JP2584198B2 - サーモトガ・マリチマ由来の熱安定性核酸ポリメラーゼをコードする遺伝子 - Google Patents
サーモトガ・マリチマ由来の熱安定性核酸ポリメラーゼをコードする遺伝子Info
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Description
ア(eu bacteria)サーモトガ・マリチマ(Thermotoga
maritima)由来の熱安定性 DNAポリメラーゼをコードす
る遺伝子に関する。熱安定性 DNAポリメラーゼは、多数
の組換え DNA技術、ことにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
による核酸の増幅において有用である。
(Thermotoga maritima)の分離は Huberら、1986, Ar
ch.Microbiol. , 144 :324-333に記載されている。サー
モトガ・マリチマ(T. maritima)は、偏性嫌気性、桿
形、発酵性、超好熱性であり、そして55℃〜90℃におい
て増殖し、至適な増殖温度は約80℃である。このユーバ
クテリウムは、イタリーおよびアゾレスにおける地熱で
加熱された海底から単離された。
tima)細胞は鞘様構造および単毛の鞭毛を有する。サー
モトガ・マリチマ(T. maritima)はムレインおよび脂
肪酸含有脂質、ジフテリア毒素抵抗性延長因子2、 RNA
ポリメラーゼサブユニットのパターン、および抗生物質
に対する感受性によりユーバクテリア界に分類される。
広範な研究が中温性微生物、例えば、大腸菌(E. col
i)からの DNAポリメラーゼの単離について実施されて
きている。例えば、 Bessmanら、1957, J.Biol.Chem.,
223 :171-177、およびButtinおよびKornberg, 1996, J.
Biol.Chem., 241:5419-5427を参照のこと。好熱性細
菌、例えば、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga mari
tima)からの DNAポリメラーゼの単離および精製につい
てなされている研究は非常に少ない。
ticus ) YT−1菌株の細胞からの DNAポリメラーゼ活性
についての6工程の単離および濃縮が、 Kaledinら、19
87,Biokhymiya, 45:644-651に開示されている。これら
の工程は、粗製の抽出物の単離、DEAE−セルロースのク
ロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトによる分別、
DEAE−セルロースによる分別、および一本鎖 DNA−セル
ロースのクロマトグラフィーを包含する。精製された酵
素の分子量は、Kaledin らにより62,000ダルトン/モノ
マー単位として報告された。
ticus ) からのポリメラーゼの第2の濃縮のスキーム
は、 Chienら、1976, J.Bacteriol., 127 : 1550-1557
に記載されている。この方法においては、粗製の抽出物
をDEAE−セファデックス(Sephadex)カラムに適用す
る。次いで、プールし透析した分画をホスホセルロース
のカラムで処理する。プールした分画を透析し、そして
ウシ血清アルブミン(BSA)を添加してポリメラーゼ活性
の損失を防止する。生ずる混合物を DNA−セルロースカ
ラムに負荷する。カラムからプールした物質を透析す
る。精製されたタンパク質の分子量は約63,000〜68,000
であると報告されている。
aledinらにより記載されている酵素を使用して、現存す
る核酸配列を最初に存在する量と比較して大量に増幅す
ることは、米国特許第 4,683,195号;米国特許第 4,68
3,202号および米国特許第 4,965,188号に記載されてお
り、これらは PCR法を記載しており、それら開示の各々
を引用によってここに加える。プライマー、鋳型、ヌク
レオシド三リン酸、適当な緩衝液および反応条件、およ
びポリメラーゼを PCR法において使用し、この方法は標
的 DNAの変性、プライマーのハイブリダイゼーション、
および相補的鎖の合成を包含する。
配列の生成のための鋳型となる。これらの特許が開示す
るように、使用するポリメラーゼが熱安定性酵素である
場合、ポリメラーゼは各変性工程後に添加することは必
要ではない。なぜなら、熱はポリメラーゼ活性を破壊し
ないからである。米国特許第 4,889,818号、欧州特許公
開第 258,017号、および PCT公開No. 83/06691 号(そ
れらの開示をここに引用によって加える)は、サームス
・アクアチクス(Thermus aquaticus ) からの約94kD
a の熱安定性 DNAポリメラーゼの単離および組み換え発
現および PCRにおけるそのポリメラーゼの使用を記載し
ている。サームス・アクアチクス(T. aquaticus ) の
DNAポリメラーゼは PCRおよび他の組み換え DNA技術に
おける使用のためにことに好ましいが、他の熱安定性ポ
リメラーゼが要求されている。
CR法を改良し、そして他の組換え技術、例えば、 DNAの
配列決定、ニック翻訳、およびなお逆転写において熱安
定性 DNAポリメラーゼを使用するとき、得られる結果を
改良するために使用することができる、精製された、熱
安定性 DNAポリメラーゼを生産することはこの分野にお
いて望まれている。本発明は、サーモトガ・マリチマ
(Thermotoga maritima)の DNAポリメラーゼのための
組み換え発現ベクターおよび精製のプロトコルを提供す
ることによって、その要求を満足することを促進する。
三リン酸の組合による、核酸鋳型鎖に対して相補的であ
る核酸鎖の形成を触媒する、精製された熱安定性 DNAポ
リメラーゼI酵素を提供する。精製された酵素はサーモ
トガ・マリチマ(Thermotoga maritima)(Tma) からの
DNAポリメラーゼIであり、そして SDS−PAGEにより測
定して約97キロダルトン(kDa)の分子量および、102kDa
の、 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列か
ら推定される分子量有する。この精製された物質は PCR
において使用して、最初に存在する量と比較して大きい
量の所定の核酸配列を生産することができるので、これ
らの配列を容易に操作および/または分析することがで
きる。
tima)からの Tma DNAポリメラーゼ酵素をコードする遺
伝子も同定され、クローニングされ、配列決定され、そ
して高いレベルで発現され、そしてなお本発明の熱安定
性酵素を調製するための他の手段を提供する。完全な遺
伝子および Tma酵素のためのコード配列に加えて、 Tma
DNAポリメラーゼのためのコード配列の誘導体もまた提
供される。本発明はまた、1種または2種以上の非イオ
ン性ポリマーの洗剤を含有する緩衝液中の前述の精製さ
れた熱安定性 Tma酵素を含んでなる安定な酵素組成物を
包含する。
ラーゼを精製する方法を提供する。この方法は、サーモ
トガ・マリチマ(Thermotoga maritima)の細胞から粗
抽出物を調製し、 DNAポリメラーゼが抽出物中のすべて
の核酸から解離するように、粗抽出物のイオン強度を調
節し、該抽出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに
かけ、該抽出物を DNA結合性タンパク質アフィニティー
クロマトグラフィーにかけ、該抽出物をアニオン交換ク
ロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィ
ーまたはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにか
けることを包含する。
は順次に前述の順序で実施される。ヌクレオチド結合性
タンパク質アフィニティークロマトグラフィーの工程
は、 DNAポリメラーゼをエンドヌクレアーゼのタンパク
質から単離するために好ましい。
メラーゼをコードする DNA配列および発現ベクター、Tm
a DNAポリメラーゼの精製のプロトコル、精製された Tm
a DNAポリメラーゼの調製、および Tma DNAポリメラー
ゼを使用する方法を提供する。本発明の理解を促進する
ために、多数の用語を下に定義する。
使用し、そしてすべてのこのような表示は子孫を包含す
る。こうして、語「形質転換体」または「形質転換され
た細胞」は、転移の数に無関係に、一次形質転換細胞、
およびその細胞から誘導された培養物を包含する。すべ
ての子孫は、意図的のまたは偶発的突然変異のために、
DNA含有が正確に同一でないことがある。もとの形質転
換された細胞についてスクリーニングしたとき同一の機
能有する突然変異子孫は、形質転換体の定義の中に含め
られる。
体における作用可能に連鎖したコード配列の発現に必要
な DNA配列を呼ぶ。例えば、原核生物に適当なコントロ
ール配列はプロモーター、必要に応じて、オペレーター
配列、リボソーム結合部位、および可能ならば他の配
列、例えば、転写停止配列を包含する。用語「発現系」
は、所望のコード配列およびコントロール配列を作用可
能な連鎖で含有する DNA配列を呼び、こうしてこれらの
配列で形質転換された宿主はコードされたタンパク質を
生産することができる。形質転換を実施するために、発
現系をベクター上に含めることができる;関係する DNA
はまた、宿主の染色体の中に組み込むことができる。
リペプチドまたは前駆体の発現をコードする DNA配列を
呼ぶ。こうして、 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子はポリメ
ラーゼおよび Tma DNAポリメラーゼのコード配列を含
む。ポリペプチドは、全長のコード配列によるか、ある
いは所望の酵素活性が保持されるかぎりコード配列の一
部分によりコードされることができる。用語「作用可能
に連鎖した」は、コントロール配列がコードされたタン
パク質の発現を推進するために機能するように、コード
配列の位置を決定することに関する。こうして、コント
ロール配列に「作用可能に連鎖した」コード配列は、コ
ード配列がコントロール配列の指令下に発現されること
ができるようなコンフィグレーションに関する。
ゼを含有する混合物に関係するとき、 Tmaポリメラーゼ
を含むが、さらに他のタンパク質を含むことができる、
物質の集まりを呼ぶ。 Tmaポリメラーゼが組換え宿主細
胞に由来する場合、他のタンパク質は通常宿主細胞に関
連するであろう。宿主が細菌である場合、汚染するタン
パク質は細菌のタンパク質であろう。用語「非イオン性
ポリマー洗剤」は、イオンの電荷もせず、そして、本発
明の目的のために、約 3.5〜約 9.5のpH範囲で Tma酵素
を可溶化する能力により特徴づけられる表面活性剤を意
味する。適当な非イオン性ポリマー洗剤の多数の例は、
米国特許同時継続出願第 387,003号、1989年7月28日提
出(その開示をここに引用によって加える)に記載され
ている。
用するとき、2またはそれより多く、好ましくは3また
はそれより多くの、通常10より多いデオキシリボヌクレ
オチドまたはリボヌクレオチドから構成された分子とし
て定義される。正確な大きさは多数の因子に依存し、次
いでこれらの因子はオリゴヌクレオチドの究極の機能ま
たはその使用に依存する。オリゴヌクレオチドは合成的
にまたはクローニングにより誘導することができる。
き、プライマーの発現が開始される条件下に配置された
とき、合成の開始点として作用することができるオリゴ
ヌクレオチドを呼ぶ。オリゴヌクレオチドの「プライマ
ー」は、精製された制限消化物におけるように、天然に
存在することができるか、あるいは合成的に生成するこ
とができる。核酸鎖に対して相補的であるプライマーの
発現生成物の合成は、4つの異なるヌクレオシド三リン
酸および Tma熱安定性酵素の存在下に適当な緩衝液の中
で適当な温度において開始される。
ファクター(例えば、2価の金属イオン)および塩(適
当なイオン強度を与えるために)を含む。 Tmaポリメラ
ーゼについて、緩衝液は好ましくは1〜3mMのマグネシ
ウム塩、好ましくは MgCl2、50〜 200μMの各ヌクレオ
シド三リン酸、および 0.2〜1μMの各プライマー、な
らびに50mMの KCl、10mMのトリス緩衝液(pH 8.0〜8.
4)、および 100μg/mlのゼラチン(しかしゼラチンは
要求されず、そしてある応用において、例えば、DNAの
配列決定において回避すべきである)を含有する。
るためには一本鎖であるが、二本鎖であることができ
る。二本鎖である場合、プライマーをまず処理してその
鎖を単離した後、発現生成物の調製のために使用する。
プライマーは通常オリゴデオキシリボヌクレオチドであ
る。プライマーは、ポリメラーゼ酵素の存在下に伸長生
成物の合成をプライミングするために十分に長くなくて
はならない。
えば、プライマー源および所望の結果に依存し、そして
反応温度は鋳型へのプライマーの適切なアニーリングを
保証するためのプライマーの長さに依存して調節しなく
てはならない。標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌ
クレオチドプライマーは典型的には15〜35ヌクレオチド
を含有する。短いプライマー分子は、一般に、十分に安
定な鋳型との複合体を形成するために、より下い温度を
必要とするであろう。
して「実質的に」相補的であるように選択すべきであ
る。プライマーは、十分に相補的であって、プライマー
の延長が起こるように鋳型の鎖とハイブリダイゼーショ
ンしなくてはならない。プライマーの配列は、鋳型の正
確な配列を反映することは必要ではない。例えば、非相
補的ヌクレオチドの断片は、プライマーの5′末端に結
合することができ、プライマーの配列の残部はその鎖に
対して実質的に相補的である。
マーの中に介在させることができるが、ただしプライマ
ーは鋳型の配列と十分に相補的であって、ハイブリダイ
ゼーションし、これによりプライマーの伸長生成物の合
成のための鋳型/プライマー複合体を形成することを条
件とする。用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制
限酵素」は、二本鎖 DNAを特定のヌクレオチド配列でま
たはその付近で切断する細菌酵素を呼ぶ。
定でありかつ耐熱性であり、そしてヌクレオチドの結合
を適切な方法で触媒(促進)して、核酸鎖に対して相補
的である伸長生成物を形成する酵素を意味する。一般
に、プライマー伸長生成物の合成は、プライマーの3′
末端において開始し、そして合成が停止するまで鋳型の
配列の5′末端に向かって進行する。熱安定性酵素は、
80℃〜 105℃の温度に短時間(すなわち、5〜30秒)暴
露した後、復元しかつ活性を再び獲得しなくてはなら
ず、そして60℃以上の至適温度をもたなくてはならな
い。
酵素は、ポリメラーゼ連鎖反応または PCRとして知られ
ている増幅反応における有効な使用のための要件を満足
する。 Tma DNAポリメラーゼ酵素は、 PCR法において主
要な工程である、二本鎖の核酸の変性を実施するために
必要な時間の間、高温に暴露したとき、不可逆的に変性
(不活性化)しない。ここにおける目的のため、酵素の
不可逆的変性は、酵素的活性の永久的かつ完全な損失を
意味する。
件は、例えば、緩衝液の塩濃度および組成、変性される
核酸の長さおよび量に依存するが、典型的には変性温度
は数秒〜数分間で約80℃〜約 105℃である。緩衝液の塩
濃度および/または核酸のGC組成が増加するにつれて、
より高い温度を必要とすることがある。 Tma酵素は約80
℃〜 105℃の温度に比較的短い暴露で不可逆的に変性し
ない。
それが機能する至適温度有する。60℃より低い温度はプ
ライマーの鋳型へのハイブリダイゼーションを促進する
が、塩の組成および濃度およびプライマーの組成および
長さに依存して、鋳型へのハイブリダイゼーションはよ
り高い温度(例えば、60℃〜80℃)において起こること
ができ、これはプライマー延長反応の特異性を促進する
ことができる。酵素のための至適温度が高くなればなる
ほど、プライマー指令の伸長反応の特異性および/また
は選択性はより大きくなるであろう。 Tma酵素は約45℃
〜90℃の広い温度範囲にわたって活性を示す;好ましい
至適温度は75℃〜80℃である。
ermotoga maritima)の熱安定性 DNAポリメラーゼI活
性をコードする DNA配列を提供する。この配列によりコ
ードされるアミノ酸配列は、サームス・アクアチクス
(Thermus aquaticus ) およびサームス・サーモフィ
ルス(Thermus thermophilus)の熱安定性 DNAポリメ
ラーゼの部分に対する相同性有する。 Tma DNAポリメラ
ーゼ遺伝子の5′−ATG開始コドンから TGA−3′停止
コドンへの完全なコード配列は下に記載されており、そ
して配列を列挙する節において配列番号:1として列挙
されている。この配列に参照のために番号を付してあ
る。
ド配列、およびコードされた3文字の略号で表されるア
ミノ酸配列の両者は、配列番号:1として配列表の節に
記載されている。便宜上、 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子
配列によりコードされたアミノ酸配列をまた、1文字の
略号でアミノ末端からカルボキシ末端に、下記に示す。
この配列に参照のための番号が付されている。
に示す。 F=フェニルアラニン H=ヒスチジン L=ロイシン Q=グルタミン I=イソロイシン N=アスパラギン M=メチオニン K=リジン V=バリン D=アスパラギン酸 S=セリン E=グルタミン酸 P=プロリン C=システイン T=スレオニン W=トリプトファン A=アラニン R=アルギニン Y=チロシン G=グリシン
列は、「縮重(degen erate)プライマー」法により同定
され、この方法は広い実用性を有し、そして本発明の重
要な面である。縮重プライマー法において、既知の熱安
定性 DNAポリメラーゼの保存されたドメインに対応する
任意の熱安定性ポリメラーゼのコード配列の DNA断片を
同定することができる。
対応する保存されたドメインは、Taq, TmaおよびTth の
熱安定性 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列のためのコー
ド配列からのものである。縮重プライマー法は、Taq, T
th, Tおよび種々の保存された領域が同定されたE.coli
からの DNAポリメラーゼIのタンパク質のアミノ酸配列
を比較することによって開発された。次いで、これらの
保存された領域に相当するプライマーが設計された。本
発明の Tma配列を使用して他の縮重プライマーを設計す
ることができる。縮重プライマー法の一般的実用性を、
ここで、 Tma遺伝子のクローニングに適用された方法を
特別に参照して例示する。
ングするために、保存されたアミノ酸配列をアミノ酸の
各々のための可能なコドンのすべてに転換した。遺伝コ
ードの縮重性のために、所定のアミノ酸はいくつかの異
なるコドンにより表示することができる。所定のアミノ
酸のためのコドンの中に複数の塩基が存在できる場合、
その配列は縮重性をもつと言われる。次いで、所定のア
ミノ酸配列をコードすることができる、すべての可能な
DNA配列のプールとして、プライマーを合成した。所定
のプライマーのプールについての縮重の量は、各位置に
おける可能なヌクレオチドの数を掛けることによって決
定することができる。
うになるほど(すなわち、プール内の個々のユニークプ
ライマー DNA配列の数がより大きくなるほど)、ユニー
クプライマー配列の1つが所望のもの以外の標的染色体
DNAの領域に結合する確率はより大きくなり−それゆ
え、生ずる増幅の特異性はより少なくなる。縮重プライ
マーを使用して増幅の特異性を増加するために、プール
をサブセットとして合成し、こうしてサブセットの全体
の群が所定のアミノ酸配列をコードするすべての可能な
DNA配列を含むが、各個々のサブセットは一部分のみを
含むようにする:例えば、1つのプールはGまたはCを
特定の位置に含有することができるが、他のものは同一
位置にAまたはTを含有する。これらのサブプールの各
々はDG番号で表示される。
的である、遺伝子の5′−領域から3′−領域に向う方
向)および逆プライマー(コード鎖に対して相補的であ
る、遺伝子の3′−領域から5′−領域に向う方向)の
両者を、これらの保存された領域の大部分について設計
して Tmaポリメラーゼをクローニングした。5′−末端
に制限部位をもつプライマーを設計して、クローニング
を促進した。前方プライマーは BalII制限部位(AGATC
T)を含有したが、逆プライマーは EcoRI制限部位(GAA
TTC)を含有した。さらに、プライマーは5′−末端に
2ヌクレオチドを含有して、その制限部位における切断
効率を増加した。
使用し、ここで標的核酸はサーモトガ・マリチマ(Ther
motoga maritima)からの染色体 DNAであった。1系列
の温度プロフィルと組み合わせて、前方プライマーおよ
び逆プライマーのプールの組み合わせを使用する PCR法
の生成物を比較した。 Taq染色体 DNAを使用して発生さ
せた生成物に対して特異的な同一の大きさの生成物を生
成したとき、 PCR断片をゲル精製し、再増幅し、そして
ベクターBSM13H:BglII の中にクローニングした(スト
ラタジーン(Stratagenc) のベクターpBSM+の誘導体、
ここでpBSM+のHindIII部位は BglII部位に転換されて
いる)。
ポリメラーゼおよび Tthポリメラーゼの中の他の既知の
アミノ酸配列に対して相同性であるアミノ酸配列をコー
ドすることが見出された場合、その配列は可能性ある熱
安定性 DNAポリメラーゼコード配列として同定された。
次いで、 Tma DNAポリメラーゼ酵素の部分が、サザン−
ブロット分析により、サーモトガ・マリチマ(Thermoto
ga maritima)の染色体 DNA中に同定された。Tma染色
体 DNAを種々の酵素で消化し、そしてニトロセルロース
のフィルターに移した。32Pまたはビオチン−dUTPで標
識したプローブを、クローニングした PCR生成物からの
遺伝子の種々の領域について発生させた。
ノム DNAにハイブリダイゼーションさせ、プローブにハ
イブリダイゼーションする染色体 DNA断片の大きさの同
定を可能とした。遺伝子の5 ′および3 ′領域をカバー
するプローブの使用により、1または2以上の DNA断片
がポリメラーゼのための構造遺伝子の全部でないにして
も大部分を含有することが保証される。クローニングを
促進するために、単一の DNA断片またはいくつかの DNA
断片中に構造遺伝子を含有する断片を生成するために使
用することができる制限酵素を同定することができる。
ゼ遺伝子をコードする染色体の DNA断片をクローニング
した。染色体 DNAを同定された制限酵素で消化し、そし
て大きさで分別した。所望の大きさの領域を含有する分
画を濃縮し、脱塩し、そしてBSM13H:BglII のクローニ
ングベクター中にクローニングした。前にクローニング
した PCR生成物から発生した標識したプローブを使用す
るハイブリダイゼーションによりクローンを同定した。
次いで、 PCR生成物をポリアクリルアミドゲル上で分析
した。
びにそれらの配列をコードする DNA化合物を使用して、
組み換え DNA発現ベクターを設計および構成して、広範
な種類の宿主細胞中での Tma DNAポリメラーゼ活性の発
現を推進することができる。上に示した DNA配列のすべ
てまたは一部分をコードする DNA化合物もまた、プロー
ブとして使用して、他の生物体からの熱安定性ポリメラ
ーゼをコードする DNAを同定することができ、そして上
に示したアミノ酸配列を使用して、熱安定性ポリメラー
ゼの同定および精製に使用できる抗体の調製における免
疫原として使用するためのペプチドを設計することがで
きる。
する組み換えベクターによるか、あるいは天然サーモト
ガ・マリチマ(T. maritima)細胞により生産されたか
どうかにかかわらず、 Tma DNAポリメラーゼは、典型的
には、精製した後、組み換えDNA技術において使用す
る。本発明はこのような精製法を提供する。天然タンパ
ク質を回収するために、細胞を任意の適当な技術を使用
して増殖させる。簡単に述べると、細胞は次の成分を含
有する「 MMS」培地の中で増殖させる(1リットル当た
り):NaCl (6.93g) ;MgSO4 ・7H2O (1.75g);MgCl
2 ・6H2O (1.38g);KCl(0.16g):NaBr (25mg);H3
BO3(7.5mg);SrCl2 ・6H2O(3.8mg);KI(0.025mg);Ca
Cl2(0.38g);KH2PO4(0.5g);Na2S(0.5G);(NH4)2
Ni(SO4)2(2mg);微量のミレラル(Balchら、Microbiol.
Rev., 43:260-296)(15ml) ;レサズリン(1mg) ;およ
び澱粉(5g)、pH6.5(H2SO4 で調節した)。
天(Oxoid)を培地に添加することができる。細胞の合理
的増殖はまた、 0.5%の酵母エキスを補充した「 SME」
培地(Stetterら、1983, Syst.Appl.Microbiol., 4:53
5-551)中で、あるいはマリンブロス(marine broth)(Di
fco2216)の中で起こる。細胞の増殖後、酵素の単離およ
び精製を6段階で実施し、それらの各々は、特記しない
限り、室温以下の温度、好ましくは約0℃〜約4℃にお
いて実施する。第1段階または工程において、細胞を、
それが凍結されている場合は、融解し、アミンコ・フレ
ッシュ・プレッシュアー・セル(Aminco fresh pressur
e cell(8〜20,000psi)の中で溶解し、緩衝液(約pH 7.
5) 中に懸濁させ、そして超音波処理して粘度を減少さ
せる。
ゼイトに添加して、 Tma DNAポリメラーゼが DNAまたは
細胞リゼイトのタンパク質に結合するのを防止する。ま
た、第2段階において、ポリミン(Polymin)P(ポリエ
チレンイミン、PEI)をリゼイトに添加して、核酸を沈澱
させ、そしてリゼイトを遠心する。第3工程において、
硫酸アンモニウムを上澄み液に添加し、そして上澄み液
を0.3Mの硫酸アンモニウムおよび 0.5mMのDTT(ジチオ
スレイトール)を含有するTE(50mMのトリス−Cl、pH7.
5)により平衡化したフェニルセファローズ(Sepharose)
カラム上に負荷する。次いでこのカラムを同一の緩衝液
で、第2にTE−DTT(硫酸アンモニウムを含まない)で、
第3にエチレングリコール−TE−DTT で、そして最後に
エチレングリコールを含有するTE−DTT 中2Mの尿素で
洗浄する。
なわち、約20〜30mgのタンパク質/mlの樹脂より多くを
負荷することによって)ことがないかぎり、 Tmaポリメ
ラーゼ活性のすべてはカラムにより保持され、そしてエ
チレングリコールを含有するTE−DTT 中の2Mの尿素で
溶出される。第4段階において、尿素の溶離液を、0.08
MのKCl 、50mMのトリス−Cl(pH 7.5)、0.1mM のEDTA、
0.2%のツイーン20および 0.5mMの DTTにより平衡化し
たヘパリンセファローズカラムに適用する。次いで、カ
ラムを同一の緩衝液で洗浄し、そして酵素を0.08M〜
0.5Mの KClの直線の勾配で溶出する。ピーク活性分画
は 0.225M〜 0.275Mの KClにおいて見いだされた。
られた分画を KClを含まないアフィゲル(affigel)−ブ
ルー緩衝液で希釈し、そして25mMのトリス−Cl(pH 7.
5)、 0.1mMのEDTA、 0.2%のツイーン20、 0.5mMの DT
T、および0.15Mの KClの中で平衡化したアフィゲル−
ブルーカラムに適用する。このカラムを同一の緩衝液で
洗浄し、そして同一の緩衝液中の0.15M〜 0.7Mの KCl
の直線勾配で溶出する。ピーク活性分画は勾配の 0.3M
〜0.55Mの KClにおいて見いだされた。次いでピーク活
性のこれらの分画を、任意の適当な手順を使用して汚染
デオキシリボヌクレアーゼ(エンドヌクレアーゼおよび
エキソヌクレアーゼ)について試験する。
過剰の DNAポリメラーゼとのインキュベーション後、フ
ァージλ DNAまたはスーパーコイルドのプラスミド DNA
の分子量の変化から電気泳動的に決定することができ
る。同様に、エキソヌクレアーゼ活性は、過剰の DNAポ
リメラーゼとのインキュベーション後、制限酵素で消化
した DNAの分子量の変化から電気泳動的に決定すること
ができる。デオキシリボヌクレアーゼ活性をもたない分
画をプールし、そして50mMの KClを含有するホスホセル
ロースの緩衝液の中に透析濾過する。
の透析濾過したプールを、25mMのトリス−Cl(pH 7.5)、
50mMの KCl、 0.1mMのEDTA、 0.2%のツイーン20および
0.5mMの DTTの正しいpHおよびイオン強度に平衡化し
た、ホスホセルロースのカラム上に負荷する。次いで、
このカラムを同一の緩衝液で洗浄し、そして0.05M〜
0.5Mの KClの直線勾配で溶出する。ピーク分画は 0.21
5M〜0.31Mの KClにおいて溶出された。これらの分画
からの、分解していない精製された DNAポリメラーゼ
は、イン−シチユ活性ゲルにおける変化しない移動パタ
ーンにより証明される。
tima)から精製された DNAポリメラーゼの分子量は、任
意の技術により、例えば、タンパク質の分子量マーカー
を使用する SDS−PAGEによるか、あるいはコード配列の
計算により決定することができる。サーモトガ・マリチ
マ(Thermotoga maritima)の精製された DNAポリメラ
ーゼの分子量は、 SDS−PAGEにより、約97kDa であると
決定される。予測されたアミノ酸配列に基づいて、分子
量は約102kDaで推定される。天然 Tma DNAポリメラーゼ
の精製のプロトコルは、実施例1により詳細に記載され
ている。本発明の組換え Tmaポリメラーゼの精製は、同
様な方法により実施することができる。
maポリメラーゼは、本発明の方法およびベクターにより
調製することができる。 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子の
完全なコード配列が大腸菌(E. coli)中の発現ベクタ
ーの中に存在するときでさえ、細胞は、位置 140におけ
るメチオニンのコドンで開始する翻訳により形成された
切頭されたポリメラーゼを生産する。
るメチオニンのコドンにおいて翻訳を開始することによ
って生産されるタンパク質に相当する切頭ポリメラーゼ
の生産のために、組み換え手段を使用することができ
る。アミノ酸1〜139 を欠如するポリメラーゼ(約86kD
a)および野生型 Tmaポリメラーゼのアミノ酸1〜 283を
欠如するポリメラーゼ(約70kDa)は、ポリメラーゼ活性
を保持するが、弱化した5′→3′エキソヌクレアーゼ
活性を有する。さらに、70kDa のポリメラーゼは天然 T
maポリメラーゼより有意にいっそう熱安定性である。
酵素の全体の配列は活性のために要求されない。組換え
DNA技術において、 Tma DNAポリメラーゼIのコード配
列の部分を使用して、 DNAポリメラーゼ活性をもつ生物
学的に活性な遺伝子生産物を生産することができる。 T
ma DNAポリメラーゼの配列をコードする DNAの入手可能
性はまた、 DNAポリメラーゼ活性を有するムテイン(突
然変異タンパク質)の形態を発生させるためにコード配
列を修飾する機会を提供する。
分はポリメラーゼ活性に不必要であり、むしろタンパク
質の5′→3′エキソヌクレアーゼ活性をコードする。
組換え DNA法を使用して、 Tma遺伝子のN−末端のコー
ド配列のほぼ1/3を欠失し、クローニングし、そして
ポリメラーゼのアッセイにおいて非常に活性である遺伝
子生産物を発現することができるが、欠失の程度に依存
して、5′→3′エキソヌクレアーゼ活性を有する。ポ
リメラーゼのある種のN−末端の短縮された形態は活性
であるので、これらのポリメラーゼの発現のために使用
する遺伝子構成体はコード配列の対応する短縮された形
態を含むことができる。
ゼのペプチド鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還
元、または他の誘導体化により修飾することができ、そ
してタンパク質を切断して活性を保持する断片を得るこ
とができる。活性を破壊しないこのような変更は、その
タンパク質を Tmaポリメラーゼ活性をもつタンパク質の
定義から除外せず、それゆえ本発明の範囲内に包含され
る。
構造を欠失、付加または変更して、そのコード配列から
生成されたmRNAの翻訳の間に Tma DNAポリメラーゼの中
に組み込まれるアミノ酸配列を変化させることは、タン
パク質の高温の DNAポリメラーゼ活性を破壊しないで、
実施することができる。このような置換または他の変更
は、本発明の考えられる範囲内に入る DNAによりコード
されるアミノ酸配列を有するタンパク質を生成する。な
お、特許請求の範囲において、アミノ酸配列(I)に対
して1個又は数個のアミノ酸の付加が、欠失及び/又は
置換により修飾されており且つ Tmaポリメラーゼ活性を
有するアミノ酸配列とは、アミノ酸配列(I)に対し
て、部位特定変異誘発法、PCR 法等、自体周知の方法に
よりアミノ酸の付加、欠失及び/又は置換が可能な程度
に修飾されており、且つ Tmaポリメラーゼ活性を有する
アミノ酸配列を意味する。
ローニングされたゲノム配列または相同の合成配列を使
用して、 Tma DNAポリメラーゼ活性をもつ融合ポリペプ
チドを発現すること、あるいは天然 Tma DNAポリメラー
ゼのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をもつタンパク
質を発現することができる。さらに、このような発現
は、 Tma DNAポリメラーゼ遺伝子のコントロール配列に
よるか、あるいは Tma DNAポリメラーゼを発現するため
に選択された宿主中で(その宿主がなにであろうと)機
能するコード配列により、指令されることができる。
可能な発現ベクターを構成することができる Tma DNAポ
リメラーゼのためのコード配列および発現されるコード
配列を提供する。 Tmaポリメラーゼをコードする配列の
部分はまた、種々の種における他の熱安定性ポリメラー
ゼをコードする配列を回復するプローブとして有用であ
る。したがって、少なくとも4〜6つのアミノ酸をエン
コードするオリゴヌクレオチドのプローブを合成し、そ
して熱安定性ポリメラーゼをエンコードする追加の DNA
を探索するために使用することができる。
tima) の熱安定性 DNAポリメラーゼの遺伝子のヌクレオ
チド配列と他の種の対応する遺伝子との間に正確な合致
は存在しないであろうから、誤った陽性を排除するため
に十分なストリンジェンシーの条件下にハイブリダイゼ
ーションを得るために、ほぼ12〜18ヌクレオチドを含有
するオリゴマー(4〜6アミノ配列をコードする)が通
常必要である。6アミノ酸をコードする配列は、このよ
うなプローブのために十分な情報を供給する。このよう
なオリゴヌクレオチドのプローブを、本発明の縮重プラ
イマー法においてプライマーとして使用して、熱安定性
ポリメラーゼをコードする解読配列を得ることができ
る。
ーゼのためのコード配列およびアミノ酸配列を提供する
ことによって、他の熱安定性ポリメラーゼ酵素およびそ
れらの酵素のためのコード配列の単離を可能とする。 T
ma DNAポリメラーゼIタンパク質のアミノ酸配列は、 T
aqおよび Tthの熱安定性 DNAポリメラーゼのアミノ酸配
列に非常に類似する。これらの類似性は、 Tma DNAポリ
メラーゼのコード配列の同定および単離を促進した。こ
れらの3つの熱安定性 DNAポリメラーゼのコード配列に
おける類似領域は、配列を整列させることによって容易
に観察することができる。
ラーゼのコード配列の間の不一致の領域をプローブとし
て使用しても、熱安定性ポリメラーゼの酵素をコードす
る他の熱安定性ポリメラーゼのコード配列を同定するこ
とができる。例えば、 Taqのいくつかの性質およびTma
の他の多様な性質を有する熱安定性ポリメラーゼのコー
ド配列を、 Taqと Tmaとの間の非類似性の領域をコード
する配列に向けられたプローブを使用することによって
同定することができる。
列コーデネートにより同定される、次の任意の1または
2以上領域からの4またはそれ以上の隣接するアミノ酸
のストレッチを包含する(番号を包含する):5-10, 73
-79, 113-119, 134-145, 191-196, 328-340, 348-352,
382-387, 405-414, 467-470, 495-499, 506-512, 555-5
59, 579-584, 595-599, 650-655, 732-742, 820-825, 8
50-856。これらの領域は「ホールマークのモチーフ(ha
llmark motifs)」として考えられ、そして熱安定性 DNA
ポリメラーゼの機能(例えば、5′→3′エキソヌクレ
アーゼ活性、3′→5′エキソヌクレアーゼ活性、およ
び DNAポリメラーゼ活性)のために重要なアミノ酸のシ
グネチュアー(signature)配列の追加の領域を定める。
が、天然 Taq DNAポリメラーゼおよび天然 Tth DNAポリ
メラーゼにおいて欠如する1つの性質は、3′→5′エ
キソヌクレアーゼ活性である。この3′→5′エキソヌ
クレアーゼ活性は、一般に望ましいと考えられる。なぜ
なら、合成された核酸配列の誤って組み込まれたまたは
不一致の塩基がこの活性により排除されるからである。
したがって、3′→5′エキソヌクレアーゼ活性をもつ
ポリメラーゼ(例えば、 Tma DNAポリメラーゼ)を利用
する PCRの信頼性は増加する。
3′→5′エキソヌクレアーゼ活性はまた、 PCRにおけ
るプライマー/2量体複合体の形成の確率を減少する。
3′→5′エキソヌクレアーゼ活性は、事実、非鋳型依
存性の方式で結合されたヌクレオチドを除去することに
よって、非鋳型依存性の方式でのプライマーの3′末端
への余分のdNTPの結合を防止する。3′→5′エキソヌ
クレアーゼ活性は、一本鎖の DNA、例えば、プライマー
または一本鎖の鋳型を排除することができる。
の各ヌクレオチドは不一致として酵素により処理され、
したがって分解される。 PCRにおけるプライマーの分解
を回避するために、ホスホロチオエートをプライマーの
3′末端に付加することができる。ホスホロチオエート
で修飾されたヌクレオチドは3′→5′エキソヌクレア
ーゼによる除去に対していっそう抵抗性である。熱安定
性 DNAポリメラーゼにおける3′→5′エキソヌクレア
ーゼ活性のために重要なアミノ酸の「モチーフ」または
特徴ある「シグネチュア配列」は、3つの短いドメイン
からなるとして定義することができる。下において、こ
れらのドメインはA,BおよびCとして定義され、重要
なアミノ酸残基は1文字の略号で示されておりそして重
要でない残留は「x」として識別されている。
ノ酸である。領域Bと領域Cとの間の距離は67−75アミ
ノ酸、好ましくは約70アミノ酸である。 Tma DNAポリメ
ラーゼにおいて、重要なモチーフのシグネチュア配列を
定めないアミノ酸配列は、ドメインAにおいて、それぞ
れ、Lおよび TSS;ドメインBにおいて、それぞれ、LK
Fおよび YKV;およびドメインCにおいて SCEである。
いて、ドメインAは DLETSSLであり;ドメインBは NLK
FDYKVLであり;そしてドメインCは YSCEDである。こう
して、本発明は、ドメインA,BおよびCを含んでな
り、そして、さらに具体的には、D−X−E−X3 −L
−X55-65 −N−X8 −D−X3 −L−X85-76 −Y−
X3 −Dを含んでなる3′→5′エキソヌクレアーゼ活
性を有する熱安定性 DNAポリメラーゼを提供し、ここで
1文字の略号を使用し、そしてXN は特定したアミノ酸
の間の重要でないアミノ酸の番号(N)を表す。
ドメインは、 Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸 291− 4
84により表される。したがって、「ドメインのシャフリ
ング(domain shuffling) 」または「熱安定性キメラ D
NAポリメラーゼ」の構成を使用して、新規な性質を有す
る熱安定性 DNAポリメラーゼを得ることができる。例え
ば、コドン約 291−約 484を含んでなる Tma DNAポリメ
ラーゼのコード配列によりサーマス・アクアチクス(Th
ermus aquaticus ) DNAポリメラーゼのコドン 289−
422を置換すると、 Taq DNAポリメラーゼの5′→3′
エキソヌクレアーゼのドメイン(1−289)、 Tma DNAポ
リメラーゼの3′→5′エキソヌクレアーゼのドメイン
(291−481)、および Taq DNAポリメラーゼ(423−832)の
DNAポリメラーゼのドメイン(423−832)を含有する新規
な熱安定性 DNAポリメラーゼが生成するであろう。
3′エキソヌクレアーゼのドメインおよび3′→5′エ
キソヌクレアーゼのドメイン(約コドン1−484)を、 T
aq DNAポリメラーゼの DNAポリメラーゼの(dNTP結合性
およびプライマー/鋳型結合性ドメイン)部分(約 423
〜 832コドン)に融合することができる。ドナーおよび
レシピエントは Taqおよび Tma DNAポリメラーゼに限定
することは必要ではない。 Tth DNAポリメラーゼは Taq
DNAポリメラーゼと類似するドメインを提供する。さら
に、 Tth DNAポリメラーゼの増強した/好ましい逆転写
酵素の性質は、上に例示した3′→5′エキソヌクレア
ーゼのドメインを付加することによってさらに増強する
ことができる。
DNAポリメラーゼのコード配列(新規な性質を有する)
を発生することができるが、好ましい方法は「オーバー
ラップ」 PCRを使用する。この方法においては、意図す
る連結部配列を PCRプライマー(それらの5′−末端)
にデザインして入れる。個々のドメインの最初の増幅の
後、種々の生成物を希釈し(約 100〜1000倍)そして組
み合わせ、変性し、アニーリングし、伸長し、次いで最
終の前方プライマーのおよび逆プライマーをそれ以外は
標準の PCRのために添加する。
5′エキソヌクレアーゼをコードする配列を Tma DNAポ
リメラーゼから除去するか、あるいは組換え DNA法によ
りこの活性を欠如する他のポリメラーゼに付加すること
ができる。非熱安定性 DNAポリメラーゼにおいて、3′
→5′エキソヌクレアーゼ活性のドメインを Tmaポリメ
ラーゼの熱安定性3′→5′エキソヌクレアーゼのドメ
インで置換することさえ可能である。
3′→5′エキソヌクレアーゼ活性のドメインを使用し
て、 Tmaポリメラーゼ(または任意の他のポリメラー
ゼ)の3′→5′エキソヌクレアーゼのドメインを置換
して本発明の有用なポリメラーゼをつくることができ
る。当業者が認識するように、上記のキメラポリメラー
ゼは組換え DNA技術により最も容易に構成される。同様
なキメラポリメラーゼは1つの DNAポリメラーゼの5′
→3′エキソヌクレアーゼのドメインを他の DNAポリメ
ラーゼに移動させることによって構成することができ
る。
たはその酵素の誘導体または相同体を生産しようとする
かどうかにかかわらず、 Tmaポリメラーゼの組換え形の
生産は、典型的には、発現ベクターの構成、そのベクタ
ーによる宿主細胞の形質転換、および発現が起こる条件
下での形質転換された宿主細胞の培養を包含する。発現
ベクターを構成するために、成熟(ここで、すべてのキ
メラまたは変異タンパク質を包含するように使用する)
酵素あるいは活性を破壊しない追加の配列への、または
活性タンパク質を生成するコントロールされた条件(例
えば、ペプチダーゼによる処理)下に切断可能な追加の
配列への Tmaポリメラーゼの融合体をコードする DNAを
得る。
適当なコントロール配列と作用可能な連鎖で配置する。
ベクターは宿主細胞の中で自律的に複製するように、あ
るいは宿主細胞の染色体 DNAの中に組み込むように設計
することができる。このベクターを使用して適当な宿主
を形質転換し、そして形質転換された宿主を組換え Tma
ポリメラーゼの発現のために適当な条件下で培養する。
この Tmaポリメラーゼを培地または細胞から単離する
が、タンパク質の回収および精製はある場合において必
要でないことがある。
ことができる。例えば、所望のコード配列をゲノムの断
片から獲得し、そして適当な宿主において直接使用する
ことができる。種々の宿主において作用可能な発現ベク
ターの構成は、一般に後述するように、適当なレプリコ
ンおよびコントロール配列を使用して実施する。所望の
コード配列およびコントロール配列を含有する適当なベ
クターの構成は、この分野においてよく理解されている
標準的連結および制限技法を使用する。単離されたプラ
スミド、 DNA配列または合成されたオリゴヌクレオチド
を切断し、修飾し、そして所望の形態に再連結する。適
当な制限部位を、通常存在しない場合、下に例示するよ
うに、コード配列の末端に付加して発現ベクターの構成
を促進することができる。
野において理解されておりかつ商業的に入手可能な酵素
の製造業者により特定されている条件下に、適当な1種
または2種以上の制限酵素で処理することによって実施
する。例えば、ニュー・イングランド・バイオラブス
(New England Biolabs)の製品カタログを参照のこと。
一般に、約1μgのプラスミドまたは他の DNAを約20μ
lの緩衝液の中で1単位の酵素により切断する;下記の
実施例において、過剰の制限酵素を一般に使用して DNA
の完全な消化を保証する。
ーション時間が適当であるが、変更も許容されうる。各
インキュベーション後、タンパク質をフェノールまたは
クロロホルムを使用する抽出により取り除く;この抽出
に引き続いて、エーテルの抽出およびエタノール沈澱に
より水性分画からの DNAの回収を実施することができ
る。必要に応じて、切断された断片のサイズ分離を、標
準的技術を使用して、ポリアクリルアミドゲルまたはア
ガロースゲルの電気泳動により実施することができる。
例えば、Methods in Enzymology , 1980, 65:499 −56
0 を参照のこと。
つ制限切断された断片は、4種類のデオキシヌクレオシ
ド三リン酸(dNTP) の存在下に約15〜25分のインキュベ
ーション時間を使用して20℃〜25℃において、50mMのト
リスpH 7.6、50mMのNaCl、10mMの MgCl2、10mMの DTTお
よび5〜10μMのdNTPの中で、大腸菌(E. coli) DNA
ポリメラーゼI(クレノー)の大断片で処理することに
よって平滑末端化(二本鎖の末端)することができる。
決定される制限内で1のみのまたは選択されたdNTPを供
給することによって、選択的修復を実施することができ
る。クレノーによる処理後、この混合物をフェノール/
クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱させる。
同様な結果はS1ヌクレアーゼを使用して達成することが
できる。なぜなら、適当な条件下のS1ヌクレアーゼによ
る処理は核酸の一本鎖部分の加水分解を生ずるからであ
る。
ら、J.Am.Chem.Soc., 103 :3185-3191 のトリエステル
法、または自動化された合成法を使用して調製すること
ができる。アニーリングの前のまたは標識化のための一
本鎖のキナーゼ処理は、50mMのトリス(pH 7.6)、10mM
の MgCl2、5mMのジチオスレイトール(DTT)および1〜
2μMの ATPの存在下に 0.5μMの基質に対して過剰
の、例えば、ほぼ10単位のポリヌクレオチドキナーゼを
使用して達成される。キナーゼ処理がプライマーの標識
化のためである場合、 ATPは高い比活性のγ−32Pを含
有するであろう。
および温度で実施される:20mlのトリス−Cl(pH 7.5)
、10mMの MgCl2、10mMの DTT、33μg/mlの BSA、10m
M〜50mMのNaCl、および0℃において40mMの ATPおよび
0.01〜0.02(Weiss)単位の T4DNAリガーゼ(相補的一本
鎖の末端をもつ断片の結合のため)あるいは14℃におい
て1mMの ATPおよび 0.3〜 0.6単位の T4DNAリガーゼ
(「平滑末端」の結合のため)。相補的末端をもつ断片
の分子相互の結合は、通常、33〜 100μg/mlの合計 D
NA濃度(5〜 100nMの合計末端濃度)で実施する。分子
相互の平滑末端の結合(必要に応じて、20〜30倍のモル
過剰のリンカーを使用する)は1μMの合計末端濃度に
おいて実施する。
を細菌のまたは仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(BAP
またはCIAP)で処理して5′のホスフェートを除去し、
そしてベクターの再結合および再構成を防止する。 BAP
およびCIAPの消化条件はこの分野においてよく知られて
おり、そして発表されたプロトコルは通常商業的に入手
可能な BAPおよびCIAP酵素に伴う。核酸断片を回収する
ために、調製物をフェノール−クロロホルムで抽出し、
そしてエタノール沈澱させてAPを除去し、そして DNAを
精製する。あるいは、再結合は、所望のベクターとの結
合の前後に、不必要なベクターの制限酵素消化により防
止することができる。
ード配列の部分のために、種々の部位特異的プライマー
指令変異誘発法を利用することができる。ポリメラーゼ
連鎖反応(PCR)を使用して部位特異的変異誘発を実施す
ることができる。現在この分野において標準的である他
の技術において、所望の突然変異をコードする合成オリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、変異原プ
ライマーの伸長生産物の構成のための鋳型として働く一
本鎖ベクター、例えば、 pBS13+の相補的核酸配列の合
成を指令する。
し、そして形質転換された細菌の培養物をプレートし、
そして同定する。修飾されたベクターの同定は、ニトロ
セルロースのフィルターまたは他の膜への選択された形
質転換体の転移、および修飾された配列への正確な合致
を許すが、もとの鎖へのハイブリダイゼーションを防止
する温度においてキナーゼ処理した合成プライマーとハ
イブリダイズした「リフト(lifts)」を包含する。次い
で、プローブとハイブリダイゼーションする DNAを含有
する形質転換体を培養し、そして修飾された DNAの溜め
として使用する。
構成のために正しい連結は、大腸菌(E. coli) DG101
株または他の適当な宿主をまず連結混合物で形質転換す
ることによって確認される。適当な形質転換体を、この
分野において理解されているように、プラスミドの構成
のモードに依存して、アンピシリン、テトラサイクリン
または他の抗生物質耐性によるか、あるいは他のマーカ
ーを使用することによって選択する。
Clewellら、1969, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 62:115
9、の方法に従い、必要に応じてクロランフェニコール
増幅(Clewell, 1972, J.Bacteriol., 110: 667)後
に調製する。プラスミド DNAを得る他の方法は、ベセス
ダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesda Research La
boratoies)の刊行物の Focus, Vol.5, No.2 、のページ
11に「Base−Acid」として記載されており、そして非常
に純粋なプラスミド DNAはそのプロトコルの工程12〜17
を DNAのCsCl/臭化エチジウムの超遠心で置き換えるこ
とによって得ることができる。
分析し、そして/またはSangerら、1977, Proc. Natl.A
cad.Sci.USA,74:5463、さらに Messingら、1981,Nuc
l.Acids Res. , 9:309 、に記載されているジデオキ
シ法によるか、または Maxamら、1980, Methods in Enz
ymology, 65:499 の方法により配列決定する。コント
ロール配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子
の発現に使用する宿主細胞のタイプに依存する。一般
に、原核生物、酵母菌、昆虫、または哺乳動物の細胞を
宿主として使用する。原核生物の宿主は、一般に、組換
えタンパク質の生産に最も効率よくかつ便利であり、し
たがって Tmaポリメラーゼの発現のために好ましい。
に使用されている原核生物は大腸菌(E. coli) であ
る。クローニングおよび配列のために、および大部分の
細菌プロモーターのコントロール下の構成体の発現のた
めに、大腸菌(E. coli) ジェネティック・ストック・
センター(Genetic Stock Center) からGCSC#6135のも
とに入手可能な、大腸菌(E. coli) K12 MM294株を宿
主として使用することができる。
クターのために、大腸菌(E. coli)K12 菌株MC1000ラ
ムダ溶系株、N7N53CI857SusP80, ATCC39531 を使用する
ことができる。1987年4月7日にATCCに(ATCC53606)と
して受託された大腸菌(E. coli) DG116および1985年3
月29日にATCCに(ATCC53075)として受託された大腸菌
(E. coli) KB2もまた、有用な宿主である。M13 ファ
ージ組換え体のために、ファージに感染されやすい大腸
菌(E. coli) 菌株、例えば大腸菌(E. coli) K12菌
株DG98を使用する。DG98菌株は1984年7月13日にATCCに
(ATCC39768)として受託された。
換え発現のために、大腸菌(E. coli) 以外の微生物の
菌株、例えば、バチルス、例えば、枯草菌(Bacillus
subtilis) 、シュードモナス属(Pseudomonas ) の種々
の菌株、および他の細菌の菌株をまた使用することがで
きる。このような原核生物系において、典型的には、宿
主または宿主と適合性の種から誘導された複製起点およ
びコントロール配列を含有するプラスミドのベクターを
使用する。
は、 Bolivarら、1977、Gene, 2:95に記載されている
pBR322の誘導体を使用して形質転換される。プラスミド
pBR322はアンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性
のための遺伝子を含有する。これらの薬物耐性のマーカ
ーは、所望のベクターを構成するとき、保持または破壊
することができ、それゆえ所望の組換え体の存在の検出
を促進することができる。
配列、すなわち、リボソーム結合部位の配列と共に、必
要に応じてオペレーターを伴う、転写開始のためのプロ
モーターは次のものを包含する:β−ラクタマーゼ(ペ
ニシリナーゼ)およびラクトース(lac)プロモーター系
(Changら、1977, Nature, 198 :1056) 、トリプトファ
ン(trp)プロモーター系(Goeddelら、1980, Nucl.Acids
Res. , 8:4057) およびラムダ由来PL プロモーター
(Shimatakeら、1981, Nature, 292 :128)およびN−遺
伝子リボソーム結合部位(NRBS ) 。
ットは、米国特許第 4,711,845号(1987年12月8日発
行)に記載されている。このカセットは、NRBS 配列の
6bpの3′内で切断可能とする少なくとも1つの制限部
位を有する第3 DNA配列より上流に位置するNRBS に作
用可能に連鎖したPL プロモーターを含む。また、 Cha
ngら、欧州特許公開第196,864 号(1986年10月8日発
行)に記載されているホスファターゼA(phoA)は有用で
ある。しかしながら、原核生物と適合性の任意の入手可
能なプロモーター系を使用して、本発明の Tma発現ベク
ターを構成することができる。
流のリボソーム結合部位の効率にマイナスに影響を与
え、低いレベルの翻訳されたポリメラーゼを生ずること
ができる。 Tma遺伝子の翻訳は、発現ベクターの「翻訳
的にカップリングされた」誘導体の構成により増強する
ことができる。短いコード配列のための停止コドンが T
ma遺伝子コード配列のための ATG開始コドンと「カップ
リング」するように、 Tma遺伝子のコード配列からちょ
うど上流に第2翻訳開始シグナルおよび短いコード配列
をもつ発現ベクターを構成することができる。
グナルを、 Tma遺伝子の開始コドンの上流に挿入するこ
とができる。例えば、1つの発現系は、TrpEの最後の6
コドンにイン−フレームで融合されたT7バクテリオフ
ァージの主要キャプシドタンパク質(遺伝子10)の最初
の10コドンおよび翻訳開始シグナルを利用することがで
きる。TrpEのための TGA(停止)コドンを、 Tma遺伝子
のコード配列のためのATG(開始)コドンと「カップリ
ング」させて、 TGATGを形成する。短いコード配列の翻
訳と Tmaのコード配列の翻訳との間に、1塩基のフレー
ム−シフトが要求される。これらの誘導体の発現ベクタ
ーは組換え DNA法により構成することができる。
関係づけることができる。典型的には、同一のアミノ酸
をコードする多数のコドンが存在するとき、可能なコド
ンの1つが生物体において優先的に使用される。しばし
ば生物体は稀に使用されるコドンに相当するものより高
いレベルで好ましいコドンに相当するtRNA種を蓄積す
る。コドン使用のパターンがサーモトガ・マリチマ(Th
ermotoga maritima) と宿主細胞との間で異る場合、 T
maポリメラーゼの遺伝子の翻訳に必要なtRNA種は豊富で
ない場合がある。
「 AGA」コドンにより最も頻繁にコードされるが、この
コドンは大腸菌(E. coli) の遺伝子において低い頻度
で使用され、そして対応するtRNAは大腸菌(E. coli)
宿主細胞において低い濃度で存在する。結局、「 AGA」
コドンのための「ArgU」tRNAの大腸菌(E. coli) 宿主
細胞における低い濃度は、大腸菌(E. coli) 宿主細胞
における Tmaポリメラーゼ遺伝子の RNAの翻訳効率を制
限することがある。大腸菌(E. coli) 宿主細胞内の T
maのコード配列の翻訳効率は、このtRNA遺伝子の多数の
コピーを宿主細胞の中で発現させることによって、この
ArgtRNAの濃度を増加することによって改良することが
できる。
母菌もまた組換え宿主細胞として使用することができ
る。サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces
cerevisiae)の実験室株のパン酵母は最も頻繁に使用さ
れるが、他の多くの菌株が普通に入手可能である。2ミ
クロン複製起点を使用するベクターが普通である(Broac
h, 1983, Methods Enzymol., 101 :307)が、酵母菌の
発現に適当な他のプラスミドベクターが既知である(参
照、Stinchcombら、1979, Nature, 282 :39; Tchempe
ら、1980, Gene, 10:157;およびClarkcら、1983, Meth
ods Enzymol., 101 :300)。酵母ベクターのためのコン
トロール配列は、解糖系酵素の合成のためのプロモータ
ーを包含する(Hess ら、1968, J.Adv.Enzyme Reg. ,
7:149; Hollandら、1978, Biotechnology , 17:490
0;およびHolland ら、1981, J.Biol.Chem., 256: 138
5)。
モーターは、次のものを包含する:3−ホスホグリセレ
ートキナーゼのためのプロモーター(Htzcmanら、1980,
J.Biol.Chem., 255 :2073) および他解糖系酵素、例え
ば、グリセルアルデヒド3−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ、ヘキドキナーゼ、ピルベートデカルボキシラー
ゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−ホスフ
ェートイソメラーゼ、3−ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリセホスフェートイソメラ
ーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキ
ナーゼのためのプロモーター。増殖条件によりコントロ
ールされる転写の追加の利点を有する他のプロモーター
は、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソサイトクロム
C、酸性ホスフェターゼ、窒素の代謝に関連する分解系
酵素、並びにマルトースおよびガラクトースの利用に関
係する酵素のためのプロモーターである。
ーミネーター配列もまた使用して発現を増大することが
できる。このようなターミネーターは、酵母誘導遺伝子
の中でコード配列の後の3′非翻訳領域において見いだ
される。酵母と適合性のプロモーター、複製起点、およ
び他の調節配列を含有する任意のベクターは、酵母菌の
Tmaの発現ベクターを構成するときの使用に適する。Tm
a遺伝子はまた、多細胞の生物体から誘導された真核生
物の宿主細胞の培養物の中で発現させることができる。
例えば、Tissure Culture , Academic Press, Cruzおよ
び Patterson編(1973)参照のこと。通常な宿主細胞系
は、 COS-7,COS-A2, CV-1、ネズミの細胞、例えば、ネ
ズミの骨髄腫 N51およびVERO, Hela細胞、およびチャイ
ニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を包含する。
常、次のものを包含する:哺乳動物細胞と適合するプロ
モーターおよびコントロール配列、例えば、シミアンウ
イルス40(SV40) からの普通に使用される前期および後
期プロモーター(Fiersら、1978, Nature, 273 :133)、
または他のウイルスのプロモーター、例えば、ポリオー
マ、アデノウイルス2、ウシ乳頭腫ウイルス(BPV)、ま
たは鳥類の肉腫ウイルスから誘導されたプロモーター、
または免疫グロブリンのプロモーターおよびヒートショ
ックプロモーター。
用して DNAを発現するための系は、米国特許第 4,419,4
46号に開示されている。この系の変更は米国特許第 4,6
01,978号に記載されている。哺乳動物細胞の一般的面
は、Axel、米国特許第 4,399,216号に記載されている。
「エンハンサー」領域もまた、発現を最適化するために
重要である;これらは、一般に、プロモーター領域の上
流に見いだされる配列である。複製起点は、必要に応じ
て、ウイルス源から得ることができる。しかしながら、
染色体の中への組み込みは真核生物における DNAの複製
のための普通のメカニズムである。
ができ、そして植物の細胞と適合するコントロール配
列、例えば、ノパリンシンサーゼプロモーターおよびポ
リアデニル化シグナル配列、(Depickerら、1982, J.Mo
l.Appl.Genet. , 1:561)が入手可能である。バキュロ
ウイルスベクターにより提供される制御系を利用する昆
虫を使用する発現系もまた、記載されている(Miller
ら、1986, Genetic Engeneering (Setlowら、編、Plen
um Publishing)8: 277−297)。昆虫に基づく発現はス
ポドプテラ・フルギペイダ(Spodoptera frugipeida)
において達成することができる。これらの系を使用して
も組み換え Tmaポリメラーゼを生産することができる。
な細胞に適当な標準的技術を使用して実施される。Cohe
n, 1972, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 69:2110に記載さ
れているような、塩化カルシウムを使用するカルシウム
処理は原核生物または実質的な細胞壁のバリヤーを含有
する他の細胞のために使用される。アグロバクテリウム
・ツムファシエンス(Agrobacterium tumfaciens) に
よる感染(Shawら、1983, Gene, 23:315)は、ある種の
植物細胞について使用される。哺乳動物細胞について、
Grahamおよびvan der Eb, 1978, Virology, 52:546 の
リン酸カルシウム沈澱方法が好ましい。酵母の中への形
質転換は、Van Solingenら、1977, J.Bacteriol., 130
:946 および Hasioら、1979, Proc.Natl.Acad.Sci.US
A, 76:3829の方法に従い実施される。
細胞の中で発現されると、タンパク質の精製が望ましい
ことがある。種々の精製手順を使用して本発明の組み換
え熱安定性ポリメラーゼを精製することができるが、よ
り少ない工程を使用して等しい純度の発現調製物を製造
する必要があろう。大腸菌(E. coli) 宿主のタンパク
質は感熱性であるので、組換え熱安定性 Tma DNAポリメ
ラーゼを粗製のリゼイトを加熱不活性化することによっ
て実質的に濃縮することができる。
メラーゼの解離を確実にしかつ TmaDNAポリメラーゼと
他の細胞リゼイトのタンパク質とのイオンの相互作用を
減少するために十分な量の塩(典型的には0.03Mの硫酸
アンモニウム)の存在下に実施する。さらに、 0.3Mの
硫酸アンモニウムの存在はフェニルセファローズカラム
との疎水性相互作用を促進する。疎水性相互作用のクロ
マトグラフィーは分離技術であり、ここで物質は疎水性
基を含有する非帯電ベッド材料との疎水性相互作用の異
なる強さに基づいて分離される。典型的には、カラムを
まず疎水性結合に好適な条件、例えば、高イオン強度の
下で平衡化する。その時、下降する塩の勾配を使用して
試料を溶出することができる。
ma DNAポリメラーゼを含有する)を、比較的強い疎水性
ゲル、例えば、フェニルセファローズ(Pharmacia製)ま
たはフェニル(Phenyl) TSK(東洋ソーダ製)を含有する
カラムに負荷する。フェニルセファローズのカラムとの
相互作用を促進するために、例えば、 0.3Mより高い
か、あるいは低い、好ましい 0.3Mの硫酸アンモニウ
ム、あるいは 0.5Mの高いか、あるいは低いNaClを含有
する溶媒を使用する。カラムおよび試料を、また、0.5m
Mの DTTを含有する50mMのトリス(pH 7.5) および 1.0m
MのEDTA(「TE」)緩衝液中の 0.3M硫酸アンモニウム
に調節し、そして試料をカラムに適用する。
衝液で洗浄する。次いで、酵素を疎水性相互作用を弱く
する溶媒、例えば、減少する塩の勾配、エチレンまたは
プロピレングリコール、または尿素で溶離することがで
きる。天然 Tma DNAポリメラーゼについて、好ましい態
様はTE-DTT中の2Mの尿素および20%のエチレングリコ
ールでカラムを洗浄することを包含する。長期間の安定
性のために、 Tma DNAポリメラーゼ酵素を1種または2
種以上の非イオン性ポリマー洗剤を含有する緩衝液の中
に貯蔵することができる。このような洗剤は、一般に、
ほぼ 100〜250,000 ダルトン、好ましくは約 4,000〜 2
00,000ダルトンの範囲の分子量を有し、そして酵素を約
3.5〜約 9.5、好ましくは約4〜 8.5のpHにおいて安定
化するものである。
れているものを包含する:McCutchconのEmulsifiers &
Detergents, North American編:1983), MC Publishing
Co.のMcCutcheon Divison発行、米国ニュージャージイ
州グレンロック、ロックロード175 、の 295〜 298ペー
ジおよび同時継続出願第 387,003号、1989年7月28日提
出、その開示をここに引用によって加える。
ルコールエーテルおよびラウリルエーテル、エトキシル
化アルキルフェノール、オクチルフェノキシポリエトキ
シエタノール化合物、変性オキシエトキシル化および/
またはオキシプロピル化直鎖状アルコール、ポリエチレ
ングリコールモノオレエート化合物、ポリソルベート化
合物、およびフェノール系脂肪族アルコールエーテルか
ら成る群より選択される。ツイーン20、ポリオキシエチ
ル化(20)ソルビタンモノラウレート(ICI Americas I
nc. 、デラウェア州ウィルミントン)およびIconol NP-
40、エトキシル化アルキルフェノール(ノニル)(BASF
Wyandotte Corp. 、ニュージャージイ州パルシパニイ
製)は、さらに一層好ましい。
が必要であるか、あるいは望ましい、任意の目的に使用
することができる。とくに好ましい態様において、酵素
は PCRとして知られている核酸増幅反応を触媒する。こ
の核酸配列を増幅する方法は、米国特許第 4,683,202号
および米国特許第 4,865,188号(それらの各々をここに
引用によって加える)に開示および特許請求されてい
る。 PCR核酸増幅法は、核酸または核酸の混合物の中に
含有されている少なくとも1つの特定の核酸配列を増幅
することを包含し、そして最も普通の態様において、二
本鎖 DNAを生成する。
ロトコルは増幅すべき特定の配列が二本鎖の核酸の中に
含有されていると仮定する。しかしながら、この方法は
一本鎖の核酸、例えば、mRNAの増幅においても同様に有
用であるが、好ましい実施態様において究極の生成物は
なお二本鎖 DNAである。一本鎖の核酸の増幅において、
第1工程は相補的鎖の合成(2つの増幅プライマーの1
つをこの目的に使用することができる)を包含し、そし
て連続する工程は下に記載する二本鎖の増幅法における
ように進行する。
および増幅されるべき各特定の配列のための2つのオリ
ゴヌクレオチドのプライマーと接触させ、ここで各プラ
イマーを、特定の配列の異なる鎖に対して相補的であり
1つのプライマーから合成された伸長生成物がその相補
的体から分離されたとき、他のプライマーの伸長生成物
の合成のための鋳型として働くように選択し、前記接触
を各プライマーが相補的核酸鎖に対してハイブリダイゼ
ーションすることができるような温度において実施し、
たはその後に、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga ma
ritima) からの DNAポリメラーゼと接触させ、前記 DNA
ポリメラーゼはヌクレオシド三リン酸を結合させて特定
の核酸配列の各鎖に対して相補的であるプライマー伸長
生成物を形成することができるものであり、(c)工程
(b)からの混合物を、酵素の活性を促進しかつ、増幅
される各異なる配列について、各核酸鎖の鋳型に対して
相補的である各プライマーの伸長生成物を合成するため
に有効であるが、各伸長生成物を相補的鎖の鋳型から分
離するほど高くない温度において有効な時間の間維持
し、
マー伸長生成物をそれらがその上で合成されて一本鎖の
分子を生成する鋳型から分離するために有効であるが、
酵素を不可逆的に変性するほど高くない温度に有効な時
間の間加熱し、(e)工程(d)からの混合物を、工程
(d)において生成された一本鎖の分子の各々へのプラ
イマーのハイブリダイゼーションを促進するために有効
な温度に有効な時間の間冷却し、そして
活性を促進しかつ、増幅される各異なる配列について、
工程(d)において生成された各核酸鎖の鋳型に対して
相補的である各プライマーの伸長生成物を合成するため
に有効であるが、各伸長生成物を相補的鎖の鋳型から分
離するほど高くない温度に有効な時間の間維持する、こ
とを含んでなる。工程(e)および(f)における有効
な時間および温度を一致させて、工程(e)および
(f)を同時に実施できるようにすることができる。工
程(d)〜(f)は、所望のレベルの増幅が得られるま
で、反復する。
を大量に生産するために有用であるばかりでなく、かつ
また存在することが知られているが、完全には特定され
ていない核酸配列を生産するために有用である。配列の
両端における十分な数の塩基を十分に詳細に知り、こう
して配列に沿った相対的位置における所望の配列の異な
る鎖にハイブリダイゼーションする2つのオリゴヌクレ
オチドのプライマーを調製できるようにし、こうして一
方のプライマーから合成された伸長生成物が、鋳型(相
補的)から分離されたとき、定義された長さの核酸配列
への他方のプライマーの伸長のための鋳型として働くこ
とができるようにする。配列の両端における塩基につい
ての知識が深くなればなるほど、標的核酸配列に対する
プライマーの特異性およびこの方法の効率をより大きく
することができる。
の初期のコピーは入手可能でなくてはならないが、配列
は純粋である必要はなく、あるいは個別の分子である必
要はない。一般に、増幅方法は連鎖反応を包含し、この
連鎖反応は、(a)要求される配列の末端が十分に詳細
に知られていて、それらにハイブリダイゼーションする
オリゴヌクレオチドを合成することができ、且つ(b)
連鎖反応を開始するために少量の配列が入手可能である
と、関係する反応工程の数に関して指数的な量で、少な
くとも1つの特定の核酸配列を生産する。連鎖反応の生
産物は、使用された特定のプライマーの5′末端に対応
する末端をもつ個別の核酸二重鎖であろう。
されない形態で出発核酸として利用することができる
が、ただしそれは増幅しようとする特定の核酸配列を含
有するか、あるいは含有すると思われるものであること
を条件とする。増幅すべき核酸は、任意の源、例えば、
プラスミド、例えば、pBR322から、クローニングした D
NAまたは RNAから、あるいは、細菌、酵母菌、ウイル
ス、細胞小器官、および高等生物、例えば、植物および
動物を包含する任意の源からの天然 DNAまたは RNAから
得ることができる。
ば、絨毛膜の絨毛、または羊膜細胞から種々の技術によ
り抽出することができる。例えば、Maniatisら、前掲、
pp.280−281 を参照のこと。この方法は、例えば、メッ
センジャー RNAを包含する DNAまたは RNAを使用するこ
とができ、前記 DNAまたは RNAは一本鎖または二本鎖で
あることができる。さらに、各々の1つの鎖を含有する
DNA− RNAハイブリッドを利用することができる。
することができ、また前の増幅反応から核酸を生成する
ことができる(同一であるか、あるいは異なるプライマ
ーを使用する)。増幅すべき特定の核酸配列は大きい分
子の一部分のみであるか、あるいは特定の配列が全体の
核酸を構成するように、個別の分子として最初から存在
することができる。
することは必要ではない;配列は複雑な混合物の小さい
部分、例えば、全ヒト DNAの中に含有されるβ−グロブ
リン遺伝子の一部分(Saikiら、1985, Science,230 :15
30−1534において例示されているように)または特定の
微生物のために核酸配列の一部分(この生物体は特定の
生物学的試料の非常に小さい部分のみを構成するであろ
う)であることができる。
こるまで(一般に1〜15分)低張緩衝液の中の懸濁およ
び約90℃〜 100℃の熱処理後、細胞を増幅法において直
接使用することができる。加熱工程後、増幅試薬を溶解
した細胞に直接添加することができる。出発核酸配列は
1より多い所望の核酸配列を含有することができる。増
幅方法は大量の1つの特定の核酸配列の生産のためにば
かりでなく、かつまた同一であるか、あるいは異なる核
酸分子上に位置する1より多い異なる特定の核酸配列を
同時に増幅するために有用である。
演ずる。語「プライマー」は、増幅法の説明において使
用するとき、とくに増幅すべき断片の末端の1または2
以上の配列に関する情報が多少不明瞭である場合、ある
いは本発明の縮重プライマー法を使用する場合、1より
多いプライマーを意味する。例えば、核酸配列をタンパ
ク質配列の情報から推理される場合、遺伝コードの縮重
性に基づいてすべての可能なコドンの多様性を表す配列
を含有する1集団のプライマーを各鎖のために使用す
る。この集団からの1つのポリメラーゼは、増幅すべき
所望の配列の末端と十分に相同性であって、増幅のため
に有用であろう。
ライマーを利用するかぎり、1より多い特定の核酸配列
を最初の核酸または核酸の混合物から増幅することがで
きる。例えば、2つの異なる特定の核酸配列を生成しよ
うとするとき、4つのプライマーを利用する。プライマ
ーのうちの2つは特定の核酸配列の1つに対して特異的
であり、そして他の2つのプライマーは第2の特定の核
酸配列に対して特異的である。このようにして、2つの
異なる特定の配列の各々を本発明の方法により指数的に
生産することができる。
大きい特異性をえるための所定の増幅サイクル後、少な
くとも1つの増幅サイクル後、増幅すべき配列の内部の
配列(すなわち、末端上に存在しない配列)に対して相
補的であるプライマーの組を添加することにより増幅す
ることができる。このようなプライマーは任意の段階に
おいて添加することができ、そしてより短い増幅された
断片を与えるであろう。あるいは、より長い断片は、非
相補性の末端をもつが増幅において前に利用したプライ
マーと多少のオーバーラップを有するプライマーを使用
することによって調製することができる。
然変異誘発のために使用するとき、主要な役割を演ず
る。使用するプライマーがもとの鋳型に正確に相補的で
ない、増幅反応の生産物は、鋳型よりむしろプライマー
の配列を含有し、それゆえin vitroの突然変異を導入す
るであろう。それ以上のサイクルにおいて、それ以上の
誤対合のプライミングが要求されないので、突然変異は
減少しない効率で増幅されるであろう。
る方法を、異なるプライマーを使用して、変更された D
NAについて反復して、それ以上の配列の変化を導入する
ことができるであろう。このようにして、1系列の突然
変異した配列を徐々に生成することができ、ここでその
系列への各新しい付加は最後のものと小さい程度に異な
るが、もとの DNA源の配列と非常に大きく異なる。
補的配列を含有できるので、プライマーの十分な量が増
幅すべき鎖に対して相補的である配列を含有するかぎ
り、多数の他の利点を実現することができる。例えば、
鋳型の配列に対して相補的でないヌクレオチド配列(例
えば、プライマー、リンカー、コード配列など)をプラ
イマーの1つまたは両方の5′末端に取り付けることが
でき、それゆえ増幅法の生成物に付加することができ
る。伸長プライマーを添加した後、十分なサイクルを実
施して、非相補的ヌクレオチドのインサートを含有する
所望の量の新しい鋳型を得る。これにより、簡単な技術
を使用して比較的短い時間(例えば、2時間以内に)
で、大量の組み合わされた断片を生産することができ
る。
の適当な方法、例えば、前述のホスホトリエステルまた
はホスホジエステルの方法、またはそれらの自動化され
た態様を使用して調製することができる。1つのこのよ
うな自動化された態様において、ジエチルホスホルアミ
ダイトを出発物質として使用し、そしてBeaucageら、19
81, Tctrahedron Letters , 22:1859−1862、に記載
されているようにして合成することができる。固体支持
体上でオリゴヌクレオチドを合成する1つの方法は、米
国特許第 4,458,066号に記載されている。また、生物学
的源(例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物)から単
離されたプライマーを使用することができる。
も、反応混合物は PCRが起こすための鋳型を含有しなく
てはならない。なぜなら、特定の核酸配列は鋳型として
その配列を含有する核酸を使用して生成されるからであ
る。第1工程は、増幅または検出されるべき各特定の核
酸配列について、各核酸鎖を4つの異なるヌクレオシド
三リン酸および2つのオリゴヌクレオチドのプライマー
と接触することを包含する。
合、ヌクレオシド三リン酸は通常dATP, dCTP, dGTPおよ
びdTTPであるが、種々のヌクレオチドの誘導体もまたこ
の方法において使用することができる。ヌクレオシド三
リン酸の濃度は広く変化することができる。典型的に
は、濃度は増幅のための緩衝液の中で各dNTPにおいて50
〜 200μMであり、そして MgCl2は緩衝液の中に1〜3
mMの量で存在して、ポリメラーゼを活性化しかつこの反
応の特異性を増加する。しかしながら、1〜20μMのdN
TPの濃度がいくつかの応用、例えば、 DNAの配列決定ま
たは高い比活性の放射線標識したプローブの発生のため
に好ましいことがある。
成物である追加の核酸鎖の合成のための鋳型として働
く。この合成は任意の適当な方法を使用して実施できる
が、一般に緩衝化された溶液の中で、好ましくはpH7〜
9において、最も好ましくはpH約8において起こる。合
成を促進するために、モル過剰の2つのオリゴヌクレオ
チドプライマーを鋳型鎖を含有する緩衝液に添加する。
実際には、増幅すべき配列は複雑な長鎖核酸鎖の混合物
の中に含有される場合、プライマーの添加量は相補的鎖
(鋳型)の量を越えたモル過剰である。大モル過剰がこ
の方法の効率を改良するために好ましい。したがって、
少なくとも 100:1またはそれ以上のプライマー:鋳型
の比を一般にクローニングされた DNAの鋳型について使
用し、そして約108 :1またはそれ以上のプライマー:
鋳型の比を一般に複雑なゲノムの混合物について使用す
る。
シド三リン酸の混合物を、増幅または検出されるべき核
酸が一本鎖または二本鎖であるかどうかに従い、処理す
る。核酸が一本鎖である場合、第1伸長サイクルの前に
変性工程は不必要であり、そして反応混合物をプライマ
ーのその相補的標的(鋳型)配列へのハイブリダイゼー
ションを促進する温度に保持する。
一般に数秒〜5分、好ましくは30秒〜1分について、約
35℃〜65℃またはそれ以上、好ましくは約37℃〜60℃で
ある。35℃〜70℃のハイブリダイゼーション温度を Tma
DNAポリメラーゼについて使用することができる。長さ
が15ヌクレオチドまたはそれより長いプライマーを使用
して、プライマーのハイブリダイゼーションの特異性を
増加する。より短いプライマーはより低いハイブリダイ
ゼーション温度を必要とする。
な緩衝液、dNTPおよび1または2以上のオリゴヌクレオ
チドのプライマーの存在下に Tma DNAポリメラーゼを添
加することによって合成することができる。適当な単一
のプライマーを添加する場合、プライマー伸長生成物は
一本鎖核酸に対して相補的であり、そして等しいか、あ
るいは等しくない長さ(プライマーが鋳型にハイブリダ
イゼーションするかどうかに依存する)の鎖の二重鎖と
なって核酸鎖とハイブリダイゼーションし、次いでこれ
を前述したように一本鎖に分離して、2つの単一の、分
離された、相補的な鎖を生産することができる。
プライマーの伸長の引き続くサイクルを鋳型としてもと
の一本鎖の核酸および第1プライマーの伸長生成物の両
者を使用して実施する。あるいは、2またはそれ以上の
適当なプライマー(それらの1つは他の伸長生成物を鋳
型として使用して合成をプライミングするであろう)を
一本鎖の核酸に添加し、そして反応を実施することがで
きる。
クルの増幅の場合におけるように、核酸が2つの鎖を含
有する場合、プライマーのハイブリダイゼーションの前
に、核酸の鎖を分離しなくてはならない。この鎖の分離
は、物理的、化学的または酵素的手段を包含する、任意
の適当な変性法により達成することができる。核酸の鎖
を分離する1つの好ましい物理的方法は、核酸を完全な
(>99%)変性が起こるまで加熱することを包含する。
きさに依存して、一般に約数秒〜数分の範囲の時間の
間、約80℃〜 105℃の温度を用いる。好ましくは、有効
な変性温度は数秒〜1分間について90℃〜 100℃であ
る。鎖の分離はまた、ヘリカーゼ(Helicases)として知
られている酵素または酵素RccA(これらはヘリカーゼの
活性を有しそして riboATPの存在下に DNAを変性するこ
とが知られている)のクラスからの酵素により誘発する
ことができる。
適当な反応条件はKuhn Hoffmann-Berling, 1978,CSH-Qu
natitative Biology, 43:63に記載されており、そして
RecAを使用する技術はRadding, 1982,Annu.Rev.Genet.
, 16:405-437 において概観されている。この変性は
等しいか、あるいは等しくない長さの2つの分離された
鎖を生成する。
応混合物を各プライマーの相補的標的(鋳型)配列への
ハイブリダイゼーションを促進する温度に冷却する。こ
の温度は、試薬に依存して、通常約25℃〜65℃、好まし
くは37℃〜60℃である。ハイブリダイゼーション温度は
有効な時間、一般に数秒〜数分、好ましくは10秒〜1分
の間維持される。実際には、温度は単に約95℃から37℃
程度に低く低下させ、そしてハイブリダイゼーションは
この範囲内の温度において起こる。
にかかわらず、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga ma
ritima) からの DNAポリメラーゼを、変性の前にまたは
その間に、あるいは温度がハイブリダイゼーションを促
進する範囲に低下しつつあるとき、あるいはその範囲に
あるとき、添加することができる。 Tmaポリメラーゼの
熱安定性は任意の時間における Tmaポリメラーゼの反応
混合物への添加を可能とするが、混合物がストリンジェ
ントのハイブリダイゼーション温度以下に冷却されない
時点において、ポリメラーゼを反応混合物に添加するこ
とによって、非特異的増幅を実質的に阻止することがで
きる。
促進されまたは最適化される温度、すなわち、ハイブリ
ダイズしたプライマーおよび鋳型からのプライマー伸長
生成物の合成を促進するにあたり酵素の活性を増加する
ために十分な温度に、反応混合物を加熱するか、あるい
は維持する。温度は、実際に、各核酸の鋳型に対して相
補的である各プライマーの伸長生成物を合成するために
十分であるが、その相補的鋳型からの各伸長生成物を変
性するほど高くあってはならない(すなわち、温度は一
般に約80℃〜90℃以下である)。
て、この合成反応に有効な典型的な温度は一般に約40℃
〜80℃、好ましくは50℃〜75℃の範囲である。サーモト
ガ・マリチマ(Thermotoga maritima) の DNAポリメラ
ーゼについて、温度はより好ましくは約65℃〜75℃の範
囲である。この合成に要求される時間は、温度、核酸の
長さ、酵素、および核酸混合物の複雑さに依存して、約
10秒〜数分またはそれ以上の範囲であることができる。
伸長時間は、通常、約30秒〜数分である。核酸がより大
きい場合、より長い時間が相補的鎖の合成に要求され
る。
は、増幅法の次の工程において使用される二本鎖の分子
を形成する。次の工程において、二本鎖の分子の鎖は加
熱変性により分離され、この加熱変性はその分子を変性
するために有効な温度および時間の間実施されるが、熱
安定性酵素が完全にかつ不可逆的に変性または不活性化
される温度ではなくかつそれほど時間は長くてはならな
い。この鋳型の変性後、温度は、前述したように、前の
工程から生成した相補的一本鎖の核酸(鋳型)へのプラ
イマーのハイブリダイゼーションを促進するレベルに低
下させる。
いはハイブリダイゼーション工程と同時に、温度は、熱
安定性酵素の活性を促進して、新しく合成された鎖およ
びもとの鎖の両者を鋳型として使用するプライマー伸長
生成物の合成を可能とするために有効な温度に調節され
る。温度はやはり前述したように、伸長生成物をその鋳
型から分離(変性)するほど高くあってはならない。ハ
イブリダイゼーションはこの工程において起こることが
できるので、変性後の冷却の前の工程は不必要である。
このような場合において、同時の工程を使用して、好ま
しい温度範囲は50℃〜70℃である。
び伸長生成物の合成の1サイクルに関係する加熱および
冷却の工程を、所望の量の特定の核酸配列を生成するた
めに必要な回数だけ反復することができる。唯一の制限
は存在するプライマー、熱安定性酵素およびヌクレオシ
ド三リン酸の量である。通常、15〜30サイクルが完了す
る。増幅された DNAの診断的検出について、サイクルの
数は試料の性質および試料の中標的の濃度に依存するで
あろう。例えば、増幅される試料が純粋である場合、よ
り少ないサイクルが要求される。
り多いサイクルが検出のために十分なシグナルを増幅す
るために要求されるであろう。一般の増幅および検出の
ために、この方法は約15回反復される。増幅を使用し
て、標識された配列特異的プローブで検出すべき配列を
発生するとき、およびヒトゲノム DNAが増幅の標的であ
るとき、明瞭に検出可能なシグナルを生成するために、
すなわち、バックグラウンドのノイズが検出を妨害しな
いようにするために十分に配列を増幅するためには、こ
の方法を15〜30回反復する。
が変性されるかあるいは不可逆的に不活性化されないこ
とを条件して、追加のヌクレオシド、プライマー、また
は熱安定性酵素は初期の添加後に不必要であるが、その
ようになった場合において、追加のポリメラーゼまたは
他の試薬を反応を続けるために添加しなくてはならない
であろう。しかしながら、各工程におけるこのような物
質の添加は反応に悪影響を及ぼさないであろう。適当な
数のサイクルを完結して、所望の量の特定の核酸配列を
生成した後、通常の方法で、例えば、EDTA、フェノー
ル、 SDS、またはCHCl3を添加して酵素を不活性化する
か、あるいは反応の成分を分離することによって、反応
を停止させることができる。
る。自動化された方法の1つの態様において、温度があ
る時間の間あるレベルでコントロールされるように、反
応混合物を温度サイクルすることができる。この目的の
ための1つのこのような機器は、パーキン−エルマー・
セツス・インスツルメンツ(Perkin-Elmer Cetus Instr
uments) により開発されかつ市販されている、増幅反応
を取り扱うための自動化された機械である。この計器を
使用して PCRを実施するための詳細なインストラクショ
ンは、この機器の購入するとき入手可能である。
鎖反応による核酸配列の増幅が有用である多様な方法に
おいて非常に有用である。増幅方法を米国特許第 4,80
0,159号に記載するように利用して、適当な発現ベクタ
ー中への挿入のための特定の核酸配列をクローニングす
ることができる。このベクターを使用して、組み換え D
NA技術の標準的方法により、適当な宿主生物体を形質転
換して遺伝子生産物を生成することができる。このよう
なクローニングは、平滑末端の結合を使用するベクター
の中への直接の結合、または制限酵素を使用するプライ
マー内に含有された部位における切断を包含することが
できる。
国特許第 4,683,195号および米国特許第 4,683,202号並
びに欧州特許公開第 229,701号;欧州特許公開第 237,3
62号;および欧州特許公開第 258,017号(これらの開示
をここに引用によって加える)に記載されているものを
包含する。さらに、本発明の酵素は非対称の PCR(参
照、GyllenstenおよびErlich, 1988, Proc.Natl.Acad.S
ci.USA, 85:7652−7656、その開示をここに引用によっ
て加える):逆 PCR(Ochmanら、1988, Gentics, 120
:621 、その開示をここに引用によって加える)にお
いて;および DNAの配列決定(参照、 Innisら、1988,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85:9436−9440、およびMcCo
nlogueら、1988, Nuc.Acids Res., 16(20):9869) のた
めに有用である。
を有すると信じられる; PCT特許公開第91/09944 号、
1991年7月11日公開を参照のこと、その開示をここに引
用によって加える。Tma DNAポリメラーゼの逆転写酵素
活性は、 RNAを転写および増幅する方法におけるこの酵
素の使用を可能とする。このような方法の改良は単一の
酵素の使用にあるが、従来の方法は1より多い酵素を必
要とした。
と適当なプライマーとを、該プライマーが対応する RNA
鋳型にアニーリングする条件下に組み合わせ;そして
(b)アニーリングされたプライマー− RNA鋳型の混合
物を Tma DNAポリメラーゼと、その DNAポリメラーゼが
デオキシヌクレオシド三リン酸の重合を触媒して RNA鋳
型の配列に対して相補的な DNA配列を形成するために十
分な条件下に、インキュベーションすることによって、
RNAを逆転写する、ことを含んでなる。
アニーリングするプライマーはまた、 PCRによる増幅の
ために適当であることがある。 PCRにおいて、逆転写さ
れたcDNA鎖に対して相補的である第2プライマーは伸長
生成物の合成の開始部位を提供する。既に述べたよう
に、 Tma DNAポリメラーゼはcDNA鋳型上のこの伸長反応
を触媒することができる。Tma DNAポリメラーゼによる
RNA分子の増幅において、第1伸長反応は逆転写であ
り、ここで DNA鎖は RNA/cDNAハイブリッドの分子の形
態で生成される。 DNA鎖を鋳型として使用する第2伸長
反応は、二本鎖 DNA分子を生成する。こうして、 Tma D
NAポリメラーゼを使用する RNA鋳型からの相補的 DNA鎖
の合成は、 PCRによる増幅のための出発物質を提供す
る。
酸の転写に使用するとき、Mg2+を含有する緩衝液の使用
は、従来使用されたMg2+を含有する逆転写緩衝液と比較
して、 Tma逆転写酵素活性の改良された刺激を提供す
る。結局、増加したcDNAの収量はまたこれらの方法から
生ずる。前述したように、 Tma DNAポリメラーゼによる
RNA転写の生成物は RNA/cDNAハイブリッドの分子であ
る。この RNAを加熱変性あるいはアルカリ、熱、または
酵素処理を包含する任意の他の既知の方法により除去す
る。次いで残留するcDNA鎖は自己相補的鎖の重合のため
の鋳型として働き、これにより増幅または他の取り扱い
に適当二本鎖cDNA分子を提供する。第2鎖の合成は配列
特異的プライマーおよび Tma DNAポリメラーゼを必要と
する。
子は、 DNA配列決定、 PCRによる増幅または特定の核酸
配列の検出を包含する、ある数の目的に役立つことがで
きる。cDNAのセグメントの増幅に有用な特定のプライマ
ーを、逆転写後に、添加することができる。また、第1
組のプライマーを使用して特定のcDNAを合成し、そして
第2の入れ子の組のプライマーを使用して所望のcDNAセ
グメントを増幅することができる。これらの反応のすべ
ては Tma DNAポリメラーゼにより触媒される。
RNA標的分子を検出する方法を簡素化および改良するた
めに使用できる。これらの方法において、 Tma DNAポリ
メラーゼは次の反応を触媒する:(a)逆転写;(b)
第2鎖cDNAの合成;および必要に応じて(c) PCRによ
る増幅。単一の酵素のみを必要とする改良に加えて、記
載する方法における Tma DNAポリメラーゼの使用は、各
手順の工程のために異なる酵素の使用のために必要であ
った、2組のインキュベーション条件の従来の要件を排
除する。 Tma DNAポリメラーゼの使用は、RNA の転写お
よび相補的 DNAの増幅を増強された特異性をもって、従
来の RNAのクローニングおよび診断的方法より工程の数
を少なくして提供する。これらの方法は実験室および臨
床的分析のためのキットにおける使用に適合可能であ
る。
た RNAは、多数の源に由来することができる。 RNA鋳型
は、任意の生物体からの核酸の調製物、例えば、ウイル
スまたはバクテリアの核酸の調製物の中に含有されてい
ることができる。この調製物は細胞の破片および他の成
分、精製された RNA、または精製されたmRNAを含有する
ことができる。 RNA鋳型はまた試料の中の不均一な RNA
分子の集団であることができる。さらに、標的 RNAは生
物学的試料の中に含有されることがあり、そして試料は
RNAがほんの小さい部分である、異種の試料であること
ができる。このような生物学的試料の例は、血液の試料
およびバイオプシーの組織試料を包含する。
ライマーは RNA鋳型に対して一般に完全に相補的である
が、プライマーは完全に相補的である必要はない。 PCR
におけるように、逆転写が起こるためにはプライマーの
すべてが鋳型にアニーリングしなくてもよい。例えば、
非相補的snはプライマーの5′末端に存在することがで
き、プライマーの残部は RNAに対して相補的である。あ
るいは、非相補的塩基がプライマーの中に介在すること
ができるが、ただしプライマーの配列はハイブリダイゼ
ーションが起こりかつ相補的 DNA鎖の合成を可能とする
ために十分な RNA鋳型と相補性をもつことを条件とす
る。
て特許請求される本発明の範囲をいかなる方法において
も限定することを意図しない。これらの実施例におい
て、特記しない限り、すべての百分率は固体について重
量により、そして液体について容量により、そしてすべ
ての温度は℃である。
リメラーゼの精製 この実施例は、サーモトガ・マリチマ (Thermotoga ma
ritima) からの Tma DNAポリメラーゼの単離を記載す
る。 DNAポリメラーゼは、Lawyerら、1989,J. Biol. C
hem., 264 (11) : 6427-6437(その開示をここに引用に
よって加える)の中に Taq DNAポリメラーゼについて記
載されている1つの変更(1mMのMgCl2)を有する方法に
従い精製の間に、種々の時点で測定した。
pH9.5 (20℃) ; 50mMのKCl ; 1mMのMgCl2 ; 1mMのβ
−メルカプトエタノール;20μMの各々のdATP, dCTP,
dGTPおよびTTP ; 10mMのα−32P−cCTP(0.03〜0.07μ
Ci/nM);12.5μgの活性化サケ精子 DNA;並びにポリ
メラーゼから構成された反応混合物の50μlの合計体積
で実施する。反応を、希釈物(希釈物は10mMのトリス−
HCl, pH8.0, 50mMのKCl, 0.1mMのEDTA, 1mg/mlのオー
トクレーブ処理したゼラチン、 0.5%のNp40,0.5%の
ツイーン20および1mMのβ−メルカプトエタノールから
構成されている)中のポリメラーゼの添加により開始
し、そして反応を75℃において実施する。
ーゼ(および希釈物)の体積を5μlであり、そして合
計反応体積を50μlであると仮定する。10分間のインキ
ュベーション後、10μlの60mMのEDTAの添加により反応
を停止させる。反応混合物を遠心し、そして50μlの反
応混合物を10mlの2mMのEDTA中50μg/mlのキャリヤー
DNA(0℃)に移す。等しい体積(1ml)の20%の TC
A,2%のピロリン酸ナトリウムを添加し、そして混合
する。
キュベーションし、次いでワットマン(Whatman) GF/C
フィルターで濾過し、そして5%の TCAおよび1%のピ
ロリン酸ナトリウムを含有する混合物(6×5ml)でよ
く洗浄し、次いで冷95%のエタノールで洗浄する。次い
でフィルターを乾燥し、そして放射能を計数する。バッ
クグラウンド(酵素なし)は通常インプット cpmの 0.0
01%〜0.01%である。約50〜 250ピコモルの32P−dCTP
標準を単位の計算のためにスポッティングする。1単位
は75℃において30分間で組込まれた10nMのdNTPに等し
い。単位は次のようにして計算する;
l)の5/6(50μl)のみを計数することから生ず
る。すべての操作は、特記しない限り、0℃〜4℃にお
いて実施した。すべてのガラス器は使用前にベーキング
し、そして精製に使用した溶液は、可能ならば、使用前
にオートクレーブ処理した。
(Thermotoga maritima) 菌株MSB8の細胞(教授 K. O.
Stettcr博士、ドイツ国レゲンスバーグ、により提供さ
れた)を、 2.4mMのPMSF(DMF中 144mMのストックから)
を含有する25mlの3×TE-DTT緩衝液(150mMのトリス−Cl
(pH7.5),3mMのEDTA、および3mMのジチオスレイトー
ル)の中で融解し、そして磁気撹拌機により低速で均質
化した。融解した細胞をアミンコ(Aminco)フレンチ圧
力セル(8〜20,000psi)の中で溶解した。リゼイトを追
加の 2.4mMのPMSFを含有する1×TE-DTT緩衝液で最終
5.5×細胞湿潤重量に希釈し、そして超音波処理して粘
度を減少させた(40〜 100%のアウトプット、9分、50
%の使用サイクル)。
ンパク質および15.5×104 単位の活性を含有した。硫酸
アンモニウムを 0.2M(7.25g)に添加し、そしてリゼ
イトを氷上で15分間撹拌した。硫酸アンモニウムは Tma
DNAポリメラーゼが粗製のリゼイトの中の DNAに結合す
るのを防止し、そして DNAポリメラーゼと他の細胞リゼ
イトのタンパク質とのイオン性相互作用を減少する。実
験的試験は、 0.2%のポリミン(Polymin) P(ポリエチ
レンイミン、PEI)が全核酸の≧92%を沈澱させることを
示した。ポリミンP(pH7.5) を 0.2%(5.49mlの10%の
PEI)にゆっくり添加し、そしてこのスラリーを氷上で30
分間撹拌し、次いで30,000×gで4℃において30分間遠
心した。上澄み液を分画II(246ml)と表示し、そして3.
05gのタンパク質および12.5×105 単位の活性を含有し
た。
添加により 0.3M硫酸アンモニウムに調製し、 DNAポリ
メラーゼのフェニルセファローズへの完全な結合を保証
した。次いで分画IIを 2.2×6.6cm (25ml)のフェニルセ
ファローズCL−4B(ロットOM08012, Pharmacia-LKBか
ら購入した)カラム(0.3Mの硫酸アンモニウムおよび0.
5mMの DTTを含有するTEの中で平衡化したもの)上に38m
l/時(10ml/ cm2/時)で負荷した。すべての樹脂は
製造業者のインストラクションに従い平衡化しそして再
循環した。
(基線に対してA280)、次いで 0.6mMの DTTを含有する
(硫酸アンモニウムを含まない)90mlのTEで洗浄し、次
いで 0.5mMのDTT を含有するTE中20%のエチレングリコ
ール95mlで洗浄し、そして最後に20%のエチレングリコ
ールおよび 0.5mMの DTTを含有するTE中2Mの尿素で溶
出した。カラムの分画を測定するとき、活性の大きい比
率が流過分画および洗浄分画の中に見いだされ、カラム
の容量を越えたことを示した。この最初のフェニルセフ
ァローズのカラムに結合した DNAポリメラーゼのほぼ70
%は低い塩において溶出され(TE-DTT洗浄液で)、そし
て結合した物質の残部は2MのTE-DTT洗浄液中20%のエ
チレングリコール中2Mの尿素で溶離された。
流過液の活性はPSII負荷と表示し(226ml)、そして1.76
gのタンパク質を含有した。分画PSII負荷を第2フェニ
ルセファローズカラム(同一のロットおよび寸法)に適
用し、そして実験を同一の方法で反復した。再び、カラ
ムの容量を越え、そして活性は低い塩および2Mの尿素
の洗浄液の両者で溶出されることがわかった。結合した
DNAポリメラーゼのわずかに10%がTE-DTT洗浄液で溶離
された;主要な部分(約90%)はTE-DTT洗浄液中20%の
エチレングリコール中2Mの尿素で溶出された。
過液の活性を第1および第2のフェニルセファローズの
カラムからのTE-DTT溶出液と一緒にし、そして 0.3Mの
硫酸アンモニウムに調節した。この分画(PSIII負荷、 2
59.4ml)は 831mgのタンパク質を含有し、そして50mlの
ベッド体積の第3フェニルセファローズカラムに10ml/
cm2/時で適用した。この時、適用した活性のすべては
このカラムにより保持され、そしてTE-DTT洗浄液中20%
のエチレングリコール中の2Mの尿素でのみ溶出され
た。
ン(Amicon)YM30上で約3〜4倍に濃縮し、そして溶出
後短時間でヘパリンセファローズ負荷緩衝液の中に透析
して、尿素への延長された暴露を回避した(カルバミル
化を回避するために)。透析しかつ濃縮した尿素溶出液
をタンパク質濃度について測定し、そしてそれらの比活
性が大きく変化することが発見された。第2フェニルセ
ファローズカラムからの尿素溶出液は他の2つの溶出液
に比べて、有意に高い比活性(約 100単位/mgのタンパ
ク質において約8×104 単位の活性)で活性の大部分を
含有したので、これをそれらと別に処理した。
ズII尿素溶出液を、0.08Mの KCl,50mMのトリス−Cl,
pH7.5 , 0.1mMのEDTA, 0.2%のツイーン20および 0.5
mMのDTTにより平衡化した5mlのベッド体積のヘパリン
セファローズCL6B(Pharmacia-LKBから購入した)カラム
に適用した。このカラムおよびすべての引き続くカラム
を1ベッド体積/時で展開した。適用した DNAポリメラ
ーゼ活性のすべてはこのカラムにより保持された。この
カラムを17mlの同一緩衝液で洗浄し(基線に対してA
280)そして60mlの同一緩衝液中80〜 500mMの KClの直線
勾配で溶出した。
53ml)をSDS-PAGEにより分析した。0.25〜 0.275Mの K
Clで溶出するピーク分画を別々に集めた。前後の分画を
後に他の分画と一緒にするために保持した。ピーク分画
(アフィゲルI負荷)のプールを KClを含まないアフィ
ゲル−ブルー緩衝液で希釈して、そのイオン強度を0.15
Mの KClに減少した。
ク質を含有しそして、25mlのトリス−Cl, pH7.5, 0.1
MのEDTA, 0.2%のツイーン20, 0.5mlの DTTおよび0.
15Mの KClの中で平衡化した 4.3mlのアフィゲル−ブル
ーカラム(BioRadから購入した)に適用した。適用した
Tma DNAポリメラーゼのすべては保持された。このカラ
ムを15mlの同一緩衝液で洗浄し、そして66mlの同一緩衝
液中0.15〜 0.7Mの KClの直線勾配で溶出した。
ml)をSDS-PAGEにより分析し、そして>90%の純度であ
るように思われた。ポリメラーゼのピーク分画は部位特
異的エンドヌクレアーゼで汚染されていなかった(65℃
において2単位の Tmaポリメラーゼと 600ngのプラスミ
ドpLSGl (ccc-DNA) を使用して1または2時間インキュ
ベーションした後、低分子量の特定の DNA断片の不存在
により示された)。0.3 〜 0.5Mで溶出するポリメラー
ゼのピークをプールし、そしてアミコンYM30膜上で約20
倍に濃縮した。次いでこの分画を 2.5×貯蔵緩衝液(50
mMのトリス−Cl,pH7.5 , 250mMの KCl,0.25mMのEDT
A, 2.5mMの DTTおよび 0.5%のツイーン20 [Pierce, S
urfact-Amps])中で透析濾過し、そして4℃において貯
蔵した。
カラムからの尿素溶出液を、第1ヘパリンセファローズ
カラムからの前後分画と一緒にした。このプール(HSII
負荷)は約 200mgのタンパク質を含有し、そして KClを
含まないヘパリンセファローズ緩衝液で80mMの KClにそ
のイオン強度を調節した。HSII負荷を16mlのベッド体積
のヘパリンセファローズカラム(80mMの KCl,50mMのト
リス−Cl,pH7.5 ,0.1 mMのEDTA, 0.2%のツイーン20
および 0.5mMの DTTの中で平衡化したもの)に適用し
た。検出可能な活性は流過分画の中に現れなかった。
そして 200mlの同一緩衝液中80〜 750mMの KCl勾配で溶
出した。 0.225〜 0.335Mの KClで溶出する分画(2m
l)を一緒にし、そしてアミコンYM30膜上で約5倍に濃
縮し、そしてヒドロキシアパタイト緩衝液の中に透析し
た。この分画(HA負荷)は 9.3mgのタンパク質を含有
し、そして4mlのベッド体積のヒドロキシアパタイト
(高い分離能の HPT, Calbiochemから購入した)カラム
(10mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7.5 , 0.5mMの DT
T, 0.1mMのEDTAおよび 0.2%のツイーン20の中で平衡
化したもの)上に負荷した。
そして60mlの10〜 500mMリン酸カリウム(pH7.5)の直線
勾配で溶出した。 0.105〜 0.230Mのリン酸カリウムで
溶出する分画(0.8ml)をSDS-PAGEにより分析した。アフ
ィゲルカラムIの分画(これはSDS-PAGEにより約10〜20
%の純度であると思われた)と比較して、これらの分画
は約5倍純度が低かった。 0.105〜 0.255Mのリン酸カ
リウムで溶出する DNAポリメラーゼのピーク分画を一緒
にし、アミコンYM30膜上で3倍に濃縮し、そしてアフィ
ゲル−ブルー緩衝液中で透析濾過した。
ルー緩衝液中で平衡化した3mlのベッド体積のアフィゲ
ル−ブルーカラムに適用した。検出可能な DNAポリメラ
ーゼの活性は流過分画中に現れなかった。このカラムを
9mlの同一緩衝液で洗浄し、そして50mlの同一緩衝液中
の 0.2〜 0.7Mの KCl直線勾配で溶離した。0.33〜 0.5
05Mの KClで溶出する分画(0.58ml)をSDS-PAGEにより
分析した。早期に溶出する分画はそれらの銀染色パター
ンによりわずかに一層きれいに見えたので、2つのプー
ルをつくった。0.31〜 0.4Mの KClで溶出する分画をプ
ールIの中に一緒にした; 0.4〜 0.515Mの KClで溶出
する分画をプールIIの中に一緒にした。2つのプールの
各々を別々にアミコンYM30膜上で約7倍に濃縮した。
ルはなお高いレベルの汚染非特異的ヌクレアーゼを含有
した。70℃において 1.5単位の DNAポリメラーゼと共に
インキュベーションすることにより、一本鎖M13の DNA
鋳型およびプラスミドの多断片の制限消化物の両者は数
時間以内に分解した。イン−シチュ活性ゲルを展開し、
そして DNAポリメラーゼの分画がタンパク質分解的分解
を受けなかったことを示した。
のプールを一緒にし、そしてホスホセルロースカラム緩
衝液の中に透析した。透析した分画(Pll I負荷)を3
mlのホスホセルロースカラム(25mMのトリス−CI,pH7.
5 ,50mMの KCl, 0.1mMのEDTA, 0.2%のツイーン20お
よび 0.5mMの DTTで一夜洗浄したもの)上に負荷した。
この洗浄は後にホスホセルロース樹脂のpHの平衡化のた
めに不十分であったことが証明された。不都合なことに
は、これは試料がカラム上に負荷された後に見出され
た。適用した活性のすべてはカラムに結合した。
そして45mlの50〜 700mMの KClの直線勾配で溶出した。
0.46〜 0.575mMの KClで溶出する DNAポリメラーゼのピ
ーク分画(0.58ml)をSDS-PAGEにより分析した。汚染タ
ンパク質の分離はピークを通して観察された:約 45kDa
の汚染バンドは0.53Mで溶出する;約 85kDaの汚染バン
ドは0.54Mの KClにおける溶出ピークを有する。したが
って、このカラムを反復した(ポリメラーゼの溶出のプ
ロフィルを考慮して、多少高いイオン強度で負荷す
る)。第1ホスホセルロースのカラムから 0.475〜0.56
Mの KClで溶出するピーク分画を第1アフィゲルカラム
からのプールと一緒にした。一緒にした分画(Pll II負
荷)は今や、精製されたポリメラーゼのすべて(約 7.5
×104)を含有した。
で希釈して、イオン強度を 0.5MのKClに調節した。Pll
II負荷を9mlのベッド体積のホスホセルロースカラム
(この場合、25mMのトリス−Cl,pH7.5 , 200mMの KC
l, 0.1mMのEDTA, 0.2%のツイーン20および 0.5mMのE
DTAの正しいpHおよびイオン強度に平衡化された)上に
負荷した。このカラムを27mlの同一緩衝液で洗浄し、そ
して 140mlの 0.2〜 0.8Mの KClの直線勾配で溶出する
ことを意図した。しかしながら、 0.8Mの KClの上限緩
衝液の代わりに、緩衝液は52mMの KClの濃度を有し、こ
れは塩の減少勾配を生じた。次いでこのカラムを32mlの
0.2Mの KCl−ホスホセルロース緩衝液により再び平衡
化し、そして140 mlの0.2 〜 0.8Mの KClの直線勾配を
再び適用した。
アッセイにより、このより高いpH(pH7.5) において、 D
NAポリメラーゼはホスホセルロース樹脂に 0.2Mの KCl
において結合しないことが示された。流過液、洗浄液、
および塩減少勾配の分画からの DNAポリメラーゼ活性を
含有する分画を一緒にした。生ずるプールをアミコンYM
30膜上で濃縮した。しかしながら、濃縮装置の故障は D
NAポリメラーゼ活性のそれ以上の損失に導いた。回収さ
れた活性を50mMの KClのホスホセルロース緩衝液の中に
透析し、そしてPll III負荷と表示した。
ース緩衝液により平衡化した5mlのベッド体積のホスホ
セルロースのカラム上に負荷した。適用した活性のすべ
てはこのカラムにより保持された。このカラムを15mlの
同一緩衝液で洗浄し、そして50mlの同一緩衝液中の50〜
500mMの KClの直線勾配で溶出した。0.16〜0.33MのKC
lで溶出する分画(0.87ml)をSDS-PAGEおよびイン−シ
チュ活性ゲルにより分析した。
を作った。 0.215〜0.31Mの KClで溶出するピーク分画
を、先行する分画および後の分画から別々に保持し、こ
れらを一緒にして副分画プールにした。両者のプールを
セントリコン(centricon) 30膜上で濃縮し、そして 2.5
×貯蔵緩衝液(50mMのトリス−Cl,pH7.5 , 250mMのKC
l, 2.5mMのEDTA, 2.5mMの DTTおよび 0.2%のツイー
ン20」Pierce, Surfact-Amps])中で透析濾過し、引き続
いて 1.5体積の80%のグリセロールと混合した。
収され;副プールは追加の1×103単位の活性をもたら
す。精製された DNAポリメラーゼは、イン−シチュ活性
ゲルの中の不変化の移動パターンにより証明されるよう
に、分解しなかった。精製された DNAポリメラーゼのゲ
ル電気泳動により決定された分子量はほぼ 97kDaであ
る。 Tma DNAポリメラーゼは、 Taq DNAポリメラーゼの
アミノ酸残基569-587 (DGTP1)および718-732 (DGTP3)
に相当する、エピトープ特異的抗体により認識される。
は、熱安定性 DNAポリメラーゼの鋳型結合ドメイン(最
も3′−側の14ヌクレオチド)におけるモチーフの1つ
に対する「前方」プライマーと表示される、4つの異な
る16倍の縮重の(各々)22マーのプールである。このモ
チーフはアミノ酸配列 Gly-Tyr-Val-Glu-Thrであり、そ
してサームス・アクアチクス(T . aquaticus )(Taq) D
NAポリメラーゼのアミノ酸 718-722に、およびサームス
・サーモフィルス(T . thermophilus)(Tth) DNAポリメ
ラーゼのアミノ酸 720-724に同一に対応する。このモチ
ーフはすべてのサームス (Thermus ) 種における DNAポ
リメラーゼ遺伝子の中に見いだされる。一緒にしたプラ
イマーのプールは64倍の縮重性であり、そしてプライマ
ーはそれらの5′末端において BglII認識部位をコード
する。前方プライマー DG164〜 DG167を下に示す:
デニンであり;Cはシチジンであり;Gはグアニジンで
あり;Tはチミンであり;YはC+T(pYrimidine) で
あり;SはG+C(Strong相互作用;3H−結合)であ
り;WはA+T(Week相互作用;2H−結合)であり;
そしてNはA+C+G+T(aNy) である。合成オリゴデ
オキシリボヌクレオチド DG160〜 DG163は、熱安定性 D
NAポリメラーゼの鋳型結合ドメイン(最も3′−側の14
ヌクレオチド)におけるモチーフの1つに対する「逆」
プライマーと表示される、4つの異なる8倍の縮重の
(各々)20マーのプールである。
配列に帰属され、そしてモチーフ Gln-Val-His-Asp-Glu
をコードし、そして Taq DNAポリメラーゼのアミノ酸 7
82-786および Tth DNAポリメラーゼのアミノ酸 784-788
に同一に対応する。このモチーフはすべてのサームス
(Thermus ) 種における DNAポリメラーゼ遺伝子中に見
いだされる。一緒にしたプライマーのプールは32倍の縮
重性であり、そしてプライマーはそれらの5′末端にお
いて EcoRI認識部位をコードする。逆プライマー DG160
〜 DG163を下に示す;
よびWは上に定義した通りであり、そしてRはG+A
(puRine)である。
断片を増幅するために、 MgCl2を使用しないで80μlの
中に次の成分を含有する PCR増幅管を調製した:(1)
5ngの変性した Tmaゲノム DNA;(2)50ピコモル(合
計)の一緒にした前方プライマーの組 DG164-DG167;
(3)50ピコモル(合計)の一緒にした逆プライマーの
組 DG160-DG163;(4)2単位の Taq DNAポリメラー
ゼ;(5)50μM(最終)の各dNTP;(6)0.05%のラ
ウレス(Laureth) −12;および(7)標準的 PCR緩衝
液、塩化マグネシウムを含まない。
−20℃において貯蔵した。凍結した試料を20μlの10mM
のMgCl2(最終濃度2mM)で層状にし、直ちに50mlの鉱油
をオーバーレイし、そしてパーキン・エルマー・セツス
・サイクラー(Perkin ElmerCetus Cycler) で次のファ
イルに従いサイクリングした:(1)98℃への段階−50
秒の保持;(2)50℃への段階−10秒の保持;(3)4
分かけて75℃への傾斜;および(4)98℃への上昇。こ
のファイルを合計30サイクル反復した。増幅生成物の1
/5(20μ)を3%のヌシーブ(Nusieve) /1%のシー
ケム(Seakem)アガロース複合ゲル上で精製し、そして
ほぼ 230bpの断片を溶出し、濃縮し、そして BglIIおよ
び EcoRIで消化した。
54および DG155は、熱安定性 DNAポリメラーゼのプライ
マー:鋳型結合ドメイン(最も3′−側の11ヌクレオチ
ド)におけるモチーフの1つに対する「前方」プライマ
ーと表示される2つの異なる32倍の縮重の(各々)19マ
ーのプールである。このモチーフはテトラペプチドの酸
配列Thr-Ala- Thr-Glyであり、そして Taq DNAポリメラ
ーゼのアミノ酸 569-572および Tth DNAポリメラーゼの
アミノ酸 571-574に同一に対応する。このモチーフはす
べてのサームス (Thermus )種における DNAポリメラー
ゼ遺伝子の中に見いだされる。一緒にしたプライマーの
プールは64倍の縮重性であり、そしてプライマーはそれ
らの5′末端において BglII認識部位をコードする。前
のプライマー DG154および DG155を下に示す:
S,Wおよびnは上に定義した通りである。
pの断片を増幅するために、 MgCl2を使用しないで80μ
lの中に次の成分を含有する PCR増幅管を調製した:
(1)5ngの変性した Tmaゲノム DNA;(2)50ピコモ
ル(合計)の一緒にした前方プライマーの組 DG154-DG1
55;(3)50ピコモル(合計)の一緒にした逆プライマ
ーの組DG160-DG163 ;(4)2単位の Taq DNAポリメラ
ーゼ;(5)50μM(最終)の各dNTP;(6)0.05%の
ラウレス(Laureth) −12;および(7)標準の PCR緩衝
液、塩化マグネシウムを含まない。
−20℃において貯蔵した。凍結した試料を20μlの10mM
のMgCl2(最終濃度2mM)で層状にし、直ちに50mlの鉱油
をオーバーレイし、そしてパーキン・エルマー・セツス
・サイクラー(Perkin ElmerCetus Cycler) で次のファ
イルに従いサイクリングした:(1)98℃への段階−50
秒の保持;(2)50℃への段階−10秒の保持;(3)4
分かけて75℃への傾斜;および(4)98℃への上昇。こ
のファイルを合計30サイクル反復した。
ガロースゲル上で精製し、そしてほぼ 670bpの断片を溶
出し、濃縮し、そして BglIIおよび EcoRIで上のように
して消化した。これらの増幅反応は、 667bpの断片、お
よび 667bpの断片の下位断片である 230bpの断片を生じ
た。これらの断片は、以下の実施例に記載するように、
Tma DNAポリメラーゼI遺伝子のための完全なコード配
列を得るとき有用であることが証明された。
ポリメラーゼI遺伝子のクローニング この実施例は、サーモトガ・マリチマ (Thermotoga ma
ritima) の Tma DNAポリメラーゼI遺伝子(Tma PolI)
をクローニングする戦略および方法を記載する。
30bp)および DG154, 155および DG160-163(667bp)に
より発生した PCR生成物の DNA配列は、XmaI制限部位の
認識配列5′CCCGGGを含有する。オリゴヌクレオチド
を、XmaI部位の上流および下流の配列にハイブリダイゼ
ーションするように設計した。 DG224は21マーであり、
XmaI部位に対して59−79bpだけ3′−末梢の PCR生成物
に対して相同性である。DG225は22マーであり、XmaI部
位からXmaI部位より21bp上流(5′)までの PCR生成物
に対して相同性である。 DG224および DG225の配列を下
に示す(KはGまたはTである)。
リゴヌクレオチドの3′末端に付加するように設計した
反応において、ビオチン−dUTPおよびトランスフェラー
ゼでテイリングすることによって標識した。これらの標
識したオリゴヌクレオチドをゲノムの Tma DNAの制限消
化のサザンブロット分析においてプローブとして使用し
た。サザン分析の結果、および実施例2に記載するよう
に生産した PCR生成物の DNA配列に基づいて、予備的制
限地図を作成した。
ゼ遺伝子が2つのXmaI制限断片を含有することを示し
た。5′末端を包含する、遺伝子の大部分はほぼ 2.6kb
のXmaI断片上に位置する。この遺伝子の残部(および
3′末端)はほぼ 4.2kbのXmaI断片上に位置する。全体
の Tma DNAポリメラーゼ遺伝子を含有する2つのXmaI断
片を、後述するように、プラスミド pBS13+(また、pB
SM13+呼ぶ)の中にクローニングした。
消化した。XmaI消化物を電気溶出によりサイズ分画し
た。γ−32P− ATP−キナーゼ処理した DG224および D
G225プローブを使用する、各分画の小部分のスロットブ
ロット分析は、 4.2kbの3′−断片(DG224とハイブリダ
イゼーションする)および 2.6kbの5′−断片(DG225と
ハイブリダイゼーションする)を含有する分画を同定し
た。分画をエタノール沈澱により濃縮し、次いでXmaI消
化した pBS13+(Stratagene)と連結した。
ルロースのフィルター上で選抜し、そしてフィルターを
適当ならばγ−32P− ATP−キナーゼ処理した DG224お
よびDG225のプローブでプロービングした。プラスミド
DNAをプローブとハイブリダイゼーションしたコロニー
から単離した。制限分析を実施して、断片が期待したも
のであることを確証し、そして pBS13+ベクターに関す
る断片の向きを決定した。
を、「ユニバーサル」および「逆」配列決定プライマー
(これらはベクター中で、制限部位のポリリンカー領域
の外側でプライミングする)を使用して実施した。さら
に、5′−クローンについて、DG154-155/ DG160-163
の 667bpのクローンの DNA配列の決定に使用したプライ
マーを用いた。予備的 DNA配列の分析により、 Tma DNA
ポリメラーゼ遺伝子を含有する所望の DNA断片がクロー
ニングされたことが確証された。
域の DNA配列を得るように、それ以上の配列決定プライ
マーを設計した。さらに、 DNA配列の分析を促進するた
めに、2つのXmaI断片のいくつかの欠失を作った。 2.6
kbの5′−断片の両者の向きについて、 EcoRI, SacI、
およびXbaIの消化物の各々を欠失し、そして分子内の結
合に好適な条件下に結合し、こうしてベクター EcoRI,
SacI、およびXbaI部位とTma XmaI断片の対応する部位と
の間の DNAを欠失した。このような内部の欠失は、「ユ
ニバーサル」または「逆の」配列決定プライマーを使用
する容易な DNA配列の分析を可能とする。
ローン中のTma PolIの内部のXmaI部位からほぼ 650bpの
BglII部位と融合して、 4.2kbの3′−断片の欠失を作
った(BamHIおよび BglIIは互いに容易に結合する同一の
GATC粘着末端を有する)。この欠失はTma PolI遺伝子の
3′末端の DNA配列の分析を可能とする。
片および 4.2kbの3′−断片の両者はNcoI, NdeIおよび
AseI制限部位を欠如することが明らかにされる。Tma Po
lI遺伝子の ATG開始およびコード配列を知ると、 DNA配
列を ATG開始部位において変更して、オリゴヌクレオチ
ドの部位特異的突然変異によりNcoI,NdeIおよびAseI制
限部位を含めるようなオリゴヌクレオチドを設計するこ
とができる。さらに、pBSM+ベクターのプロモーターと
Tma PolI遺伝子の開始部位との間の配列の欠失が、 ATG
開始部位におけるNdeIまたはAseI認識部位の包含と同時
になされるように、突然変異のオリゴヌクレオチドを設
計することができる。
lI遺伝子の開始部位との間の配列の欠失はまた、欠失さ
れた領域におけるXmaI制限部位を排除し、こうしてこの
分野において普通の技術を使用する発現プラスミド中へ
の全体コード配列のアセンブリングを便利にする(例え
ば、同時継続出願第 455,967号、1989年12月22日提出、
その開示をここに引用によって加える、の中の pDG174-
pDG181についての合成のプロトコルを参照のこと)。
ラーゼを使用して、 Tthゲノム DNAからのrRNA配列を増
幅する。反応体積は50μlであり、そして反応混合物は
50ピコモルのプライマーDG73,105 〜106 の Tthのコピ
ー(約2×105コピーのゲノム/ngのDNA),50ピコモル
のプライマーDG74, 200μMの各dNTP,2mMの MgCl2,
10mMのトリス− HCl,pH8.3 ,50mMの KCl、および 100
μg/mlのゼラチン(必要に応じて、ゼラチンを省略す
ることができる)を含有する。
スツルメンツ(Perkin-Elmer CetusInstruments)の DNA
サーマルサイクラー (Thermal Cycler) で実施する。20
〜30サイクルの96℃で15秒;50℃で30秒、および75℃で
30秒を実施する。20サイクルにおいて、増幅生成物(160
bpの大きさ)が臭化エチジウム染色したゲル上にかすか
に見ることができ、そして30サイクルにおいて、生成物
は臭化エチジウム染色したゲル上で容易に見ることがで
きる(紫外線下)。
用する場合(すなわち、0.31単位/50μlの反応)、 P
CRはより少ない非特異的生成物を生ずるであろう。さら
に、非イオン性洗剤、例えば、ラウレス−12を反応混合
物に約 0.5%〜1%の最終濃度に添加すると、 PCR生成
物の収量を改良することができる。プライマーDG73およ
びDG74を下に示す:
01)中の Tma遺伝子の5′末端を、オリゴヌクレオチド
DG240および DG244でオリゴヌクレオチドの部位特異的
変異により変異誘発した。プラスミド pBS:Tma7-1は、
ベクター pBS+の中にクローニングされた 2.6kbの5′
XmaI断片を含んで成る。
+ベクター中のβ−ガラクトシダーゼの ATGとTma PolI
の ATGとの間に欠失を有するので、 Tmaコード配列はベ
クター lacプロモーター、オペレーターおよびリボソー
ム結合部位(RBS)を利用する発現のために配置された。
両者の組の変異体はまた、Tma PolIのための第2および
第6のコドン中に変更を有して、コードされたタンパク
質のアミノ酸配列を変化させないで、大腸菌(E . col
i)のコドンの使用といっそう適合性となった。
列の ATG開始部に配置し(5′CATATG )、そして DG24
4はNcoI制限部位をコード配列の ATG開始部に配置させ
た(5′CCATG G)。 DG240変異の候補コロニーを [γ32
P] 標識したオリゴヌクレオチド DG241でスクリーニン
グし、そして DG244変異の候補コロニーを [γ32P]標
識したオリゴヌクレオチド DG245でスクリーニングし
た。プラスミド DNAを適当なプローブとハイブリダイゼ
ーションしたコロニーから単離し、そして変異は制限分
析および DNA配列の分析により確証された。 DG240の変
異体をpTma5′ Nde#9と命名し、そして後にpTma07と
改名された)。
11−1Bam/Bgl (ATCC No. 68472 、後の改名pTma04)中
で変異誘発オリゴヌクレオチド DG238で変異誘発した。
プラスミドpBSTma3′11−1Bam/Bgl は、実施例3に記
載するように、 4.2kbの3′XmaI断片を pBS+中にクロ
ーニングし、生ずるプラスミドを BamHIおよび BglIIで
消化し、そして消化からの大きい断片を結合することに
よって環化して構成された。
止コドンの直ぐ下流に挿入する。変異コロニーの候補を
[γ32P] 標識したオリゴヌクレオチド DG239で同定し
た。陽性のコロニーから単離したプラスミド DNAを適当
な制限消化のパターンについてスクリーニングし、そし
て DNA配列を確認した。得られた1つの正しいプラスミ
ドをpTma3′ mut#1として表示し、そして後にpTma05
と改名した。
遺伝子のアセンブリング 大腸菌(E . coli)中のTma PolIの低いレベルの発現お
よびTma PolIによる大腸菌(E . coli)ポリメラーゼ変
異体の可能な相補性(ここで高いレベルの発現は細胞を
殺すことがあるが、低いレベルは救済または補完するこ
とができる)を研究する目的で、Tma PolI遺伝子を pBS
13+クローニングベクターの中でアセンブリングした。
pTma3′ mut#1からの約 300bpのXmaI-EcoRV断片を、
アガロースゲルの電気泳動および臭化エチジウムの染色
後、約 300bpの断片を含有するアガロースゲルのスライ
スを切除しそしてコスター(Costar)スピネックスのフィ
ルターユニット中で凍結することによって、単離および
精製した。
ジ(microfuge)で回転し、そして DNA断片を含有する液
体を集めた。エタノール沈澱後、断片を2つの5′ベク
ター、 pTma5′ Nde#3および pTma5′ Nco#9の各々と連
結し、これらの各々をAsp718で消化し、クレノーおよび
すべてのdNTPで修復し(反応条件は次の通りである:56
mMのトリス−Cl,pH8.0 ,56mMのNaCl,6mMの MgCl2,
6mMの DTT,5μMのdNTPおよび11単位のクレノー、37
℃,15分;次いで75℃において10分間不活性化する)、
次いでXmaIでさらに消化した。
連結するために条件は次の通りであった:20μg/mlの
合計の DNA,20mMのトリス−Cl,pH7.4 ,50mMのNaCl,
10mMの MgCl2,40μmの ATP、および0.2Weiss単位の T
4DNAリガーゼ/20μlの反応、0℃、一夜。Asp718消化
しそしてクレノー修復した平滑末端を EcoRV消化した平
滑末端と連結するために、第1の連結物を、同一の結合
緩衝液の中で4〜5倍に希釈しそして15℃においてイン
キュベーションした。但し、1mMの ATPおよび10Wciss
単位の T4DNAリガーゼを20μlの反応について使用し
た。連結物を DG101宿主細胞に形質転換した。候補を適
当な制限部位についてスクリーニングし、そしてクロー
ニング部位付近の DNA配列を確認した。所望のプラスミ
ドをpTma08(ATGにおいてNdeI部位)およびpTma09(ATG部
位においてNcoI部位)と表示した。
センブリング λPL プロモーターのコントロール下に全長のTma PolI
をアセンブリングしかつ発現するために使用したPL プ
ロモーターの発現ベクターを下表に記載する。
耐性の場合、プラスミドpDG160の誘導体であるか、ある
いはテトラサイクリン耐性の場合、pDG161である。プラ
スミドpDG160およびpDG161並びに表に示す pDGベクター
に類似するベクターを構成するスキームは、米国特許出
願第 455,967号、1989年12月22日提出(その開示をここ
に引用によって加える)に記載されている。ベクターは
アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性を与え、そし
てすべてはサーモトガ・マリチマ (Thermotoga maritim
a) からのδ−トキシン陽性のレトロレギュレーターお
よび同一の点突然変異を RNAII遺伝子の中に含有し、こ
れらはプラスミドをコピー数について温度感受性とす
る。表に記載されているプライマーおよびオリゴヌクレ
オチドを下に示す。
でTma PolI遺伝子をアセンブリングした。ベクターをSm
aIおよびNdeI (pDG174, pDG178)またはNcoI (pDG182,
pDG184, pDG185)で消化する。Tma PolI遺伝子の5′末
端はNdeIおよびXmaIで消化した pTma5′Nde#3 からのも
のであるか、あるいはNcoIおよびXmaIで消化した pTma
5′ Nco#9からのものである。遺伝子の3′末端はXmaI
および EcoRVで消化したpTma3′ mut#1からのものであ
りそして約 300bpの断片を前述したように精製した。
ームを使用して、発現ベクターpTma13を構成した。プラ
スミドpDG184および上のスキームを使用して、ベクター
pTma12-1および pTma2-3を構成した。プラスミドpTma12
-3はpTma12-1と異なり、pTma12-3は同一の連結/形質転
換のプロトコルの間に生成した pctma12-1の2量体であ
る。プラスミドpDG185および上のスキームを使用して、
発現ベクターpTMa11を構成した。
有することができるが、この酵素の短縮された形態を独
占的にあるいは全長のプラスミドとの組み合わせで発現
することができる。 Tma DNAポリメラーゼのこれらの短
縮された形態は、5′− ATG以外のコード配列中のメチ
オニン(ATG)コドンの1つにおいて起こる翻訳開始から
生ずる。モノマーのpTma12-1のプラスミドは、加熱誘導
すると、天然 Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸 1-139を
欠如する生物学的に活性な熱安定性 DNAポリメラーゼを
主として生成する。約 86kDaのタンパク質は、 Tmaコー
ド配列の位置 140におけるメチオニンのコドンにおける
翻訳開始の結果であり、そしてMET140と呼ばれる。
℃における加熱誘導)下の震盪フラスコの研究におい
て、マルチマーのpTma12-3の発現ベクターは、有意なレ
ベルの「全長の」 Tma DNAポリメラーゼ(SDS-PAGEによ
りほぼ 97kDa)およびより少量のMet140における翻訳開
始から生ずる短縮された(ほぼ 86kDa)の形態を生じ
た。全長の Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸配列決定
は、アミノ末端のメチオニンが除去され、そして第2位
置の AlaがN−末端に存在することを示した。
ドpTma12-3を含有する大腸菌(E .coli)菌株 DG116か
ら精製した。10リットルの発酵用種母フラスコは、トリ
プトン(20g/l)、酵母エキス(10g/l)、NaCl
(10g/l)、アンピシリン(100mg/l)およびチアミ
ン(10mg/l)を含有した。種母フラスコに寒天プレー
ト(凍結グリセロール培養物を使用することもできる)
からのコロニーを接種した。種母フラスコを30℃におい
て 0.5〜 2.0光学密度(A680)に増殖させた。
計算して、細菌の濃度が 0.5mgの乾燥重量/リットルで
あるようにする。12.5リットルの増殖培地は、60mMのKH
2PO4,16mMのNaNH4HPO4 ,10mMのクエン酸および1mMの
MgSO4を含有した。次の無菌の成分を添加した:2g/
lのグルコース、10mg/lのチアミン、 2.5g/lのカ
ザミノ酸、 100mg/lのアンピシリン、および 100mg/
lのメチシリン。必要に応じて、消泡剤としてプロピレ
ングリコールの添加により、発泡を抑制した。空気の流
れを2リットル/分に維持した。発酵槽に前述したよう
に接種し、そして培養物を30℃において 4.5時間 0.7の
細胞密度(A680)に成長させた。
DNAポリメラーゼの合成を誘導した。温度のシフトはpT
ma12-3プラスミドのコピーの数を増加し、そして同時に
宿主の中の欠陥のあるプロファージのリソゲンによりコ
ードされる温度感受性cIリプレッサーの不活性化によ
り、修飾された Tma DNAポリメラーゼ遺伝子のラムダP
L プロモーターがコントロールする転写を抑制解除す
る。細胞を21時間の間4の光学密度(A680)に増殖さ
せ、そして遠心により収穫した。生ずる細胞のペースト
を−70℃で貯蔵した。
6におけるように精製した。簡単に述べると、細胞を1
体積のTE緩衝液(50mMのトリス−Cl, pH7.5および10mM
のEDTAおよび1mMの DTT)の中で融解し、そしてプロテ
アーゼ阻害剤を添加する(PMSFを 2.4mMに、ロイペプチ
ンを1μg/mlに、そしてTLCKを 0.2mMに)。細胞をア
ミコ(Amico)フレンチ圧力セル中で 20,000psiにおいて
溶解し、そして超音波処理して粘度を低下させた。
ゼ阻害剤を 5.5×湿潤重量の細胞塊(分画I)に希釈
し、 0.3Mの硫酸アンモニウムに調節し、そして急速に
75℃にし、そして75℃に15分間維持した。熱処理した上
澄み液を0℃に急速に冷却し、そして大腸菌(E . col
i)細胞の膜および変性されたタンパク質を20,000×g
の30分間の遠心後に除去した。 Tma DNAポリメラーゼ
(分画II)を含有する上澄み液を取って置く。
リミン(Polymin)Pのレベルを試験沈殿により決定する
(通常 0.6〜1%w/vの範囲)。所望量のポリミン(P
olymin)Pを0℃において30分間急速に撹拌しながらゆ
っくり添加し、そしてこの懸濁液を20,000×gで30分間
遠心して、沈澱した核酸を除去する。 Tma DNAポリメラ
ーゼを含有する上澄み液(分画III)を取って置く。
0.3Mの硫酸アンモニウム、10mMのEDTAおよび1mMの DT
Tの中で平衡化したフェニルセファローズのカラムに適
用する。カラムを2〜4体積の同一緩衝液で洗浄し(基
線に対してA280)、次いで1〜2カラム体積の 100mMの
KCl を含有するTE緩衝液で洗浄して大部分の汚染する
E. coliタンパク質を除去する。次いで Tma DNAポリメ
ラーゼをカラムから50mMのトリス−Cl,pH7.5 ,2Mの
尿素、20%(w/v)のエチレングリコール、10mMのED
TAおよび1mMの DTTを含有する緩衝液で溶出し、そして
DNAポリメラーゼ活性を含有する遊離をプールする(分
画IV)。
を、ヘパリンセファローズのクロマトグラフィー(天然
またはMET284組換え DNAポリメラーゼについて)、アニ
オン交換クロマトグラフィー、またはアフィゲルブルー
のクロマトグラフィーを使用して達成する。組換えTma
DNAポリメラーゼを 2.5×貯蔵緩衝液の中に透析濾過
し、 1.5体積の無菌の80%(w/v)のグリセロールと
一緒にし、そして−20℃において貯蔵する。
含有する発現プラスミドは、開始コドンにおける翻訳の
開始から生ずる全長のポリメラーゼ、あるいは位置 140
におけるメチオニンのコドンに存在する翻訳開始部から
生ずる短縮されたポリメラーゼを発現した。翻訳開始部
位として作用することができる第3メチオニンコドン
は、 Tma遺伝子のコード配列の位置 284に存在する。天
然 Tma DNAポリメラーゼのアミノ酸 1-283を欠如する D
NAポリメラーゼを発現するプラスミドを、 Tmaのコード
配列の対応する領域を欠失することによって構成した。
ド位置 848)およびHindIII (ヌクレオチド位置2629)
で消化した。1781bpの断片をアガロースゲル精製により
単離した。 DNAからアガロースを分離するために、所望
の断片を含有するゲルのスライスをコスター(Costar)
スピンネックスフィルターユニットの中で−20℃におい
て凍結した。室温において融解後、ユニットをマイクロ
フージ(microfuge)の中で回転した。 DNAを含有するフ
ィルターをスピード・バク(Spood Vac)濃縮装置で濃縮
し、そして DNAをエタノールで沈澱させた。
したpTma12-1の中にクローニングした。NcoIの消化物は
BspH1による消化物と同一の粘着末端の配列を残すの
で、1781塩基対の断片はNcoIおよび HindIIIで消化する
ことによってプラスミドpTma12-1から切除した全長の断
片と同一の粘着末端を有する。単離した断片と消化した
プラスミドとの結合は断片のスイットを生じ、そしてpT
ma14と表示するプラスミドをつくるために使用した。
pTma13の中にクローニングすることによって構成した。
pTma14と同様に、pTma15は天然 Tma DNAポリメラーゼの
アミノ酸 1-283を欠如するポリメラーゼの発現を推進す
る;翻訳は天然コード配列の位置 284のメチオニンのコ
ドンにおいて開始する。
ドは、約 70kDaの分子量の生物学的に活性な熱安定性 D
NAポリメラーゼを高いレベルで発現した;プラスミドpT
ma15は T4DNAリガーゼより高いレベルでポリメラーゼを
発現した。大腸菌(E . coli)PolIのクレノー断片との
類似性、例えば、3′−5′エキソヌクレアーゼ活性の
ために必須の3つのすべてのドメインにおけるアミノ酸
配列のモチーフの保存性、アミノ末端からエキソヌクレ
アーゼ活性のために必須の第1ドメインまでの距離、お
よび発現されたタンパク質の長さ、に基づいて、 Tmaポ
リメラーゼの短縮された形態(MET284)は3′−5′エ
キソヌクレアーゼおよびプルーフ−リーディング(proof
-reading)活性を有するが、5′−3′エキソヌクレア
ーゼ活性を欠如する。
ゼ活性についての初期の SDS活性のゲルアッセイおよび
溶液アッセイは、プラスミドpTma15を収容する大腸菌
(E .coli)宿主細胞により発現されたポリメラーゼの
プルーフ−リーディング活性の有意の弱化を示唆した。
ドpTma15を含有する大腸菌(E . coli)菌株 DG116から
精製した。10リットルの発酵の種母フラスコは、トリプ
トン(20g/l)、酵母エキス(10g/l)、グルコー
ス(10g/l)、アンピシリン(50mg/l)およびチア
ミン(10mg/l)を含有した。種母フラスコに寒天プレ
ート(凍結グリセロール培養物を使用することができ
る)からのコロニーを接種した。種母フラスコを30℃に
おいて 0.5〜 2.0光学密度(A680)に増殖させた。発酵
槽中に接種した種母培養物の体積を計算して、細菌濃度
が 0.5mg乾燥重量/リットルであるようにする。10リッ
トルの増殖培地は、25mMのKH2PO4,10mMのNaNH4HPO4,
4mMのクエン酸ナトリウム、 0.3mMの FeCl3,0.04mMの
ZnCl2,0.03mMの CoCl2,0.03mMの CuCl2および1mMの
H3BO3を含有した。
O4,20g/lのグルコース、20mg/lのチアミン、およ
び50mg/lのアンピシリン。pHをNaOHで 6.8に調節し、
そして発酵の間 NH4OHの添加によりコントロールした。
グルコースを NH4OHの添加と組み合わせて連続的に添加
した。必要に応じて、消泡剤としてプロピレングリコー
ルの添加により、発泡を抑制した。溶解した酸素の濃度
を40%に維持した。
養物を30℃において 0.5〜 1.0×10 10の細胞密度(15の
光学密度 [A680])に増殖させた。増殖温度を38℃にシ
フトして、MET284の Tma DNAポリメラーゼの合成を誘導
した。温度のシフトはpTma15のプラスミドのコピーの数
を増加し、そして同時に宿主中の欠陥のあるプロファー
ジのリソゲンによりコードされる温度感受性cIリプレッ
サーの不活性化により、修飾された Tma DNAポリメラー
ゼ遺伝子のラムダPL プロモーターがコントロールする
転写を抑制解除する。
そして遠心により収穫した。細胞塊(約95g/l)を50
mMのトリス−Cl, pH7.6,20mMのEDTAおよび20%(w/
v)のグリセロールを含有する等しい体積の緩衝液の中
に再懸濁させた。この懸濁液を液体窒素の中にゆっくり
滴下して懸濁液を「ビース」または小さいペレットとし
て凍結した。凍結した細胞を−70℃で貯蔵した。
の細胞を含有する)に、 100mlのl×TE(50mMのトリス
−Cl, pH7.5,10mMのEDTA)を添加し、そして DTTを
0.3mMに、PMSFを 2.4mMに、ロイペプチンを1μg/ml
に、そしてTLCK(プロテアーゼ阻害剤)を 0.2mMに添加
した。試料を氷上で融解し、そして低速のブレンダーの
中で均一に再懸濁した。細胞懸濁液を細胞をアミンコ
(Aminco)フレンチ圧力セルの中で 20,000psiにおいて
溶解した。粘度を減少するために、溶解した細胞の試料
を各3分間50%の使用サイクルおよび70%のアウトプッ
トで4回超音波処理した。
F,1μg/mlのロイペプチンおよび0.2mMのTLCK(分画
I)を含有する1×TEで 550mlに調節した。硫酸アンモ
ニウムを 0.3Mに添加した後、粗製のリゼイトを沸騰す
る水の中で急速に75℃にし、そして75℃の水に15分間移
して大腸菌(E . coli)宿主のタンパク質を変性および
不活性化した。熱処理した試料を急速に0℃にし、そし
て氷上で20分間インキュベーションした。5℃において
20,000×Gで遠心することによって沈澱したタンパク質
および細胞膜を除去し、そして上澄み液(分画II)を取
って置いた。
レンイミン(PEI)で処理して、 DNAおよび RNAの除去し
た。ポリミン(Polymin)P(34.96mlの10% [w/v] ,
pH7.5)を急速に撹拌しながら、 437mlの分画IIに0℃に
おいて添加した。0℃において30分後、試料を20,000×
Gで30分間遠心した。上澄み液(分画III)を、50mMのト
リス−Cl, pH7.5, 0.3Mの硫酸アンモニウム、10mMの
EDTAおよび1mMの DTTの中で平衡化した。
2×12.5cm)に、80ml/時で適用した。このカラムを約
200mlの同一緩衝液で洗浄し(基線に対してA280)、次
いで150mlの50mMのトリス−Cl, pH7.5, 100mMの KC
l,10mMのEDTAおよび1mMの DTTで洗浄した。次いでMET
284の Tma DNAポリメラーゼをカラムから50mMのトリス
−Cl, pH7.5,2Mの尿素、20%(w/v)のエチレン
グリコール、10mMのEDTAおよび1mMの DTTを含有する緩
衝液で溶離し、そして DNAポリメラーゼ活性を含有する
分画をプールした(分画IV)。
のEDTAおよび1mMの DTTの中で50mMの KClに等しい導電
性に調節した。この試料を、同一緩衝液の中で平衡化し
た15mlのヘパリン−セファローズのカラムに適用(9ml
/時で)した。このカラムを同一緩衝液で約14ml/時
(3.5カラム体積)で洗浄し、そして同一緩衝液中の 150
mlの0.05〜 0.5Mの KClで溶離した。 DNAポリメラーゼ
活性は0.11〜0.22Mの KClの間で溶離された。
リメラーゼを含有する分画をプールし、濃縮し、そして
2.5×貯蔵緩衝液(50mMのトリス−Cl, pH8.0, 250mM
の KCl,0.25mMのEDTA, 2.5mMの DTTおよび 0.5%のツ
イーン20)に対して透析濾過し、引き続いて 1.5体積の
無菌の80%(w/v)のグリセロールを混合し、そして
−20℃において貯蔵した。必要に応じて、ヘパリンセフ
ァローズ溶出の DNAポリメラーゼまたはフェニルセファ
ローズ溶出の DNAポリメラーゼを透析するか、あるいは
50mMのトリス−Cl,pH7.5,1mMの DTT,1mMのEDTAおよ
び 0.2%のツイーン20の中で50mMの KClに等しい導電性
に調節し、そして同一の緩衝液の中で平衡化したアフィ
ゲルブルーカラムに適用(1mgのタンパク質/mlの樹
脂)することができる。
液で洗浄し、そして10カラム体積の同一緩衝液中の KCl
の勾配(0.05〜 0.8M)で溶出した。 DNAポリメラーゼ
活性(0.25〜 0.4Mの KClの間で溶出する)を含有する
分画をプールし、濃縮し、透析濾過し、そして上のよう
に貯蔵した。種々の DNAポリメラーゼの相対的耐熱性を
比較した。97.5℃において、天然 DNA Tmaポリメラーゼ
の半減期は天然または組換え Taq DNA(すなわち、Ampl
iTaq R ) ポリメラーゼの半減期の2倍より大きい。驚く
べきことには、 MET284Tma DNAポリメラーゼの97.5℃に
おける半減期は天然 Tma DNAポリメラーゼの半減期より
3倍長い。
MgCl2 (Taqまたは天然 Tma DNAポリメラーゼについて)
または3mMのMgCl2 (MET284Tma DNAポリメラーゼについ
て)、50mMの KCl(Taq、天然 TmaおよびMET284 Tma DNA
ポリメラーゼについて)または KCl不含(MET284Tma DNA
ポリメラーゼ)、 0.5μMの各プライマー PCR01および
PCR02,1ngのラムダ鋳型DNA, 200μMの各dNTP(dCTP
を除外する)、および4単位の各酵素を含有する PCR管
を97.5℃において大きい水浴中で0〜60分間インキュベ
ーションした。試料を経時的に抜き出し、0℃において
貯蔵し、そして5μlを残留活性についての標準の活性
のアッセイにおいて75℃において10分間測定した。
0分の半減期を有したが、天然 TmaDNAポリメラーゼは9
7.5℃において約21〜22分間の半減期を有した。驚くべ
きことには、 Tma DNAポリメラーゼのMET284の形態は、
Taqまたは天然 Tma DNAポリメラーゼのいずれより有意
に長い半減期(50〜55分)を有した。 MET284Tma DNAポ
リメラーゼの改良された耐熱性は、 PCRにおける、とく
にG+Cに富んだ標的が増幅困難である場合に用途を見
いだすであろう。なぜなら、標的および PCR生成物の配
列の完全な変性に要求される鎖単離の温度は酵素の不活
性化に導くからである。
の MgCl2,20μMの各dNTP, 0.5ngのバクテリオファー
ジラムダの DNA, 0.5μMのプライマー PCR01,4単位
の MET284Tma DNAポリメラーゼおよび 0.5mMのプライマ
ー PCR02またはPL10を含有する PCR管を、1分間の96℃
のT(変性)および2分間の60℃のT(アニーリング−
伸長)を使用して25サイクルをサイクルした。ラムダ D
NA鋳型、デオキシヌクレオチドのストック溶液、並びに
プライマー PCR01および PCR02は、 PECI Gene AmpR キ
ットの一部分であった。プライマーPL10は配列: (配列
番号:45) 5′-GGCGTACCTTTGTCTCACGGGCAAC-3′を有
し、そしてバクテリオファージラムダのヌクレオチド 8
106-8130に対して相補的である。
からの 500bpの生成物を増幅する。プライマー対 PCR01
およびPL10はラムダからの1kbの生成物を増幅する。そ
れぞれのプライマーの組を使用して増幅した後、5μl
のアリコートをアガロースゲルの電気泳動にかけ、そし
て特定の意図する生成物のバンドを臭化エチジウムの染
色で可視化した。豊富なレベルの生成物が両者のプライ
マーの組で発生し、 MET284Tma DNAポリメラーゼは意図
する標的配列を首尾よく増幅したことを示す。
子のコード配列を含有するプラスミドで形質転換された
宿主細胞は、短縮された形態(MET140)の Tmaポリメラ
ーゼを単独または全長のポリメラーゼと一緒に発現す
る。変異を行って、発現されるポリメラーゼの形態をコ
ントロールすることができる。ポリメラーゼのMET140の
独占的な発現を増強するために、 139までのアミノ酸に
相当するコード領域を発現ベクターから欠失した。
実施例6に記載されている構成に類似する:短縮された
遺伝子断片を切り出し、次いで全長の断片が切除されて
いるベクターの中に挿入する。しかしながら、短縮され
た断片は、制限消化物から精製するよりむしろ PCR増幅
生成物として得られる。この方法は有用な場合に新しい
上流制限部位(または他の配列)の組込みを可能とす
る。位置 140におけるメチオニンのコドンまでの領域を
欠失するために、SphI部位をpTma12-1およびpTma13中に
PCRを使用して導入した。位置 140のメチオニンのコド
ンのちょうど上流にSphI部位を導入するように、前方プ
ライマー(FL63)を設計した。位置 624にXbaIを含むよ
うに、逆プライマー(FL69)を選択した。SmaIで線状化
したプラスミドpTma12-1を PCR鋳型として使用して、 2
25bpの PCR生成物を生成した。
中の50μg/mlのプロテイナーゼK+ 0.5%の SDSおよ
び5mMのEDTAで処理した。37℃において30分間インキュ
ベーションした後、プロテイナーゼKを68℃で10分間加
熱不活性化した。この手順は、引き続く制限消化を阻害
しうる生成物に結合した Taqポリメラーゼを排除した。
緩衝液をTE緩衝液に交換し、そして過剰の PCRプライマ
ーをセントリコン(Centricon)100マイクロコンセントレ
ーターで除去した。
レノーで処理して、SphI切断した末端に平滑末端をつく
り、そして最後にXbaIで消化した。生ずる断片を、NcoI
で消化したプラスミドpTma13(pTma12-1が適当であった
であろう)と結合し、クレノーで修復し、次いでXbaIで
消化した。この連結は、最初のNcoI部位(コード配列の
第1メチオニンから上流)と導入されたSphI部位(位置
140におけるメチオニンコード配列から上流)との間の
領域が除去されたインフレームのコード配列を生じた。
生ずる発現ベクターをpTma16と表示した。この実施例に
おいて使用したプライマーを下および配列のリストの節
に記載する。
置 140のメチオニンのコドンから上流のリボソーム結合
部位(RBS)を排除することによって達成することができ
る。オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発により排除
した。遺伝コードの冗長性の利点を利用して、コドンの
第3位置を変化して核酸配列を変更し、これにより、コ
ードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化しないで、
RBSを排除することができる。
ー(FL64)を合成し、そしてリン酸化した。一本鎖pTma
09(NcoI部位を有する全長クローン)を、ストラタジー
ン(Stratagene)から商業的に入手可能な、ヘルパーフ
ァージR480で同時感染することによって調製した。一本
鎖pTma09および pBS13+の PvuII消化からの大きい断片
の「ギャップド二重鎖 (gapped duplex)」を、2つのプ
ラスミドを混合し、2分間沸騰加熱しそして65℃に5分
間冷却することによって作った。次いで、リン酸化した
プライマーと「ギャップド二重鎖」とを、混合、2分間
の80℃への加熱および引き続く室温へのゆっくりした冷
却によりアニーリングした。残留するギャップをクレノ
ーを使用する伸長により満たし、そして断片を T4DNAリ
ガーゼにより連結した。両反応を標準的塩類中 200mMの
各dNTPおよび40mMの ATPの中で37℃において30分間実施
した。
ースフィルター上でプレート形質転換により形質転換し
た。二重反復実験のファルターをつくり、そして正しい
プラスミドの存在をγ32P−リン酸化プローブ(FL65)
でプロービングすることによって検出した。生ずるベク
ターをpTma19と表示した。
/XbaI断片のスイッチによりpTma12-1中にクローニング
した。プラスミド19をNcoIおよびXbaIで消化し、そして
620bpの断片を、上の実施例7におけるように、電気泳
動により精製した。pTma12-1をNcoI,XbaIおよびXcmIで
消化した。XcmIによる切断は、引き続く連結工程のため
に PBS+断片を不活性化し、これは「粘着」末端の連結
に適当な条件下に実施される(希いリガーゼおよび40mM
のATP)。最後に、発現のために、連結生成物をDG116宿
主細胞の中に形質転換し、そしてpTma19-PBSと表示す
る。この実施例において使用したオリゴヌクレオチド配
列を下記および配列表の節に記載する。
けるアスパラギン酸のコドン付近において翻訳を開始す
るために、このコドンの前にメチオニンのコドンを導入
し、そして最初のNcoI部位からこの導入されたメチオニ
ンのコドンまでの領域を欠失させる。欠失の方法は、前
述の同一の下流プライマー(FL69)、および 570bpの生
成物を生ずるためにNcoI部位およびメチオニンのコドン
組込むように設計した上流プライマー(FL66)を使用す
る手順を包含する。
on)-100マイクロコンセントレーターで濃縮して、過剰
のプライマーおよび緩衝液を排除した。生成物をスピー
ド・バク(Speed Vac)濃縮装置で濃縮し、次いで消化混
合物の中に再懸濁させる。増幅した生成物をNcoIおよび
XbaIで消化する。同様に、pTma12-1,pTma13またはpTma
19-RBSを同じ2つの制限酵素で消化し、そして増幅断片
の消化物と消化した発現ベクターとを連結した。生ずる
構成体は、天然 Tmaコード配列の開始コドンから上流の
NcoI部位から、天然 Tmaコード配列の位置21のアスパラ
ギン酸のコドンから上流に導入された新しいメチオニン
のコドンまでの欠失を有する。
の位置74のグルタミンのコドン Glu74において開始する
ように、欠失の変異体をつくることができる。メチオニ
ンのコドンおよびNcoI部位を Glu74の前に導入するよう
に上流プライマー(FL67)を設計する。使用する下流プ
ライマーおよびクローニングのプロトコルは、 MET ASP
21構成体について前述した通りである。この実施例にお
いて使用した上流プライマーの配列を下記および配列表
の節に記載する。
またはリボソーム結合部位(RBS)を変化することによっ
て変更することができる。T7遺伝子10のプロモーター
および RBSを使用して、発現ベクターpTma17からの Tma
DNAポリメラーゼの発現を推進し、そしてT7遺伝子10
のプロモーターおよび遺伝子Nの RBSを使用して、発現
ベクターpTma18からの Tma DNAポリメラーゼの発現を推
進した。
存在するユニーク制限部位:プロモーターから上流の A
flII部位、 RBSから下流のNcoI部位、およびプライマー
と RBSとの間の BspE1部位を利用した。存在するプロモ
ーターを、前の実施例に記載する技術に類似する技術を
使用して、pTma12-1から切除しそして合成T7遺伝子10
プロモーターと置換した。
ヌクレオチドから合成インサートをつくった。pTma7(T
7遺伝子10の RBSをもつ)をつくるために、等しい比率
の FR414および FR416を混合し、加熱沸騰させ、そして
室温にゆっくり冷却した。ハイブリダイゼーションした
オリゴヌクレオチドをクレノーで伸長して、全長の二本
鎖のインサートをつくった。次いで伸長した断片を Afl
IIおよびNcoIで消化し、適当な「粘着」末端を残した。
インサートを AflIIおよびNcoIで消化したプラスミドpT
ma12-1中にクローニングした。 DG116宿主細胞を生ずる
プラスミドにより形質転換し、そして形質転換体を所望
のプラスミドについてスクリーニングした。
つ)の作製において使用したが、ただし FR414および F
R418を使用し、そして伸長した断片を AflIIおよび Bsp
E1で消化した。この DNA断片を、 AplIIおよび BspE1で
消化したプラスミドpTma12-1中のPL プロモーターと置
換した。プラスミドpTma17およびpTma18を使用して、誘
発可能な T7DNAポリメラーゼ遺伝子を含有するように修
飾された大腸菌(E . coli)宿主細胞を形質転換する。
これらのベクターの構成において使用したオリゴヌクレ
オチドを下記および配列表の節に記載する。
部位のちょうど上流に短いコード配列をカップリングす
ることによって、翻訳カップリングはタンパク質の発現
の効率を増加することができる。上流のコード配列の翻
訳の停止は、下流のコード配列のための開始部位に密接
に近接してリボソームの残す。上流のコード配列は、所
望のタンパク質のためのコード配列の開始に対して下流
にリボソームを動かす機能のみをする。
ターを構成し、そしてこの発現ベクターは Tmaコード領
域の上流に位置する大腸菌(E . coli)のTrpEの最後の
6コドンに対してインフレームで融合したT7バクテリ
オファージの主要キャプシドタンパク質(遺伝子10)の
最初の10コドンおよび翻訳開始シグナルを有した。TrpE
のための TGA(停止)コドンと Tma遺伝子のための ATG
(開始)コドンとを「カップリング」して、配列 TGATG
を形成する。短いコード配列の翻訳と Tmaコード配列の
翻訳との間に、1塩基のフレーム−シフトが要求され
る。
腸菌(E . coli)TrpE/TrpD融合生成物を含有する断片
(TrpEからの最後の6コドンおよび TGA停止コドンなら
びにTrpDからのオーバーラップする ATG開始コドン)
は、前以て存在するプラスミドから転移された。当業者
は認識するように、翻訳的にカップリングした発現ベク
ターの構成において使用したT7遺伝子10−大腸菌(E
. coli)TrpE/TrpD融合生成物は合成オリゴヌクレオ
チドとして構成することができる。挿入された断片のた
めの配列を下記および配列表の節に記載する。
TrpD融合生成物を、プラスミドpSYC1868からプライマー
FL48およびFL49を使用して増幅した。プライマーFL51お
よびFL53では、pTma08(NdeI部位を含有する全長クロー
ン)中のTma PolI遺伝子の5′末端を、 ATG開始コドン
から ATG開始コドンの下流のMroI部位まで増幅した。オ
ーバーラッピング領域を残し、こうして本質的に実施例
10に記載するようにして2つの増幅された生成物をアニ
ーリングしそして伸長することができるようにプライマ
ーFL51およびFL49を設計した。2つの増幅生成物を混合
し、95℃に加熱し、室温にゆっくり冷却し、そして Taq
ポリメラーゼで伸長した。
よびFL53で増幅し、次いでXmaIおよびMroIで消化した。
プラスミドpTma12-1をMroIで消化し、そして仔ウシ腸ア
ルカリ性ホスファターゼで処理して再連結を防止した。
消化したpTma12-1をインサートと連結した。生ずる構成
体で DG116宿主細胞を形質転換し、そして形質転換体を
所望のプラスミド DNAについてスクリーニングした。生
ずるベクターをpTma20と表示した。オリゴヌクレオチド
プライマーおよびT7遺伝子10−大腸菌(E . coli)Tr
pE/TrpD融合生成物(遺伝子10のインサート)の配列を
下記および配列表の節に記載する。
ermotoga maritima)と大腸菌(E . coli)との間で異
なる。 Tmaコード配列において、アルギニンは「 AGA」
コドンにより最も頻繁にコードされるが、このコドンは
大腸菌(E . coli)宿主細胞の中で低い頻度で使用され
る。対応する「ArgU」tRNAは大腸菌(E. coli)におい
て低い濃度で現れる。宿主細胞中の ArgtRNAの低い濃度
は Tmaポリメラーゼ遺伝子の翻訳効率を制限することが
ある。大腸菌(E . coli)宿主内の Tmaコード配列の翻
訳効率は、「ArgU」tRNAのための遺伝子を含有する第2
発現ベクターを使用して、tRNA遺伝子の多数のコピーを
宿主細胞中にクローニングすることによって、このtRNA
種の濃度を増加することにより改良することができる。
び DG285を使用して、大腸菌(E .coli)ゲノム DNAか
ら PCR増幅した。増幅生成物をSalIおよび BspH1で消化
し、そして次にArgU断片を消化したベクターと連結し
た。 DG101細胞を形質転換し、そして連結したベクター
をpARG01と表示した。最後に、 DG116宿主細胞をpARG01
およびpTma12-1により同時形質転換した。この実施例に
おいて使用したオリゴヌクレオチドのプライマーを下記
および配列表の節に記載する。
Claims (12)
- 【請求項1】 サーモトガ・マリチマ (Thermotoga ma
ritima)(Tma) ポリメラーゼ酵素活性を有し、そして次
のアミノ酸配列(I): 【化1】 【化2】 又は前記アミノ酸配列(I)のN−末端側のおよそ3分
の1以下が欠失しており且つ Tmaポリメラーゼ活性を有
するアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列(I)に対し
て1個又は数個のアミノ酸の付加、欠失及び/又は置換
により修飾されており且つ Tmaポリメラーゼ活性を有す
るアミノ酸配列、のいずれかをコードするDNA; 但し、前記 Tmaポリメラーゼ活性とは、 (1)ヌクレオシドトリホスフェートから核酸鋳型鎖に
相補的な核酸鎖を形成する反応(ポリメラーゼ反応)を
触媒する; (2)3′→5′エキソヌクレアーゼ活性を有する; (3)ポリメラーゼ反応のための至適温度は約75℃〜80
℃である;及び (4)ポリメラーゼ反応のために好ましいpHは約7〜9
である; を特徴とするものとする。 - 【請求項2】 前記アミノ酸配列の修飾が、アミノ酸位
置323, 325, 329, 385,389, 393, 464 及び 468の少な
くとも1ケ所に存在する、請求項1に記載の DNA。 - 【請求項3】 前記配列(I)のアミノ酸No.140− 893
をコードする、請求項2に記載の DNA。 - 【請求項4】 前記配列(I)のアミノ酸No.284− 893
をコードする、請求項2に記載の DNA。 - 【請求項5】 次のヌクレオチド配列(II): 【化3】 【化4】 【化5】 【化6】 又はその部分配列を有する請求項1に記載の DNA。
- 【請求項6】 前記配列(II)のヌクレオチドNo.418−
2682に対応するヌクレオチド配列を有する、請求項5に
記載の DNA。 - 【請求項7】 前記配列(II)のヌクレオチドNo.850−
2682に対応するヌクレオチド配列を有する、請求項5に
記載の DNA。 - 【請求項8】 請求項1〜7のいずれか1項に記載の D
NA配列を含んで成るDNAベクター。 - 【請求項9】 前記熱安定性 DNAポリメラーゼをコード
する DNAが宿主に適合した転写開始シグナル及びリボゾ
ーム結合部位を有する、請求項8に記載の DNAベクタ
ー。 - 【請求項10】 請求項8又は9に記載のベクターによ
り形質転換された組換え宿主細胞。 - 【請求項11】 宿主によってではなくサーモトガ・マ
リチマにより好んで使用されるコドンに対して特異的な
tRNAをコードする遺伝子の多数のコピーを含んで成る請
求項10に記載の組換え宿主細胞。 - 【請求項12】 大腸菌(Escherichia coli)の細胞
である請求項10又は11に記載の組換え宿主細胞。
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