pierce, S
urfact-Amps])中で透析濾過し、そして４℃において貯
蔵した。
【０１８４】第１および第３のフェニルセファローズの
カラムからの尿素溶出液を、第１ヘパリンセファローズ
カラムからの前後分画と一緒にした。このプール（HSII
負荷）は約 200mgのタンパク質を含有し、そして KClを
含まないヘパリンセファローズ緩衝液で80mMの KClにそ
のイオン強度を調節した。HSII負荷を16mlのベッド体積
のヘパリンセファローズカラム（80mMの KCl，50mMのト
リス−Cl，pH7.5 ，0.1 mMのEDTA， 0.2％のツイーン20
および 0.5mMの DTTの中で平衡化したもの）に適用し
た。検出可能な活性は流過分画の中に現れなかった。
【０１８５】このカラムを80mlの同一緩衝液で洗浄し、
そして 200mlの同一緩衝液中80〜 750mMの KCl勾配で溶
出した。 0.225〜 0.335Ｍの KClで溶出する分画（２m
l）を一緒にし、そしてアミコンYM30膜上で約５倍に濃
縮し、そしてヒドロキシアパタイト緩衝液の中に透析し
た。この分画（HA負荷）は 9.3mgのタンパク質を含有
し、そして４mlのベッド体積のヒドロキシアパタイト
（高い分離能の HPT, Calbiochemから購入した）カラム
（10mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7.5 ， 0.5mMの DT
T， 0.1mMのEDTAおよび 0.2％のツイーン20の中で平衡
化したもの）上に負荷した。
【０１８６】このカラムを12mlの同一緩衝液で洗浄し、
そして60mlの10〜 500mMリン酸カリウム(pH7.5）の直線
勾配で溶出した。 0.105〜 0.230Ｍのリン酸カリウムで
溶出する分画(0.8ml）をSDS-PAGEにより分析した。アフ
ィゲルカラムＩの分画（これはSDS-PAGEにより約10〜20
％の純度であると思われた）と比較して、これらの分画
は約５倍純度が低かった。 0.105〜 0.255Ｍのリン酸カ
リウムで溶出する DNAポリメラーゼのピーク分画を一緒
にし、アミコンYM30膜上で３倍に濃縮し、そしてアフィ
ゲル−ブルー緩衝液中で透析濾過した。
【０１８７】アフィゲルII負荷分画を、アフィゲル−ブ
ルー緩衝液中で平衡化した３mlのベッド体積のアフィゲ
ル−ブルーカラムに適用した。検出可能な DNAポリメラ
ーゼの活性は流過分画中に現れなかった。このカラムを
９mlの同一緩衝液で洗浄し、そして50mlの同一緩衝液中
の 0.2〜 0.7Ｍの KCl直線勾配で溶離した。0.33〜 0.5
05Ｍの KClで溶出する分画（0.58ml）をSDS-PAGEにより
分析した。早期に溶出する分画はそれらの銀染色パター
ンによりわずかに一層きれいに見えたので、２つのプー
ルをつくった。0.31〜 0.4Ｍの KClで溶出する分画をプ
ールＩの中に一緒にした； 0.4〜 0.515Ｍの KClで溶出
する分画をプールIIの中に一緒にした。２つのプールの
各々を別々にアミコンYM30膜上で約７倍に濃縮した。
【０１８８】３つのすべてのアフィゲル−ブルーのプー
ルはなお高いレベルの汚染非特異的ヌクレアーゼを含有
した。70℃において 1.5単位の DNAポリメラーゼと共に
インキュベーションすることにより、一本鎖Ｍ13の DNA
鋳型およびプラスミドの多断片の制限消化物の両者は数
時間以内に分解した。イン−シチュ活性ゲルを展開し、
そして DNAポリメラーゼの分画がタンパク質分解的分解
を受けなかったことを示した。
【０１８９】第２アフィゲル−ブルーカラムからの２つ
のプールを一緒にし、そしてホスホセルロースカラム緩
衝液の中に透析した。透析した分画（Pll Ｉ負荷）を３
mlのホスホセルロースカラム（25mMのトリス−CI，pH7.
5 ，50mMの KCl， 0.1mMのEDTA， 0.2％のツイーン20お
よび 0.5mMの DTTで一夜洗浄したもの）上に負荷した。
この洗浄は後にホスホセルロース樹脂のpHの平衡化のた
めに不十分であったことが証明された。不都合なことに
は、これは試料がカラム上に負荷された後に見出され
た。適用した活性のすべてはカラムに結合した。
【０１９０】このカラムを９mlの負荷緩衝液で洗浄し、
そして45mlの50〜 700mMの KClの直線勾配で溶出した。
0.46〜 0.575mMの KClで溶出する DNAポリメラーゼのピ
ーク分画（0.58ml）をSDS-PAGEにより分析した。汚染タ
ンパク質の分離はピークを通して観察された：約 45kDa
の汚染バンドは0.53Ｍで溶出する；約 85kDaの汚染バン
ドは0.54Ｍの KClにおける溶出ピークを有する。したが
って、このカラムを反復した（ポリメラーゼの溶出のプ
ロフィルを考慮して、多少高いイオン強度で負荷す
る）。第１ホスホセルロースのカラムから 0.475〜0.56
Ｍの KClで溶出するピーク分画を第１アフィゲルカラム
からのプールと一緒にした。一緒にした分画（Pll II負
荷）は今や、精製されたポリメラーゼのすべて（約 7.5
×104)を含有した。
【０１９１】分画Pll II負荷をホスホセルロース緩衝液
で希釈して、イオン強度を 0.5ＭのKClに調節した。Pll
II負荷を９mlのベッド体積のホスホセルロースカラム
（この場合、25mMのトリス−Cl，pH7.5 ， 200mMの KC
l， 0.1mMのEDTA， 0.2％のツイーン20および 0.5mMのE
DTAの正しいpHおよびイオン強度に平衡化された）上に
負荷した。このカラムを27mlの同一緩衝液で洗浄し、そ
して 140mlの 0.2〜 0.8Ｍの KClの直線勾配で溶出する
ことを意図した。しかしながら、 0.8Ｍの KClの上限緩
衝液の代わりに、緩衝液は52mMの KClの濃度を有し、こ
れは塩の減少勾配を生じた。次いでこのカラムを32mlの
0.2Ｍの KCl−ホスホセルロース緩衝液により再び平衡
化し、そして140 mlの0.2 〜 0.8Ｍの KClの直線勾配を
再び適用した。
【０１９２】流過液、洗浄液、および勾配分画の日常的
アッセイにより、このより高いpH(pH7.5) において、 D
NAポリメラーゼはホスホセルロース樹脂に 0.2Ｍの KCl
において結合しないことが示された。流過液、洗浄液、
および塩減少勾配の分画からの DNAポリメラーゼ活性を
含有する分画を一緒にした。生ずるプールをアミコンYM
30膜上で濃縮した。しかしながら、濃縮装置の故障は D
NAポリメラーゼ活性のそれ以上の損失に導いた。回収さ
れた活性を50mMの KClのホスホセルロース緩衝液の中に
透析し、そしてPll III負荷と表示した。
【０１９３】この分画を50mMの KClを含むホスホセルロ
ース緩衝液により平衡化した５mlのベッド体積のホスホ
セルロースのカラム上に負荷した。適用した活性のすべ
てはこのカラムにより保持された。このカラムを15mlの
同一緩衝液で洗浄し、そして50mlの同一緩衝液中の50〜
500mMの KClの直線勾配で溶出した。0.16〜0.33ＭのKC
lで溶出する分画（0.87ml）をSDS-PAGEおよびイン−シ
チュ活性ゲルにより分析した。
【０１９４】銀染色パターンに基づいて、２つのプール
を作った。 0.215〜0.31Ｍの KClで溶出するピーク分画
を、先行する分画および後の分画から別々に保持し、こ
れらを一緒にして副分画プールにした。両者のプールを
セントリコン(centricon) 30膜上で濃縮し、そして 2.5
×貯蔵緩衝液（50mMのトリス−Cl，pH7.5 ， 250mMのKC
l， 2.5mMのEDTA， 2.5mMの DTTおよび 0.2％のツイー
ン20」Pierce, Surfact-Amps])中で透析濾過し、引き続
いて 1.5体積の80％のグリセロールと混合した。
【０１９５】約 3.1×104 単位がピーク分画において回
収され；副プールは追加の１×103単位の活性をもたら
す。精製された DNAポリメラーゼは、イン−シチュ活性
ゲルの中の不変化の移動パターンにより証明されるよう
に、分解しなかった。精製された DNAポリメラーゼのゲ
ル電気泳動により決定された分子量はほぼ 97kDaであ
る。 Tma DNAポリメラーゼは、 Taq DNAポリメラーゼの
アミノ酸残基569-587 (DGTP1）および718-732 (DGTP3）
に相当する、エピトープ特異的抗体により認識される。
【０１９６】実施例２ Tma DNAポリメラーゼＩ活性をコードする DNAの単離 合成オリゴデオキシリボヌクレオチド DG164〜 DG167
は、熱安定性 DNAポリメラーゼの鋳型結合ドメイン（最
も３′−側の14ヌクレオチド）におけるモチーフの１つ
に対する「前方」プライマーと表示される、４つの異な
る16倍の縮重の（各々）22マーのプールである。このモ
チーフはアミノ酸配列 Gly-Tyr-Val-Glu-Thrであり、そ
してサームス・アクアチクス（T . aquaticus )(Taq) D
NAポリメラーゼのアミノ酸 718-722に、およびサームス
・サーモフィルス（T . thermophilus)(Tth) DNAポリメ
ラーゼのアミノ酸 720-724に同一に対応する。このモチ
ーフはすべてのサームス (Thermus ) 種における DNAポ
リメラーゼ遺伝子の中に見いだされる。一緒にしたプラ
イマーのプールは64倍の縮重性であり、そしてプライマ
ーはそれらの５′末端において BglII認識部位をコード
する。前方プライマー DG164〜 DG167を下に示す：
【０１９７】
【表２】
【０１９８】これらの前のプライマーにおいて：Ａはア
デニンであり；Ｃはシチジンであり；Ｇはグアニジンで
あり；Ｔはチミンであり；ＹはＣ＋Ｔ（pYrimidine) で
あり；ＳはＧ＋Ｃ（Strong相互作用；３Ｈ−結合）であ
り；ＷはＡ＋Ｔ（Week相互作用；２Ｈ−結合）であり；
そしてＮはＡ＋Ｃ＋Ｇ＋Ｔ(aNy) である。合成オリゴデ
オキシリボヌクレオチド DG160〜 DG163は、熱安定性 D
NAポリメラーゼの鋳型結合ドメイン（最も３′−側の14
ヌクレオチド）におけるモチーフの１つに対する「逆」
プライマーと表示される、４つの異なる８倍の縮重の
（各々）20マーのプールである。
【０１９９】これらのプライマーは相補的（＋）鎖 DNA
配列に帰属され、そしてモチーフ Gln-Val-His-Asp-Glu
をコードし、そして Taq DNAポリメラーゼのアミノ酸 7
82-786および Tth DNAポリメラーゼのアミノ酸 784-788
に同一に対応する。このモチーフはすべてのサームス
(Thermus ) 種における DNAポリメラーゼ遺伝子中に見
いだされる。一緒にしたプライマーのプールは32倍の縮
重性であり、そしてプライマーはそれらの５′末端にお
いて EcoRI認識部位をコードする。逆プライマー DG160
〜 DG163を下に示す；
【０２００】
【表３】 これらの逆プライマーにおいて、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ，Ｓお
よびＷは上に定義した通りであり、そしてＲはＧ＋Ａ
（puRine）である。
【０２０１】Tma DNAポリメラーゼ遺伝子の約 230bpの
断片を増幅するために、 MgCl2を使用しないで80μｌの
中に次の成分を含有する PCR増幅管を調製した：（１）
５ngの変性した Tmaゲノム DNA；（２）50ピコモル（合
計）の一緒にした前方プライマーの組 DG164-DG167；
（３）50ピコモル（合計）の一緒にした逆プライマーの
組 DG160-DG163；（４）２単位の Taq DNAポリメラー
ゼ；（５）50μＭ（最終）の各dNTP；（６）0.05％のラ
ウレス(Laureth) −12；および（７）標準的 PCR緩衝
液、塩化マグネシウムを含まない。
【０２０２】試料を−70℃でフラッシュ凍結し、そして
−20℃において貯蔵した。凍結した試料を20μｌの10mM
のMgCl2(最終濃度２mM）で層状にし、直ちに50mlの鉱油
をオーバーレイし、そしてパーキン・エルマー・セツス
・サイクラー(Perkin ElmerCetus Cycler) で次のファ
イルに従いサイクリングした：（１）98℃への段階−50
秒の保持；（２）50℃への段階−10秒の保持；（３）４
分かけて75℃への傾斜；および（４）98℃への上昇。こ
のファイルを合計30サイクル反復した。増幅生成物の１
／５（20μ）を３％のヌシーブ(Nusieve) ／１％のシー
ケム（Seakem）アガロース複合ゲル上で精製し、そして
ほぼ 230bpの断片を溶出し、濃縮し、そして BglIIおよ
び EcoRIで消化した。
【０２０３】合成オリゴデオキシリボヌクレオチド DG1
54および DG155は、熱安定性 DNAポリメラーゼのプライ
マー：鋳型結合ドメイン（最も３′−側の11ヌクレオチ
ド）におけるモチーフの１つに対する「前方」プライマ
ーと表示される２つの異なる32倍の縮重の（各々）19マ
ーのプールである。このモチーフはテトラペプチドの酸
配列Thr-Ala- Thr-Glyであり、そして Taq DNAポリメラ
ーゼのアミノ酸 569-572および Tth DNAポリメラーゼの
アミノ酸 571-574に同一に対応する。このモチーフはす
べてのサームス (Thermus ）種における DNAポリメラー
ゼ遺伝子の中に見いだされる。一緒にしたプライマーの
プールは64倍の縮重性であり、そしてプライマーはそれ
らの５′末端において BglII認識部位をコードする。前
のプライマー DG154および DG155を下に示す：
【０２０４】
【表４】 これらの前方プライマーにおいて、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ，
Ｓ，Ｗおよびｎは上に定義した通りである。
【０２０５】Tma DNAポリメラーゼ遺伝子のほぼ約 667b
pの断片を増幅するために、 MgCl2を使用しないで80μ
ｌの中に次の成分を含有する PCR増幅管を調製した：
（１）５ngの変性した Tmaゲノム DNA；（２）50ピコモ
ル（合計）の一緒にした前方プライマーの組 DG154-DG1
55；（３）50ピコモル（合計）の一緒にした逆プライマ
ーの組DG160-DG163 ；（４）２単位の Taq DNAポリメラ
ーゼ；（５）50μＭ（最終）の各dNTP；（６）0.05％の
ラウレス(Laureth) −12；および（７）標準の PCR緩衝
液、塩化マグネシウムを含まない。
【０２０６】試料を−70℃でフラッシュ凍結し、そして
−20℃において貯蔵した。凍結した試料を20μｌの10mM
のMgCl2(最終濃度２mM）で層状にし、直ちに50mlの鉱油
をオーバーレイし、そしてパーキン・エルマー・セツス
・サイクラー(Perkin ElmerCetus Cycler) で次のファ
イルに従いサイクリングした：（１）98℃への段階−50
秒の保持；（２）50℃への段階−10秒の保持；（３）４
分かけて75℃への傾斜；および（４）98℃への上昇。こ
のファイルを合計30サイクル反復した。
【０２０７】増幅生成物の１／５（20μ）を 1.5％のア
ガロースゲル上で精製し、そしてほぼ 670bpの断片を溶
出し、濃縮し、そして BglIIおよび EcoRIで上のように
して消化した。これらの増幅反応は、 667bpの断片、お
よび 667bpの断片の下位断片である 230bpの断片を生じ
た。これらの断片は、以下の実施例に記載するように、
Tma DNAポリメラーゼＩ遺伝子のための完全なコード配
列を得るとき有用であることが証明された。
【０２０８】実施例３ サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)(Tma) DNA
ポリメラーゼＩ遺伝子のクローニング この実施例は、サーモトガ・マリチマ (Thermotoga ma
ritima) の Tma DNAポリメラーゼＩ遺伝子（Tma PolI）
をクローニングする戦略および方法を記載する。
【０２０９】プライマー DG164-167および DG160-163(2
30bp）および DG154, 155および DG160-163(667bp）に
より発生した PCR生成物の DNA配列は、XmaI制限部位の
認識配列５′CCCGGGを含有する。オリゴヌクレオチド
を、XmaI部位の上流および下流の配列にハイブリダイゼ
ーションするように設計した。 DG224は21マーであり、
XmaI部位に対して59−79bpだけ３′−末梢の PCR生成物
に対して相同性である。DG225は22マーであり、XmaI部
位からXmaI部位より21bp上流（５′）までの PCR生成物
に対して相同性である。 DG224および DG225の配列を下
に示す（ＫはＧまたはＴである）。
【０２１０】
【表５】 DG224および DG225を、ほぼ8 ビオチン−dUMP残基をオ
リゴヌクレオチドの３′末端に付加するように設計した
反応において、ビオチン−dUTPおよびトランスフェラー
ゼでテイリングすることによって標識した。これらの標
識したオリゴヌクレオチドをゲノムの Tma DNAの制限消
化のサザンブロット分析においてプローブとして使用し
た。サザン分析の結果、および実施例２に記載するよう
に生産した PCR生成物の DNA配列に基づいて、予備的制
限地図を作成した。
【０２１１】予備的地図は、全体の Tma DNAポリメラー
ゼ遺伝子が２つのXmaI制限断片を含有することを示し
た。５′末端を包含する、遺伝子の大部分はほぼ 2.6kb
のXmaI断片上に位置する。この遺伝子の残部（および
３′末端）はほぼ 4.2kbのXmaI断片上に位置する。全体
の Tma DNAポリメラーゼ遺伝子を含有する２つのXmaI断
片を、後述するように、プラスミド pBS13＋（また、pB
SM13＋呼ぶ）の中にクローニングした。
【０２１２】約40μｇの Tmaゲノム DNAをXmaIで完全に
消化した。XmaI消化物を電気溶出によりサイズ分画し
た。γ−32Ｐ− ATP−キナーゼ処理した DG224および D
G225プローブを使用する、各分画の小部分のスロットブ
ロット分析は、 4.2kbの３′−断片(DG224とハイブリダ
イゼーションする）および 2.6kbの５′−断片(DG225と
ハイブリダイゼーションする）を含有する分画を同定し
た。分画をエタノール沈澱により濃縮し、次いでXmaI消
化した pBS13＋（Stratagene）と連結した。
【０２１３】アンピシリン耐性の形質転換体をニトロセ
ルロースのフィルター上で選抜し、そしてフィルターを
適当ならばγ−32Ｐ− ATP−キナーゼ処理した DG224お
よびDG225のプローブでプロービングした。プラスミド
DNAをプローブとハイブリダイゼーションしたコロニー
から単離した。制限分析を実施して、断片が期待したも
のであることを確証し、そして pBS13＋ベクターに関す
る断片の向きを決定した。
【０２１４】クローニングした断片の DNA配列の分析
を、「ユニバーサル」および「逆」配列決定プライマー
（これらはベクター中で、制限部位のポリリンカー領域
の外側でプライミングする）を使用して実施した。さら
に、５′−クローンについて、DG154-155／ DG160-163
の 667bpのクローンの DNA配列の決定に使用したプライ
マーを用いた。予備的 DNA配列の分析により、 Tma DNA
ポリメラーゼ遺伝子を含有する所望の DNA断片がクロー
ニングされたことが確証された。
【０２１５】予備的 DNA配列から、断片のより内部の領
域の DNA配列を得るように、それ以上の配列決定プライ
マーを設計した。さらに、 DNA配列の分析を促進するた
めに、２つのXmaI断片のいくつかの欠失を作った。 2.6
kbの５′−断片の両者の向きについて、 EcoRI, SacI、
およびXbaIの消化物の各々を欠失し、そして分子内の結
合に好適な条件下に結合し、こうしてベクター EcoRI，
SacI、およびXbaI部位とTma XmaI断片の対応する部位と
の間の DNAを欠失した。このような内部の欠失は、「ユ
ニバーサル」または「逆の」配列決定プライマーを使用
する容易な DNA配列の分析を可能とする。
【０２１６】同様に、ベクターの BamHI部位を、そのク
ローン中のTma PolIの内部のXmaI部位からほぼ 650bpの
BglII部位と融合して、 4.2kbの３′−断片の欠失を作
った(BamHIおよび BglIIは互いに容易に結合する同一の
GATC粘着末端を有する）。この欠失はTma PolI遺伝子の
３′末端の DNA配列の分析を可能とする。
【０２１７】制限部位分析において、 2.6kgの５′−断
片および 4.2kbの３′−断片の両者はNcoI, NdeIおよび
AseI制限部位を欠如することが明らかにされる。Tma Po
lI遺伝子の ATG開始およびコード配列を知ると、 DNA配
列を ATG開始部位において変更して、オリゴヌクレオチ
ドの部位特異的突然変異によりNcoI，NdeIおよびAseI制
限部位を含めるようなオリゴヌクレオチドを設計するこ
とができる。さらに、pBSM＋ベクターのプロモーターと
Tma PolI遺伝子の開始部位との間の配列の欠失が、 ATG
開始部位におけるNdeIまたはAseI認識部位の包含と同時
になされるように、突然変異のオリゴヌクレオチドを設
計することができる。
【０２１８】ベクターの中の lacプロモーターとTma Po
lI遺伝子の開始部位との間の配列の欠失はまた、欠失さ
れた領域におけるXmaI制限部位を排除し、こうしてこの
分野において普通の技術を使用する発現プラスミド中へ
の全体コード配列のアセンブリングを便利にする（例え
ば、同時継続出願第 455,967号、1989年12月22日提出、
その開示をここに引用によって加える、の中の pDG174-
pDG181についての合成のプロトコルを参照のこと）。
【０２１９】実施例４ Tma DNAポリメラーゼを使用する PCR 約1.25単位の実施例１において精製した Tma DNAポリメ
ラーゼを使用して、 Tthゲノム DNAからのrRNA配列を増
幅する。反応体積は50μｌであり、そして反応混合物は
50ピコモルのプライマーDG73，105 〜106 の Tthのコピ
ー（約２×105コピーのゲノム／ngのDNA)，50ピコモル
のプライマーDG74， 200μＭの各dNTP，２mMの MgCl2，
10mMのトリス− HCl，pH8.3 ，50mMの KCl、および 100
μｇ／mlのゼラチン（必要に応じて、ゼラチンを省略す
ることができる）を含有する。
【０２２０】反応はパーキン−エルマー・セツス・イン
スツルメンツ(Perkin-Elmer CetusInstruments)の DNA
サーマルサイクラー (Thermal Cycler) で実施する。20
〜30サイクルの96℃で15秒；50℃で30秒、および75℃で
30秒を実施する。20サイクルにおいて、増幅生成物(160
bpの大きさ）が臭化エチジウム染色したゲル上にかすか
に見ることができ、そして30サイクルにおいて、生成物
は臭化エチジウム染色したゲル上で容易に見ることがで
きる（紫外線下）。
【０２２１】より少ない単位の Tma DNAポリメラーゼ使
用する場合（すなわち、0.31単位／50μｌの反応）、 P
CRはより少ない非特異的生成物を生ずるであろう。さら
に、非イオン性洗剤、例えば、ラウレス−12を反応混合
物に約 0.5％〜１％の最終濃度に添加すると、 PCR生成
物の収量を改良することができる。プライマーDG73およ
びDG74を下に示す：
【表６】
【０２２２】実施例５ Tma DNAポリメラーゼの組換えベクター Ａ．Tma PolI遺伝子の５′および３′末端の変異誘発 ベクター pBS：Tma7-1 (ATCC No. 68471、後で改名pTma
01）中の Tma遺伝子の５′末端を、オリゴヌクレオチド
DG240および DG244でオリゴヌクレオチドの部位特異的
変異により変異誘発した。プラスミド pBS：Tma7-1は、
ベクター pBS＋の中にクローニングされた 2.6kbの５′
XmaI断片を含んで成る。
【０２２３】両者の変異誘発から生ずる変異体は、 pBS
＋ベクター中のβ−ガラクトシダーゼの ATGとTma PolI
の ATGとの間に欠失を有するので、 Tmaコード配列はベ
クター lacプロモーター、オペレーターおよびリボソー
ム結合部位(RBS）を利用する発現のために配置された。
両者の組の変異体はまた、Tma PolIのための第２および
第６のコドン中に変更を有して、コードされたタンパク
質のアミノ酸配列を変化させないで、大腸菌（E . col
i）のコドンの使用といっそう適合性となった。
【０２２４】さらに、 DG240はNdeI制限部位をコード配
列の ATG開始部に配置し（５′CATATG ）、そして DG24
4はNcoI制限部位をコード配列の ATG開始部に配置させ
た（５′CCATG G)。 DG240変異の候補コロニーを [γ32
Ｐ] 標識したオリゴヌクレオチド DG241でスクリーニン
グし、そして DG244変異の候補コロニーを [γ32Ｐ]標
識したオリゴヌクレオチド DG245でスクリーニングし
た。プラスミド DNAを適当なプローブとハイブリダイゼ
ーションしたコロニーから単離し、そして変異は制限分
析および DNA配列の分析により確証された。 DG240の変
異体をpTma５′ Nde＃９と命名し、そして後にpTma07と
改名された）。
【０２２５】Tma PolI遺伝子の３′末端を、pBSTma３′
11−1Bam／Bgl (ATCC No. 68472 、後の改名pTma04）中
で変異誘発オリゴヌクレオチド DG238で変異誘発した。
プラスミドpBSTma３′11−1Bam／Bgl は、実施例３に記
載するように、 4.2kbの３′XmaI断片を pBS＋中にクロ
ーニングし、生ずるプラスミドを BamHIおよび BglIIで
消化し、そして消化からの大きい断片を結合することに
よって環化して構成された。
【０２２６】DG238は EcoRVおよび BamHI部位を TGA停
止コドンの直ぐ下流に挿入する。変異コロニーの候補を
[γ32Ｐ] 標識したオリゴヌクレオチド DG239で同定し
た。陽性のコロニーから単離したプラスミド DNAを適当
な制限消化のパターンについてスクリーニングし、そし
て DNA配列を確認した。得られた１つの正しいプラスミ
ドをpTma３′ mut＃１として表示し、そして後にpTma05
と改名した。
【０２２７】Ｂ． lacプロモーターのベクター中の全長
遺伝子のアセンブリング 大腸菌（E . coli）中のTma PolIの低いレベルの発現お
よびTma PolIによる大腸菌（E . coli）ポリメラーゼ変
異体の可能な相補性（ここで高いレベルの発現は細胞を
殺すことがあるが、低いレベルは救済または補完するこ
とができる）を研究する目的で、Tma PolI遺伝子を pBS
13＋クローニングベクターの中でアセンブリングした。
pTma３′ mut＃１からの約 300bpのXmaI-EcoRV断片を、
アガロースゲルの電気泳動および臭化エチジウムの染色
後、約 300bpの断片を含有するアガロースゲルのスライ
スを切除しそしてコスター(Costar)スピネックスのフィ
ルターユニット中で凍結することによって、単離および
精製した。
【０２２８】融解すると、このユニットをマイクロフー
ジ(microfuge）で回転し、そして DNA断片を含有する液
体を集めた。エタノール沈澱後、断片を２つの５′ベク
ター、 pTma5′ Nde#3および pTma5′ Nco#9の各々と連
結し、これらの各々をAsp718で消化し、クレノーおよび
すべてのdNTPで修復し（反応条件は次の通りである：56
mMのトリス−Cl，pH8.0 ，56mMのNaCl，６mMの MgCl2，
６mMの DTT，５μＭのdNTPおよび11単位のクレノー、37
℃，15分；次いで75℃において10分間不活性化する）、
次いでXmaIでさらに消化した。
【０２２９】連結は２工程で実施した。XmaI粘着末端を
連結するために条件は次の通りであった：20μｇ／mlの
合計の DNA，20mMのトリス−Cl，pH7.4 ，50mMのNaCl，
10mMの MgCl2，40μｍの ATP、および0.2Weiss単位の T
4DNAリガーゼ／20μｌの反応、０℃、一夜。Asp718消化
しそしてクレノー修復した平滑末端を EcoRV消化した平
滑末端と連結するために、第１の連結物を、同一の結合
緩衝液の中で４〜５倍に希釈しそして15℃においてイン
キュベーションした。但し、１mMの ATPおよび10Wciss
単位の T4DNAリガーゼを20μｌの反応について使用し
た。連結物を DG101宿主細胞に形質転換した。候補を適
当な制限部位についてスクリーニングし、そしてクロー
ニング部位付近の DNA配列を確認した。所望のプラスミ
ドをpTma08(ATGにおいてNdeI部位）およびpTma09(ATG部
位においてNcoI部位）と表示した。
【０２３０】Ｃ．ＰL 発現ベクター中の全長遺伝子のア
センブリング λＰL プロモーターのコントロール下に全長のTma PolI
をアセンブリングしかつ発現するために使用したＰL プ
ロモーターの発現ベクターを下表に記載する。
【０２３１】
【表７】
【０２３２】表の中の５つのベクターは、アンピシリン
耐性の場合、プラスミドpDG160の誘導体であるか、ある
いはテトラサイクリン耐性の場合、pDG161である。プラ
スミドpDG160およびpDG161並びに表に示す pDGベクター
に類似するベクターを構成するスキームは、米国特許出
願第 455,967号、1989年12月22日提出（その開示をここ
に引用によって加える）に記載されている。ベクターは
アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性を与え、そし
てすべてはサーモトガ・マリチマ (Thermotoga maritim
a) からのδ−トキシン陽性のレトロレギュレーターお
よび同一の点突然変異を RNAII遺伝子の中に含有し、こ
れらはプラスミドをコピー数について温度感受性とす
る。表に記載されているプライマーおよびオリゴヌクレ
オチドを下に示す。
【０２３３】
【表８】
【０２３４】３つの断片の結合を使用して、ベクター中
でTma PolI遺伝子をアセンブリングした。ベクターをSm
aIおよびNdeI (pDG174, pDG178）またはNcoI (pDG182,
pDG184, pDG185）で消化する。Tma PolI遺伝子の５′末
端はNdeIおよびXmaIで消化した pTma5′Nde#3 からのも
のであるか、あるいはNcoIおよびXmaIで消化した pTma
5′ Nco#9からのものである。遺伝子の３′末端はXmaI
および EcoRVで消化したpTma3′ mut#1からのものであ
りそして約 300bpの断片を前述したように精製した。
【０２３５】表に示すプラスミドpDG182および上のスキ
ームを使用して、発現ベクターpTma13を構成した。プラ
スミドpDG184および上のスキームを使用して、ベクター
pTma12-1および pTma2-3を構成した。プラスミドpTma12
-3はpTma12-1と異なり、pTma12-3は同一の連結／形質転
換のプロトコルの間に生成した pctma12-1の２量体であ
る。プラスミドpDG185および上のスキームを使用して、
発現ベクターpTMa11を構成した。
【０２３６】ベクターはポリメラーゼ全コード配列を含
有することができるが、この酵素の短縮された形態を独
占的にあるいは全長のプラスミドとの組み合わせで発現
することができる。 Tma DNAポリメラーゼのこれらの短
縮された形態は、５′− ATG以外のコード配列中のメチ
オニン(ATG）コドンの１つにおいて起こる翻訳開始から
生ずる。モノマーのpTma12-1のプラスミドは、加熱誘導
すると、天然 Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸 1-139を
欠如する生物学的に活性な熱安定性 DNAポリメラーゼを
主として生成する。約 86kDaのタンパク質は、 Tmaコー
ド配列の位置 140におけるメチオニンのコドンにおける
翻訳開始の結果であり、そしてMET140と呼ばれる。
【０２３７】適当な条件（38℃ではなく、34℃または36
℃における加熱誘導）下の震盪フラスコの研究におい
て、マルチマーのpTma12-3の発現ベクターは、有意なレ
ベルの「全長の」 Tma DNAポリメラーゼ（SDS-PAGEによ
りほぼ 97kDa）およびより少量のMet140における翻訳開
始から生ずる短縮された（ほぼ 86kDa）の形態を生じ
た。全長の Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸配列決定
は、アミノ末端のメチオニンが除去され、そして第２位
置の AlaがＮ−末端に存在することを示した。
【０２３８】組換え Tma DNAポリメラーゼを、プラスミ
ドpTma12-3を含有する大腸菌（E .coli）菌株 DG116か
ら精製した。10リットルの発酵用種母フラスコは、トリ
プトン（20ｇ／ｌ）、酵母エキス（10ｇ／ｌ）、NaCl
（10ｇ／ｌ）、アンピシリン(100mg／ｌ）およびチアミ
ン（10mg／ｌ）を含有した。種母フラスコに寒天プレー
ト（凍結グリセロール培養物を使用することもできる）
からのコロニーを接種した。種母フラスコを30℃におい
て 0.5〜 2.0光学密度（Ａ680)に増殖させた。
【０２３９】発酵槽の中に接種した種母培養物の体積を
計算して、細菌の濃度が 0.5mgの乾燥重量／リットルで
あるようにする。12.5リットルの増殖培地は、60mMのKH
2PO4，16mMのNaNH4HPO4 ，10mMのクエン酸および１mMの
MgSO4を含有した。次の無菌の成分を添加した：２ｇ／
ｌのグルコース、10mg／ｌのチアミン、 2.5ｇ／ｌのカ
ザミノ酸、 100mg／ｌのアンピシリン、および 100mg／
ｌのメチシリン。必要に応じて、消泡剤としてプロピレ
ングリコールの添加により、発泡を抑制した。空気の流
れを２リットル／分に維持した。発酵槽に前述したよう
に接種し、そして培養物を30℃において 4.5時間 0.7の
細胞密度（Ａ680)に成長させた。
【０２４０】増殖温度を35℃にシフトして、組換え Tma
DNAポリメラーゼの合成を誘導した。温度のシフトはpT
ma12-3プラスミドのコピーの数を増加し、そして同時に
宿主の中の欠陥のあるプロファージのリソゲンによりコ
ードされる温度感受性cIリプレッサーの不活性化によ
り、修飾された Tma DNAポリメラーゼ遺伝子のラムダＰ
L プロモーターがコントロールする転写を抑制解除す
る。細胞を21時間の間４の光学密度（Ａ680)に増殖さ
せ、そして遠心により収穫した。生ずる細胞のペースト
を−70℃で貯蔵した。
【０２４１】組換え Tma DNAポリメラーゼを下の実施例
６におけるように精製した。簡単に述べると、細胞を１
体積のTE緩衝液（50mMのトリス−Cl， pH7.5および10mM
のEDTAおよび１mMの DTT）の中で融解し、そしてプロテ
アーゼ阻害剤を添加する（PMSFを 2.4mMに、ロイペプチ
ンを１μｇ／mlに、そしてTLCKを 0.2mMに）。細胞をア
ミコ(Amico）フレンチ圧力セル中で 20,000psiにおいて
溶解し、そして超音波処理して粘度を低下させた。
【０２４２】超音波処理物をTE緩衝液およびプロテアー
ゼ阻害剤を 5.5×湿潤重量の細胞塊（分画Ｉ）に希釈
し、 0.3Ｍの硫酸アンモニウムに調節し、そして急速に
75℃にし、そして75℃に15分間維持した。熱処理した上
澄み液を０℃に急速に冷却し、そして大腸菌（E . col
i）細胞の膜および変性されたタンパク質を20,000×ｇ
の30分間の遠心後に除去した。 Tma DNAポリメラーゼ
（分画II）を含有する上澄み液を取って置く。
【０２４３】核酸の＞95％を沈澱させるために必要なポ
リミン(Polymin）Ｐのレベルを試験沈殿により決定する
（通常 0.6〜１％ｗ／ｖの範囲）。所望量のポリミン(P
olymin）Ｐを０℃において30分間急速に撹拌しながらゆ
っくり添加し、そしてこの懸濁液を20,000×ｇで30分間
遠心して、沈澱した核酸を除去する。 Tma DNAポリメラ
ーゼを含有する上澄み液（分画III)を取って置く。
【０２４４】分画 IIIを50mMのトリス−Cl，pH7.5 ，
0.3Ｍの硫酸アンモニウム、10mMのEDTAおよび１mMの DT
Tの中で平衡化したフェニルセファローズのカラムに適
用する。カラムを２〜４体積の同一緩衝液で洗浄し（基
線に対してＡ280)、次いで１〜２カラム体積の 100mMの
KCl を含有するTE緩衝液で洗浄して大部分の汚染する
E. coliタンパク質を除去する。次いで Tma DNAポリメ
ラーゼをカラムから50mMのトリス−Cl，pH7.5 ，２Ｍの
尿素、20％（ｗ／ｖ）のエチレングリコール、10mMのED
TAおよび１mMの DTTを含有する緩衝液で溶出し、そして
DNAポリメラーゼ活性を含有する遊離をプールする（分
画IV）。
【０２４５】組換え Tma DNAポリメラーゼの最後の精製
を、ヘパリンセファローズのクロマトグラフィー（天然
またはMET284組換え DNAポリメラーゼについて）、アニ
オン交換クロマトグラフィー、またはアフィゲルブルー
のクロマトグラフィーを使用して達成する。組換えTma
DNAポリメラーゼを 2.5×貯蔵緩衝液の中に透析濾過
し、 1.5体積の無菌の80％（ｗ／ｖ）のグリセロールと
一緒にし、そして−20℃において貯蔵する。
【０２４６】実施例６ 切頭 TmaポリメラーゼMET284の発現 上に記載したように、完全な Tma遺伝子のコード配列を
含有する発現プラスミドは、開始コドンにおける翻訳の
開始から生ずる全長のポリメラーゼ、あるいは位置 140
におけるメチオニンのコドンに存在する翻訳開始部から
生ずる短縮されたポリメラーゼを発現した。翻訳開始部
位として作用することができる第３メチオニンコドン
は、 Tma遺伝子のコード配列の位置 284に存在する。天
然 Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸 1-283を欠如する D
NAポリメラーゼを発現するプラスミドを、 Tmaのコード
配列の対応する領域を欠失することによって構成した。
【０２４７】プラスミドpTma12-1を BspH1（ヌクレオチ
ド位置 848）およびHindIII （ヌクレオチド位置2629）
で消化した。1781bpの断片をアガロースゲル精製により
単離した。 DNAからアガロースを分離するために、所望
の断片を含有するゲルのスライスをコスター（Costar）
スピンネックスフィルターユニットの中で−20℃におい
て凍結した。室温において融解後、ユニットをマイクロ
フージ(microfuge）の中で回転した。 DNAを含有するフ
ィルターをスピード・バク(Spood Vac）濃縮装置で濃縮
し、そして DNAをエタノールで沈澱させた。
【０２４８】単離した断片をNcoIおよび HindIIIで消化
したpTma12-1の中にクローニングした。NcoIの消化物は
BspH1による消化物と同一の粘着末端の配列を残すの
で、1781塩基対の断片はNcoIおよび HindIIIで消化する
ことによってプラスミドpTma12-1から切除した全長の断
片と同一の粘着末端を有する。単離した断片と消化した
プラスミドとの結合は断片のスイットを生じ、そしてpT
ma14と表示するプラスミドをつくるために使用した。
【０２４９】プラスミドpTma15は同一の単離した断片を
pTma13の中にクローニングすることによって構成した。
pTma14と同様に、pTma15は天然 Tma DNAポリメラーゼの
アミノ酸 1-283を欠如するポリメラーゼの発現を推進す
る；翻訳は天然コード配列の位置 284のメチオニンのコ
ドンにおいて開始する。
【０２５０】pTma14およびpTma15の両者の発現プラスミ
ドは、約 70kDaの分子量の生物学的に活性な熱安定性 D
NAポリメラーゼを高いレベルで発現した；プラスミドpT
ma15は T4DNAリガーゼより高いレベルでポリメラーゼを
発現した。大腸菌（E . coli）PolIのクレノー断片との
類似性、例えば、３′−５′エキソヌクレアーゼ活性の
ために必須の３つのすべてのドメインにおけるアミノ酸
配列のモチーフの保存性、アミノ末端からエキソヌクレ
アーゼ活性のために必須の第１ドメインまでの距離、お
よび発現されたタンパク質の長さ、に基づいて、 Tmaポ
リメラーゼの短縮された形態（MET284）は３′−５′エ
キソヌクレアーゼおよびプルーフ−リーディング(proof
-reading）活性を有するが、５′−３′エキソヌクレア
ーゼ活性を欠如する。
【０２５１】しかしながら３′−５′エキソヌクレアー
ゼ活性についての初期の SDS活性のゲルアッセイおよび
溶液アッセイは、プラスミドpTma15を収容する大腸菌
（E .coli）宿主細胞により発現されたポリメラーゼの
プルーフ−リーディング活性の有意の弱化を示唆した。
【０２５２】MET284Tma DNAポリメラーゼを、プラスミ
ドpTma15を含有する大腸菌（E . coli）菌株 DG116から
精製した。10リットルの発酵の種母フラスコは、トリプ
トン（20ｇ／ｌ）、酵母エキス（10ｇ／ｌ）、グルコー
ス（10ｇ／ｌ）、アンピシリン（50mg／ｌ）およびチア
ミン（10mg／ｌ）を含有した。種母フラスコに寒天プレ
ート（凍結グリセロール培養物を使用することができ
る）からのコロニーを接種した。種母フラスコを30℃に
おいて 0.5〜 2.0光学密度（Ａ680)に増殖させた。発酵
槽中に接種した種母培養物の体積を計算して、細菌濃度
が 0.5mg乾燥重量／リットルであるようにする。10リッ
トルの増殖培地は、25mMのKH2PO4，10mMのNaNH4HPO4，
４mMのクエン酸ナトリウム、 0.3mMの FeCl3，0.04mMの
ZnCl2，0.03mMの CoCl2，0.03mMの CuCl2および１mMの
H3BO3を含有した。
【０２５３】次の無菌の成分を添加した：４mMの MgS
O4，20ｇ／ｌのグルコース、20mg／ｌのチアミン、およ
び50mg／ｌのアンピシリン。pHをNaOHで 6.8に調節し、
そして発酵の間 NH4OHの添加によりコントロールした。
グルコースを NH4OHの添加と組み合わせて連続的に添加
した。必要に応じて、消泡剤としてプロピレングリコー
ルの添加により、発泡を抑制した。溶解した酸素の濃度
を40％に維持した。
【０２５４】発酵槽に前述したように接種し、そして培
養物を30℃において 0.5〜 1.0×10 10の細胞密度（15の
光学密度 [Ａ680]）に増殖させた。増殖温度を38℃にシ
フトして、MET284の Tma DNAポリメラーゼの合成を誘導
した。温度のシフトはpTma15のプラスミドのコピーの数
を増加し、そして同時に宿主中の欠陥のあるプロファー
ジのリソゲンによりコードされる温度感受性cIリプレッ
サーの不活性化により、修飾された Tma DNAポリメラー
ゼ遺伝子のラムダＰL プロモーターがコントロールする
転写を抑制解除する。
【０２５５】細胞を６時間の間37（Ａ680)に増殖させ、
そして遠心により収穫した。細胞塊（約95ｇ／ｌ）を50
mMのトリス−Cl， pH7.6，20mMのEDTAおよび20％（ｗ／
ｖ）のグリセロールを含有する等しい体積の緩衝液の中
に再懸濁させた。この懸濁液を液体窒素の中にゆっくり
滴下して懸濁液を「ビース」または小さいペレットとし
て凍結した。凍結した細胞を−70℃で貯蔵した。
【０２５６】200ｇの凍結したビーズ(100ｇの湿潤重量
の細胞を含有する）に、 100mlのｌ×TE（50mMのトリス
−Cl， pH7.5，10mMのEDTA）を添加し、そして DTTを
0.3mMに、PMSFを 2.4mMに、ロイペプチンを１μｇ／ml
に、そしてTLCK（プロテアーゼ阻害剤）を 0.2mMに添加
した。試料を氷上で融解し、そして低速のブレンダーの
中で均一に再懸濁した。細胞懸濁液を細胞をアミンコ
（Aminco）フレンチ圧力セルの中で 20,000psiにおいて
溶解した。粘度を減少するために、溶解した細胞の試料
を各３分間50％の使用サイクルおよび70％のアウトプッ
トで４回超音波処理した。
【０２５７】超音波処理物を１mMの DTT， 2.4mMのPMS
F，１μｇ／mlのロイペプチンおよび0.2mMのTLCK（分画
Ｉ）を含有する１×TEで 550mlに調節した。硫酸アンモ
ニウムを 0.3Ｍに添加した後、粗製のリゼイトを沸騰す
る水の中で急速に75℃にし、そして75℃の水に15分間移
して大腸菌（E . coli）宿主のタンパク質を変性および
不活性化した。熱処理した試料を急速に０℃にし、そし
て氷上で20分間インキュベーションした。５℃において
20,000×Ｇで遠心することによって沈澱したタンパク質
および細胞膜を除去し、そして上澄み液（分画II）を取
って置いた。
【０２５８】熱処理した上澄み液（分画II）をポリエチ
レンイミン(PEI）で処理して、 DNAおよび RNAの除去し
た。ポリミン(Polymin）Ｐ(34.96mlの10％ [ｗ／ｖ] ，
pH7.5)を急速に撹拌しながら、 437mlの分画IIに０℃に
おいて添加した。０℃において30分後、試料を20,000×
Ｇで30分間遠心した。上澄み液（分画III)を、50mMのト
リス−Cl， pH7.5， 0.3Ｍの硫酸アンモニウム、10mMの
EDTAおよび１mMの DTTの中で平衡化した。
【０２５９】100mlのフェニルセファローズのカラム(3.
2×12.5cm）に、80ml／時で適用した。このカラムを約
200mlの同一緩衝液で洗浄し（基線に対してＡ280)、次
いで150mlの50mMのトリス−Cl， pH7.5， 100mMの KC
l，10mMのEDTAおよび１mMの DTTで洗浄した。次いでMET
284の Tma DNAポリメラーゼをカラムから50mMのトリス
−Cl， pH7.5，２Ｍの尿素、20％（ｗ／ｖ）のエチレン
グリコール、10mMのEDTAおよび１mMの DTTを含有する緩
衝液で溶離し、そして DNAポリメラーゼ活性を含有する
分画をプールした（分画IV）。
【０２６０】分画VIを50mMのトリス−Cl， pH7.5，１mM
のEDTAおよび１mMの DTTの中で50mMの KClに等しい導電
性に調節した。この試料を、同一緩衝液の中で平衡化し
た15mlのヘパリン−セファローズのカラムに適用（９ml
／時で）した。このカラムを同一緩衝液で約14ml／時
(3.5カラム体積）で洗浄し、そして同一緩衝液中の 150
mlの0.05〜 0.5Ｍの KClで溶離した。 DNAポリメラーゼ
活性は0.11〜0.22Ｍの KClの間で溶離された。
【０２６１】pTma15でエンコードされた修飾 Tma DNAポ
リメラーゼを含有する分画をプールし、濃縮し、そして
2.5×貯蔵緩衝液（50mMのトリス−Cl， pH8.0， 250mM
の KCl，0.25mMのEDTA， 2.5mMの DTTおよび 0.5％のツ
イーン20）に対して透析濾過し、引き続いて 1.5体積の
無菌の80％（ｗ／ｖ）のグリセロールを混合し、そして
−20℃において貯蔵した。必要に応じて、ヘパリンセフ
ァローズ溶出の DNAポリメラーゼまたはフェニルセファ
ローズ溶出の DNAポリメラーゼを透析するか、あるいは
50mMのトリス−Cl，pH7.5,１mMの DTT，１mMのEDTAおよ
び 0.2％のツイーン20の中で50mMの KClに等しい導電性
に調節し、そして同一の緩衝液の中で平衡化したアフィ
ゲルブルーカラムに適用（１mgのタンパク質／mlの樹
脂）することができる。
【０２６２】このカラムを３〜５カラム体積の同一緩衝
液で洗浄し、そして10カラム体積の同一緩衝液中の KCl
の勾配（0.05〜 0.8Ｍ）で溶出した。 DNAポリメラーゼ
活性（0.25〜 0.4Ｍの KClの間で溶出する）を含有する
分画をプールし、濃縮し、透析濾過し、そして上のよう
に貯蔵した。種々の DNAポリメラーゼの相対的耐熱性を
比較した。97.5℃において、天然 DNA Tmaポリメラーゼ
の半減期は天然または組換え Taq DNA（すなわち、Ampl
iTaq R ) ポリメラーゼの半減期の２倍より大きい。驚く
べきことには、 MET284Tma DNAポリメラーゼの97.5℃に
おける半減期は天然 Tma DNAポリメラーゼの半減期より
３倍長い。
【０２６３】10mMのトリス−Cl， pH8.3および 1.5mMの
MgCl2 (Taqまたは天然 Tma DNAポリメラーゼについて）
または３mMのMgCl2 (MET284Tma DNAポリメラーゼについ
て）、50mMの KCl(Taq、天然 TmaおよびMET284 Tma DNA
ポリメラーゼについて）または KCl不含(MET284Tma DNA
ポリメラーゼ）、 0.5μＭの各プライマー PCR01および
PCR02，１ngのラムダ鋳型DNA, 200μＭの各dNTP（dCTP
を除外する）、および４単位の各酵素を含有する PCR管
を97.5℃において大きい水浴中で０〜60分間インキュベ
ーションした。試料を経時的に抜き出し、０℃において
貯蔵し、そして５μｌを残留活性についての標準の活性
のアッセイにおいて75℃において10分間測定した。
【０２６４】Taq DNAポリメラーゼは97.5℃において約1
0分の半減期を有したが、天然 TmaDNAポリメラーゼは9
7.5℃において約21〜22分間の半減期を有した。驚くべ
きことには、 Tma DNAポリメラーゼのMET284の形態は、
Taqまたは天然 Tma DNAポリメラーゼのいずれより有意
に長い半減期（50〜55分）を有した。 MET284Tma DNAポ
リメラーゼの改良された耐熱性は、 PCRにおける、とく
にＧ＋Ｃに富んだ標的が増幅困難である場合に用途を見
いだすであろう。なぜなら、標的および PCR生成物の配
列の完全な変性に要求される鎖単離の温度は酵素の不活
性化に導くからである。
【０２６５】50μｌの10mMのトリス−Cl，pH8.3 ，３mM
の MgCl2，20μＭの各dNTP， 0.5ngのバクテリオファー
ジラムダの DNA， 0.5μＭのプライマー PCR01，４単位
の MET284Tma DNAポリメラーゼおよび 0.5mMのプライマ
ー PCR02またはPL10を含有する PCR管を、１分間の96℃
のＴ（変性）および２分間の60℃のＴ（アニーリング−
伸長）を使用して25サイクルをサイクルした。ラムダ D
NA鋳型、デオキシヌクレオチドのストック溶液、並びに
プライマー PCR01および PCR02は、 PECI Gene AmpR キ
ットの一部分であった。プライマーPL10は配列： (配列
番号：45） 5′-GGCGTACCTTTGTCTCACGGGCAAC-3′を有
し、そしてバクテリオファージラムダのヌクレオチド 8
106-8130に対して相補的である。
【０２６６】プライマー PCR01および PCR02は、ラムダ
からの 500bpの生成物を増幅する。プライマー対 PCR01
およびPL10はラムダからの１kbの生成物を増幅する。そ
れぞれのプライマーの組を使用して増幅した後、５μｌ
のアリコートをアガロースゲルの電気泳動にかけ、そし
て特定の意図する生成物のバンドを臭化エチジウムの染
色で可視化した。豊富なレベルの生成物が両者のプライ
マーの組で発生し、 MET284Tma DNAポリメラーゼは意図
する標的配列を首尾よく増幅したことを示す。
【０２６７】実施例７ 切頭 Tmaポリメラーゼの発現 上に記載したように、完全な Tma DNAポリメラーゼ遺伝
子のコード配列を含有するプラスミドで形質転換された
宿主細胞は、短縮された形態（MET140）の Tmaポリメラ
ーゼを単独または全長のポリメラーゼと一緒に発現す
る。変異を行って、発現されるポリメラーゼの形態をコ
ントロールすることができる。ポリメラーゼのMET140の
独占的な発現を増強するために、 139までのアミノ酸に
相当するコード領域を発現ベクターから欠失した。
【０２６８】このようなに欠失を構成するプロトコルは
実施例６に記載されている構成に類似する：短縮された
遺伝子断片を切り出し、次いで全長の断片が切除されて
いるベクターの中に挿入する。しかしながら、短縮され
た断片は、制限消化物から精製するよりむしろ PCR増幅
生成物として得られる。この方法は有用な場合に新しい
上流制限部位（または他の配列）の組込みを可能とす
る。位置 140におけるメチオニンのコドンまでの領域を
欠失するために、SphI部位をpTma12-1およびpTma13中に
PCRを使用して導入した。位置 140のメチオニンのコド
ンのちょうど上流にSphI部位を導入するように、前方プ
ライマー（FL63）を設計した。位置 624にXbaIを含むよ
うに、逆プライマー（FL69）を選択した。SmaIで線状化
したプラスミドpTma12-1を PCR鋳型として使用して、 2
25bpの PCR生成物を生成した。
【０２６９】消化の前に、 PCR生成物を PCR反応混合物
中の50μｇ／mlのプロテイナーゼＫ＋ 0.5％の SDSおよ
び５mMのEDTAで処理した。37℃において30分間インキュ
ベーションした後、プロテイナーゼＫを68℃で10分間加
熱不活性化した。この手順は、引き続く制限消化を阻害
しうる生成物に結合した Taqポリメラーゼを排除した。
緩衝液をTE緩衝液に交換し、そして過剰の PCRプライマ
ーをセントリコン(Centricon)100マイクロコンセントレ
ーターで除去した。
【０２７０】増幅された断片をSphIで消化し、次いでク
レノーで処理して、SphI切断した末端に平滑末端をつく
り、そして最後にXbaIで消化した。生ずる断片を、NcoI
で消化したプラスミドpTma13（pTma12-1が適当であった
であろう）と結合し、クレノーで修復し、次いでXbaIで
消化した。この連結は、最初のNcoI部位（コード配列の
第１メチオニンから上流）と導入されたSphI部位（位置
140におけるメチオニンコード配列から上流）との間の
領域が除去されたインフレームのコード配列を生じた。
生ずる発現ベクターをpTma16と表示した。この実施例に
おいて使用したプライマーを下および配列のリストの節
に記載する。
【０２７１】
【表９】
【０２７２】実施例８ MET140発現ベクター中の望ましくない RBSの排除 Tma DNAポリメラーゼのMET140の形態の少い発現は、位
置 140のメチオニンのコドンから上流のリボソーム結合
部位(RBS）を排除することによって達成することができ
る。オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発により排除
した。遺伝コードの冗長性の利点を利用して、コドンの
第３位置を変化して核酸配列を変更し、これにより、コ
ードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化しないで、
RBSを排除することができる。
【０２７３】修飾された配列を含有する変異原プライマ
ー（FL64）を合成し、そしてリン酸化した。一本鎖pTma
09（NcoI部位を有する全長クローン）を、ストラタジー
ン（Stratagene）から商業的に入手可能な、ヘルパーフ
ァージR480で同時感染することによって調製した。一本
鎖pTma09および pBS13＋の PvuII消化からの大きい断片
の「ギャップド二重鎖 (gapped duplex)」を、２つのプ
ラスミドを混合し、２分間沸騰加熱しそして65℃に５分
間冷却することによって作った。次いで、リン酸化した
プライマーと「ギャップド二重鎖」とを、混合、２分間
の80℃への加熱および引き続く室温へのゆっくりした冷
却によりアニーリングした。残留するギャップをクレノ
ーを使用する伸長により満たし、そして断片を T4DNAリ
ガーゼにより連結した。両反応を標準的塩類中 200mMの
各dNTPおよび40mMの ATPの中で37℃において30分間実施
した。
【０２７４】生ずる環状断片を DG101に、ニトロセルロ
ースフィルター上でプレート形質転換により形質転換し
た。二重反復実験のファルターをつくり、そして正しい
プラスミドの存在をγ32Ｐ−リン酸化プローブ（FL65）
でプロービングすることによって検出した。生ずるベク
ターをpTma19と表示した。
【０２７５】pTma19からの PBSを含まない部分を、NcoI
／XbaI断片のスイッチによりpTma12-1中にクローニング
した。プラスミド19をNcoIおよびXbaIで消化し、そして
620bpの断片を、上の実施例７におけるように、電気泳
動により精製した。pTma12-1をNcoI，XbaIおよびXcmIで
消化した。XcmIによる切断は、引き続く連結工程のため
に PBS＋断片を不活性化し、これは「粘着」末端の連結
に適当な条件下に実施される（希いリガーゼおよび40mM
のATP)。最後に、発現のために、連結生成物をDG116宿
主細胞の中に形質転換し、そしてpTma19-PBSと表示す
る。この実施例において使用したオリゴヌクレオチド配
列を下記および配列表の節に記載する。
【０２７６】
【表１０】 実施例９ 切頭 Tma DNAポリメラーゼ MET ASP21の発現 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子のコード配列の位置21にお
けるアスパラギン酸のコドン付近において翻訳を開始す
るために、このコドンの前にメチオニンのコドンを導入
し、そして最初のNcoI部位からこの導入されたメチオニ
ンのコドンまでの領域を欠失させる。欠失の方法は、前
述の同一の下流プライマー（FL69）、および 570bpの生
成物を生ずるためにNcoI部位およびメチオニンのコドン
組込むように設計した上流プライマー（FL66）を使用す
る手順を包含する。
【０２７７】増幅された生成物をセントリコン(Centric
on）-100マイクロコンセントレーターで濃縮して、過剰
のプライマーおよび緩衝液を排除した。生成物をスピー
ド・バク(Speed Vac）濃縮装置で濃縮し、次いで消化混
合物の中に再懸濁させる。増幅した生成物をNcoIおよび
XbaIで消化する。同様に、pTma12-1，pTma13またはpTma
19-RBSを同じ２つの制限酵素で消化し、そして増幅断片
の消化物と消化した発現ベクターとを連結した。生ずる
構成体は、天然 Tmaコード配列の開始コドンから上流の
NcoI部位から、天然 Tmaコード配列の位置21のアスパラ
ギン酸のコドンから上流に導入された新しいメチオニン
のコドンまでの欠失を有する。
【０２７８】同様に、翻訳の開始が天然 Tmaコード配列
の位置74のグルタミンのコドン Glu74において開始する
ように、欠失の変異体をつくることができる。メチオニ
ンのコドンおよびNcoI部位を Glu74の前に導入するよう
に上流プライマー（FL67）を設計する。使用する下流プ
ライマーおよびクローニングのプロトコルは、 MET ASP
21構成体について前述した通りである。この実施例にお
いて使用した上流プライマーの配列を下記および配列表
の節に記載する。
【０２７９】
【表１１】 実施例10 Ｔ７プロモーターをもつ発現ベクター 発現の効率は、発現ベクター中のプロモーターおよび／
またはリボソーム結合部位(RBS）を変化することによっ
て変更することができる。Ｔ７遺伝子10のプロモーター
および RBSを使用して、発現ベクターpTma17からの Tma
DNAポリメラーゼの発現を推進し、そしてＴ７遺伝子10
のプロモーターおよび遺伝子Ｎの RBSを使用して、発現
ベクターpTma18からの Tma DNAポリメラーゼの発現を推
進した。
【０２８０】これらのベクターの構成は、pTma12-1中に
存在するユニーク制限部位：プロモーターから上流の A
flII部位、 RBSから下流のNcoI部位、およびプライマー
と RBSとの間の BspE1部位を利用した。存在するプロモ
ーターを、前の実施例に記載する技術に類似する技術を
使用して、pTma12-1から切除しそして合成Ｔ７遺伝子10
プロモーターと置換した。
【０２８１】２つのオーバーラッピングする合成オリゴ
ヌクレオチドから合成インサートをつくった。pTma7(Ｔ
７遺伝子10の RBSをもつ）をつくるために、等しい比率
の FR414および FR416を混合し、加熱沸騰させ、そして
室温にゆっくり冷却した。ハイブリダイゼーションした
オリゴヌクレオチドをクレノーで伸長して、全長の二本
鎖のインサートをつくった。次いで伸長した断片を Afl
IIおよびNcoIで消化し、適当な「粘着」末端を残した。
インサートを AflIIおよびNcoIで消化したプラスミドpT
ma12-1中にクローニングした。 DG116宿主細胞を生ずる
プラスミドにより形質転換し、そして形質転換体を所望
のプラスミドについてスクリーニングした。
【０２８２】同一手順をpTma18（遺伝子Ｎの RBSをも
つ）の作製において使用したが、ただし FR414および F
R418を使用し、そして伸長した断片を AflIIおよび Bsp
E1で消化した。この DNA断片を、 AplIIおよび BspE1で
消化したプラスミドpTma12-1中のＰL プロモーターと置
換した。プラスミドpTma17およびpTma18を使用して、誘
発可能な T7DNAポリメラーゼ遺伝子を含有するように修
飾された大腸菌（E . coli）宿主細胞を形質転換する。
これらのベクターの構成において使用したオリゴヌクレ
オチドを下記および配列表の節に記載する。
【０２８３】
【表１２】 実施例11 翻訳カップリング 前述したように、タンパク質のためのコード配列の開始
部位のちょうど上流に短いコード配列をカップリングす
ることによって、翻訳カップリングはタンパク質の発現
の効率を増加することができる。上流のコード配列の翻
訳の停止は、下流のコード配列のための開始部位に密接
に近接してリボソームの残す。上流のコード配列は、所
望のタンパク質のためのコード配列の開始に対して下流
にリボソームを動かす機能のみをする。
【０２８４】翻訳的にカップリングした Tmaの発現ベク
ターを構成し、そしてこの発現ベクターは Tmaコード領
域の上流に位置する大腸菌（E . coli）のTrpEの最後の
６コドンに対してインフレームで融合したＴ７バクテリ
オファージの主要キャプシドタンパク質（遺伝子10）の
最初の10コドンおよび翻訳開始シグナルを有した。TrpE
のための TGA（停止）コドンと Tma遺伝子のための ATG
（開始）コドンとを「カップリング」して、配列 TGATG
を形成する。短いコード配列の翻訳と Tmaコード配列の
翻訳との間に、１塩基のフレーム−シフトが要求され
る。
【０２８５】下記の実施例において、Ｔ７遺伝子10−大
腸菌（E . coli）TrpE／TrpD融合生成物を含有する断片
（TrpEからの最後の６コドンおよび TGA停止コドンなら
びにTrpDからのオーバーラップする ATG開始コドン）
は、前以て存在するプラスミドから転移された。当業者
は認識するように、翻訳的にカップリングした発現ベク
ターの構成において使用したＴ７遺伝子10−大腸菌（E
. coli）TrpE／TrpD融合生成物は合成オリゴヌクレオ
チドとして構成することができる。挿入された断片のた
めの配列を下記および配列表の節に記載する。
【０２８６】Ｔ７遺伝子10−大腸菌（E . coli）TrpE／
TrpD融合生成物を、プラスミドpSYC1868からプライマー
FL48およびFL49を使用して増幅した。プライマーFL51お
よびFL53では、pTma08（NdeI部位を含有する全長クロー
ン）中のTma PolI遺伝子の５′末端を、 ATG開始コドン
から ATG開始コドンの下流のMroI部位まで増幅した。オ
ーバーラッピング領域を残し、こうして本質的に実施例
10に記載するようにして２つの増幅された生成物をアニ
ーリングしそして伸長することができるようにプライマ
ーFL51およびFL49を設計した。２つの増幅生成物を混合
し、95℃に加熱し、室温にゆっくり冷却し、そして Taq
ポリメラーゼで伸長した。
【０２８７】伸長されたインサートをプライマーFL48お
よびFL53で増幅し、次いでXmaIおよびMroIで消化した。
プラスミドpTma12-1をMroIで消化し、そして仔ウシ腸ア
ルカリ性ホスファターゼで処理して再連結を防止した。
消化したpTma12-1をインサートと連結した。生ずる構成
体で DG116宿主細胞を形質転換し、そして形質転換体を
所望のプラスミド DNAについてスクリーニングした。生
ずるベクターをpTma20と表示した。オリゴヌクレオチド
プライマーおよびＴ７遺伝子10−大腸菌（E . coli）Tr
pE／TrpD融合生成物（遺伝子10のインサート）の配列を
下記および配列表の節に記載する。
【０２８８】
【表１３】
【０２８９】実施例12 ArgUtRNAの発現 コドンの使用のパターンは、サーモトガ・マリチマ (Th
ermotoga maritima）と大腸菌（E . coli）との間で異
なる。 Tmaコード配列において、アルギニンは「 AGA」
コドンにより最も頻繁にコードされるが、このコドンは
大腸菌（E . coli）宿主細胞の中で低い頻度で使用され
る。対応する「ArgU」tRNAは大腸菌（E. coli）におい
て低い濃度で現れる。宿主細胞中の ArgtRNAの低い濃度
は Tmaポリメラーゼ遺伝子の翻訳効率を制限することが
ある。大腸菌（E . coli）宿主内の Tmaコード配列の翻
訳効率は、「ArgU」tRNAのための遺伝子を含有する第２
発現ベクターを使用して、tRNA遺伝子の多数のコピーを
宿主細胞中にクローニングすることによって、このtRNA
種の濃度を増加することにより改良することができる。
【０２９０】ArgtRNA遺伝子を、プライマー DG248およ
び DG285を使用して、大腸菌（E .coli）ゲノム DNAか
ら PCR増幅した。増幅生成物をSalIおよび BspH1で消化
し、そして次にArgU断片を消化したベクターと連結し
た。 DG101細胞を形質転換し、そして連結したベクター
をpARG01と表示した。最後に、 DG116宿主細胞をpARG01
およびpTma12-1により同時形質転換した。この実施例に
おいて使用したオリゴヌクレオチドのプライマーを下記
および配列表の節に記載する。
【０２９１】
【表１４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ローヤー，フランシス シー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611，オークランド，サロニ ドライ ブ 6641 (72)発明者 ストッフェル，スザンヌ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94530，エル セリット，ガルビン ド ライブ 935

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 サーモトガ・マリチマ (Thermotoga ma
    ritima）(Tma) ポリメラーゼ酵素活性を有し、そして次
    のアミノ酸配列（Ｉ）： 【化１】 【化２】 又は前記アミノ酸配列（Ｉ）のＮ−末端側のおよそ３分
    の１以下が欠失しており且つ Tmaポリメラーゼ活性を有
    するアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列（Ｉ）に対し
    て１個又は数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換
    により修飾されており且つ Tmaポリメラーゼ活性を有す
    るアミノ酸配列、のいずれかをコードするDNA； 但し、前記 Tmaポリメラーゼ活性とは、 （１）ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳型鎖に
    相補的な核酸鎖を形成する反応（ポリメラーゼ反応）を
    触媒する； （２）３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する； （３）ポリメラーゼ反応のための至適温度は約75℃〜80
    ℃である；及び （４）ポリメラーゼ反応のために好ましいpHは約７〜９
    である； を特徴とするものとする。
  2. 【請求項２】 前記アミノ酸配列の修飾が、アミノ酸位
    置323, 325, 329, 385,389, 393, 464 及び 468の少な
    くとも１ケ所に存在する、請求項１に記載の DNA。
  3. 【請求項３】 前記配列（Ｉ）のアミノ酸No.140− 893
    をコードする、請求項２に記載の DNA。
  4. 【請求項４】 前記配列（Ｉ）のアミノ酸No.284− 893
    をコードする、請求項２に記載の DNA。
  5. 【請求項５】 次のヌクレオチド配列（II）： 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 又はその部分配列を有する請求項１に記載の DNA。
  6. 【請求項６】 前記配列（II）のヌクレオチドNo.418−
    2682に対応するヌクレオチド配列を有する、請求項５に
    記載の DNA。
  7. 【請求項７】 前記配列（II）のヌクレオチドNo.850−
    2682に対応するヌクレオチド配列を有する、請求項５に
    記載の DNA。
  8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の D
    NA配列を含んで成るDNAベクター。
  9. 【請求項９】 前記熱安定性 DNAポリメラーゼをコード
    する DNAが宿主に適合した転写開始シグナル及びリボゾ
    ーム結合部位を有する、請求項８に記載の DNAベクタ
    ー。
  10. 【請求項１０】 請求項８又は９に記載のベクターによ
    り形質転換された組換え宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 宿主によってではなくサーモトガ・マ
    リチマにより好んで使用されるコドンに対して特異的な
    tRNAをコードする遺伝子の多数のコピーを含んで成る請
    求項１０に記載の組換え宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 大腸菌（Escherichia coli）の細胞
    である請求項１０又は１１に記載の組換え宿主細胞。
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