JP2886842B2 - 熱安定性ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

熱安定性ｄｎａポリメラーゼ

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JP2886842B2 JP9070192A JP7019297A JP2886842B2 JP 2886842 B2 JP2886842 B2 JP 2886842B2 JP 9070192 A JP9070192 A JP 9070192A JP 7019297 A JP7019297 A JP 7019297A JP 2886842 B2 JP2886842 B2 JP 2886842B2
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、未変性酵素が示す
ものとは異なるレベルの５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性が示されるように変更又は突然変異された熱安定性
DNA ポリメラーゼに関する。本発明は同様に、このよう
な変更ポリメラーゼを単離及び生産するための手段にも
関する。熱安定性DNA ポリメラーゼは数多くの組換えDN
A 技術、特にポリメラーゼ連鎖反応(PCR）による核酸増
幅、自立的 (self-sustained) 配列複製（３SR）及び高
温DNA 配列決定において役立つものである。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌（E.coli）などの中温菌からのDN
A ポリメラーゼの単離に関しては広範な研究が行なわれ
てきた。例えばBessman 他、1957年、J. Biol. Chem.
223 :171-177及びButtin及びKornberg, 1966年、J. B
iol. Chem. 241 : 5419-5427を参照のこと。幾分か少
ないものの、テルムス・アクアチクス (Thermus aquati
cus)、テルムス・サーモフィルス（Thermus thermophil
us）、テルモタガ・マリチマ（Thermotoga maritim
a）、テルムス（Thermus)スペーシースsps17, テルム
ス（Thermus)スペーシースZ05 及びテルモシポ・アフリ
カヌス（Thermosipho africanus)といった好熱生物から
DNA ポリメラーゼを単離及び純化することについても研
究が行なわれてきた。
【０００３】当初存在している量に比べて多い量に既存
の核酸配列を増幅するために熱安定性酵素を使用するこ
とは、米国特許第4,683,195 号及び4,683,202 号の中で
記述されていた（引用により、これらを本明細書に組み
入れる）。標的DNA の変性，プライマのハイブリッド形
成及び相補鎖の合成が関与するRCR 方法では、プライ
マ、鋳型、ヌクレオシド三燐酸、適当な緩衝液及び反応
条件、並びにポリメラーゼが用いられる。各々のプライ
マの延長生成物は望ましい核酸配列の生産のための鋳型
となる。２つの特許は、使用するポリメラーゼが熱安定
性酵素である場合、熱がポリメラーゼ活性を破壊するこ
とは無いことから全ての変性段階の後にポリメラーゼを
付加する必要が無いということを開示している。
【０００４】米国特許第 4,889,818号、欧州特許公報第
258,017号及びPCT 公開第89/06691は、テルムス・アク
アチクス (Thermus aquaticus)からの〜94kDa の熱安定
性DNA ポリメラーゼの単離及び組換え体発現ならびにPC
R におけるこのポリメラーゼの利用について記述してい
る（これらの記載を引用により本明細書に組み入れ
る）。Ｔ．アクアチクス（T. aquaticus)DNAポリメラー
ゼは、PCR 及びその他の組換えDNA 技法において使用す
るのに特に好まれるものであるが、その他の熱安定性ポ
リメラーゼに対する必要性も残っている。
【０００５】
【発明の要約】その他の熱安定性ポリメラーゼに対する
必要性に取り組みながら、当該発明者は、テルムス・ア
クアチクス（Thermus aquaticus) (Taq)から分離された
もののようないくつかの熱安定性DNA ポリメラーゼが
５′→３′エキソヌクレアーゼ又は構造依存性一本鎖エ
ンドヌクレアーゼ（SDSSE)活性を示すことを発見した。
以下でさらに詳細に説明するように、このような５′→
３′のエキソヌクレアーゼ活性は、生産される生成物の
量を制限し、通常は指数的に蓄積される生成物のプラト
ー現象に貢献する可能性があることから、RCR で使用す
べき酵素の中では望ましくないものである。
【０００６】さらに、熱安定性DNA ポリメラーゼ内の
５′→３′ヌクレアーゼ活性の存在は、特にＧ＋Ｃが豊
富な標的について10kb以上の長いPCR 生成物を効率良く
生成する能力の欠陥に貢献する可能性がある。DNA 配列
決定の利用分野及びサイクル配列決定の利用分野におい
ては、５′→３′のヌクレアーゼ活性の存在は、望まれ
るバンド強度の減少及び／又は擬似又はバックグラウン
ドバンドの生成に貢献する可能性がある。最後に、５′
→３′ヌクレアーゼ活性が無ければ、組合せ型ポリメラ
ーゼ−リガーゼ連鎖反応（PLCR）検定におけるより高感
度の対立遺伝子識別を容易にすることができる。
【０００７】しかしながら、熱安定性DNA ポリメラーゼ
における強化された又はより多くの量の５′→３′エキ
ソヌクレアーゼ活性は、標的核酸配列の同時の増幅及び
検出のための均質検定システムにおいて用いられるよう
な酵素においては望ましいものであり得る。一般に、強
化された５′→３′のエキソヌクレアーゼ活性は、高め
られたエキソヌクレアーゼ開裂速度又はニックトランス
レーション合成の高められた速度、或いは又フラグメン
トの開裂の前の比較的大きいヌクレオチドフラグメント
の置換によって定義づけされる。
【０００８】従って、本発明は、変更された５′→３′
エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定性DNA ポリメラー
ゼを提供することによって先行技術の必要性を満たすべ
く開発された。熱安定性DNA ポリメラーゼの使用目的に
応じて、ポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性を、一定範囲の５′→３′エキソヌクレアーゼ活性
が発現されうるように変更することが可能である。この
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性の範囲は、強化され
た活性から活性の全く欠如した状態にまで広がってい
る。いくつかのPCR 利用分野例えば均質検定においては
強化された活性が有利であるが、その他のほとんどのPC
R 利用分野において利用される熱安定性DNA ポリメラー
ゼにおいては、できるかぎり少ない５′→３′エキソヌ
クレアーゼ活性が望まれる。
【０００９】同様に部位特異的突然変異誘発ならびに欠
失突然変異誘発が両方共、本発明の熱安定性DNA ポリメ
ラーゼにおける望ましい変更された５′→３′エキソヌ
クレアーゼ活性をもたらしうるということも見出され
た。エキソヌクレアーゼ活性を変えるいくつかの突然変
異がDNA ポリメラーゼのプロセシングの可能性を変える
ことがわかっている。数多くの利用分野（例えば、大量
の高度に複雑なゲノムDNA が存在する中での中サイズの
標的の増幅）において、プロセシング可能性の低下はPC
R の最適化を単純なものにし、高い酵素濃度での特異性
の強化に寄与する可能性がある。
【００１０】５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を除去
するいくつかの突然変異は、熱安定性DNA ポリメラーゼ
のプロセシング可能性を減少させず強化させる可能性が
あり、従ってこれらの突然変異体酵素がその他の利用分
野（例えば長いPCR 生成物の生成）においては好ましい
可能性もある。５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を除
去するいくつかの突然変異は、同時に、野性型との関係
において、突然変異体の熱安定性ポリメラーゼの耐熱性
を高め、従ってこれらの突然変異体酵素は、Ｇ＋Ｃが豊
富な又はその他の形では変性が困難な標的の増幅におい
てさらに有効である。
【００１１】熱安定性DNA ポリメラーゼゲノムの特定の
共通領域又はドメインが、酵素の５′→３′エキソヌク
レアーゼに突然変異誘発が影響を及ぼすのに好ましい部
位として同定された。これらのドメインを単離し、そし
て天然の５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を全く又は
ほとんどもたない熱安定性DNA ポリメラーゼの中に挿入
して、その活性を増強することができる。かくして、変
更された５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有するキ
メラ熱安定性DNA ポリメラーゼを製造する方法も本発明
に包含される。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、５′→３′エキソヌク
レアーゼの発現を変えるべく突然変異を受けた熱安定性
DNA ポリメラーゼをコードするDNA 配列及び発現ベクタ
を提供する。本発明の理解を容易にするため、いくつか
の用語を以下で定義づけする。「細胞」、「細胞系」及
び「細胞培養物」という語は、互換性ある形で使用で
き、このような呼称は全て子孫を含んでいる。従って、
「形質転換体」又は「形質転換された細胞」という語
は、トランスファ（転移）の回数に関わりなく、最初に
形質転換された細胞及びこの細胞から誘導された培養物
を含んでいる。意図的な又は偶然の突然変異のため、全
ての子孫がDNA 含有量について正確に同一とは限らな
い。当初形質転換された細胞内でスクリーニングされた
のと同じ機能性をもつ突然変異体子孫が、この形質転換
体の定義中に含まれる。
【００１３】「制御配列」という語は、特定の宿主生物
体の中で作動的(operable)に連鎖されたコード配列の発
現に必要なDNA 配列のことを意味する。例えば、原核生
物に適した制御配列には、プロモータが含まれ、任意の
ものとしてオペレータ配列、リボソーム結合部位及び可
能性あるものとしてその他の配列が含まれる。真核細胞
は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル及びエンハン
サを使用することが知られている。「発現系」という語
は、作動的な連鎖の中に所望のコード配列及び制御配列
を含み、そのためこれらの配列によって形質転換された
宿主がコードされたタンパク質を生産することができる
ようになっているDNA 配列のことを意味する。形質転換
を実行するためには、発現系はベクター上に含有されて
いてよい；しかしながら、関連DNA が宿主染色体に組込
まれていてよい。
【００１４】「遺伝子」という語は、回収可能な生物活
性ポリペプチド又は前駆物質の生産に必要な制御配列及
びコード配列を含むDNA 配列のことを意味する。ポリペ
プチドは、酵素活性が保持されるかぎり全長のコード配
列により又はコード配列のいずれか一部分によってコー
ドされうる。「作動的に連鎖された」(operably linke
d) という語は、制御配列がコード配列によってコード
されたタンパク質の発現を駆動するために機能すること
になるようなコード配列の位置づけのことである。従っ
て、制御配列に対し「作動的に連鎖された」コード配列
というのは、コード配列が制御配列の指令の下で発現さ
れうるような配置のことである。
【００１５】熱安定性ポリメラーゼを含む混合物に関連
する場合の「混合物」という語は、望ましい熱安定性ポ
リメラーゼを含むがその他のタンパク質も同様に含みう
る材料の収集物のことを意味する。望ましい熱安定性ポ
リメラーゼが組換え宿主細胞に由来する場合、その他の
タンパク質は通常宿主と関連するものである。宿主が細
菌宿主である場合、汚染タンパク質は当然のことながら
細菌性タンパク質となる。「非イオン重合体洗剤」とい
う語は、本発明においては約 3.5乃至約 9.5好ましくは
４〜8.5 のpH範囲で熱安定性ポリメラーゼ酵素を安定化
させる能力によって特徴づけられる、イオン電荷を全く
もたない界面活性剤のことを指している。
【００１６】ここで使用する「オリゴヌクレオチド」と
いう語は２つ以上好ましくは３つ以上通常は10以上のデ
オキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから成る
分子として定義づけされる。正確なサイズは数多くの要
因によって左右されるが、これらの要因はそれ自体オリ
ゴヌクレオチドの究極的機能又は用途によって左右され
るものである。オリゴヌクレオチドは合成的にでも又ク
ローニングによってでも誘導することができる。
【００１７】ここで使用する「プライマ」という語は、
プライマ延長が開始される条件下に置かれたとき、合成
開始点として作用することのできるオリゴヌクレオチド
のことを言う。オリゴヌクレオチド「プライマ」は、純
化された制限消化物の中といったように天然にも発生し
うるが、合成で生産することもできる。核酸鎖に相補的
なものであるプライマ延長生成物の合成は、４つの異な
るヌクレオシド三燐酸及び１つの熱安定性ポリメラーゼ
酵素が適切な緩衝液内で適当な温度で存在する中で開始
される。「緩衝液」の中には、望ましいpHに調整された
状態で補因子（例えば二価金属イオン）及び塩（適切な
イオン強度を提供するため）が含まれる。
【００１８】プライマは、増幅における最大効率を得る
ため一本鎖であるが、代替的には２本鎖であってもよ
い。２本鎖である場合、プライマは、延長生成物を調製
する前にまずその鎖を分離する処理を受ける。プライマ
は通常オリゴデオキシリボ核酸である。プライマはポリ
メラーゼ酵素が存在する中で延長生成物の合成を起動さ
せるのに充分長いものでなくてはならない。プライマの
正確な長さは、プライマ供給源及び望まれる結果といっ
た数多くの要因によって左右され、反応温度は、鋳型に
対するプライマの適切なアニーリングを確保するべくプ
ライマの長さ及びヌクレオチド配列に応じて調整されな
くてはならない。標的配列の複雑性に応じて、オリゴヌ
クレオチドプライマは標準的に15〜35のヌクレオチドを
含んでいる。短かいプライマ分子は一般に、鋳型と充分
に安定した複合体を形成するのに比較的低い温度を必要
とする。
【００１９】プライマは、鋳型の特定の配列の１つの鎖
に対し「実質的に」相補的となるように選択される。プ
ライマは、プライマの伸長が起こるために鋳型鎖とハイ
ブリッド形成するのに充分相補的でなくてはならない。
プライマ配列が鋳型の正確な配列を反映している必要は
ない。例えば、非相補ヌクレオチドフラグメントをプラ
イマの５′末端に付け、プライマ配列の残りの部分は実
質的にその鎖に相補的であることが可能である。プライ
マ配列がハイブリッド形成しかくしてプライマの延長生
成物の合成のための鋳型プライマ複合体を形成するのに
充分な相補性を鋳型の配列との間に有することを条件と
して、プライマの中に非相補的塩基又は比較的長い配列
を点在させることが可能である。
【００２０】「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵
素」という語は、２本鎖DNA を特定のヌクレオチド配列
又はその近くにて切断する細菌性酵素のことを意味す
る。「熱安定性ポリメラーゼ酵素」という語は、熱に対
して安定し、耐熱性を有し、鋳型核酸鎖に対して相補的
なプライマ延長生成物を形成するのに適切な要領でヌク
レオチドの結合に触媒として作用する（容易にする）酵
素のことを意味する。一般に、プライマ延長生成物の合
成はプライマの３′末端で始まり、合成が終結するまで
鋳型鎖に沿って５′方向に進む。本発明の理解をさらに
容易にするため、本発明の広い概念を例示するため明細
書全体を通して特定の熱安定性DNA ポリメラーゼ酵素が
参考として示されているが、これらの参考は本発明を制
限する意図をもつものではない。頻繁に言及されている
特定の酵素は、明細書で使用されることになる共通の略
号及びそのそれぞれのヌクレオチド及びアミノ酸配列の
配列番号と共に、以下に記されている。
【００２１】
【表１】
【００２２】以上で要約したように、本発明は、天然ポ
リメラーゼの活性から変更された５′→３′エキソヌク
レアーゼ活性を示す熱安定性DNA ポリメラーゼに関す
る。従って、本発明のポリメラーゼは、天然ポリメラー
ゼの活性から強化された５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性又は低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活性の
いずれかを示す。
【００２３】低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活
性を有する熱安定性DNA ポリメラーゼ DNA ポリメラーゼはしばしば多機能を有する。ヌクレオ
チドの重合に加えて、大腸菌（E.coli）DNA ポリメラー
ゼＩ（pol.Ｉ）は、例えばDNA のピロリン酸分解ならび
にホスホジエステル結合の加水分解に触媒として作用す
る。pol Ｉについてはこのような加水分解活性が２つ特
徴づけされている：その１つは３′→５′エキソヌクレ
アーゼ活性であり、もう１つは５′→３′エキソヌクレ
アーゼ活性である。２つのエキソヌクレアーゼ活性はpo
l Ｉ分子の異なる２つのドメインと関連づけられる。し
かしながら、pol Ｉの５′→３′エキソヌクレアーゼ活
性は、熱安定性DNA ポリメラーゼの５′→３′エキソヌ
クレアーゼ活性が自ら作用を及ぼす基質に対しより厳し
い構造的要件を有するという点で、この熱安定性DNA ポ
リメラーゼのものと異なっている。
【００２４】熱安定性DNA ポリメラーゼの５′→３′の
エキソヌクレアーゼ活性についての適切かつ感度の高い
検定は、活性の構造的要件の発見を利用している。この
検定の設計の重要な特徴は、標識された下流オリゴヌク
レオチドプローブのエキソヌクレアーゼ開裂のために適
切な形でポリメラーゼを位置づける上流のオリゴヌクレ
オシドプライマである。重合−非依存性エキソヌクレア
ーゼ活性の検定（すなわちデオキシヌクレオシド三燐酸
が無い状態で行なわれる検定）については、プローブ
は、鋳型に対し相補的なプローブの領域がプライマの
３′末端に直ぐ隣接するような形で位置づけされなくて
はならない。さらに、プローブは、鋳型に対して相補的
でない少なくとも１つ、好ましくは２〜10の又最も好ま
しくは３〜５のヌクレオチドをプローブの５′末端に含
んでいるべきである。
【００２５】鋳型に対してアニーリングされた時プライ
マとプローブの組合せは、ニックの３′−ヒドロキシル
５′及びニックの置換された一本鎖３′を伴うニックを
含む２本鎖構造を作り出す。あるいは、検定は、重合依
存性反応として行なうことができ、この場合、各々のデ
オキシヌクレオシド三燐酸が１μＭ〜２mM好ましくは10
μＭ〜200 μＭの濃度で含まれるべきであるが、ただ
し、鋳型配列によって命じられる通りに、制限されたdN
TPの添加（従って、制限されたdNTPの含有）が関与する
可能性もある。dNTPが存在する中で検定が行なわれる場
合、必要な構造的条件は、ポリメラーゼによる鋳型の相
補的鎖の合成を誘導するための上流のオリゴヌクレオチ
ドプライマ、及び上流プライマを延長する過程において
ポリメラーゼによる接触を受けることになる標識づけさ
れた下流のオリゴヌクレオチドプローブである。重合−
非依存的熱安定性DNA ポリメラーゼ５′→３′エキソヌ
クレアーゼ検定の一例が、以下に記されている。
【００２６】合成３′リン酸化オリゴヌクレオチドプロ
ーブ（ポリメラーゼ延長を排除するためにリン酸化され
たもの）BW33（GATCGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCp)
(配列番号：13)(100pmol)を、ガンマー〔32Ｐ〕ATp(300
0Ci/mmol)及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより
５′末端において32Ｐ−標識した。反応混合物をフェノ
ール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、
その後エタノール沈澱を行なった。32Ｐ標識されたオリ
ゴヌクレオチドプローブを 100μｌのTE緩衝液内に再溶
解させ、取り込まれなかったATP をSephadex G-50 スピ
ンカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィによって除去
した。
【００２７】32Ｐ標識されたBW33プローブ５pmolを、10
mMのトリス−HCl (pH 8.3)、50mMのKCl 及び３mMのMgCl
2 を含む 100μｌの反応混合物中で５pmolの合成オリゴ
ヌクレオチドプライマBW37 (GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAG
CGGTCA)(配列番号：14) の存在下で５pmolの一本鎖M13m
p10w DNAにアニーリングした。アニーリング混合物を５
分間95℃まで加熱し、10分間70℃で冷却し、さらに10分
間70℃で保温し、次に30分間Perkin-Elmer Cetus DNAサ
ーマルサイクラーの中で25℃まで冷却した。10μｌのア
ニーリング混合物を含むエキソヌクレアーゼ反応混合物
を１分間70℃で予備保温した。予備保温反応物に 2.5μ
ｌの体積で熱安定性DNA ポリメラーゼ酵素（DNA ポリメ
ラーゼ活性約0.01〜１単位、又は 0.005〜0.05pmolの酵
素）を加え、反応混合物を70℃で保温した。
【００２８】１分及び５分後にアリコート（５μｌ）を
取り出し、１μｌの60mMEDTAを添加して停止させた。反
応生成物をホモクロマトグラフィで分析し、オートラジ
オグラフィに従ってエキソヌクレアーゼ活性を数量化し
た。Polygram CEL300DEAE セルロース薄層クロマトグラ
フィ板上で７Ｍの尿素中２％の部分的に加水分解された
酵母RNA を含むホモクロマトグラフィ混合物中で、クロ
マトグラフィを行なった。５′→３′エキソヌクレアー
ゼ活性が存在する結果、32Ｐ標識されたオリゴマーが生
成されることになり、このオリゴマーはTLC 板を上へ移
動し、オートラジオグラム上で、原点にとどまっている
未分解プローブから容易に区別される。
【００２９】熱安定性DNA ポリメラーゼの５′→３′エ
キソヌクレアーゼ活性は、二本鎖DNA の５′末端領域を
切除し、逐次的に５′−モノ−及びオリゴヌクレオチド
を解放する。エキソヌクレアーゼのための好ましい基質
は、除去された(displaced)一本鎖DNA であり、ここ
で、除去された(displaced) 一本鎖DNA と二重らせんDN
A の間ではホスフォジエステル結合の加水分解が発生し
ている。好ましいエキソヌクレアーゼ開裂部位は、２重
らせん領域内のホスフォジエステル結合である。従って
エキソヌクレアーゼ活性は、構造依存型一本鎖エンドヌ
クレアーゼ(SDSSE) としてより良く描写することができ
る。
【００３０】Taq. Tma , Tsps17, TZ05, Tth 及びTaf
を含め数多くの熱安定性ポリメラーゼがこの５′→３′
エキソヌクレアーゼ活性を示す。５′→３′エキソヌク
レアーゼ活性を有する熱安定性ポリメラーゼがPCR 法に
おいて利用される場合、生産される生成物の量の制限、
長いPCR 生成物を生成するか又は有意な二次構造を含む
領域を増幅する能力の障害、シャドウバンドの生成又は
DNA 配列決定中の望ましい終結バンドの信号強度の低
下、２本鎖プライマ−鋳型複合体の情況内でのオリゴヌ
クレオチドプライマの５′末端の分解、オリゴヌクレオ
チド誘導突然変異誘発中のニックトランスレーション合
成、及びRNA : DNA ハイブリッドのRNA 成分の分解、を
含むさまざまな望ましくない結果が観察されている。
【００３１】生成されたPCR 生成物の量の制限は、そう
でなければ指数的な生成物の蓄積におけるプラトー現象
のせいである。このようなプラトー現象は、一部には、
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を伴うポリメラーゼ
がPCR 基質上でフォーク状構造と遭遇したとき５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性がホスフォジエステル結合
の開裂又は加水分解をひき起こすために起こるものであ
る。このようなフォーク状構造は一般に或る種のＧ及び
Ｃが豊富なDNA 鋳型の中に存在する。これらの状況下で
のこれらのホスフォジエステル結合の開裂は、PCR法に
よるある種のＧ−及びＣが豊富な標的の増幅を排除する
ことから、望ましくないものである。さらにホスフォジ
エステル結合の開裂は同様に、生成物の鎖濃度及び再生
動態がフォーク状構造基質を生じさせる場合にPCR の後
期サイクルの生成におけるプラトー現象にも寄与する。
【００３２】DNA 配列決定の状況下で、DNA 延長反応中
のホスフォジエステル結合の開裂が「偽停止」をひき起
こすことから、DNA ポリメラーゼの５′→３′エキソヌ
クレアーゼ活性はここでもフォーク状構造の鋳型で障害
となる。一方これらの「偽停止」はシャドウバンドに寄
与し、極端な場合には、正確且つ解釈が可能な配列デー
タが不在をもたらしうる。２本鎖プライマ−鋳型複合体
と共にPCR 法で利用された場合、DNA ポリメラーゼの
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は、オリゴヌクレオ
チドプライマの５′−末端の分解をもたらしうる。この
活性は、PCR において望ましくないものであるばかりで
なく第２鎖cDNA合成及び配列決定法においても望ましく
ない。
【００３３】最適な効率のオリゴヌクレオチド誘導突然
変異誘発法の間、使用されるDNA ポリメラーゼは、鎖除
去(strand-displacement) 合成及び／又はニックトラン
スレーション能力を有していてはならない。従って、オ
リゴヌクレオチド誘導型突然変異誘発に用いられるポリ
メラーゼにおける５′→３′のエキソヌクレアーゼ活性
の存在も又同様に望ましくないことである。最後に、ポ
リメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は一般
に同様に固有のRNase H 活性も含んでいる。しかしなが
ら、RNA : DNA ハイブリッドを含むPCR 法におけるよう
にポリメラーゼが逆転写酵素としても使用されなくては
ならない場合、このような固有のRNase H 活性は不利な
ものでありうる。
【００３４】従って、本発明の一態様には、大幅に減少
もしくは低下された又は完全に除去された５′→３′エ
キソヌクレアーゼ活性を示す熱安定性DNA ポリメラーゼ
変異体の生成が含まれる。このような変異体熱安定性DN
A ポリメラーゼは、PCR 、第２鎖cDNA合成、配列決定及
びオリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発といった方法に
おいて使用するのにより適切かつ望ましいものとなるだ
ろう。５′→３′エキソヌクレアーゼ活性が低下又は除
去された熱安定性DNA ポリメラーゼ変異体の生産は、部
位特異的突然変異誘発及び欠失突然変異誘発といった方
法によって達成できる。
【００３５】例えば、Taq DNA ポリメラーゼのアミノ酸
配列内の残基46におけるGly のコドンの第２の位置での
ＧからＡの部位特異的変異（すなわちDNA 配列における
Ｇ（137)から（Ａ）の変異）は、５′→３′エキソヌク
レアーゼ活性の約1000分の１の減少をもたらし、ポリメ
ラーゼ活性、プロセシング可能性又は延長速度には見か
けの変化が全く無いということがわかった。Taq DNAポ
リメラーゼのヌクレオチド配列のこの部位特異的変異は
Gly (46)からAsp へのアミノ酸変化をもたらす。Taq D
NAポリメラーゼのグリシン46はテルムス（Thermus)スペ
ーシスsps17DNAポリメラーゼ内で保存されているが、残
基43に位置しており、同じGly からAspへの変異はTsps1
7DNA ポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活
性に対し同様の効果をもつ。Tth (Gly46) 、TZ05 (Gly4
6)、Tma (Gly37) 及びTaf (Gly37) DNA ポリメラーゼの
保存されたGly のAsp へのこのような変異は、これらの
ポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性に対
しても類似の低下効果をもつ。
【００３６】Tsps17 Gly43, Tth Gly46, TZ05 Gly46,
Tma Gly37及びTaf Gly37 は、同様に、保存されたＡ
（Ｖ／Ｔ）YG（配列番号：15) 配列ドメイン内にも見い
出され、いずれのポリメラーゼのこの保存された配列ド
メイン内でのグリシンのアスパラギン酸への変化も５′
→３′エキソヌクレアーゼ活性を低下されることが予想
される。具体的に言うと、Tsps17 Gly43, Tth Gly46,
TZ05 Gly46, 及びTaf Gly37 はAVYG配列ドメインを共有
し、Tma Gly37 はATYGドメイン内に見出される。
【００３７】保存されたＡ（Ｖ／Ｔ）YG (配列番号：1
5）ドメインを含むその他の熱安定性DNA ポリメラーゼ
におけるグリシンからアスパラギン酸への変異は、Taq
ポリメラーゼの部位特異的変異誘発のために用いられる
ものと同じ原理及び技術を利用して達成されうる。この
ような部位特異的変異誘発技術の例としては、1990年５
月15日付出願の米国出願第 523,394号の例５，1991年９
月27日付出願の弁理士事件整理番号第2583.1号の例４，
1989年12月22日付出願の米国出願第 455,967号の例４及
び５、ならびに1991年８月13日付のPCT 出願第91105753
号の例５及び８がある。
【００３８】このような部位特異的変異誘発は一般に、
部位特異的プライマ誘導変異誘発によって達成される。
この技術は現在当該技術分野において標準的なものであ
り、望まれる突然変異を表わす制限された誤対合を除い
て突然変異誘発されるべき一本鎖ファージDNA に対し相
補的な合成オリゴヌクレオチドプライマを用いて行なわ
れる。簡単に言うと、プラスミド又はファージに対し相
補的な鎖の合成を誘導するためのプライマとして、合成
オリゴヌクレオチドが用いられ、得られる２重鎖DNA
は、ファージ支持宿主細菌に形質転換される。形質転換
された細菌の培養は、ファージを宿す単細胞からのプラ
ーク形成を可能にする上部寒天培地内で平板培養される
か或いは又、プラスミドベクターのための薬物選択的培
地上で平板培養される。
【００３９】理論的には、新しいプラークの50％が一本
鎖として変異された形態を有するファージを含み、50％
はもとの配列を有する。プラークはニトロセルロースフ
ィルターに移送され、「リフト」は、正確な対合のハイ
ブリッド形成を可能にするがもとの鎖との誤対合がハイ
ブリッド形成を妨げるのに充分であるような温度で、キ
ナーゼ付加された合成プライマとハイブリッド形成させ
られる。次に、プローブとハイブリッド形成するプラー
クが採取され、培養され、そしてDNA が回収される。
【００４０】以下に記述する構成においては、プラスミ
ド構成のための正しい連結は、連結混合物で大腸菌（E.
Coli）DG98, DG101, DG116、又はその他の適切な宿主
をまず形質転換することによって確認される。成功した
形質転換体は、当該技術分野において理解されているよ
うに、プラスミド構成の様式に応じて、アンピシリン、
テトラサイクリンその他の抗生物質耐性によって、或い
は又その他の標識を用いて選択される。次に形質転換体
からのプラスミドを、Clewell, D.B他、Proc,Natl, Aca
d, Sci (USA) (1969年) 62：1159の方法に従って、又
任意にはクロラムフェニコール増幅（Clewell, D.B.,J.
Bacteriol. (1972年）110 ：667)に従って調製する。次
に、分離されたDNA は制限酵素により分析され、そして
／又は、Messing 、他のNucleic Acid. Res. (1981年）
９：309 又はMaxam その他のMethods in Enzymology
（酵素化学方法（1981年）65；499 によってさらに記述
されているように、Sanger, F., 他、Proc. Natl. Aca
d. Sci. (USA)（1977年）74：5463のジデオキシ（チェ
ーンターミネータ）法によって配列決定される。
【００４１】クローニング及び配列決定のため及びほと
んどのlac 又は PL プロモータの制御下での構成の発現
のためには、大腸菌（E. coli）DG98, DG98, DG101, D
G116を宿主として用いた。 PL N RBS プロモータの制御
下での発現のためには、大腸菌（E. coli）Ｋ12 MC100
0 ラムダ溶原株、N7N53cI857 Sus P80, ATCC39531 を使
用することができる。ここで、変更された５′→３′エ
キソヌクレアーゼ活性をもつ熱安定性DNA ポリメラーゼ
の発現のために用いられる宿主の例としては、1987年４
月７日にATCCに寄託された（ATCC53606)E.ColiDG116 及
び1985年３月29日にATCCに寄託された (ATCC53075)E.Co
liKB2 がある。
【００４２】Ｍ13ファージ組換え体としては、大腸菌
（E.coli）Ｋ12菌株DG98といったようなファージ感染を
受ける可能性のある大腸菌（E. coli）菌株が使用され
る。DG98菌株は、1984年７月13日にATCCに寄託され、39
768 という受入れ番号をもつ。哺乳動物の発現は、COS-
7, COS-A2, CV-1 及びマウス細胞内で達成され、昆虫細
胞ベースの発現はスポドプテラ・フルギペイダ（Spodop
tera frugipeida)内で達成されうる。
【００４３】本発明の熱安定性DNA ポリメラーゼは一般
に、プラスミドPLSG33の特徴を含む大腸菌（E. coli）
DG116 から純化される。一次的特徴は、温度調節される
プロモータ（λP L プロモータ）、温度調節されるプラ
スミドベクター、正のレトロレギュレーション（retro-
legulatory）要素（PRE) (1987年５月19日付発行の米国
特許第4,666,848 号参照）及び熱安定性DNA ポリメラー
ゼ遺伝子の変更形態である。米国特許出願第 455,967号
明細書の46ページに記載されているように、pLSG33は、
pLSG24のNdeI -Bam HI制限フラグメントを発現ベクタpD
G178に連結することによって調製された。
【００４４】得られたプラスミドはアンピシリン耐性を
もち、本発明の熱安定性DNA ポリメラーゼの５′→３′
エキソヌクレアーゼ欠損形態を発現することのできるも
のである。10リットルの発酵用の種母フラスコは、トリ
プトン（20ｇ／ｌ）、イーストエキス（10ｇ／ｌ），Na
Cl（10ｇ／ｌ）及び 0.005％のアンピシリンを含んでい
る。種母フラスコは、寒天培地板からのコロニーから接
種されるか或いは又、凍結したグリセロール保存培養物
を用いることも可能である。種母は 0.5〜1.0O.D.（Ａ
680)まで増殖させられる。発酵内へ接種される種母培養
物の量は、細菌の最終濃度がリットルあたり１mgの乾燥
重量となるように計算される。
【００４５】10リットルの増殖培地には、25mMのKH2P
O4、10mMの（NH4)2 SO4 、４mMのくえん酸ナトリウム、
0.4mMのFeCl2 、0.04mMのZnCl2 、0.03mMのCoCl2 、0.
03mMのCuCl2 及び0.03mMのH3BO3 が含まれている。以下
の無菌成分が付加される：４mMのMgSO4 、20ｇ／ｌのグ
ルコース、20mg／ｌのチアミン−HCl 及び50mg／ｌのア
ンピシリン。pHはNaOHで 6.8に調整され、NH4OH の添加
によって発酵中に制御された。グルコースは発酵中、NH
4OH の添加と連係して連続的に添加される。発泡は、消
泡剤として必要なだけポリプロピレングリコールを添加
することによって制御される。溶存酸素濃度は40％に維
持される。
【００４６】発酵物は上述のように接種され、培養物は
21（Ａ680)の光学濃度に達するまで30℃で増殖させられ
る。次に、望まれるポリメラーゼの合成を誘発するため
温度を37℃まで上昇させる。誘導後８時間増殖を続行
し、次に細胞は向流ろ過とそれに続く遠心分離を用いて
の濃縮によって収穫される。得られた細胞ペーストは−
70℃で凍結され、約 500グラムの細胞ペーストが得られ
る。相反する指示の無いかぎり、全ての精製段階は、４
℃で行なわれる。
【００４７】上述のようなプラスミドpLSG33を宿す凍結
（−70℃) 大腸菌（E. coli)K12 菌株DG116 又はその他
の適切な宿主の一部分を一晩−20℃にまで暖める。細胞
ペレットに対し、次の試薬を付加する：１体積の２×TE
（100mM のトリス−HCl, pH7.5, 20mMのEDTA），１mg／
mlのロイペプチン及び 144mMのPMSF（ジメチルホルムア
ミド中）。ロイペプチンの最終濃度は１μｇ／mlであ
り、PMSFについては 2.4mMであった。好ましくは、ジチ
オトレイトール（DTT)をTE内に含めて１mM DTTの最終濃
度を提供する。混合物は、混合機の中で低速で均質化さ
れる。使用に先立ち全てのガラス製品は乾熱しておき、
精製に用いる溶液はできれば使用に先立って加圧滅菌し
ておく。細胞は10000psiでMicro flui-dizerに２度通過
させることによって溶菌させる。
【００４８】溶菌液は、細胞湿潤重量の 5.5×の最終体
積に至るまで、１mMのDTT を含む１×TEで希釈する。１
μｇ／mlまでロイペプチンを添加し、 2.4mMまでPMSFを
添加する。最終体積（分画Ｉ）は約1540mlである。一般
に硫酸アンモニウムを徐々に 0.2Ｍ（26.4ｇ／ｌ）にな
るまで添加し、そして溶菌液を攪拌する。硫酸アンモニ
ウムを添加した時点で、以下に記すポリエチレンイミン
（PEI)沈澱段階に先立って除去される沈降物が形成され
る。硫酸アンモニウム沈降物は、20分間JA−14ロータの
中で 15000〜20000 ×ｇで懸濁液を遠心分離することに
よって除去される。上澄みは、デカントされ保持され
る。次に硫酸アンモニウムの上澄みを、それが75℃に達
するまで加熱プレート上で攪拌し、次に77℃の浴内に置
き、そこで15分間場合によって攪拌を加えながら保持す
る。次に上澄みを氷浴の中で20℃まで冷却し、PEI 検定
のため10mlのアリコートを取り出す。
【００４９】0.3％のPEI(BDH からPolymin P として市
販されている）が〜90％の高分子DNA 及びRNA を沈澱さ
せる、すなわちいかなるDNA バンドもPEI 処理後の臭化
エチジウムで染色されたアガロースゲル上に見えないと
いうことを確認するため、PEI 検定及びアガロースゲル
電気泳動が用いられる。10％の保存溶液から 0.3％まで
攪拌しながらゆっくりとPEI を加える。PEI 処理された
上澄みを、JA-14 ロータ内で20分間、10000RPM(17000×
ｇ）にて遠心分離する。上澄みをデカントし、そして保
持する。この体積（分画II）は約1340mlである。
【００５０】分画IIを、 0.2Ｍの硫酸アンモニウムを含
むTEの６〜10カラム体積での平衡化の後の 2.6×13.3cm
（71ml）のフェニルセファロースCL-4B （Pharmacia-LK
B)カラム上に負荷する。このとき10cm／時の線形流速で
分画IIを負荷する。流速は 0.9ml／分である。カラム
は、３カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄し、次に２カラ
ム体積のTEで洗浄して汚染する非DNA ポリメラーゼタン
パク質を除去する。組換え型熱安定性DNA ポリメラーゼ
は、20％のエチレングリコールを含むTE中 2.5Ｍ尿素４
カラム体積で溶出する。標準的な手順に従って、光学的
吸収（Ａ280)，DNA ポリメラーゼ活性検定及びSDS-PAGE
によって、DNA ポリメラーゼを含む分画を識別する。ピ
ーク分画をプールし、そして 0.2ミクロンの無菌真空ろ
過装置を通してろ過する。体積（分画III)は約 195mlで
ある。メーカーの推奨事項に従って、樹脂を平衡化させ
そして再循環使用する。
【００５１】１時間あたり１カラム体積で、６〜10カラ
ム体積の0.05MKCl，50mMのトリス−HCl,pH7.5, 0.1mMの
EDTA及び 0.2％のTween20 により、2.6 ×1.75cm（93m
l）のヘパリンセファロースCl-6B カラム(Pharmacia- L
KB)を均衡化させる。好ましくは、緩衝液は１mMのDTT
を含んでいる。カラムは、３カラム体積の平衡化緩衝液
で洗浄する。本発明の望ましい熱安定性DNA ポリメラー
ゼを、同じ緩衝液内で50-750mMのKCl 勾配の10カラム体
積の直線勾配で溶出させる。無菌管内に分画（10分の１
カラム体積）を収集し、望ましい熱安定性DNA ポリメラ
ーゼを含む分画をプールする（分画IV，体積 177ml）。
【００５２】Amicon YM30 膜上で10mlまで分画IVを濃縮
する。緩衝液交換のため、20mlまで濃縮器を満たし毎回
10mlまで体積を濃縮することによって、 2.5×の貯蔵を
緩衝液（50mMのトリス−HCl, pH7.5, 250mM のKCl, 0.2
5mM のEDTA, 2.5mM のDTT 及び 0.5％の Tween-20)で５
回、ダイアフィルトレーション(diafiltration) を行な
う。濃縮器を空にし10mlの 2.5×の貯蔵緩衝液で洗い流
し、この緩衝液は濃縮物と合わさって分画Ｖを提供す
る。
【００５３】残留DNA を除去するためには、陰イオン交
換クロマトグラフィが用いられる。生物学的安全用フー
ドの中で手順を行ない、無菌技術が用いられる。１秒あ
たり約５滴の速度で注射器を用いて30mlの2.5 ×貯蔵緩
衝液で、0.2 ミクロンの無菌使い捨て注射器先端部フィ
ルタユニットを伴うウオーターズ(Waters) Sep-Pakプラ
スQMA カートリッジを平衡化させる。使い捨て注射器を
用いて、１秒あたり約１滴の割合でカートリッジ内に分
画Ｖを通過させ、無菌管内に収集する。カートリッジを
５mlの 2.5ml貯蔵緩衝液で流水洗浄し、空気で押し乾燥
する。80％のグリセロールで溶離剤を 1.5×に希釈し、
−20℃で貯蔵する。得られる最終分画IVのプールは、変
更された５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を伴う活性
熱安定性DNA ポリメラーゼを含んでいる。
【００５４】ヌクレオチド配列の部位特異的変異誘発に
加えて、熱安定性DNA ポリメラーゼの５′→３′エキソ
ヌクレアーゼ活性を低下させるため、欠失変異技術を使
用することも可能である。このような欠失変異の一例と
しては、熱安定性DNA ポリメラーゼの保存されたＡ（Ｖ
／Ｔ）YG（配列番号：15）ドメイン内のグリシンまで
（グリシンを含めて）の全てのアミノ末端アミノ酸の欠
失がある。５′→３′エキソヌクレアーゼ活性に影響を
及ぼす第２の欠失変異は、Taq DNAポリメラーゼ内のAl
a77 までの欠失である。このアミノ酸（Ala77)は、Taq
DNAポリメラーゼの約85.5kDa のタンパク質分解生成物
の中でアミノ末端アミノ酸として同定された。このタン
パク質分解生成物は、いくつかの天然Taq DNAポリメラ
ーゼ調製物中で同定されており、タンパク質は安定して
いるように見える。このようなAla77 までの欠失はGly4
6 を含んでいることから、これはTaq DNAポリメラーゼ
の５′→３′エキソヌクレアーゼ活性にも影響を及ぼ
す。
【００５５】しかしながら、Ala77 で始まる欠失変異体
は、ペプチドが安定状態にとどまることをタンパク質分
解の証拠が示唆しているという点で、フェニルアラニン
47で始まる欠失突然変異体に比べ付加的な利点をもつ。
さらに、Ala77 は、Taq DNAポリメラーゼ内の配列YKA
よりもアミノ酸５個前の配列HEAYG(配列番号：16) 内に
見出される。Tth DNAポリメラーゼ、TZ05 DNAポリメラ
ーゼ及びTsps17 DNAポリメラーゼ内には、類似の配列モ
チーフHEAYE(配列番号：17) が見られる。アラニンは、
保存されたモチーフYKA より５アミノ酸分前である。Ta
q Ala77 に相応するその他の熱安定性DNA ポリメラーゼ
例の中のアミノ酸は、Tth Ala78, TZ05Ala78, Tsps17
Ala74, Tma Leu72 及びTaf Ile73 である。
【００５６】この配列を含むテルムス（Thermus)の種の
熱安定性DNA ポリメラーゼ内のモチーフHEAY（Ｇ／Ｅ)
(配列番号：16又は配列番号：17) 内のアラニン又は対
応するアミノ酸までの欠失は、その５′→３′エキソヌ
クレアーゼ活性を低下させるであろう。５′→３′エキ
ソヌクレアーゼモチーフYKA は同様にTma DNA ポリメラ
ーゼ（アミノ酸76-78)及びTaf DNA ポリメラーゼ（アミ
ノ酸77-79)の中に保存されている。
【００５７】この熱安定性ポリメラーゼ一族の中では、
保存されたモチーフ（Ｌ／Ｉ）LET(配列番号：18）がYK
A モチーフのすぐ前にある。Taf DNAポリメラーゼIle7
3 はこのYKA モチーフより残基５個分前にあり、一方TM
A DNA ポリメラーゼLeu72 は、YKA モチーフより残基５
個分前にある。テルモタガ（Thermotoga）又はテルモシ
ポ（Thermosipho)属からの熱安定性DNA ポリメラーゼ内
のモチーフ（Ｌ／Ｉ）LETYKA (配列番号：19）内のLeu
又はIle の欠失は同様に５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性を低下させるであろう。
【００５８】かくして、テルムス（Thermus)属のDNA ポ
リメラーゼならびにテルモタガ（Thermotoga）及びテル
モシポ（Thermosipho)のDNA ポリメラーゼの５′→３′
エキソヌクレアーゼ活性を構成する保存されたアミノ酸
配列が（Ｉ／Ｌ／Ａ）Ｘ3 YKA(配列番号：20)(なおここ
でＸ3 は３つのアミノ酸のいずれかの配列である）とし
て同定された。従って熱安定性DNA ポリメラーゼの５′
→３′エキソヌクレアーゼ活性は同様に、この保存され
たアミノ酸ドメインを変異させることによっても変える
ことができる。当業者であれば、組換え宿主細胞内でこ
のような欠失変異体が発現される場合、メチオニンコド
ンがつねにコード配列の５′末端に置かれ、従って欠失
変異体タンパク質のアミノ末端配列は上述のテルムス
（Thermus)属内で MET-ALAとなる、ということがわか
る。
【００５９】欠失変異を行なうための好ましい技術に
は、熱安定性DNA ポリメラーゼのヌクレオチド配列上の
既知の制限部位の利用が含まれる。欠失すべき特定の１
又は複数のアミノ酸の同定に続いて、欠失されるべきア
ミノ酸又はドメインに対応する位置またはその位置に対
しわずかに３′遠位の位置で標的DNA 配列の開裂をひき
起こすがしかし望まれるポリメラーゼのその他の特性を
コードするドメインを、開裂された時に保持するような
制限部位が同定される。
【００６０】あるいは、標的アミノ酸又はドメインをコ
ードする配列のいずれかの側（５′又は３′）上の制限
部位を利用してその配列を開裂させることも可能であ
る。しかしながら、この場合、次に配列の２つの望まし
い部分の連結が必要となる。この連結は、当該技術分野
では標準的なものであり1990年５月15日付出願の米国出
願第 523,394号の例９，1991年８月13日付出願のPCT 出
願明細書第91/05753号の例７、及び1990年９月28日付出
願の米国特許出願第590490号に例示されている技術を用
いて行なうことができる。
【００６１】熱安定性DNA ポリメラーゼの欠失変異を達
成するためのもう１つの技術は、PCR 変異誘発法を利用
することによるものである。この方法においては、制限
部位ドメイン及び任意的にはメチオニンコドンがすでに
存在していない場合このコドンを取り込むプライマが調
製される。かくして、このプライマによるPCR 生成物
は、酵素の５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をコード
するドメインを除去するべく適切な制限酵素で消化され
うる。次に、生成物の２つの残りの区分が連結されて、
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性の欠如した熱安定性
DNA ポリメラーゼのためのコード配列が形成される。こ
のようなコード配列は、５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性の欠如した望ましい熱安定性DNA ポリメラーゼを生
産するため適切な宿主細胞内で発現ベクターとして利用
できる。
【００６２】減少した５′→３′エキソヌクレアーゼ活
性をもつTaq DNAポリメラーゼ変異体に加えて、減少さ
れた５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する末端切
除されたTma DNA ポリメラーゼを、Tma DNAポリメラー
ゼ遺伝子の完全なコード化配列が大腸菌（E. coli）内
の発現ベクター内に存在している場合でさえ組換え技術
によって生産できるということも見出された。このよう
な末端が切除されたTma DNA ポリメラーゼは、位置140
のメチオニンコドンで出発する翻訳によって形成され
る。さらに組換え手段を用いて、Tma コード配列の位置
284 でのメチオニンコドンにおいて翻訳を開始すること
により生産されたタンパク質に相当する末端切除された
ポリメラーゼを生成することが可能である。
【００６３】アミノ酸１〜139 の欠如したTma DNA ポリ
メラーゼ（約86kDa)及びアミノ酸１〜283 の欠如したTm
a DNA ポリメラーゼ（約70kDa)は、ポリメラーゼ活性を
保持しているが、低下した５′→３′エキソヌクレアー
ゼ活性を有する。70kDa のTma DNA ポリメラーゼの付加
的な利点は、それが未変性のTma ポリメラーゼに比べて
有意に熱安定性があるという点にある。かくして無傷の
Tma DNA ポリメラーゼＩ酵素の全配列が活性のために必
要とされることはないということがわかった。Tma DNA
ポリメラーゼＩコード配列の一部分を組換え DNA技術の
中で用いて DNAポリメラーゼ活性をもつ生物学的に活性
の遺伝子生成物を生産することが可能である。
【００６４】さらに、Tma DNA ポリメラーゼ配列をコー
ドするDNA の利用可能性は、同様にDNA ポリメラーゼ活
性をもつが低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活性
を有するミューティン（変異体タンパク質）形態を生成
するべくコード配列を変更する機会を提供する。Tma DN
A ポリメラーゼのアミノ（Ｎ）−末端部分はポリメラー
ゼ活性のために必要なものではないが、むしろタンパク
質の５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をコードする。
かくして、組換え DNA方法を用いて、Tma 遺伝子のＮ末
端コード配列のほぼ最高３分の１まで欠失させ、クロー
ニングし、ポリメラーゼ検定においてきわめて活性であ
るが欠失の範囲に応じて５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性を全くもたない遺伝子生成物を発現することが可能
である。ポリメラーゼのいくつかのＮ末端短縮形態が活
性であることから、これらのポリメラーゼの発現のため
に用いられる遺伝子構成体は、コード配列の対応する短
縮形態を含むことができる。
【００６５】Ｎ末端欠失に加えて、Tma DNA ポリメラー
ゼ又はその他の熱安定性DNA ポリメラーゼのペプチド鎖
内の個々のアミノ酸残基を、酸化、還元又はその他の誘
導体化によって変更することが可能であり、ポリメラー
ゼ活性を保持するが低下した５′→３′エキソヌクレア
ーゼ活性をもつフラグメントを得るためタンパク質を開
裂することもできる。Tma DNA ポリメラーゼコード配列
又はその他の熱安定性DNA ポリメラーゼのコード配列の
一次構造に対して欠失、付加又は変更により修正を行な
い、そのコード配列から生産されたmRNAの翻訳中に熱安
定性DNA ポリメラーゼへと取り込まれるアミノ酸を変化
させることは、タンパク質の高温DNA ポリメラーゼ活性
を破壊することなく行なうことができる。
【００６６】低下した又は増強された５′→３′エキソ
ヌクレアーゼ活性のごとき新規の性質を含む熱安定性DN
A ポリメラーゼを調製するためのもう１つの技術は、
「熱安定性キメラDNA ポリメラーゼ」の構成のための
「ドメインシャフリング（混合）」技法である。例え
ば、Taq DNA ポリメラーゼＩコドン 289-422に換えて約
291〜約484 のコドンを含むTma DNA ポリメラーゼコー
ド配列を用いることは、TaqDNAポリメラーゼの３′→
５′エキソヌクレアーゼドメイン(1-289) 、Tma DNAポ
リメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼドメイン(2
91〜484)及びTaq DNAポリメラーゼの DNAポリメラーゼ
ドメイン(423〜832)を含有する新規な熱安定性DNAポリ
メラーゼを生み出すことになる。あるいは、Tma DNA ポ
リメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼドメイン及
び３′→５′エキソヌクレアーゼドメイン (およそ、コ
ドン1-484)を、Taq DNA ポリメラーゼのDNA ポリメラー
ゼ（dNTP結合及びプライマ／鋳型結合ドメイン）部分
（およそ、コドン 423-832) に融合させることができ
る。
【００６７】ここでわかるように、「ドメインシャッフ
リング」による「熱安定性キメラ DNAポリメラーゼ」の
生成のための供与体と受容体はTaq 及びTma DNA ポリメ
ラーゼに制限される必要はない。その他の熱安定性ポリ
メラーゼは、Taq 及びTma DNA ポリメラーゼと類似のド
メインを提供する。その上、５′→３′エキソヌクレア
ーゼドメインは、変更された５′→３′ヌクレアーゼ活
性をもつ熱安定性 DNAポリメラーゼから誘導されうる。
例えば、Taq DNA ポリメラーゼの１〜 289 の５′→
３′ヌクレアーゼドメインは、Taq ポリメラーゼ遺伝子
のGly (46)からAsp への変異体形態から誘導されうる。
同様に、Tma DNA ポリメラーゼの５′→３′ヌクレアー
ゼ及び３′→５′ヌクレアーゼドメインは５′→３′エ
キソヌクレアーゼ欠損ドメインをコードし、Tma Gly (3
7)→Asp アミノ酸１〜484 をコードするDNA フラグメン
ト、又はこれに代えて末端切除形Met140〜アミノ酸484
をコードするDNA フラグメントとして取出すことができ
る。
【００６８】さまざまな手段のいずれを用いてもキメラ
DNA ポリメラーゼコード配列（新しい特性をもつもの）
を生成することができるが、好ましい方法は「オーバー
ラップ」PCR を利用する。この方法においては、意図さ
れた連結部配列はPCR プライマ内（その５′末端で）に
盛り込まれている。個々のドメインの初期増幅に続い
て、さまざまな生成物が希釈され（約 100〜1000倍）、
組合わされ、変性され、アニーリングされ、延長され、
その後、そうでなければ標準的なPCR のために最終的順
方向及び逆方向プライマが付加される。
【００６９】当業者であれば、低下した５′→３′エキ
ソヌクレアーゼ活性をもつ上述の熱安定性DNA ポリメラ
ーゼが組換えDNA 技法によって最も容易に構築されると
いうことを認識することだろう。低下した５′→３′エ
キソヌクレアーゼ活性をもつ本発明に従った変異体酵素
の１つ又はこれらの酵素の誘導体又は相同体を生産した
い場合、酵素の組換え体形態を生産することには、発現
ベクターの構成、ベクターを用いた宿主細胞の形質転換
及び発現が発生するような条件下での形質転換された宿
主細胞の培養が、典型的には含まれる。
【００７０】発現ベクターを構成するためには、成熟
（ここでは全てのキメラ又はミューテインを含む）酵素
又は、活性を破壊しない付加的な配列への又は活性タン
パク質を与えるための（ペプチダーゼでの処理といっ
た）制御された条件下で開裂可能な付加的な配列への変
異体ポリメラーゼの融合をコードするDNA が得られる。
次に、コード配列は、発現ベクター内で適当な制御配列
との作動的連鎖状態に置かれる。ベクターは、宿主細胞
内で自律的に複製するように、又は宿主細胞の染色体DN
A 内に組込まれるように設計され得る。適切な宿主を形
質転換するためにこのベクターが用いられ、形質転換さ
れた宿主は、組換え型ポリメラーゼの発現に適した条件
下で培養される。
【００７１】前述の段階の各々はさまざまな方法で行な
うことができる。例えば、ゲノムフラグメントから望ま
しいコード配列を得、これを直接適切な宿主内で使用す
ることが可能である。さまざまな宿主内で作動的な発現
ベクタのための構成は、以下に一般的に記述するように
レプリコン及び制御配列を用いて行なわれる。望ましい
コード化及び制御配列を含む適切なベクターの構成は、
当該技術分野において充分に理解されている標準的な連
結及び制限技術を利用する。単離されたプラスミド、DN
A 配列又は合成オリゴヌクレオチドは開裂され、変更さ
れ、望ましい形に再連結される。適当な制限部位は、通
常得られない場合、以下に例示するように発現ベクター
の構成を容易にするべくコード配列の端部に付加するこ
とが可能である。
【００７２】部位特異的DNA 開裂は、当該技術分野にお
いて一般に理解されており又市販の制限酵素のメーカー
が規定しているような条件の下で適当な制限酵素（１又
は複数）で処理することによって行なわれる。例えばNe
w England Biolabs 、製品カタログを参照のこと。一般
に、約１μｇのプラスミド又はその他のDNA が約20μｌ
の緩衝液中で酵素１単位によって開裂される。以下の例
では、DNA の完全な消化を確保するために過剰の制限酵
素が使用されている。
【００７３】約37℃で約１時間から２時間の保温時間が
標準的であるが、変更も許容できる。各保温の後、タン
パク質はフェノール及びクロロホルムでの抽出により除
去される；この抽出の後には、エーテル抽出及びエタノ
ールでの沈澱による水性分画からのDNA の回収を続行う
ことができる。望ましい場合には、開裂された分画のサ
イズ分離を、標準技法を用いたポリアクリルアミドゲル
又はアガロースゲル電気泳動法によって行なうことも可
能である。例えばMethods in Enzymology,1980年，65；
499-560を参照のこと。
【００７４】一本鎖の「突出」末端を有する制限開裂さ
れたフラグメントは、50mMのトリス−Cl pH7.6，50mMの
NaCl，10mMのMgCl2, 10mM のDTT 及び５〜10μＭのdNTP
の中で20℃〜25℃、約15〜25分の保温時間を用いて４つ
のデオキシヌクレオシド三燐酸（dNTP）の存在下で大腸
菌（E. coli）DNA ポリメラーゼＩ（クレノウ）の大フ
ラグメントで処理することにより、平滑末端（２本鎖末
端）にすることができる。Klenowフラグメントは５′の
突出末端でフィルインするが、たとえ４つのdNTPが存在
する場合でも、突出する３′一本鎖をチューバックす
る。
【００７５】望ましい場合には、突出末端の性質によっ
て課せられる制限条件の範囲内でdNTPs のうちの１つだ
けつまり選択されたものだけを供給することにより、選
択的修復を行なうことが可能である。Klenowでの処理の
後、混合物はフェノール／クロロホルムで抽出され、エ
タノール沈澱される。Ｓ１ヌクレアーゼを用いた適切な
条件下での処理は核酸の全一本鎖部分の加水分解をもた
らすから、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて類似の結果を達成
することも可能である。
【００７６】Mafteuci他、1981. J. Am. Chem. Soc.
103 ：3185-3191 のトリエステル方法、或いは又自動合
成方法を用いて、合成オリゴヌクレオチドを調製するこ
とが可能である。アニーリングに先立つ又は標識づけの
ための一本鎖のキナーゼ付加は、50mMのトリス、pH7.6,
10mMの MgCl2, ５mMのジチオトレイトール(DTT）、及び
１〜２μＭのATP の存在下で 0.5μＭの基質に対し余剰
の、例えば約10単位のポリヌクレオチドキナーゼを用い
て達成される。キナーゼ付加がプローブの標識づけのた
めである場合、ATP は高い比活性のγ- 32Ｐを含むこと
になる。
【００７７】以下の標準的条件及び温度で15〜30μｌの
体積で連結が行なわれる：20mMのトリス−Cl，pH7.5, 1
0mM のMgCl2, 10mM のDTT , 33μｇ／mlのBSA,10mM〜50
mMのNaCl及び（相補的一本鎖末端を伴うフラグメントの
連結のため）０℃で0.01〜0.02（Weissl単位のＴ４ DNA
リガーゼと40μＭのATP 、又は（「平滑末端」連結のた
め）14℃で 0.3〜0.6 単位のＴ４ DNAリガーゼと１mMの
ATP のいずれか。相補的末端を伴うフラグメントの分子
間結紮は、通常33〜100 μｇ／mlの合計 DNA濃度（５〜
100nM の合計末端濃度）で行なわれる。分子間鈍端結紮
（通常、任意で20〜30倍のモル余剰リンカーを用いる）
は、１μＭの合計末端濃度で行なわれる。
【００７８】ベクター構成において、ベクターフラグメ
ントは一般に、５′リン酸を除去しベクターの再連結及
び再構成を防ぐため、細菌又は子ウシの腸内アルカリ性
ホフファターゼ（BAP 又はCIAP）で処理される。BAP 及
びCIAP消化条件は当該技術分野において周知のものであ
り、公表されたプロトコルが通常、市販のBAP 及びCIAP
酵素に付随してくる。核酸フラグメントを回収するため
には、調製物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エ
タノール沈澱してホスファターゼを除去しDNAを精製さ
せる。
【００７９】あるいは、適切な制限サイトが利用可能で
ある場合、連結前後の制限酵素消化により、望ましくな
いベクターフラグメントの再連結を防ぐことができる。
配列変更を必要とするコード配列又はベクターの一部分
については、さまざまな部位特異的、プライマ誘導的な
変異誘発方法が利用可能である。ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR)を、部位特異的変異誘発を行なうために使用する
ことが可能である。現在当該技術分野において標準的な
ものであるもう１つの技術においては、望まれる突然変
異をコードする合成オリゴヌクレオチドが、変異誘発プ
ライマの延長生成物の構成のために鋳型として用いられ
るPBS 13+ のごとき一本鎖ベクターの相補的核酸配列の
合成を誘導するためのプライマとして用いられる。
【００８０】変異誘発されたDNA は、宿主細菌に形質転
換され、形質転換された細菌の培養物はプレートされ同
定される。変更されたベクターの同定には、ニトロセル
ロースフィルタ又はその他の膜に対する選択された形質
転換体のDNA の移行、及び変更された配列に対する正確
な対合のハイブリッド形成を可能にするがしかしもとの
鎖とのハイブリッド形成を妨げるような温度でキナーゼ
付加された合成プライマとハイブリッド形成された「リ
フト」が関与することが考えられる。プローブとハイブ
リッド形成するDNA を含む形質転換体が次に培養され、
変更されたDNAの溜めとして役立つ。
【００８１】以下に記される構成においては、プラスミ
ド構成のための適正な連結は、まず連結混合物で大腸菌
（E. coli) DG101又はその他の適切な宿主を形質転換す
ることによって確認される。成功した形質転換体は、当
該技術分野では周知の通り、プラスミド構成様式に応じ
て、アンピシリン、テトラサイクリン又はその他の抗生
物質耐性又は感受性又はその他の標識を用いることによ
って選択される。形質転換体からのプラスミドは次に、
Clewell 他.,1969年、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 62：
1159の方法に従って、任意にはクロラムフェニコール増
幅（Clewell, 1972 年, J.Bacterial.110 ：667)に従っ
て調製される。
【００８２】プラスミドDNA を得るためのもう１つの方
法は、Bethesda Research Laboratories刊行物 Focus、
第５巻、第２号の11ページに「塩基−酸」抽出方法とし
て記述されており、プロトコルの段階12〜17を、DNA の
CsCl／臭化エチジウム超遠心分離で置き換えることによ
って、非常に純粋なプラスミドDNA を得ることができ
る。分離されたDNA は、制限酵素消化によって分析さ
れ、及び／又はMessing 他、1981年、Nuc. Acids Res
. 9 ：309 によってさらに詳述されているようなSange
r他.,1977年、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 74：5463の
ジデオキシ（チェーンターミネータ）法によってか、或
いは又Maxam 他、1980年、Methods in Enzymology 65
：499 の方法によって配列決定される。
【００８３】制御配列、発現ベクター及び形質転換方法
は、遺伝子を発現するのに用いられる宿主細胞のタイプ
によって異なる。一般に、宿主としては、原核生物、酵
母菌、昆虫又は哺乳動物の細胞が用いられる。原核生物
の宿主は一般に、組換えタンパク質の生産のために最も
効果的で便利なものであり、従って本発明の熱安定性DN
A ポリメラーゼの発現にとって好ましいものである。組
換え型タンパク質を発現するのに最も頻繁に用いられる
原核生物は、大腸菌である。クローニング及び配列決定
のためそして大部分の細菌性プロモータの制御下での構
成の発現のためには、GCSC#6135 として大腸菌（E. col
i)遺伝材料センタから入手できる大腸菌（E. coli)K12
株MM294 を宿主として使用することが可能である。
【００８４】P L N RBS 制御配列を伴う発現ベクタにつ
いては、大腸菌（E. coli） K12株MC1000ラムダ溶原
株、N7N53cI857Sus P80, ATCC39531を用いることができ
る。1987年４月７日にATCCに寄託された(ATCC53606) 大
腸菌（E. coli) DG116及び1985年３月29日にATCCに寄託
された（ATCC53075)大腸菌（E. coli)： KB2も同様に有
用な宿主細胞である。Ｍ13ファージ組換え体について
は、大腸菌（E. coli)K12株DG98といったファージ感染
を受けやすい大腸菌（E. coli)株が使用される。DG98株
は、1984年７月13日にATCCに寄託されている（ATCC3976
8)。
【００８５】しかしながら、本発明の熱安定性DNA ポリ
メラーゼの組換え体発現のためには、バシルス・スブチ
リス（Bacillus subtilis）などのかん菌、さまざまな
シュードモナス（Pseudomonas)の種及びその他の細菌株
といった大腸菌（E. coli)以外の微生物株も用いること
ができる。このような原核生物系においては、宿主又は
宿主と適合性ある種から誘導された制御配列及び複製部
位を含むプラスミドベクタが標準的に用いられる。
【００８６】例えば、大腸菌（E. coli)は典型的には、
Boliver 他., 1977 年、Gene 2 ：95によって記述され
ているpBR322の誘導体を用いて形質転換される。プラス
ミドpBR322はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性の
ための遺伝子を含んでいる。これらの薬物耐性標識は、
望ましいベクタを構成する上で保持することも破壊する
こともでき、従って望まれる組換え体の存在を検出する
助けとなる。一般に使用されている制御配列、すなわ
ち、リボソーム結位部位配列と共に任意には１つのオペ
レータを伴う転写開始のためのプロモータとしては、β
−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトース（la
c)プロモータ系（Chang 他.,1977年、Nature 198 : 1
056)、トリプトファン(trp) プロモータ系（Goeddel
他、1980年 Nuc. Acids Res. 8 : 4057)及びラムダ誘
導型ＰL プロモータ（Shimatake 他、1981年、Nature
292 : 128) 及びＮ−遺伝子リボソーム結合部位 (Ｎ
RBS ) が含まれる。
【００８７】1987年12月８日付発行の米国特許第 4,71
1,845号に、ポータブル式制御システムカセットが記述
されている。このカセットは、ＮRBS 配列の６bp３′内
の開裂を許容する少なくとも１つの制限部位をもつ第３
のDNA 配列の上流に位置するＮ RBS に作動的に連鎖され
たＰL プロモータを含んでいる。同様に有効なのは、19
86年10月８日に公示された欧州特許公開第 196,864号中
にChang 他によって記述されているホスファターゼＡ
（phoA）系である。しかしながら、本発明の変更された
熱安定性DNA ポリメラーゼ発現ベクターを構成するため
には、原核生物と適合性ある入手可能なあらゆるプロモ
ータ系を用いることができる。
【００８８】細菌に加えて、酵母のごとき真核微生物を
組換え宿主細胞として使用することも可能である。サッ
カロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisia
e）の実験用株、つまりパン酵母菌が最も多く用いられ
るが、その他のいくつかの菌株も一般に入手可能であ
る。２ミクロン複製起点を用いるベクターが一般的であ
る（Broach, 1983年、Meth. Enz. 101 ：307)が、酵母
での発現に適したその他のプラスミドベクタも知られて
いる（例えば、Stinchcomb 他、1979年、Nature 282 :
39 ; Tschempe他., 1980 年、Gene 10 : 157 :及びCl
arke他、1983年、Meth. Enz.101: 300を参照のこと）。
酵母ベクターのための制御 配列には、解糖系酵素の合
成のためのプロモータが含まれている（Hess他., 1968
年、J. Adv. Enzyme Req. 7 : 149, Halland 他.,1978
年、Biotec hnology 17 : 4900 ; 及び Halland他., 1
981 年J. Biol. Chem. 256 : 1385)。
【００８９】当該技術分野において知られているさらな
るプロモータとしては、３−ホスフォグリセリン酸キナ
ーゼのためのプロモータ（Hitzeman他., 1980 年、J. B
iolChem. 255 : 2073）、及びグリセルアルデヒド３リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デ
カルボキシラーゼ、ホスフォフラクトキナーゼ、グルコ
ース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスフォグリセリ
ン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸
イソメラーゼ、ホスフォグルコースイソメラーゼ及びグ
ルコキナーゼといったその他の解糖酵素のためのプロモ
ータが含まれる。増殖条件によって制御される転写の付
加的利点をもつその他のプロモータは、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ２、イソサイトクロムＣ、酸性ホスファタ
ーゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、並びにマルトース
及びガラクトースの利用を担う酵素（Halland 、前述）
のためのプロモータ領域である。
【００９０】コード配列の３′末端に置かれたとき、タ
ーミネータ配列も発現強化のために用いることができ
る。このようなターミネータは、酵母由来の遺伝子内の
コード配列に続く３′非翻訳領域内に見い出される。酵
母適合性プロモータ、複製起点及びその他の制御配列を
含むあらゆるベクターが、本発明の熱安定性DNA ポリメ
ラーゼのための酵母発現ベクターの構成に使用するのに
適している。本発明の熱安定性DNA ポリメラーゼをコー
ドするヌクレオチド配列は、多細胞生物に由来する真核
宿主細胞培養物の中でも発現されうる。例えばTissue
Culture, Acadenic Press. Cruz and Patterson,editor
s (1973 年）を参照のこと。有用な宿主細胞系として
は、Cos-７，Cos-A2，CV-1，マウス細胞例えばマウスの
骨髄腫Ｎ51及びVERO，HeLa細胞及びチャイニーズハムス
ターの卵巣（CHO)細胞が含まれる。
【００９１】このような細胞のための発現ベクターに
は、通常、例えば一般に用いられるシミアンウイルス40
（SV40）からの初期及び後期プロモータ（Fiers 他.,19
78年、Nature 273 : 113）又は、ポリオーマウィル
ス、アデノウィルス２、ウシの乳頭腫ウィルス（BPV)又
は鳥類の肉腫ウィルスといったその他のウィルス性プロ
モータ、又は免疫グロブリンプロモータ及びヒートショ
ックプロモータといったような哺乳動物細胞と適合性あ
る制御配列及びプロモータが含まれる。
【００９２】BPV ベクター系を用いた哺乳動物系内でDN
A を発現するための系は、米国特許第 4,419,446号の中
で開示されている。この系の変形態様は、米国特許第
4,601,978号に記述されている。哺乳動物細胞宿主系形
質転換の一般的観点は、Axelの米国特許第4,399,216 号
に記述されている。「エンハンサー」領域も又、発現を
最適化する上で重要である。これらは、一般にプロモー
タ領域の上流に見られる配列である。複製起点は必要と
あらばウィルス性供給源から得ることができる。しかし
ながら、染色体内への統合は、真核生物内のDNA 複製に
とって共通のメカニズムである。
【００９３】植物細胞を宿主として利用することもで
き、ノパリンシンターゼプロモータ及びポリアデニル化
シグナル配列（Depicker他、1982年、J. Mol . Appl,
Gen .1 :561)といった、植物細胞と適合性ある制御配
列が利用可能である。バキュロウィルスベクターによっ
て提供される制御系を用いた昆虫細胞を利用する発現系
も同様に記述されている（Miller他、1986年、Genetic
Engineering (Setlow 他., eds.,Plenum Publishing)8
：277-297)。昆虫細胞ベースの発現はスポドプテラ・
フルグペイダ（Spodoptera frugpeida）内で達成でき
る。これらの系は、同様に本発明の組換え熱安定性ポリ
メラーゼを生産するのに用いることができる。
【００９４】使用する宿主細胞に応じて、このような細
胞に適切な標準的技術を用いて転質転換が行なわれる。
Cohen, 1972 年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 : 21
10により記述されているような塩化カルシウムを用いる
カルシウム処理は、実質的な細胞壁バリヤを含む原核生
物又はその他の細胞のために用いられる。或る種の植物
細胞のためには、アグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス（Agrobacteriumtumefaciens)を用いる感染（Shaw
他., 1983 年、Gene 23 : 315) が用いられる。哺乳動
物の細胞のためには、Graham and van der Eb,1978年、
Virology 52 :546のリン酸カルシウム沈澱方法が好ま
れる。酵母への形質転換は、Van Solingen他、1977年、
J. Bact. 130 ： 946及びHsiao 他、1979年、Proc. Na
tl. Acad. Sci . USA . 76：3829の方法に従って行なわ
れる。
【００９５】組換え宿主細胞内で、変更された５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性を有する望ましい熱安定性
DNA ポリメラーゼがひとたび発現されると、タンパク質
の精製が望まれる可能性がある。本発明の組換え熱安定
性ポリメラーゼを精製するためにはさまざまな精製手順
を用いることができるが、等しい純度の酵素調製物を生
み出すためには、比較的少ない段階しか必要でない可能
性がある。大腸菌 (E. coli)の宿主タンパク質は熱に敏
感であることから、本発明の組換え熱安定性DNAポリメ
ラーゼは、粗溶菌液を熱不活性化することによって著し
く富化することができる。この段階は、宿主DNA からの
熱安定性DNA ポリメラーゼの解離を確実に行ない、熱安
定性DNA ポリメラーゼとその他の細胞溶菌液タンパク質
とのイオン相互作用を減少させるため、充分な量の塩
（標準的には 0.2〜0.3 Ｍの硫酸アンモニウム）の存在
下で行なわれる。
【００９６】さらに、 0.3Ｍの硫酸アンモニウムの存在
は、フェニールセファロースカラムとの疎水性相互作用
を促進する。疎水性相互作用クロマトグラフィは、疎水
性基を含む未負荷のベッド材料との疎水性相互作用の強
度の差に基づいて物質が分離される分離技術である。典
型的には、カラムはまず、高イオン強度のごとき疎水結
合にとって有利な条件の下で平衡化される。次に、試料
を溶出させるため、下降する塩勾配を用いることができ
る。
【００９７】本発明に従うと、（変更された５′→３′
エキソヌクレアーゼ活性をもつ組換え型熱安定性DNA ポ
リメラーゼを含む）水性混合物が、フェニルセファロー
ス（Pharmacia 製）又はPhenyl Tsk（東ソー製）のごと
き比較的強い疎水性ゲルを含むカラム上に負荷される。
フェニルセファロースカラムとの疎水性相互作用を促進
するため、 0.3Ｍ以上の硫酸アンモニウム(0.3Ｍが好ま
しい）又は 0.5Ｍ以上のNaClを含む溶剤が用いられる。
カラム及び試料は、同様に 0.5mMのDTT を含む50mMのTr
is(pH7.5) 及び1.0mM のEDTA (「TE」) 緩衝液の中で
0.3Ｍの硫酸アンモニウムに調整され、試料はカラムに
対し適用される。カラムは 0.3Ｍの硫酸アンモニウム緩
衝液で洗浄する。次に、減少する塩勾配、エチレンもし
くはプロピレングリコール又は尿素のごとき疎水的相互
作用を低下させる溶剤で、酵素を溶出させることができ
る。
【００９８】長期にわたる安定性のためには、本発明の
熱安定性DNA ポリメラーゼー酵素は、１又は複数の非イ
オン性ポリマー洗剤を含む緩衝液の中で保存することが
できる。このような洗剤は、一般に約100 〜250,000 ダ
ルトン好ましくは約 4,000〜200,000 ダルトンの範囲内
の分子量を有するものであり、約 3.5〜約 9.5好ましく
は約４〜8.5 のpHで酵素を安定化させる。このような洗
剤の例としては、Mc Cutcheon Dinision of MC Publish
ing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ (USA) により
発行されたMc Cutcheon のEmulsifiers & Detergents
(乳化剤と清浄剤）の 295〜298 ページ及び1989年７月2
8日付の同時係属米国出願第 387,003号に規定されてい
るものが含まれる（これらの記載を引用により本明細書
に組み入れる）。
【００９９】好ましくは、洗剤はエトキシル化脂肪族ア
ルコールエーテル及びラウリルエーテル、エトキシル化
アルキルフェノール、オクチルフェノキシポリエトキシ
エタノール化合物、修飾オキシエチル化及び／又はオキ
シプロピル化直鎖アルコール、モノオレイン酸ポリエチ
レングリコール化合物、ポリソルビン酸化合物及びフェ
ノール脂肪族アルコールエーテルを含むグループの中か
ら選択される。より具体的には、ICIAmericas Inc., Wi
lmington, DEからのポリオキシエチル化(20)モノラウリ
ン酸ソルビタンであるTween20 、及びBASF Wyadotte Co
rp., Parsippany, NJ からのエトキシル化アルキルフェ
ノール (ノニル) であるIconol NP-40が好ましい。
【０１００】本発明の熱安定性酵素は、このような酵素
の活性が必要であるか又は望まれるあらゆる用途に用い
ることができる。Sangerジデオキシヌクレオチド法によ
るDNA 配列決定 (Sanger他.,1977年、Proc, Natl, Aca
d, Sci , USA 74 : 5463-5467) は近年、新たなベクタ
ー (Yanisch-Perron他.,1985年、Gene 33 : 103-119)
、塩基類似体 (Mills 他.,1979年、Proc Natl, Acad,
Sci USA 76： 2232-2235、及びBarr他.,1986年、Bio T
echnigues 4 : 428-432),酵素 (Tabor 他.,1987年、P
roc, Natl Acad Sci, USA 84: 4763-4771及びInnis,
M.A. 他、1988年、Proc. Natl Acad Sci, USA 85 : 94
36 : 9440) 及びDNA 配列分析の部分的自動化のための
計器 (Smith他.,1986年、Nature 321 ; 674-679 ; Pro
ber 他、1987年、Science 238 : 336-341；及びAnsorg
e 他、1987年、Nuc, Acids, Res. 15 : 4593-4603) の
開発を含め、著しい改良を受けてきた。
【０１０１】基本的なジデオキシ配列決定手順には、
(ｉ) 適切な一本鎖又は変性２本鎖DNA 鋳型にオリゴヌ
クレオチドプライマをアニーリングすること； (ii) 各
々１つのｄ標識dNTP又はddNTP(代替的には、標識プライ
マを用いることができる), 未標識dNTPs の混合物及び
１つの読み終りジデオキシヌクレオチド−５′−三燐酸
(ddNTP）を含む４つの別々の反応においてDNA ポリメラ
ーゼでプライマを延長すること；（iii)高解像度ポリア
クリルアミド−尿素ゲル上で反応生成物の４組を分離す
ること；並びに（iv）DNA 配列を推論するため検査する
ことのできるゲルのオートラジオグラフィ画像を生産す
ること、が含まれる。あるいは、反応生成物を同定する
ため蛍光標識プライマ又はヌクレオチドを用いることが
できる。既知のジデオキシ配列決定方法は、大腸菌（E.
coli)DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、逆転
写酵素、Taq DNA ポリメラーゼ又は変更T7 DNAポリメラ
ーゼのごときDNA ポリメラーゼを利用する。
【０１０２】市販のキットの導入はこの技術を大幅に簡
略化し、DNA 配列決定をあらゆる実験室にとっての日常
的技術にした。しかしながらそれでもなお、パリンドロ
ームヘヤピンループといった二次的構造を含む核酸及び
Ｇ＋Ｃの豊富なDNA でうまく機能する配列決定プロトコ
ルに対する必要性が、当該技術分野には存在している。
一本鎖DNA は、ヘヤピンループといったような、延長反
応における不適切な停止を通して又は５′→３′エキソ
ヌクレアーゼ活性をもつ酵素の場合にはヘヤピンの接合
における鋳型鎖の開裂を通してジデオキシ (チェーンタ
ーミネータ) 配列決定プロトコルと著しく妨害する可能
性のある二次構造を形成することができる。
【０１０３】高温は二次構造を不安定にするから、熱安
定性DNA ポリメラーゼでの例えば70〜75℃といった高温
における延長反応を行なう能力は、このような二次構造
を含むDNA の配列決定における著しい改善をもたらす。
しかしながら、ポリメラーゼ延長と適合性ある温度が全
ての二次構造を除去するわけではない。５′→３′エキ
ソヌクレアーゼ欠損熱安定性DNA ポリメラーゼは、この
分野におけるさらなる改良である。というのもこのポリ
メラーゼは、鋳型を開裂して不適切な停止すなわち延長
ラン−オフ・フラグメントをもたらすのではなくむしろ
鎖の除去（displacement) 反応においてヘヤピンを通し
て合成できるからである。
【０１０４】基本的ジデオキシ (チェーンターミネー
タ) 配列決定に代るものとして、サイクルジデオキシ配
列決定は、ジデオキシチェーンターミネータの存在下で
の標的配列の非対称な増幅である。単一のサイクルは考
えられる全ての長さの延長生成物の１群を生成する。延
長反応生成物をDNA 鋳型から変性した後、プライマアニ
ーリングとプライマ延長の多くのサイクルがジデオキシ
ターミネータの存在上で起こる。この方法はPCR 法とは
異る。なぜなら、わずか１つのプライマしか用いられず
各サイクル内の配列決定反応生成物の増加は直線的であ
り、増幅生成物は長さが不均一であり、次の反応に対す
る鋳型として役立たないからである。サイクルジデオキ
シ配列決定は、自動化されたDNA 配列決定計器を用いる
実験室及びその他の大量配列決定実験室にとって利点を
提供する技術である。技術の特異性及び生成されるシグ
ナル量の増大のため、クローニング無しに直接ゲノミッ
クDNA を配列決定することが可能である。サイクル配列
決定プロトコルは、ゲノミック、クローニング及びPCR
増幅された鋳型を含む一本鎖及び二本鎖の鋳型に対処す
る。
【０１０５】熱安定性DNA ポリメラーゼは、サイクル配
列決定においていくつかの利点をもつ；すなわち、これ
らのポリメラーゼは、ゲノミック標的に対するプライマ
の特異的ハイブリッド形成のために必要とされるストリ
ンジェント・アニーリング温度に耐え、しかも各サイク
ル内で起こる高温変性の多くのサイクルに耐える。70〜
75℃といった高い温度で延長反応を実行することは、二
次構造の不安定化のため、二次構造を含むDNA での配列
決定結果における著しい改善をもたらす。しかしながら
このような温度は、全ての二次構造を排除するものでは
ない。
【０１０６】５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損熱安定
性DNA ポリメラーゼはこの分野におけるさらなる改良で
ある。というのも、このポリメラーゼは、鋳型を開裂し
て不適切な停止を作り出すのではなくむしろ鎖除去（di
splacement) 反応においてヘヤピンを通して合成できる
からである。さらに、PCR と同様に、サイクル配列決定
は生成物の鎖の復元という現象に悩まされる。５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性DNA ポリ
メラーゼの場合、生成物鎖復元によって作られた２本鎖
領域へのプライマの延長は、復元された相補的生成物鎖
の開裂をもたらす。開裂された鎖はさらに短かいものと
なり、かくして不適切な停止として現われる。
【０１０７】さらに、適正な予め合成された停止シグナ
ルは減少することになる。５′→３′エキソヌクレアー
ゼ活性が欠損している熱安定性DNA ポリメラーゼは、こ
のような延長生成物フラグメントが形成されないという
点で、改良をもたらす。サクイル配列決定の一変形態様
には、一定の増幅レベルを保持しながら２本鎖鋳型の各
鎖に対し配列決定梯子を同時に生成することが含まれる
（Ruans 及びKidd, Proc. Natl, Acad, Sci, USA 1991
年、88：2815-2819)。結合され増幅及び配列というこの
方法は、鎖サイクル配列決定と同様の形で５′→３′エ
キソヌクレアーゼ活性が欠損した熱安定性DNA ポリメラ
ーゼの使用からの恩恵をこうむることになる。
【０１０８】特に好ましい態様においては、５′→３′
エキソヌクレアーゼ活性が減少されるか又は除去された
酵素は、PCR として知られている核酸増幅反応を触媒
し、上述のとおり、その結果、より高い５′→３′エキ
ソヌクレアーゼ活性をもつそれぞれの天然性酵素で達成
される以上に優れた望ましい生成物の収量が生み出され
ることになる。収量の改善は、５′→３′エキソヌクレ
アーゼ活性によってひき起こされる、すでに合成された
生成物を分解する能力が無いことの結果である。
【０１０９】核酸配列を増幅させるためのこの方法は、
米国特許第 4,683,202号及び 4,865,188号の中で開示さ
れそして特許請求されている。これらの記載を引用によ
り本明細書に組み入れる。PCR 核酸増幅方法には、核酸
又は核酸混合物の中に含まれている少なくとも１つの特
定の核酸配列を増幅することが関与し、最も一般的な態
様においては、２本鎖DNA が生成される。収量の改善の
他に、低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をも
つ熱安定性DNA ポリメラーゼは、より長いPCR生成物を
生成する改善された能力、Ｇ＋Ｃの豊富な鋳型から生成
物を生産する改善された能力及びPCR 生成物及びDNA 配
列決定梯子（ladder）を高レベルの２次構造をもつ鋳型
から生成する改善された能力を示す。
【０１１０】論述する上で容易なように、以下に記すプ
ロトコルでは、増幅すべき特定の配列が２本鎖核酸の中
に含まれているということを仮定している。しかしなが
ら、この方法は、mRNAのごとき１本鎖核酸を増幅する上
でも同様に有効である。ただし好ましい実施態様におい
て、究極的な生成物は２本鎖DNA である。一本鎖核酸の
増幅においては、第１の段階には相補的鎖の合成が関与
しており（この目的で２つの増幅プライマのうちの１つ
を用いることができる）、その後に続く段階は以下で記
す２本鎖増幅法と同じように進められる。
【０１１１】この増幅法は、以下のような段階を含んで
いる； （ａ）増幅されるべき各特定の配列について２つのオリ
ゴヌクレオチドプライマ及び４つの異なるヌクレオシド
三燐酸と各核酸鎖とを接触させる段階：ここで、各プラ
イマは、特定の配列の異なる鎖に対し実質的に相補的で
あるよう選択されており、かくして、１つのプライマか
ら合成された延長生成物はその相補体から分離されたと
きその他のプライマの延長生成物の合成のための鋳型と
して役立つことができるようになっている。この接触作
業は、相補的核酸鎖に対する各プライマのハイブリッド
形成を可能にする温度で行なわれる： （ｂ）特定の核酸配列の各鎖に対し相補的なプライマ延
長生成物を形成するためヌクレオシドリン酸の結合を可
能にする本発明の熱安定性DNA ポリメラーゼと各核酸鎖
を、段階（ａ）と同時に又はその後で接触させる段階； （ｃ）酵素の活性を促進し、増幅中の異なる各配列につ
いて各核酸鎖鋳型に対して相補的な各プライマの延長生
成物を合成するために有効な時間にわたりそのために有
効な温度において、ただし相補的鎖鋳型から各延長生成
物を分離するほど高くはない温度及び時間で、段階
（ｂ）からの混合物を維持する段階；
【０１１２】（ｄ）一本鎖分子を生成するためプライマ
延長生成物が合成された鋳型からこのプライマ延長生成
物を分離するのに有効な、ただし酵素を不可逆的に変性
するほど高くはない温度及び時間で、段階（ｃ）からの
混合物を加熱する段階； （ｅ）段階（ｄ）で生産された一本鎖分子の各々に対す
るプライマのハイブリッド形成を促進するため有効な時
間にわたり、そのために有効な温度まで、段階（ｄ）か
らの混合物を冷却する段階；及び （ｆ）酵素の活性を促進し、増幅中の異なる各配列につ
いて、段階（ｄ）で生産された各核酸鋳型に相補的な各
プライマの延長生成物を合成するのに有効な時間にわた
り、そのために有効な温度で、ただし相補的鎖鋳型から
各々の延長生成物を分離するほど高くない温度及び時間
で、段階（ｅ）からの混合物を維持する段階。段階
（ｅ）と（ｆ）の有効な時間と温度は一致していてよ
く、かくして段階（ｅ）及び（ｆ）は同時に行なうこと
ができる。段階（ｄ）〜（ｆ）は望ましい増幅レベルに
至るまで反復される。
【０１１３】増幅方法は、既知の配列の特定の核酸配列
を大量に生産するのに有効であるのみならず、存在する
ことはわかっているが完全に特定されていない核酸配列
を生産するためにも有効である。１つのプライマから合
成された延長生成物が鋳型（相補体）から分離された時
点で規定の長さの核酸へのその他のプライマの延長のた
めの鋳型として役立つことができるように配列に沿って
相対的な位置に望ましい配列の異なる鎖に対しハイブリ
ッド形成することになる２つのオリゴヌクレオチドポリ
マーが調製されうるように充分に詳しく、充分な数の塩
基が配列の両端においてわかっていることだけが必要な
のである。配列の両端での塩基についての知識が多けれ
ば多いほど、標的核酸配列に対するプライマの特異性及
び反応の特異性及び方法の効率は高いものとなりうる。
【０１１４】いずれの場合でも、増幅すべき配列の初期
コピーが利用可能でなくてはならないが、この配列は純
粋な又は分離された分子である必要はない。一般に、増
幅プロセスには、（ａ）ハイブリッド形成されることに
なるオリゴヌクレオチドが合成されうるのに充分詳細に
所要配列の末端がわかっていること及び（ｂ）連鎖反応
を開始するのに少量の配列が利用可能であることを仮定
して、関与する反応段階の数との関係において指数的な
量で少なくとも１つの特定の核酸配列を生産するための
連鎖反応が関与している。連鎖反応の生成物は、使用さ
れた特定のプライマの５′末端に相応する末端をもつ分
離された核酸の２重鎖となる。
【０１１５】増幅しようとする特定の核酸配列を含んで
いるか又は含んでいると思われるものであることを条件
として精製された又は精製されていない形のあらゆる核
酸配列を出発核酸として利用することが可能である。増
幅すべき核酸は、あらゆる供給源例えばpBR322のごとき
プラスミド、クローニングされたDNA もしくはRNA 、又
は細菌、酵母菌、ウィルス、オルガネラ (細胞器官) 及
びさらに高等植物及び動物などの生物体からの天然のDN
A 又はRNA から得ることができる。DNA 又はRNA は、血
液、絨毛膜絨毛などの組織材料又は羊膜細胞から、さま
ざまな技術によって抽出することができる。例えば、Ma
niatis他、1982年、Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY) p280〜281 を参照のこと。
【０１１６】従って、この方法は例えば、メッセンジャ
ーRNA を含むDNA 又はRNA を利用することができ、これ
らのDNA 又はRNA は、一本鎖であっても二本鎖であって
もよい。さらに、各々を１鎖ずつ含むDNA-RNA ハイブリ
ッドを利用することも可能である。これらの核酸のうち
のいずれかの混合物は同様に、 (同じ又は異なるプライ
マを用いた) 前の増幅反応から生産された核酸と同じよ
うに用いることができる。増幅されるべき特定の核酸配
列は、大きな分子の単なる一分画であってもよいし或い
は又当初から分離された分子として存在し、かくして特
定の配列が核酸全体を構成するようになっていてもよ
い。
【０１１７】増幅すべき配列は、当初純粋な形で存在す
る必要はない。配列は、特定の生物学的試料の極めてわ
ずかな分画しか構成しないであろう特定の微生物による
核酸配列の一部分又は、ヒトDNA 全体の中に含まれたβ
−グロブリンの一部分（Saiki 他、1985年、Science 2
3：1530-1534 で例示されているようなもの) といっ
た、複雑な混合物のわずかな分画であってよい。細胞
は、低張緩衝液内での懸濁及び細胞間成分の細胞溶菌及
び分散が起こるまでの約90℃〜 100℃での熱処理 (一般
に１〜15分) の後に、増幅法において直接用いることが
できる。加熱段階の後、増幅試薬を直接溶菌済み細胞に
付加することができる。出発核酸配列は、望ましい特定
の核酸配列を複数含むことができる。増幅法は、１つの
特定の核酸配列を大量に生産するためのみならず、同じ
又は異なる核酸分子上にある複数の異なる特定の核酸配
列を同時に増幅するためにも役立つ。
【０１１８】PCR 法においては、プライマが主要な役割
を果たす。増幅法を説明する上で用いられる「プライ
マ」という語は、特に増幅すべきフラグメントの末端配
列に関する情報において幾分かのあいまいさがある場合
又は1991年８月13日付のPCT 出願第91/05-753 号内に記
されている縮重プライマ法を利用する場合において、複
数のプライマのことを指すことがある。例えば、タンパ
ク質配列情報から核酸配列が類推される場合、各々の鎖
のために、遺伝子コードの縮重に基づく考えられる全て
のコドンの変動を表わす配列を含むプライマの１つのコ
レクションを用いることができる。このコレクションの
中の１つのプライマは、増幅のために役立つように増幅
すべき所望の配列の一部分と充分に相同的なものとな
る。
【０１１９】さらに、異なるオリゴヌクレオチドプライ
マが適切な数用いられるかぎり、最初の核酸又は核酸混
合物から複数の特定の核酸配列を増幅することが可能で
ある。例えば、２つの異なる特定の核酸配列を生産しな
くてはならない場合、４つのプライマが使用される。プ
ライマのうちの２つは、特定の核酸配列の１つに対して
特異的であり、その他の２つのプライマは第２の特定の
核酸配列に対して特異的である。この要領で、２つの異
なる特定の配列の各々を、当該方法によって指数的に生
産することができる。
【０１２０】増幅すべき配列の内部配列（すなわち末端
にない配列）に対して相補的な１組のプライマを少なく
とも１回の増幅サイクルの後に添加することによって反
応においてより大きい特異性を得るため、一定の与えら
れた数の増幅サイクルの後に、一定の与えられた配列内
の１つの配列を増幅することが可能である。このような
プライマはどの段階ででも付加することができ、より短
い増幅フラグメントを提供することになる。あるいは、
以前に増幅に利用されたプライマと幾分かのオーバーラ
ップを有しながら非相補的な末端を伴うプライマを用い
ることにより、さらに長いフラグメントを調製すること
ができる。
【０１２１】プライマは同様に、生体外変異誘発のため
に増幅法が用いられる場合に主要な役割を果たす。利用
されるプライマがもとの鋳型と正確に相補的でない増幅
反応の生成物は、鋳型よりもむしろプライマの配列を含
むことになり、従って生体外変異を導く。さらなるサイ
クルにおいて、この変異は、それ以上いかなる誤対合プ
ライミングも必要とされないことから、効率が低減され
ることなく増幅されることになる。上述のような変更DN
A 配列を作成する方法は、さらなる配列変更を誘発する
べく異なるプライマを用いて変更DNA に対して反復して
行なうことができる。このようにして、系列に対して新
規に付加する各々のものは、その直前のものとわずかに
しか異ならないがもとのDNA 原始配列とは漸進的に大き
く異なる、一連の変更配列を段階的に生み出すことが可
能である。
【０１２２】充分な量のプライマが増幅すべき鎖に対し
て相補的である１つの配列を含んでいることを条件とし
て、プライマはその配列の一部として非相補性配列を含
むことができるため、その他の数多くの利点が実現可能
である。例えば、プライマの一方又は両方の５′末端に
おいて、鋳型配列に対し相補的でないヌクレオチド配列
（例えばプロモータ、リンカー、コード配列など）を付
着させ、かくしてこれを増幅法の生成物に追加させるこ
とが可能である。延長プライマが付加された後、非相補
的ヌクレオチドインサートを含む望ましい量の新しい鋳
型を達成するため充分なサイクルが行なわれる。こうし
て、単純な技術を用いて比較的短かい時間（例えば２時
間以下）内で組合された大量のフラグメントの生産が可
能となる。
【０１２３】例えば上述のホスフォトリエステル及びホ
スフォジエステル方法又はその自動化された態様といっ
た何らかの適切な方法を用いて、オリゴヌクレオチドプ
ライマを調製することが可能である。このような自動化
された態様の１つにおいては、出発材料としてジエチル
ホスホロアミジトが用いられ、これはBeaucage他、1981
年、Tetrahedron Letters 22 : 1859-1862によって記述
されているように合成されうる。修飾された固形支持体
上でオリゴヌクレオチドを合成するための１つの方法
は、米国特許第 4,458,066号に記されている。同様に、
(制限エンドヌクレアーゼ消化物などの) 生物学的供給
源から分離されたプライマを使用することも可能であ
る。
【０１２４】しかしながら、どんなプライマが使用され
ようとも、反応混合物は、PCR が起こるよう１つの鋳型
を含んでいなくてはならない。というのも、特定の核酸
配列はその配列を鋳型として含む核酸を用いることによ
って生産されるからである。第１の段階には、増幅中の
又は検出中の各々の特定の核酸配列について２つのオリ
ゴヌクレオチドプライマ及び４つの異なるヌクレオシド
三燐酸と各々の核酸鎖を接触させることが含まれる。増
幅又は検出すべき核酸がDNA である場合、ヌクレオシド
三燐酸は通常dATP, dCTP, dGTP及びdTTPであるが、工程
中さまざまなヌクレオチド誘導体も同様に使用可能であ
る。例えば、未知の配列の試料中の既知の配列の検出の
ためにPCR を用いる場合、1991年７月23日付のPCT 出願
第91/05210号（引用によりこの記載を本明細書に組み入
れる）に教示されているように、試料の間の汚染を減少
させる目的で、dTTPの代りにdUTPがしばしば用いられ
る。
【０１２５】ヌクレオシド三燐酸の濃度は大幅に変化し
うる。標準的には、濃度は、増幅用緩衝液内で各々のdN
TP中50〜200 μＭであり、MgCl2 はポリメラーゼを活化
させ反応の特異性を増大させるため１〜３mMの量で緩衝
液中に存在する。しかしながら、１〜20μＭというdNTP
濃度が、高い比活性での放射線識されたプローブの生成
又はDNA 配列決定といったいくつかの利用分野のために
は好ましいものであり得る。
【０１２６】標的核酸の核酸鎖は、プライマの延長生成
物である追加の核酸鎖の合成のための鋳型として役立
つ。この合成は、適切ないかなる方法を用いても行なう
ことができるが、一般に、好ましくはpH７〜９、最も好
ましくは約８のpHの緩衝水溶液内で起こる。合成を容易
にするため、鋳型鎖を含む緩衝液に対して２つのオリゴ
ヌクレオチドプライマのモル余剰分が加えられる。実際
問題として、付加されるプライマの量は、増幅すべき配
列が複雑な長連鎖核酸鎖の混合物内に含まれている場
合、相補的（鋳型）の量に比べモル過剰状態にある。プ
ロセスの効率を改善するためには、大きいモル過剰が好
ましい。従って、1000：１以上のプライマ対鋳型の比率
がクローニングされたDNA 鋳型に対して一般に用いら
れ、複雑なゲノミック試料からの増幅については一般に
約 108：１以上のプライマ対鋳型比率が用いられる。
【０１２７】次に、鋳型、プライマ及びヌクレオシド三
燐酸の混合物を、増幅又は検出すべき核酸が２本鎖であ
るか１本鎖であるかに応じて処理する。核酸が１本鎖で
ある場合、第１の延長サイクルに先立っていかなる変性
段階も使用する必要がなく、反応混合物は、プライマの
相補的標的（鋳型）配列に対するハイブリッド形成を促
進する温度に保たれる。このような温度は一般に数秒か
ら５分好ましくは30秒から１分の有効時間にわたり約35
℃から65℃以上好ましくは約37℃から60℃である。５′
→３′エキソヌクレアーゼ変異体熱安定性DNA ポリメラ
ーゼのためには、35℃から70℃のハイブリッド形成温度
を用いることができる。プライマのハイブリッド形成の
特異性を増大させるためには、長さが15ヌクレオチド以
上のプライマが用いられる。これよりも短かいプライマ
には、さらに低いハイブリッド形成温度が必要である。
【０１２８】もとの１本鎖核酸に対する相補体は、適切
な緩衝液、dNTPs 及び１又は複数のオリゴヌクレオチド
プライマの存在下で本発明の熱安定性DNA ポリメラーゼ
を添加することによって合成できる。適切な単一のプラ
イマが付加される場合、プライマ延長生成物は１本鎖核
酸に対し相補的なものとなり、（プライマがどこで鋳型
とハイブリッド形成するかに応じて）等しい又は等しく
ない長さの２重鎖に核酸鎖のハイブリッド形成すること
になり、次にこれは上述のように２つの単一の分離した
相補的鎖を生成するべく、一本鎖へと分離されうる。こ
のとき、もとの一本鎖核酸及び第１のプライマ延長生成
物の両方を鋳型として用いて次に続くプライマ延長サイ
クルが起こるように、第２のプライマが添加される。あ
るいは、一本鎖核酸に対し２つ以上の適切なプライマ
（そのうちの１つは鋳型としてその他のプライマの延長
生成物を用いる合成をプライミングする）を添加し、反
応を行なわせることができる。
【０１２９】２本鎖標的の増幅又は一本鎖標的の第２サ
イクルの増幅の場合のように、核酸が２本の鎖を含む場
合、核酸の鎖はプライマがハイブリッド形成される前に
分離されなくてはならない。この鎖分離は、物理的、化
学的又は酵素的手段を含む、適切なあらゆる変性方法に
よって達成されうる。核酸の鎖を分離する好ましい物理
的方法には、完全な（＞99％) 変性が起こるまで核酸を
加熱することが含まれる。典型的な熱変性には、核酸の
組成及びサイズに応じて一般に約数秒から数分までの時
間の約80℃〜 150℃の範囲の温度が関与している。
【０１３０】好ましくは、有効な変性温度は数秒から１
分の間で90℃〜 100℃である。ヘリカーゼ活性を有しAT
P が存在する中でDNA を変性するものであることがわか
っている酵素RecA又はヘリカーゼとして知られているク
ラスの酵素のうちのいずれかの酵素によっても、鎖分離
を誘発することが可能である。ヘリカーゼで核酸の鎖を
分離するのに適した反応条件は、Kuhn Hoffmann-Berlin
g, 1978 年CSH-Quantitative Biology 43 ：63によって
記述されており、RecAを使用するための技術は、Raddin
g, 1982 年, Ann, Rev, Genetics 16 :405-437 の中
で総説されている。変性は、等しい又は等しくない長さ
の２つの分離された相補的鎖を生み出す。
【０１３１】２本鎖核酸が熱によって変性される場合、
反応混合物は、相補的標識（鋳型）配列に対する各プラ
イマのハイブリッド形成を促進する温度まで冷却され
る。この温度は通常、試薬に応じて約35℃〜65℃以上好
ましくは37℃〜60℃である。ハイブリッド形成温度は一
般に数秒から数分、好ましくは10秒から１分までの有効
時間中維持される。実際上は、温度は単に約95℃から37
℃まで低下させられ、ハイブリッド形成はこの範囲内の
温度で起こる。
【０１３２】核酸が一本鎖であろうと二本鎖であろう
と、本発明の熱安定性DNA ポリメラーゼは、変性段階よ
り前又は変性段階中又は温度低下中又は温度がハイブリ
ッド形成を促進するための範囲内にあるときのいずれに
でも添加することができる。本発明に基づくポリメラー
ゼの熱安定性のため、このようなポリメラーゼをいつで
も反応混合物に付加することが可能になっているが、混
合物がストリンジェントハイブリッド形成温度より下に
冷却されなくなる時点で反応混合物に対しポリメラーゼ
を添加することによって非特異的増幅を実質的に抑制す
ることが可能である。
【０１３３】ハイブリッド形成の後、反応混合物は次
に、酵素の活性が促進されるか又は最適化される温度す
なわちハイブリッド形成されたプライマ及び鋳型からの
プライマ延長生成物の合成を容易にする上で酵素の活性
を増大させるのに充分な温度まで加熱されるか又はこの
温度に維持される。温度は実際には、各々の核酸鋳型に
対して相補的である各々のプライマの延長生成物を合成
するのに充分なものでなくてはならないが、各々の延長
生成物をその相補的鋳型から変性するほど高いものであ
ってはならない (すなわち、温度は一般に約80℃〜90℃
未満である）。
【０１３４】用いられる核酸 (１又は複数) に応じて、
この合成反応のために有効な標準的な温度は、約40℃〜
80℃好ましくは50℃〜75℃である。さらに好ましい温度
は、本発明の熱安定性DNA ポリメラーゼについて約65℃
〜75℃である。この合成に必要な時間は、主として温
度、核酸の長さ、酵素及び核酸混合物の複雑性に応じ
て、約10秒から数分以上であると考えられる。延長時間
は通常約30秒から数秒である。核酸がさらに長い場合、
よた長い時間が相補的鎖合成のために一般に必要とされ
る。
【０１３５】新たに合成された鎖及び相補体核酸鎖は、
増幅プロセスの次に続く段階で用いられる２本鎖分子を
形成する。次の段階では、２本鎖分子の鎖は、分子を変
性させるのに有効な時間にわたりこのために有効な温度
での熱変性によって分離されるが、この温度及び時間
は、熱安定性酵素が完全にかつ不可逆的に変性されるか
又は不活性化されるようなものではない。この鋳型の変
性の後、温度は、上述のように前段階で製造された相補
的一本鎖分子（鋳型）に対するプライマのハイブリッド
形成を促進するようなレベルまで低下させられる。
【０１３６】このハイブリッド形成段階の後又はこの段
階と同時に、温度は、新たに合成された鎖及びもとの鎖
の両方を鋳型として用いたプライマ延長生成物の合成を
可能にするため熱安定性酵素の活性を促進するのに有効
である温度に調整される。ここでも、温度は上述のよう
に延長生成物をその鋳型から分離（変性）するほど高い
ものであってはならない。ハイブリッド形成はこの段階
で起こる可能性があり、従って前述の変性後の冷却段階
は必要でなくなる。このような場合、同時段階を用い
て、好ましい温度範囲は50℃〜70℃である。
【０１３７】鎖の分離、ハイブリッド形成及び延長生成
物合成の１つのサイクルに関与する加熱及び冷却段階
は、特定の核酸配列を望ましい量だけ生成するのに必要
とされるだけの回数反復することができる。唯一の制限
は、存在するプライマ、熱安定性酵素及びヌクレオシド
三燐酸の量である。通常15〜30サイクルが完全に行なわ
れる。増幅されたDNA の診断検出を目的とする場合、サ
イクル数は試料の性質、試料内の初期標的濃度及び増幅
後に用いられる検出法の感度によって左右される。
【０１３８】一定の与えられた検出感度に対しては、増
幅中の試料が純粋でかつ初期標的濃度が高い場合にはよ
り少ない回数のサイクルしか必要とされない。試料が核
酸の複雑な混合物であり初期標的濃度が低い場合、検出
のために充分にシグナルを増幅するには、さらに多くの
サイクルが必要となる。一般的増幅及び検出のために
は、この工程が約15回くり返される。標識された配列特
異的プローブで検出されるべき配列を生成するのに増幅
が用いられる場合及びヒトゲノムDNA が増幅の標的であ
る場合、明らかに検出可能なシグナルが生産されるよう
すなわちバックグラウンドが検出を妨害することのない
ように充分に配列を増幅するため工程は15〜30回反復さ
れる。
【０１３９】いかなる主要試薬も枯褐しておらず又酵素
が変性又は不可逆的に不活性化された状態になっていな
いことを条件として、初期添加の後いかなる追加のヌク
レオチド、プライマ又は熱安定性酵素も添加する必要は
ない。なお上記条件のような場合には、反応が続行する
ために追加のポリメラーゼ又はその他の試薬を加えなく
てはならなくなる。望ましい量の特定の核酸配列を生産
するため適切なサイクル数が完了した後、通常の要領す
なわちEDTA、フェノール、SDS 又はCHCl3 を添加して酵
素を不活性化することによって或いは又反応の成分を分
離することによって反応を停止することができる。
【０１４０】増幅法は連続的に行なうことができる。自
動化された方法の一態様においては、一定の時間中一定
のレベルで制御されるべく温度がプログラミングされる
ような形で反応混合物を温度循環させることができる。
この目的をこのような計器の１つとしては、Perkin-Elm
erCetus Instruments により開発され市販されている増
幅反応を取り扱うための自動化された機械がある。この
計器でPCR を行なうための詳細な指示事項は、計器購入
時点で入手可能である。
【０１４１】変更された５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性をもつ本発明の熱安定性DNA ポリメラーゼは、PCR
による核酸配列の増幅が有用であるさまざまなプロセス
において非常に役に立つ。増幅方法は、米国特許第 4,8
00,159号に記述されているように適切な表現ベクター内
への挿入のため特定の核酸配列をクローニングするのに
利用することができる。ベクタは、組換えDNA 技術の標
準的方法によって配列の遺伝子生成物を生産するべく適
切な宿主生体を形質転換するのに使用することができ
る。このようなクローニングには、平滑末端連結を用い
たベクタ内への直接連結、又はプライマ内に含まれてい
る部位で開裂するための制限酵素の使用が含まれよう。
【０１４２】本発明の熱安定性DNA ポリメラーゼに適し
たその他の方法には、米国特許第 4,683,195号及び 4,6
83,202号及び欧州特許公報第229,701 号； 237,362号；
及び258,017号に記されているものが含まれる（これら
の記載を引用により本明細書に組み入れる）。さらに、
当該酵素は、非対称 PCR〔Gyllensten及びErlich, 1988
年, Proc, Natl, Acad, Sci,USA, 85 : 7652〜7656、
（本明細書に引用により組み入れる) を参照のこと〕；
逆 PCR〔Ochman他、1988年、Genetics 120 : 621(本明
細書に引用により組入れる）〕；においても有用であ
り、又DNA 配列 (Innis 他、1988年、Proc, Natl, Aca
d, Sci,USA 85 : 9436-9440及びMc Conlongue他、1988
年、Nuc, Acids Res,16(20):9869), cDNA末端のランダ
ム増幅 (RACE)、一連のDNA フラグメントを増幅するの
に用いられるランダムプライミングPCR、及びMETHODS:A
Companion to Methods in Enzymology (方法：酵素学
方法必携)(1991年) ２：p.11〜19でLoh, E. が記述して
いるようなアンカーPCR 及び連結媒介アンカーPCR とい
った片側特異性(singlesided specificity) をもつPCR
法のためにも有用である。
【０１４３】５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損熱安定
性DNA ポリメラーゼが役に立つもう１つのプロセスは、
ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（PLCR) と呼ばれるプロ
セスである。その名が示唆しているように、このプロセ
スは、PCR の特徴とリガーゼ連鎖反応 (LCR)の特徴とを
併せもつ。PLCRは一部には、利用されたdNTPの低濃度
(〜１μＭ）が増幅の程度を制限していた対立遺伝子特
異的PCR の特異性を増大させる技術として開発されたも
のである。PLCRでは、DNA が変性され、４つの相補的で
はあるが隣接していないオリゴヌクレオチドプライマが
dNTP、熱安定性DNA ポリメラーゼ及び熱安定性リガーゼ
と共に添加される。
【０１４４】プライマは、非隣接的に標的DNA にアニー
リングし、熱安定性DNA ポリメラーゼは非隣接プライマ
の間の間隙を満たしかくしてプライマを隣接させるべく
下流プライマの３′末端に対する適切なdNTPの付加をひ
き起こす。このとき熱安定性リガーゼは２つの隣接する
オリゴヌクレオチドプライマを連結することになる。し
かしながら、熱安定性DNA ポリメラーゼの中に５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性が存在することは、このよ
うな活性が下流プライマの５′末端からのヌクレオチド
又は小さいオリゴヌクレオチドの切除をひき起こしかく
してプライマの連結を妨げることから、２つのプライマ
間の間隙を閉鎖する確率を著しく低下させる。従って、
PLCRにおいては、低下した又は除去された５′→３′エ
キソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性DNA ポリメラー
ゼが特に有用となる。
【０１４５】簡単に言うと、減少、低下又は除去された
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をもつように変異を
受けた本発明の熱安定性DNA ポリメラーゼは、以下に記
述する均質検定技術のような５′→３′エキソヌクレア
ーゼ活性を必要とする手順及び技術を除いて、そのそれ
ぞれの変異を受けていないポリメラーゼと同じ手順及び
技術のために役立つ。さらに、本発明の変異を受けたDN
A ポリメラーゼはしばしば、固有の５′→３′エキソヌ
クレアーゼ活性の減少又は除去に基き、手順及び技術の
より効率の良い性能をもたらすことになる。低下した
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をもつ特異的熱安定
性DNA ポリメラーゼは、Taq 、Tma 、Tsps17、TZ05、Tt
h 、及びTaf DNA ポリメラーゼの以下の変異形態を含ん
でいる。以下の表内及びこの明細書全体を通して、欠失
変異は、欠失を構成する番号付けされたヌクレオチド又
はアミノ酸を含んでいる。
【０１４６】
【表２】
【０１４７】
【表３】
【０１４８】
【表４】
【０１４９】
【表５】
【０１５０】
【表６】
【０１５１】
【表７】
【０１５２】強化された５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性をもつ熱安定性DNA ポリメラーゼ 本発明のもう１つの態様は、それぞれの天然ポリメラー
ゼのものに比べて強化された又は増大された５′→３′
エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定性DNA ポリメラー
ゼの生成を含む。増加された又は強化された５′→３′
エキソヌクレアーゼ活性を有する本発明の熱安定性DNA
ポリメラーゼは、1991年８月６日付のPCT 出願第91/055
71号内に記されている均質(homogeneous) 検定系におい
て特に有用である（引用により本明細書に組み入れ
る）。簡単に言うと、この系は、以下の段階を含む、試
料中の標的アミノ酸配列の検出方法である：
【０１５３】（ａ）標的核酸の一領域に対して相補的な
１つの配列を含むオリゴヌクレオチド及び同じ標的核酸
鎖の第２の領域に対し相補的な１つの配列を含むが第１
のオリゴヌクレオチドが規定する核酸配列を含まない標
識されたオリゴヌクレオチドと、一本鎖核酸を含む試料
とを接触させて、ハイブリッド形成条件下で２重鎖の混
合物を生成する段階；なお、ここでこれらの２重鎖は、
第１のオリゴヌクレオチドの３′末端が標識されたオリ
ゴヌクレオチドの５′末端に隣接するように第１のオリ
ゴヌクレオチド及び標識されたオリゴヌクレオチドにア
ニーリングされた標的核酸を含んでいる；
【０１５４】（ｂ）ボリメラーゼの５′→３′ヌクレア
ーゼ活性が、アニーリングされ、標識されたオリゴヌク
レオチドを開裂し標識されたフラグメントを解放できる
ようにするのに充分な条件の下に、５′→３′ヌクレア
ーゼ活性をもつ鋳型依存型核酸ポリメラーゼと共に段階
（ａ）の混合物を維持する段階；及び （ｃ）標識されたフラグメントの放出を検出し及び／又
は測定する段階。 この均質検定系は、標的配列が増幅されている間にシグ
ナルを生成し、かくしてその他の検定システムに共通の
増幅された生成物の増幅後の取り扱いを最低限におさえ
るものである。さらに、増大した５′→３′エキソヌク
レアーゼ活性をもつ熱安定性DNA ポリメラーゼの特に好
ましい用途は、PCR 技術を利用する均質検定系において
である。この特定の検定系には、以下の段階が関与して
いる：すなわち、
【０１５５】（ａ）前記試料を含むPCR 検定に、標的核
酸の領域に対し相補的な配列を含む少なくとも１つの標
識オリゴヌクレオチドを提供する段階；なおここでこの
標識オリゴヌクレオチドは段階（ｂ）のオリゴヌクレオ
チドプライマによって境界づけされた標的核酸配列内で
アニーリングする； （ｂ）一組のオリゴヌクレオチドプライマを提供する段
階、なおここで第１のプライマは、標的核酸配列の１つ
の鎖の中の１領域に対し相補的な配列を含み、相補的DN
A 鎖の合成を起動させ、又第２のプライマは、標的核酸
の第２の鎖内の１領域に対し相補的な配列を含み、相補
的DNA 鎖の合成を起動させる；又ここで各オリゴヌクレ
オチドプライマは、同じ核酸鎖にアニーリングされたあ
らゆる標識オリゴヌクレオチドの上流でその相補的鋳型
にアニーリングするように選択されている；
【０１５６】（ｃ）（ｉ）標的領域内に含まれている鋳
型核酸配列へのプライマ及び標識オリゴヌクレオチドの
アニーリング及び（ii）プライマの延長というPCR 循環
段階を許容する条件下で鋳型依存性重合剤として５′→
３′ヌクレアーゼ活性をもつ核酸ポリメラーゼを利用し
て標的核酸配列を増幅する段階；なおここで、この核酸
ポリメラーゼは、核酸ポリメラーゼの５′→３′ヌクレ
アーゼ活性が標識オリゴヌクレオチドとその相補的鋳型
核酸配列を含むアニーリングされた２重鎖から同時に標
識フラグメントを放出して検出可能なフラグメント生成
する間に、１つのプライマ延長生成物を合成する；及び （ｄ）試料中の標的配列の存在又は不在を見極めるため
標識フラグメントの放出を検出し及び／又は測定する段
階。
【０１５７】本発明に基づく熱安定性DNA ポリメラーゼ
の増大した５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は、均質
検定系内で用いられた場合、その大きい方の相補的ポリ
ヌクレオチドにアニーリングされたオリゴヌクレオチド
からのモノヌクレオチド又は小さなオリゴヌクレオチド
の開裂をひき起こす。開裂が効率良く起こるためには、
上流オリゴヌクレオチドも同様に、同じ大きい方のポリ
ヌクレオチドにアニーリングされなくてはならない。こ
の上流オリゴヌクレオチドの３′末端は、核酸ポリメラ
ーゼのための初期結合部位を提供する。結合されたポリ
メラーゼが下流オリゴヌクレオチドの５′末端に遭遇す
ると直ちにポリメラーゼは、モノヌクレオチド又は小さ
いオリゴヌクレオチドをそれから開裂させることができ
る。
【０１５８】２つのオリゴヌクレオチドは、それらが相
補的標的核酸上で極く近くでアニーリングして上流オリ
ゴヌクレオチドの３′末端に対する核酸ポリメラーゼの
結合がそれを自動的に下流オリゴヌクレオチドの５′末
端と接触状態に置くことになるように設計されうる。こ
の方法は、開裂を完遂するべく核酸ポリメラーゼを所定
の位置にもってくるのに重合が必要とされないことか
ら、「重合非依存性開裂」と呼ばれる。
【０１５９】あるいは、２つのオリゴヌクレオチドが鋳
型核酸標的のより遠く隔離された領域にアニールする場
合、核酸ポリメラーゼが下流オリゴヌクレオチドの５′
末端と遭遇する前に重合が起こらなくてはならない。重
合が続行するにつれて、ポリメラーゼは下流オリゴヌク
レオチドの５′末端からモノヌクレオチド又は小さいオ
リゴヌクレオチドを徐々に開裂させる。この開裂は、下
流オリゴヌクレオチドの残りが、鋳型分子から解離する
程度にまで不安定化されてしまうまで続く。この工程は
「重合依存性開裂」と呼ばれる。
【０１６０】下流オリゴヌクレオチドに対する標識の取
りつけが、開裂されたモノヌクレオチド及び小さいオリ
ゴヌクレオチドの検出を可能にする。その後は、未開裂
の標識オリゴヌクレオチドをその開裂されたフラグメン
トから区別するため、複数の方法のうちのいずれでも利
用できる。この要領で、上流及び下流のオリゴヌクレオ
チドに対して相補的な配列を含む核酸試料を識別するこ
とが可能である。換言すると、PCR の開始時点でプライ
マに付随して標識オリゴヌクレオチドが添加され、プロ
ーブの標識ヌクレオチドの加水分解から生成されたシグ
ナルが標的配列の増幅中の検出のための手段を提供す
る。
【０１６１】均質検定系の方法においては、問題の特定
のオリゴヌクレオチド配列すなわち「標的核酸」を含ん
でいる疑いのある試料が提供される。試料中に含まれて
いる標的核酸はまず必要とあらばcDNAに逆転写され、次
に、当業者にとっては周知の物理的、化学的又は酵素的
手段を含む適当なあらゆる変性方法を用いて変性されう
る。鎖分離のための好ましい物理的手段には、完全に
（＞99％）変性されるまで核酸を加熱することが含まれ
る。代表的な変性には、数秒から数分に至るまでの時
間、約80℃から約 105℃までの温度が関与する。変性に
対する１つの代替法として、標識核酸は、例えば一本鎖
RNA 又はDNA ウイルスといったように試料中に一本鎖形
態で存在する可能性がある。
【０１６２】この場合、変性された核酸鎖は、単一の核
酸鎖へのプライマ及びプローブの結合を可能にする条件
であるハイブリッド形成条件下で、予め選択されたオリ
ゴヌクレオチドプライマ及び標識オリゴヌクレオチド
（ここでは、「プローブ」としても言及されている）と
共に保温される。当該技術分野において良く知られてい
るように、プライマは、その２重鎖配列に沿った相対的
位置が、１つのプライマから合成された延長生成物がそ
の鋳型（相補体）から分離された時点でその他のプライ
マの延長のための鋳型として役立ちかくして規定の長さ
の複製鎖生成するように選択される。
【０１６３】相補的鎖はプロープ又はプライマのいずれ
よりも長いことから、鎖はより多くの接触点をもち、従
って与えられたいかなる時間にわたっても互いを見い出
す確率がさらに高くなっている。高いモル余剰のプロー
ブ、及びプライマは、鋳型の再アニーリングよりもむし
ろプライマ及びプローブのアニーリングの方へ平衡を傾
かせる一助となる。プライマは、重合剤が存在する中で
延長生成物の合成を起動するのに充分な長さをもってい
なくてはならない。プライマの正確な長さ及び組成は、
アニーリング反応の温度、プライマの供給源及び組成、
プライマアニーリング部位までのプローブアニーリング
部位の近接性及びプライマ対プローブ濃度の比率を含む
数多くの要因によって左右される。例えば、標的配列の
複雑性に応じて、オリゴヌクレオチドプライマは標準的
に約15〜30個のヌクレオチドを含んでいるが、１つのプ
ライマがそれ以上又はそれ以下のヌクレオチドを含むこ
ともできる。プライマはそのそれぞれの鎖に選択的にア
ニーリングし、安定した２重鎖を形成するだけの充分な
相補性を有していなくてはならない。
【０１６４】ここで用いられるプライマは、増幅すべき
各特定の配列の異なる鎖に対して「実質的に」相補的と
なるように選択される。プライマは、鋳型の正確な配列
を反映している必要はないが、そのそれぞれの鎖に選択
的にハイブリッド形成するのに充分な相補性を有してい
なくてはならない。非相補的塩基又はより長い配列をプ
ライマの中に点在させたり又はプライマの端部に位置づ
けすることも可能であるが、この場合、プライマが鋳型
鎖と安定した２重鎖を形成するのに充分な相補性をこの
鋳型鎖との間に保持していることを条件とする。プライ
マの非相補性ヌクレオチド配列は制限酵素部位を含んで
いてもよい。均質検定系の実践に際しては、標識オリゴ
ヌクレオチドはまず最初に、核酸ポリメラーゼがこの２
重鎖領域に遭遇する前に相補的核酸にアニーリングさ
れ、かくして５′→３′エキソヌクレアーゼ活性が標識
オリゴヌクレオチドフラグメントを開裂及び放出するの
を可能にしなくてはならない。
【０１６５】プライマ延長重合がこの２重鎖領域に達す
る前に又はポリメラーゼが重合非依存性工程において上
流オリゴヌクレオチドに付着する前に標識オリゴヌクレ
オチドが相補的核酸にアニーリングしてしまっている確
率を高めるためには、さまざまな技術を利用することが
できる。重合非依存性工程については、プローブの５′
末端がプライマの３′−末端から比較的遠くなりかくし
てプローブにはプライマ延長がプローブ結合部位をブロ
ックする前にアニールするためのより多くの時間が与え
られることになるように、プローブを位置づけすること
ができる。短かいプライマ分子は一般に、標的核酸と充
分に安定したハイブリッド複合体を形成するのに比較的
低い温度しか必要としない。従って、標識オリゴヌクレ
オチドがプライマアニーリングとの関係において比較的
高い温度で標的に優先的にアニーリングするように、標
識オリゴヌクレオチドをプライマよりも長くなるように
設計することが可能である。
【０１６６】異なる熱安定性をもつプライマ及び標識オ
リゴヌクレオチドを使用することも可能である。例え
ば、プライマよりも大きいＧ／Ｃ含有量ひいてはプライ
マよりも大きい熱安定性をもつように、標識オリゴヌク
レオチドのヌクレオチド組成を選択することが可能であ
る。同様のやり方で、天然の核酸の中に典型的に存在す
る塩基よりもさらに安定した塩基対を形成する塩基類似
体を含む変更されたヌクレオチドをプローブの中に取り
入れることが可能である。
【０１６７】当該検定の効率を最大限にするためプライ
マ結合に先立ってプローブ結合を容易にすることのでき
るプローブの変更としては、プローブと標的のポリアニ
オンバックボーンの相反を減少させるためのプローブ内
への正に帯電した又は中立のホスフォジエステル連鎖の
取込み、（Letsinger 他、1988年、J. Amer. Chem. So
c, 110 ：4470を参照）；塩基の積み重ね (stacking)
を増大させるための、プローブ内への５−ブロモウリジ
ンのごときアルキル化又はハロゲン化された塩基の取込
み；増大した塩基の積み重ねをもつ「Ａ」構造へとプロ
ーブ対標的の２重鎖を強制するための、プローブ内への
リボヌクレオチドの取込み；及びプローブ内でのアデノ
シンの一部分又は全てに対する、６−ジアミノプリン
（アミノアデノシン）の置換が含まれる。
【０１６８】本発明に基づくこのような変更されたプロ
ーブを調製するにあたっては、２重鎖形成の律速段階が
「核形成」つまり単一の塩基対の形成であり、従って望
まれる結果を達成するためには例えば３′又は５′末端
部分のみといったようにプローブの一部分の生物物理学
的特性を変えるだけで充分であるということを認識すべ
きである。さらに、プローブの３′末端部分（３′末端
の８〜12ヌクレオチド）がポリメラーゼによる５′末端
のエキソヌクレアーゼ分解の後で解離することから、
３′末端の変更はポリメラーゼ／ヌクレアーゼ活性との
干渉に関わり無く、行なうことができる。
【０１６９】標識オリゴヌクレオチド及びプライマの異
なる熱安定性を利用するべく、熱循環パラメータも同様
に変動させることができる。例えば、熱循環における変
性段階に続いて、標識オリゴヌクレオチドの結合には許
容されるがプライマ結合には許容されない中間温度を導
入することが可能であり、この場合、温度はプライマの
アニーリング及び延長を可能にすべくさらに低下させら
れる。しかしながら適当な結果を得るためには、後のPC
R 法のサイクルにおいてのみプローブ開裂が起こる必要
があるという点に留意されたい。従って、後のサイクル
においてプローブが優先的にプライマに結合するようた
とえプライマが当初優先的にプローブに結合しようとも
プライマ濃度がプライマ延長を通して減少されるような
形で、反応混合物を設定することが可能である。
【０１７０】プライマの前に標識オリゴヌクレオチドの
結合に有利に作用するためには、プライマ濃度に対する
標識オリゴヌクレオチドの高いモル過剰も使用すること
ができる。この態様においては、標識オリゴヌクレオチ
ド濃度は、典型的に、一般に0.5〜５×10-7Ｍであるそ
れぞれのプライマ濃度よりも約２〜20倍高い範囲内にあ
る。当業者であれば、オリゴヌクレオチド濃度、長さ及
び塩基組成が各々、反応混合物内のいずれかの特定のオ
リゴヌクレオチドのTmに影響を及ぼす重要な要因である
ことを認識することができる。これらの要因の各々は、
プライマアニーリングよりもプローブアニーリングに有
利に作用するため熱力学的偏りを作り出すように操作さ
れうるものである。
【０１７１】当然のことながら、増幅が関与しない系に
対して、均質検定システムを適用することもできる。実
際、本発明は、重合が起こることを必要とさえしていな
い。重合非依存性の系のもつ１つの利点は、標的配列の
増幅の必要性を無くするという点にある。プライマ延長
が存在しない場合、標的核酸は本質的に一本鎖である。
プライマ及び標識オリゴヌクレオチドが標的核酸に対し
隣接して結合されていることを条件として、オリゴヌク
レオチドのアニーリングと標識フラグメントの開裂の逐
次的ラウンドが起こりうる。従って充分な量の標識フラ
グメントを生成することができ、かくして重合が無い状
態での検出が可能となる。当業者であればわかるよう
に、PCR 増幅中に生成されたシグナルはこの重合非依存
性活性により増大されうる。
【０１７２】上述の均質検定系に加えて、強化された
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をもつ本発明の熱安
定性DNA ポリメラーゼは同様に、PCR プライマの１つが
標的配列のRNA コピーを作製するのに用いられるプロモ
ータをコードするような転写増幅系のごときその他の増
幅系においても有用である。同様にして、本発明は、全
て単一の温度でその後DNA コピーを作製するのに使用さ
れることになるRNA 転写物を作るのにさまざまな酵素を
用いる自己保持配列複製(3SR）系においても使用するこ
とができる。５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をもつ
ポリメラーゼを適切なオリゴヌクレオチドと共にリガー
ゼ連鎖反応(LCR）システム内に取込むことにより、LCR
生成物を検出するのに本発明を利用することもできる。
【０１７３】同様に、５′→３′エキソヌクレアーゼ欠
損熱安定性DNA ポリメラーゼがPLCRにおいて役立つのと
ちょうど同じ様に、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性
をもつその他の熱安定性DNA ポリメラーゼも異なる状況
下でPLCRにおいて役に立つ。このことは、PLCRにおける
下流プライマの５′尾部が標的DNA に対して非相補的で
ある場合にいえることである。このような非相補性は、
上流プライマの５′末端が通常標的DNA にアニーリング
することになるフォーク状構造をひき起こす。熱安定性
リガーゼはこのようなフォーク状構造に対して作用でき
ない。しかしながら、熱安定性DNA ポリメラーゼ内の
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性の存在は上流プライ
マのフォーク状５′尾部の切除をひき起し、かくしてリ
ガーゼが作用できるようにする。
【０１７４】低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活
性を有する熱安定性DNA ポリメラーゼを調製するのに効
果的であるものとして以上に記述されている同じプロセ
ス及び技術は、強化された５′→３′エキソヌクレアー
ゼ活性を有する熱安定性DNAポリメラーゼを調製するた
めにも同様に有効である。上述のように、これらの方法
は、部位特異的変異誘発、欠失変異誘発及び「ドメイン
・シャフリング」といった技術も含んでいる。
【０１７５】強化された５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性をもつ熱安定性DNA ポリメラーゼを調製する上で特
に有用なのは、上述の「ドメイン・シャフリング」技法
である。簡単に要約すると、この技術には、そのポリメ
ラーゼの非常に活発な５′→３′エキソヌクレアーゼ活
性をコードするものとして認められているポリメラーゼ
の特定のドメインの開裂及びその後このドメインをさら
に低いレベル又はゼロレベルの５′→３′エキソヌクレ
アーゼ活性をコードする第２の熱安定性DNA ポリメラー
ゼ遺伝子の適切な部域内へと移送することが含まれる。
望まれるドメインは、第２の熱安定性DNA ポリメラーゼ
の望ましくない特性をコードするドメインに置き換わる
ことができ、又第２の熱安定性DNA ポリメラーゼのヌク
レオチド配列に付加することもできる。
【０１７６】約 291〜484 のコドンを含むTma DNA ポリ
メラーゼコード配列がTaq DNA ポリメラーゼエコドン 2
89〜422 の代りに使用されている特定の「ドメインシャ
フリング」例が上に記されている。この置換は、Taq DN
A ポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼドメイ
ン（コドン１〜289)、Tma DNA ポリメラーゼ３′→５′
エキソヌクレアーゼドメイン（コドン 291〜484)及びTa
q DNA ポリメラーゼのDNA ポリメラーゼドメイン（コド
ン 423〜832)を含む新規な熱安定性DNA ポリメラーゼを
生み出す。しかしながら、当業者であれば、強化された
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性のごときいくつかの
望まれる特徴をもつ熱安定性DNA ポリメラーゼを構築す
るためにその他の置換も行なうことができるということ
が認識できることだろう。
【０１７７】以下の例は、例示を目的としてのみ提供さ
れているものであり、請求されている発明の範囲を制限
する意図は全く無いものである。これらの例において、
全ての百分率は、相反する規定のないかぎり、固体の場
合重量百分率であり、液体の場合体積百分率であり、全
ての温度は摂氏温度で示されている。
【０１７８】例１．既知の５′→３′エキソヌクレアー
ゼドメインの無作為突然変異RCR 誘発によるTaq DNAポ
リメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ突然変異体
の調製 インサートの調製 PCR のための鋳型としてプラスミドpLSG12を用いた。こ
のプラスミドは、配列番号：１のTaq ポリメラーゼ遺伝
子ヌクレオチド 616〜621 がAAGCTTからAAGCTGに変えら
れたpLSG5 のHind IIIマイナスヴァージョンである。こ
の変化により、コードされるタンパク質配列を変更する
ことなくTaq ポリメラーゼ遺伝子内でHind III認識配列
が削除された。
【０１７９】プライマとしてオリゴヌクレオチドMK61(A
GGACTACAACTGCCACACACC)（配列番号：21) 及びRA01(CGA
GGCGCGCCAGCCCCAGGAGATCTACCAGCTCCTTG)（配列番号：2
2) を用い鋳型としてpLSG12用いて、Taq ポリメラーゼ
遺伝子のATG 出発（コドン）を含む 384bpフラグメント
ならびにATG 出発コドンの下流のコード配列の追加の 3
31bpを増幅するため、PCR を行なった。以下の製剤及び
反応物を以下の量だけ用いて、 100μｌのPCR を25サイ
クルにわたり行なった： プライマMK61（配列番号：21）50pmol； プライマRA01（配列番号：22）50pmol； 各dNTP50μＭ； トリス−HCl, pH8.3, 10mM； KCl 50mM； MgCl2 1.5mM； pLSG12. 75.6pg； Ampli Taq DNA ポリメラーゼ 2.5単位。
【０１８０】上述のPCR 反応混合物をPerkin-Elmer Cet
usサーモサイクラー内に入れ、以下のプロフィールを通
して作用させた。まず反応混合物を１分45秒にわたり最
高98℃まで上昇させ、25秒間98℃で保持した。反応混合
物を次に45秒にわたり55℃まで下降させ、20秒間この温
度に保った。最後に混合物を45秒にわたって最高72℃ま
で上昇させ、30秒間72℃に保った。最後の５分の延長
は、75℃にて起こった。次にPCR 生成物をクロロホルム
で抽出し、当該技術分野においては周知の技術を用いて
イソプロパノールで析出させた。２時間37℃で、 300ng
のPCR 生成物試料を20ＵのHind IIIで消化した（30μｌ
の反応中) 。この一連の消化は、クローニングのための
330bpのフラグメントを生み出した。
【０１８１】37℃で２時間20ＵのHind III（40μｌ中）
で 5.3μｇのpLSG12を消化することによって、ベクタを
調製した。この消化の後で続けて12ＵのBss H IIを添加
し、50℃で２時間保温した。30℃で30分間CIAP（子牛の
腸内アルカリ性ホスファターゼ）特に0.04ＵのCIAPで処
理することにより、ベクターを脱リン酸した。次に反応
を停止させるためベクター調製物に対して 500mMのEGTA
を４μｌ添加し、45分間65℃で保温することによりホス
ファターゼを不活性化した。上述のホスファターゼ処理
されたベクタ 225ngを10ngのPCR 誘導されたインサート
と１：１のモル比で連結した。
【０１８２】次に、DG116 細胞を連結混合物の５分の１
で形質転換し、30℃でアンピシリン耐性形質転換体を選
択した。OD6000.7に至るまで30℃で一晩適切なコロニー
を増殖させた。PLベクタを含む細胞を37℃で４時間、９
時間又は20時間、振とう水浴内で保温し、調製物を音波
処理し、 0.2Ｍの硫酸アンモニウムが存在する中で75℃
で熱処理した。最後に、ポリメラーゼ活性及び５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性について抽出物を検定し
た。
【０１８３】上述の５′→３′エキソヌクレアーゼ検定
を利用して５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を数量化
した。具体的に言うと、ガンマー〔32Ｐ〕ATP(3000Ｃ：
１mmol）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて
５′末端において、合成３′リン酸化オリゴヌクレオチ
ドプローブ（ポリメラーゼ延長を排除するためリン酸化
されたもの）BW33(GATCGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGC
P)（配列番号：13) (100pmol) を32Ｐ標識した。反応混
合物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー
ルで抽出しその後続けてエタノール沈澱させた。32Ｐ標
識したオリゴヌクレオチドプローブを 100μｌのTE緩衝
液内に再溶解させ、Sephadex G-50 スピンカラム上での
ゲルろ過クロマトグラフィにより、取込まれなかったAT
P を除去した。
【０１８４】10mMのトリス−HCl(pH8.3)、50mMのKCl 、
及び３mMのMgCl2 を含む 100μｌの反応において５pmol
の合成オリゴヌクレオチドプライマBW37(GCGCTAGGGCGCT
GGCAAGTGTAGCGGTCA)（配列番号：14）の存在下で、５pm
olの32ｐ標識されたBW33プローブを、５pmolの一本鎖M1
3mp10W DNAにアニーリングさせた。アニーリング混合物
を５分間95℃まで加熱し、10分にわたって70℃まで冷却
し、さらに10分間70℃で保温し、次に30分にわたりPerk
in-Elmer Cetus DNAサーマルサイクラーの中で25℃にな
るまで冷却した。10μｌのアニーリング混合物を含むエ
キソヌクレアーゼ反応物を１分間70℃で予備保温した。
予備保温反応物に対し 2.5μｌの体積で本発明の熱安定
性DNA ポリメラーゼ調製物（約 0.3Ｕの酵素活性）を加
え、反応混合物を70℃で保温した。
【０１８５】１分後と５分後にアリコート（５μｌ）を
取り出し、60mMのEDTAを１μｌ付加することによって停
止させた。反応生成物をホモクロマトグラフィによって
分析し、エキソヌクレアーゼ活性をオートラジオグラフ
ィに従って数量化した。Polygram CEL300DEAE セルロー
ス薄層クロマトグラフィ板上で７Ｍの尿素内に２％の一
部分加水分解された酵母菌RNA を含むホモクロマトグラ
フィ混合液の中でクロマトグラフィを行なった。５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性の存在は小さい32Ｐ標識さ
れたオリゴマの生成をひき起こし、このオリゴマはTLC
板を上へと移動し、原点に残った分解していないプロー
ブからオートラジオグラム上で容易に区別された。
【０１８６】クローン３−２は、予想されたレベルのポ
リメラーゼ活性を有していたが、５′→３′エキソヌク
レアーゼ活性はほとんど検出不可能であった。これは、
天然Taq DNA ポリメラーゼの中に存在するものに比べ、
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性について1000分の１
以上の減少に相当した。このクローンを次に配列決定
し、G(137)がDNA 配列内でＡに変異していることがわか
った。この変異は、Taq DNA ポリメラーゼのアミノ酸配
列においてGly(46) からAsp への変異をひき起こし、か
くして著しく低下した５′→３′エキソヌクレアーゼ活
性をもつ本発明の熱安定性DNA ポリメラーゼをもたらし
た。回収されたタンパク質は、1990年５月15日付出願の
米国特許出願第 523,394号（引用により本明細書に組み
入れる）の中で教示されているTaq DNA ポリメラーゼプ
ロトコールに従って純化させた。
【０１８７】例２．Taq ポリメラーゼのMet289（Δ289)
544 アミノ酸形態の構成 1990年５月15日に提出された米国特許第 523,394号の例
９に示されているように、天然Taq ポリメラーゼの精製
中に、70℃でdNTPの鋳型依存型組込みを触媒する変更形
態のTaq ポリメラーゼが得られた。この変更形態のTaq
ポリメラーゼは、免疫学的に言うと、精製された天然Ta
q ポリメラーゼのおよそ90kdの形態と関係あるものであ
ったが、分子量はそれよりも低いものであった。SDS-PA
GE電気泳動に従ったBSA 及びオバルブミンとの関係にお
ける移動度に基づくと、この形態の見かけの分子量は約
61kdである。
【０１８８】酵素のこの変更態様は、SDS-PAGEウェスタ
ンブロット分析法或いは又SDS-PAGEゲル電気泳動法に従
った原位置DNA ポリメラーゼ活性測定（Spanos. A., 及
びHubscher, U.（1983年）Meth. Enz. 91 : 263-277)に
よって決定されるようにテルムス・アクアチクス (Ther
mus aquaticus)細胞の入念に調製された粗抽出液の中に
は存在しない。この形態は、試料の取り扱いの間に生じ
うるタンパク質分解の人工産物であると思われる。この
比較的低い分子量の形態は、均質になるまで精製され、
ABI 自動気相シーケンサ上でＮ末端配列決定が行われ
た。得られたＮ末端配列をTaq ポリメラーゼ遺伝子から
予想されるアミノ酸配列（配列番号：１）と比較する
と、この比較的短かい形態がGlu (289) とSer(290)の間
のタンパク質分解による開裂の結果として生じたもので
あることがわかる。
【０１８９】544 アミノ酸の合成を誘導するTaq ポリメ
ラーゼ遺伝子のさら末端が切除された形態を得るために
は、一次翻訳産生プラスミドpFC54 ・t 、pSYC1578及び
相補的合成オリゴヌクレオチドDG29（５′−AGCTTATGTC
TCCAAAAGCT)(配列番号：23)及びDG30（５′−AGCTTTTGG
AGACATA)(配列番号：24) を用いた。Hind III及び BamH
I を用いてプラスミドpFC54 ・t の完全消化を行っ
た。プラスミドpSYC1578をBst XIで消化し（配列番号：
１のヌクレオチド 872〜883 において）、４種類のdNTP
の全ての存在下で大腸菌（E. coli)DNA ポリメラーゼKl
enowフラグメントで処理することによりヌクレオチド
３′粘着末端を除去し、そしてTaq ポリメラーゼ配列内
にLeu294をコードするCTG 末端の２重鎖鈍端を生成せし
めた(Taqポリメラーゼ配列番号：１ヌクレオチド880-88
2 を参照）。
【０１９０】DNA 試料をBal IIを用いて完全消化を行
い、アガロースゲル電気泳動法と電気溶出法によってお
よそ 1.6kbのBst XI(修復されたもの)/Bgl II Taq DNA
フラグメントを精製した。pFC54.t プラスミド消化物
(0.1pmole) をTaq ポリメラーゼ遺伝子フラグメント
(0.3pmole) 及びアニーリングされた非リン酸化DG29／D
G30２重鎖アダプタ(0.5pmole)と30μｇ／ml、15℃で一
晩、粘着性リガーゼ条件の下で連結した。DNA を１mlあ
たり約10マイクログラムまで希釈させ、平滑末端条件下
で連結を続行した。連結されたDNA 試料をXba Ｉで消化
し、あらゆるIL-2ミューテインコード連結生成物を線状
化（不活性化）した。大腸菌（E.coli) K12 菌株DG116
をアンピシリン耐性へと形質転換するため、80ナノグラ
ムの連結され消化されたDNA を使用した。
【０１９１】Eco R Ｉ(4,781bp＋2,386bp), Pst Ｉ(4,1
38bp＋3,029bp), Apa Ｉ(7,167bp）及びHind III／Pst
Ｉ(3,400bp＋3,029bp ＋738bp)で予想された消化生成物
を生成するおよそ7.17Kbのプラスミドの存在について、
Amp R 候補をスクリーニングした。候補プラスミドを宿
す大腸菌 (E.coli) コロニーを、約61kdのTaq ポリメラ
ーゼ関連ポリペプチドの温度誘導性合成について、シン
グロコロニー免疫ブロット法によってスクリーニングし
た。さらに、５′λＰL プロモータ：Taq DNA連結部及
び３′Taq DNA : BT cry PPE 連結部において、候補プ
ラスミドをDNA配列決定に付した。意図されたDNA 配列
をコードし温度誘導可能な61kdのTaq ポリメラーゼ関連
ポリペプチドの合成を誘導するプラスミドの１つを、pL
SG68と称した。
【０１９２】61kDa のTaq Pol Ｉの発現 pLSG8 を含む培養物を、米国特許出願第 523,364号で教
示され以下の例３に記されているように増殖させた。61
kDa のTaq PolＩは、41℃での熱誘導の時点で分解しな
いように思われる。41℃で21時間の後、pLSG8 を宿す培
養物からの熱処理された粗抽出液は、粗抽出液タンパク
質１mgにつき 12310単位の熱安定性DNAポリメラーゼ活
性を有し、これは未誘発培養物に比べ24倍の増大に当た
る。21時間、37℃で誘導されたpLSG8 培養物からの熱処
理された抽出液は、粗抽出液タンパク質１mgあたり9503
単位の活性を有していた。
【０１９３】37℃で５時間と21時間の誘発の間では、Ta
q Pol Ｉの蓄積レベルにおいて９倍の増加が見られ、41
℃では５時間と21時間の誘発の間でほぼ４倍の増大が見
られた。同じ全タンパク質及び熱処理された抽出物をSD
S-PAGEによって分析した。ゲルの各レーンに対して20μ
ｇの粗抽出液タンパク質又は20μｇの粗抽出液タンパク
質からの熱処理された粗抽出液を適用した。17℃及び41
℃の21時間誘導された全タンパク質レーンの両方に容易
に見られる主要バンドは、その熱処理されたものと等し
いほどに強いものである。37℃及び41℃の21時間試料か
ら得られた20μｇの全タンパク質より熱処理された粗抽
出液は、それぞれ熱安定性DNA ポリメラーゼ活性を 186
単位及び 243単位含んでいる。
【０１９４】PCR における61kDa のTaq DNA ポリメラー
ゼの有用性を見極めるため、pLSG8の誘導された培養物
からの熱処理された粗抽出液を用いてPCR 検定を行なっ
た。PCR における全長Taq PolＩの供給源として、pLSG
5 の誘導された培養からの熱処理された粗抽出液を用い
た。末端切除酵素４単位及び２単位を使用した反応にお
いてPCR 生成物が観察された。全長酵素反応物のいずれ
におけるよりもこれらのPCR においてより多くの生成物
が存在していた。さらに、非特異的なより分子量の高い
生成物は全く見えなかった。
【０１９５】61kDa のTaq Pol Ｉの精製 誘導されたpLSG8/DG116 細胞からの61kDa のTaq PolＩ
の精製は、幾分かの修正は加えたが1990年５月15日付の
米国特許第 523,394号の例１におけるように全長Taq P
olＩの生成と同様に推移した。誘導されたpLSG8/DG116
細胞（15.6ｇ）を、1990年５月15日付米国特許第 523,3
94号及び以下の例３で記されているように均質化し溶菌
させた。分画Ｉは、1.87ｇのタンパク質及び 1,047×10
6 単位の活性を含んでいた。 0.2Ｍの硫酸アンモニウム
の上澄みとして得られた分画IIは、74ml中1.84ｇのタン
パク質及び1.28×106 単位の活性を含んでいた。
【０１９６】熱処理に続いて、 0.7％になるまでゆっく
りとPolymin Ｐ（pH7.5)を添加した。遠心分離の後、上
澄み、分画III は 155mgのタンパク質と1.48×106 単位
の活性を含んでいた。分画III を10ml／cm2 ／時で1.15
× 3.1cm（3.2ml)のフェニルセファロースカラム上に負
荷した。適用された活性の全てがカラム上に保持されて
いた。カラムをまず15mlの平衡緩衝液で洗浄し、次にTE
中５ml(1.5カラム体積) の0.1MKCl で洗浄した。20％の
エチレングリコールを含むTE中で２Ｍの尿素でポリメラ
ーゼ活性を溶出させた。ポリメラーゼ活性を伴う分画
（各々0.5 ml) をプールし(8.5ml）、 0.1ＭのKCl を含
むヘパリンセファロース緩衝液中で透析した。透析した
材料、分画IV（12.5ml) は、5.63mgのタンパク質と1.29
×106 単位の活性を含んでいた。
【０１９７】分画IVを、上述のように平衡された 1.0ml
のベッド体積のヘパリンセファロースカラム上に負荷し
た。カラムを６mlの同じ緩衝液 （Ａ280 、ベースラインまで）で洗浄し、同じ緩衝液中
15mlの直線0 .1〜0.5 ＭのKCl 勾配で溶出した。0.16Ｍ
と0.27Ｍの間のKCl により溶出する分画（0.15ml）をSD
S-PAGEで分析した。約47kDa の少量の（＜１％）汚染タ
ンパク質が61kDaのTaq PolＩと同時精製された。 0.16
5Ｍと 0.255Ｍの間のKCl で溶出する分画をプールし、
2.5 Ｘの保存緩衝液中でCentricon30 膜上でダイアフィ
ルトレーションした。分画Ｖは 2.8mgのタンパク質及び
1.033×106 単位の61kDa Taq PolＩを含んでいた。
【０１９８】精製した61kDa のTaq PolＩを用いるPCR 0.5ngのラムダDNA 、各々10pmolの２つのラムダ特異的
プライマ、200 μＭずつのNTP, 10mM のトリス−Cl, pH
8.3, 3mMのMgCl2, 10mM のKCl 及び 3.5単位の61kDa Ta
q PolＩを含むPCR 反応（50μｌ）を行なった。比較と
して、２mMのMgCl2 及び50mMのKCl の置換を伴って上述
のように全長Taq PolＩ1.25単位を用いてPCR 反応を行
なった。熱循環条件は、95℃で１分、60℃で１分を23サ
イクル、そして最後の５分の延長時間は75℃であった。
一回の反応あたりのDNA の量をHoechst 螢光染色素検定
法で数量化した。全長Taq PolＩ(1.4×105 倍の増幅）
の場合の0.70μｇのDNA と比べて61kDa のTaq PolＩ
(2.2×105 倍増幅）の場合1.11μｇの生成物が得られ
た。
【０１９９】61kDa のTaq PolＩの熱安定性 PCR を模倣した緩衝液条件下で、組換え型94kDa のTaq
PolＩ及び61kDa TaqPolＩの定常状態熱不活性化を行な
った。94kDa のTaq PolＩは97.5℃で約９分の見かけの
半減期を有し、一方61kDa のTaq PolＩの半減期は、約
21分であった。61kDa のTaq PolＩの熱不活性化は、０
〜50mMの範囲にわたりKCl 濃度によって影響されなかっ
た。プラスミドpFC85a〜2.68kbのHind III−Asp 718 フ
ラグメント内に含まれたさらにもう１つの末端切除Taq
ポリメラーゼ遺伝子を、ATG 開始コドンに対し、Taq po
l 遺伝子をコードするアミノ末端HindIII 制限部位を作
動的に連鎖させることによって例えばプラスミド PP L
N RBS ATG を用いて発現させることができる。発現時点
でこの融合生成物は〜70,000−72,000ダルトンの末端切
除ポリメラーゼを生成する。
【０２００】この特定の構成は、Hind IIIでプラスミド
pFC85 を消化させ、dATP及びdGTPの存在下でKlenowフラ
グメントで処理することによって作ることができる。得
られるフラグメントは、一本鎖拡張を全て除去するため
Ｓ１ヌクレアーゼでさらに処理され、生じたDNA はAsp
718 で消化され、４つのdNTP全てが存在する中でKlenow
フラグメントで処理される。回収されたフラグメント
は、Sac Ｉで消化されATG 平滑末端を構成するべくdGTP
の存在下でKlenowフラグメントで処理された脱リン酸さ
れたプラスミド PP L N RBS ATG に対してＴ４DNA リガ
ーゼを用いて連結されうる。この連結混合物は次に大腸
菌（E. coli)DG116 を形質転換するために用いることが
でき、形質転換体はTaq ポリメラーゼの生産のためにス
クリーニングされる。発現は、ウェスタン免疫ブロット
分析及び活性分析によって確認することができる。
【０２０１】例３．末端切除５′→３′エキソヌクレア
ーゼ欠損Tma ポリメラーゼ（MET283）の構成、発現及び
精製、 天然Tma DNA ポリメラーゼのアミノ酸 1-283が欠けてい
る５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損Tma DNA ポリメラ
ーゼを発現させるために、以下の段階を行なった。プラ
スミドpTma12-1をBsp H Ｉ（ヌクレオチド位置848)及び
Hind III（ヌクレオチド位置2629）で消化した。アガロ
ースゲル精製により1781塩基対フラグメントを分離し
た。DNA からアガロースを分離するために、望ましいフ
ラグメントを含むゲル切片を、Costar spinex フィルタ
ユニット内で−20℃で凍結させた。室温で解凍した後、
マイクロ遠心分離器内でユニットを回転させた。DNA を
含むろ液をSpeed Vac 濃縮器の中で濃縮し、DNA をエタ
ノール沈澱した。
【０２０２】分離されたフラグメントを、Nco I 及びHi
nd IIIで消化したプラスミドpTma12-1にクローニングし
た。Nco Ｉ消化が、BspHＩでの消化と同じ粘着末端配列
を残すので、前記1781塩基対フラグメントはNco Ｉ及び
Hind IIIでの消化によってプラスミドpTma12-1から切り
出された全長フラグメントと同じ粘着末端を有する。消
化されたプラスミドと分離されたフラグメントとの連結
はフラグメントスイッチをひき起こし、pTma14と呼称さ
れたプラスミドを作製するのに用いられた。類似の方法
で、同じ分離されたフラグメントをpTma13にクローニン
グすることによりプラスミドpTma15を構成した。pTma14
の場合と同様に、pTma15は、天然Tma DNA ポリメラーゼ
のアミノ酸１から 283が欠如したポリメラーゼの発現を
駆動する：未変性コード配列の位置 284でメチオニンコ
ドンにおいて翻訳が開始する。
【０２０３】pTma14及びpTma15の発現プラスミドは両方
共高いレベルで、約70kDa の分子量の５′→３′エキソ
ヌクレアーゼ活性の無い生物学的に活性な熱安定性DNA
ポリメラーゼを発現した；プラスミドpTma15は、pTma14
より高いレベルでポリメラーゼを発現した。３′→５′
エキソヌクレアーゼ活性にとってきわめて重要である３
つのドメイン全てにおけるアミノ酸配列モチーフの保
存、エキソヌクレアーゼ活性にとってきわめて重要な第
１のドメインに至るまでのアミノ末端からの距離、及び
発現されたタンパク質の長さといった大腸菌（E. col
i）Pol ＩのKlenowフラグメントとの類似性に基づく
と、Tma DNA ポリメラーゼの短縮形態（MET284）は、
３′→５′のエキソヌクレアーゼ又はプルーフリーディ
ング活性を示すが５′→３′エキソヌクレアーゼ活性が
欠如している。初期SDS 活性ゲル検定及び３′→５′エ
キソヌクレアーゼ活性についての溶液検定は、プラスミ
ドpTma15を宿す大腸菌（E. coli）宿主細胞によって発
現されたポリメラーゼのプルーフリーディング活性のレ
ベルの低下を示唆する。
【０２０４】MET284 Tma DNA ポリメラーゼを、プラス
ミドpTma15を含む大腸菌（E. coli）菌株DG116 から精
製した。10Ｌの発酵のための種母フラスコには、トリプ
トン（20ｇ／ｌ) 、酵母菌抽出物（10ｇ／ｌ) 、NaCl
（10ｇ／ｌ）、グルコース（10ｇ／ｌ）、アンピシリン
（50ｇ／ｌ）、チアミン（10ｇ／ｌ）が含まれた。種母
フラスコには、寒天平板からのコロニーを接種した（凍
結したグリセロール培養を使用することもできる）。種
母フラスコを0.5 O.D.〜2.0 O.D.（Ａ680)まで30℃で増
殖させた。発酵槽内に接種された種母培養の量は、細菌
濃度が 0.5mgの乾燥重量／リットルとなるように計算さ
れる。
【０２０５】10リットルの増殖培地は、25mMのKH2PO4,
10mMの（NH4)2SO4, ４mMのクエン酸ナトリウム、 0.4mM
のFeCl3, 0.04mM のZnCl2, 0.03mM のCoCl2, 0.03mM の
CuCl 2 及び0.03mMのH3BO3 を含んでいた。以下のような
無菌成分を付加した：４mMのMgSO4, 20ｇ／ｌのグルコ
ース、20mg／ｌのチアミン及び50mg／ｌのアンピシリ
ン。pHはNaOHで 6.8に調整され、添加したNH4OH により
発酵中制御された。NH4OH 添加に関連付けることによっ
てグルコースを連続的に添加した。消泡剤として必要に
応じてプロピレングリコールを付加することにより、発
泡を制御した。溶存酵素濃度は40％に維持した。
【０２０６】発酵槽には上述のように接種を行ない、培
養を30℃で 0.5〜1.0 ×1010細胞／mlの細胞密度（15の
光学密度〔Ａ680 〕）まで増殖させた。増殖温度はMET2
84 Tma DNAポリメラーゼの合成を誘導するため38℃まで
移行させた。温度の移行はpTma15プラスミドのコピー数
を増大させ、同時に、宿主内の欠損プロファージ溶原に
よりコードされた温度感受性cI抑制因子の不活性化を通
して変更されたTma DNA ポリメラーゼ遺伝子の転写を制
御するラムダＰL プロモータを抑制除去する。細胞は６
時間37（Ａ680)の光学密度まで増殖させ、遠心分離によ
って収獲した。細胞マス（ca. 95ｇ／ｌ）を、50mMトリ
ス−Cl，pH7.6, 20mM のEDTA及び20％（ｗ／ｖ）のグリ
セロールを含む緩衝液の等量の中に再懸濁させた。懸濁
液をゆっくりと液体窒素中に滴下させ、「ビーズ」すな
わち小さいペレットとして懸濁液を凍結させた。凍結細
胞を−70℃で保存した。
【０２０７】凍結ビーズ 200ｇ(100ｇの湿潤重量細胞を
含む) に対し、 100mlの１×TE（50mMのトリス−Cl，pH
7.5, 10mM のEDTA）及び 0.3mMまでのDTT, 2.4mMまでの
PMSF, １μｇ／mlまでのロイペプチン及び 0.2mMまでの
TLCK（プロテアーゼインヒビター）を添加した。試料を
氷上で解凍し、低速でブレンダー内で均質に再懸濁させ
た。20000 psi でAmincoフレンチプレスのセル内で、細
胞懸濁液を溶菌させた。粘度を減少させるため、溶菌し
た細胞試料を、各々50％の負荷率、70％の出力で３分間
４回音波処理した。１mMのDTT, 2.4mMのPMSF, １μｇ／
mlのロイペプチン及び 0.2mMのTLCKを含む１×TEを用い
て 550mlになるまで音波処理物を調整した（分画Ｉ）。
【０２０８】0.3Ｍまで硫酸アンモニウムを添加した
後、沸とうしている水浴の中で粗溶菌液を急速に75℃に
し、15分間75℃の水浴へ移送して大腸菌（E. coli）宿
主タンパク質を変性し不活性化した。熱処理された試料
を、急速に０℃まで冷やし20分間氷上で保持した。沈降
したタンパク質及び細胞膜を５℃で30分間20,000XGでの
遠心分離により除去し、上澄み（分画II）を保存した。
熱処理された上澄み（分画II）を、大部分のDNA 及びRN
A を除去すべくポリエチレンイミン(PEI）で処理した。
急速に攪拌しながら、０℃で 437mlの分画IIにPolymin
Ｐ (10％〔ｗ／ｖ〕34.96ml, pH7.5) をゆっくりと添加
した。０℃で30分間の後、30分間20,000×Ｇで試料を遠
心分離した。
【０２０９】50mMのトリス−Cl, pH7.5, 0.3Ｍの硫酸ア
ンモニウム、10mMのEDTA及び１mMのDTT 内で平衡化され
た 100mlのフェニルセファロースカラム(3.2×12.5cm)
に対し80ml／時で上澄み（分画III ）を適用した。同じ
緩衝液約 200mlで（Ａ280 、ベースラインまで）でカラ
ムを洗浄し次に 150mlの50mMトリス−Cl, pH7.5, 100m
M のKCl, 10mM のEDTA及び１mMのDTT で洗浄した。次
に、50mMのトリス−Cl,pH7.5, 2Ｍの尿素，20％（ｗ／
ｖ）のエチレングリコール、10mMのEDTA、及び１mMのDT
T を含む緩衝液でカラムからMET284 Tma DNA ポリメラ
ーゼを溶出し、DNA ポリメラーゼ活性を含む分画をプー
ルした（分画IV) 。
【０２１０】50mMトリス−Cl, pH7.5, 1mMのEDTA、及び
１mMのDTT 中で50mMのKCl と同等の伝導率に分画IVを調
整した。同じ緩衝液中で平衡化された15mlのヘパリン・
セファロースカラムに対して（９ml／時で）試料を適用
した。カラムを約14ml／時(3.5カラム体積) で同じ緩衝
液で洗浄し、同じ緩衝液中で 150mlの0.05〜 0.5ＭのKC
l 勾配で溶出した。DNA ポリメラーゼ活性は、0.11Ｍ〜
0.22Ｍの間のKCl で溶出した。pTma15でコードされた変
形Tma DNA ポリメラーゼを含む分画をプールし、濃縮
し、 2.5×貯蔵緩衝液（50mMのトリス−Cl，pH8.0, 250
mMのKCl, 0.25mMのEDTA, 2.5mM のDTT 及び 0.5％のTwe
en 20) に対しダイアフィルトレーションし、その後 1.
5体積の無菌80％（ｗ／ｖ）グリセロールと混合し、−2
0℃で保存した。
【０２１１】場合によっては、ヘパリンセファロース溶
出されたDNA ポリメラーゼ又はフェニールセファロース
溶出されたDNA ポリメラーゼを透析するか又は50mMトリ
ス−Cl, pH7.5, 1mMのDTT, 1mMのEDTA及び 0.2％のTwee
n 20中50mMのKCl と同等の伝導率に調整し、同じ緩衝液
中で平衡化されたアフィゲルブルーカラムに適用する
（１mgのタンパク質／１mlの樹脂）ことができる。カラ
ムを、同じ緩衝液３〜５カラム体積で洗浄し、同じ緩衝
液中10カラム体積のKCl 勾配（0.05Ｍ〜 0.8Ｍ）で溶出
した。DNA ポリメラーゼ活性を含む分画（0.25Ｍから
0.4ＭまでのKCl で溶出する）をプールし、濃縮し、ダ
イアフィルトレーションし、上述のように保存した。
【０２１２】種々のDNA ポリメラーゼの相対的な耐熱性
を比較した。97.5℃で天然Tma DNAポリメラーゼの半減
期は、天然又は組換え型Taq DNA （すなわちAmpli Taq)
DNAポリメラーゼの半減期の２倍以上である。驚くべき
ことに、MET284 Tma DNA ポリメラーゼの97.5℃での半
減期は、天然Tma DNA ポリメラーゼの半減期より、 2.5
〜３倍長い。10mMのトリス−Cl, pH8.3 及び 1.5mMのMg
Cl2(Taq 又は天然Tma DNAポリメラーゼについて）又は
３mMのMgCl2(MET284 Tma DNA ポリメラーゼについ
て）、50mMのKCl(Taq 、天然Tma 及びMET284 Tma DNA
ポリメラーゼについて）又はKCl無し(MET284 Tma DNA
ポリメラーゼについて）、各々 0.5μＭのプライマーPC
R01 及びPCR02, 1ngのラムダ鋳型DNA 、各々 200μＭの
dNTP（dCTPを除く）及び各々４単位の酵素を含むPCR 管
を、０〜60分間、大型水浴内で97.5℃で保温した。時間
の経過につれて、試料をひき出し、０℃で保存し、残留
活性について５μｌを標準活性検定において10分間75℃
で検定した。
【０２１３】天然Tma DNA ポリメラーゼが97.5℃で約21
〜22分の半減期を有していたのに対して、Taq DNA ポリ
メラーゼは、97.5℃で約10分の半減期を有していた。驚
くべきことに、Tma DNA ポリメラーゼのMET284形態は、
Taq 又は天然Tma DNAポリメラーゼのいずれよりも著し
く長い半減期（50〜55分）を有していた。MET284 Tma
DNA ポリメラーゼの改良された耐熱性は、PCR 特に、標
的及びPCR 生成物の配列の完全な変性のために必要とさ
れる鎖分離温度が酵素の不活性化を導くためにＧ＋Ｃの
豊富な標的を増幅するのが困難である場合に、応用され
る。
【０２１４】10mMのトリス−Cl, pH8.3, 3mMのMgCl2, 2
00μＭずつのdNTP, 0.5ng のバクテリオファージラムダ
DNA, 0.5μＭのプライマPCR01,４単位のMET284 Tma DN
A ポリメラーゼ及び0.5 μＭのプライマPCR02 又はPL10
を50μｌ含むPCR 管を、１分間96℃の変性温度及び２分
間60℃のアニーリング−延長温度を用いて25サイクル循
環させた。ラムダDNA 鋳型、デオキシヌクレオチド貯蔵
溶液及びプライマPCR01 及びPCR02 は、PECI Gene Amp
キットの一部を成していた。プライマPL10は次の配列を
有している：５′−GGCGTACCTTTGTCTCACGGGCAAC-３′
（配列番号：25）。又これはバクテリオファージラムダ
ヌクレオチド8106−8130に対し相補的である。
【０２１５】プライマPCR01 及びPCR02 は、ラムダから
500bp生成物を増幅する。プライマ対PCR01 及びPL10は
ラムダから１kb生成物を増幅する。それぞれのプライマ
組での増幅の後、５μｌのアリコートをアガロースゲル
電気泳動に付し、臭化エチジウム染色で特定の意図され
た生成物バンドを視覚化した。両方のプライマ組で豊富
なレベルの生成物が生成され、MET284 Tma DNA ポリメ
ラーゼが意図された標的配列をうまく増幅したことが示
された。
【０２１６】例４．末端切除型Tma DNA ポリメラーゼの
発現 MET 140 での翻訳を開始するTma DNA ポリメラーゼの
５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損形態を発現するた
め、アミノ酸１から 139に相当するコード領域を発現ベ
クターから欠失させた。このような欠失を構成するため
のプロトコルは、例２及び３に記述されている構成に類
似している：すなわち、短縮された遺伝子フラグメント
を切り出し、次に全長フラグメントが切除されたベクタ
ー内にこれを再挿入する。しかしながら、短縮されたフ
ラグメントは、制限消化物から精製するのではなくむし
ろPCR 増幅生成物として得ることができる。この方法論
は、新しい上流制限部位（又はその他の配列）が有用な
場合にこれを取り込むことができる。
【０２１７】位置 140にあるメチオニンコドンまでの領
域を欠失させるために、PCR を用いてpTma12-1及びpTma
13内にSph I 部位を導入した。Tma DNA ポリメラーゼ配
列番号：3(FL63）のヌクレオチド409-436 に対応する順
方向プライマを、位置 140のメチオニンコドンのちょう
ど上流でSph I 部位に導入するよう設計した。Tma DNA
ポリメラーゼ配列番号：3(FL69）のヌクレオチド608-63
4 の相補体に一致する逆プライマは、位置 621でXba I
部位を含むように選択された。Sma I で 線状化された
プラスミドpTma12-1をPCR 鋳型として用い、約225bp の
PCR 生成物を生成せしめた。
【０２１８】消化の前に、PCR 生成物をPCR 反応混合物
中でプロテイナーゼ K50μｇ／mlに0.5％のSDS 及び５m
MのEDTAを加えたもので処理した。37℃で30分間保温し
た後、プロテイナーゼ Kを10分間68℃で熱不活性化し
た。この手順は、次の制限消化を抑制する可能性のある
生成物に結合されたあらゆるTaq ポリメラーゼを除去し
た。緩衝液はTE緩衝液に変えられ、余分なPCR プライマ
はCentricon 100 マイクロ濃縮器で除去された。
【０２１９】増幅したフラグメントをまずSph Ｉで消化
し、次にSph Ｉ開裂末端で平滑末端を形成すべくKlenow
で処理し、最後にXba Ｉで消化した。得られたフラグメ
ントを、Nco Ｉで消化されたプラスミドpTma13 (pTma12
-1でもよかろう）に連結させ、Klenowで修復し、次にXb
a Ｉで消化した。連結は、Nco Ｉ部位（コード配列の第
１のメチオニンコドン）及び導入されたSph Ｉ部位（位
置 140のメチオニンコドンの上流) に続く領域が欠失さ
れた状態で、フレーム内コード配列を生成した。得られ
た発現ベクターはpTma16と呼称された。この例で使用さ
れるプライマは以下にそして配列表の節で示される。
【０２２０】
【表８】
【０２２１】例５．MET140発現ベクタ中の望ましくない
RBS の除去 位置 140のメチオニンコドンの上流のリボソーム結合部
位(RBS）を除去することによって、Tma DNA ポリメラー
ゼのMET140形態の発現の低減を達成することができる。
RBS は、アミノ酸配列を変えることなくオリゴヌクレオ
チド部位特異的変異誘発を介して除去された。遺伝子コ
ードの縮重性を利用して、核酸配列を変えるべくコドン
の第３の位置に変化をもたらすことができ、かくしてコ
ードされたタンパク質のアミノ酸配列を変えることなく
RBS を除去することができる。
【０２２２】変更された配列を含む変異誘発性プライマ
（FL64）を合成し、リン酸化した。Stratagen から市販
されているヘルパーファージR408と同時感染させること
によって、一本鎖のpTma09（Nco Ｉ部位を有する全長ク
ローン）を調製した。一本鎖pTma09とpBS13+のPvu II消
化物からの大きなフラグメントの「ギャップを有する２
重鎖」を、まず２つのプラスミドを混合し、２分間沸と
うするまで加熱し、５分間65℃まで冷却することによっ
て形成した。次に、リン酸化したプライマを混合し２分
間80℃まで加熱し、その後ゆっくりと室温まで冷却する
ことにより「ギャップを有する２重鎖」とアニーリング
させた。Klenowでの延長により残留するギャップをフィ
ルインし、フラグメントをＴ４DNA リガーゼで連結し
た。これらの反応は両方共、30分間37℃で標準塩中 200
μＭずつのdNTPと40μＭのATP の中で行なわれた。
【０２２３】得られた円形フラグメントをニトロセルロ
ースフィルタ上の平板形質転換によってDG101 宿主細胞
へと形質転換させた。重複フィルタを作り、正しいプラ
スミドの存在をγ32Ｐ−リン酸化プローブ（FL65）で調
査することによって検出した。得られたベクタは、pTma
19と呼称された。pTma19からのRBS マイナス部分は、Nc
o Ｉ／Xba Ｉフラグメントスイッチを介してpTma12-1へ
とクローニングした。
【０２２４】Nco Ｉ及びXba ＩでプラスミドpTma19を消
化し、上述の例３のようにゲル電気泳動により 620bpフ
ラグメントを精製した。プラスミドpTma12-1をNco Ｉ，
XbaＩ、及びXcm Ｉで消化した。Xcm Ｉ開裂は、「粘
着」末端を連結するのに適した条件下（希釈リガーゼ及
び40μＭのATP)で行なわれるその後の連結段階を目的と
して、RBS+フラグメントを不活性化させる。最終的に、
連結生成物は、発現のためDG116 宿主細胞に形質転換さ
れ、pTma19-RBSと呼称される。この例で用いられるオリ
ゴヌクレオチド配列は、以下にそして配列表の節で列挙
される。
【０２２５】
【表９】
【０２２６】例６．末端切除型Tma DNA ポリメラーゼME
T-ASP21 及びMET-GLU74 の発現 Tma DNA ポリメラーゼ遺伝子コード配列の位置21におい
てアスパラギン酸コドンで翻訳開始を行なうために、こ
のコドンの前にメチオニンコドンを導入して、最初のNc
o Ｉ部位からこの導入されたメチオニンコドンまでの領
域を欠失させる。例４と同様に、欠失法には、 570塩基
対生成物を生成するためNco Ｉ部位とメチオニンコドン
を取り込むよう設計された上流プライマ（FL66）及び上
述の同じ下流プライマ（FL69）を用いるPCR が含まれ
た。
【０２２７】増幅した生成物を、余分なプライマ及び緩
衝液を除去するためCentricon-100 マイクロ濃縮器で濃
縮した。生成物をSpeed Vac 濃縮器で濃縮し、次に消化
混合物中に再懸濁した。増幅生成物をNco IV及びXba Ｉ
で消化した。同様にして、pTma12-1, pTma13、又はpTma
19-RBSを同じ２つの制限酵素で消化した。消化し増幅さ
れたフラグメントを消化された発現ベクタに連結した。
得られた構成体は、天然Tma コード配列の出発コドンの
上流のNco Ｉ部位から天然Tmaコード配列の位置21にお
いてアスパラギン酸コドンの上流に導入された新しいメ
チオニンコドンまでの欠失を有している。
【０２２８】同様にして、翻訳開始がGlu74 つまり天然
Tma コード配列の位置74におけるグルタミン酸コドンで
始まるような形で、欠失変異体を作製した。上流プライ
マ（FL67）はメチオニンコドンとNco Ｉ部位をGlu74 の
前に導入するように設計される。使用された下流プライ
マ及びクローニングプロトコルは、MET-ASP21 構成体に
ついて上述した通りである。この例で用いられた上流プ
ライマ配列は、以下にそして配列表の節に列挙する。
【０２２９】
【表１０】
【０２３０】例７．末端切除型Taf ポリメラーゼの発現 ５′→３′エキソヌクレアーゼ活性が欠如しているTaf
ポリメラーゼのミューテイン形態をTaf ポリメラーゼ遺
伝子の５′末端に欠失を導入することによって構成し
た。以下のプロトコルを用いて279 及び 417の両方の塩
基対欠失を作った；すなわち、望まれるフラグメントを
切除するため制限酵素で発現プラスミドを消化し、平滑
末端を生成するべくフラグメント末端をKlenow及び４つ
のdNTP全てを用いて修復し、望まれる欠失を伴う新しい
円形プラスミドを生成するべく生成物を連結した。93キ
ロダルトンのTaf ポリメラーゼの５′→３′エキソヌク
レアーゼ欠損形態を発現するため、アミノ酸2-93を含む
279bp欠失を生成させた。88キロダルトンのTaf ポリメ
ラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損形態を発現
するためには、アミノ酸2-139 を含む 417bp欠失を生成
させた。
【０２３１】コドン2-93が欠失されたプラスミドを作る
ためには、Nco Ｉ及びNde ＩでpTaf03を消化し、末端を
Klenow処理により修復した。消化され修復されたプラス
ミドを５μｇ／mlまで希釈し、平滑末端条件下で連結し
た。希釈したプラスミド濃度は、分子間連結に有利に作
用する。連結されたプラスミドをDG116 に形質転換し
た。ミニ−スクリーンDNA 調製物を制限分析に付し、適
切なプラスミドをDNA 配列分析によって確認した。pTaf
03からセグメントを欠失させることにより生み出され
た、得た発現ベクターはpTaf09と呼称された。pTaf03か
ら作製された類似のベクターはpTaf10と呼称された。コ
ドン2-139 が欠失した発現ベクターも作製した。最初の
制限消化がNco Ｉ及びBgl IIで行なわれるという点を除
き、同じプロトコルを用いた。pTaf03から作製された発
現ベクタはpTaf11と呼称され、pTaf05から作製された発
現ベクタはpTaf12と呼称された。
【０２３２】例８．５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損
熱安定性DNA の誘導と発現 アミノ酸 292から 834までを含むテルムス (Thermus)ス
ペーシスＺ05のポリメラーゼ テルムス（Thermus)スペーシスＺ05からの５′→３′エ
キソヌクレアーゼ欠損熱安定性DNA ポリメラーゼをコー
ドするDNA フラグメントを得るために、アミノ酸 292か
ら 834を含むDNA ポリメラーゼ遺伝子の一部分を、10mM
のトリス−HClpH8.3, 50mM のKCl を含み 100μｌの鉱
油が上に被さった80μｌの溶液： 50pmolesのTZA292 50pmolesのTZR01 10ngのテルムス（Thermus)スペーシスＺ05ゲノムDNA 2.5 単位のAmpli Taq DNA ポリメラーゼ 各々50μＭのdATP, dGTP, dCTP, dTTP 中で順方向プライマTZAA292 及び逆方向プライマTZR01
を伴うPCR において選択的に増幅させた。反応は、80℃
の予熱されたサイクラー内に管を入れた後 7.5mMのMgCl
2 を含む20μｌを添加することによって開始された。
【０２３３】ゲノムDNA を、制限エンドヌクレアーゼAs
p 718 で完全に消化し、５分間98℃で変性させ、０℃ま
で急速に冷却した。試料を、以下のプロフィールに従っ
てPerkin-Elmer Cetusサーマルサイクラの中で循環させ
た： 96℃までステップ循環させ、20秒間保持する。55℃まで
ステップ循環させ、30秒間保持する。30秒にわたり72℃
まで上昇させ１分間保持する。このプロフィルを３サイ
クル反復する。96℃までステップ循環させ、20秒間保持
する。65℃までステップ循環させ、２分間保持する。プ
ロフィルを25サイクル反復する。最後のサイクルの後、
５分間保持する。
【０２３４】アガロースゲル電気泳動により意図された
1.65kbのPCR 生成物を精製し、フェノール−クロロホル
ム抽出とエタノール沈澱の後、回収した。精製された生
成物を、制限エンドヌクレアーゼNde Ｉ及びBgl IIで消
化し、Nde I ／BamHＩ消化され脱リン酸されたプラスミ
ドベクターpDG164と連結させる（1989年12月22日付の米
国特許第455, 967 号、例６Ｂ；引用によりこの明細書
に組み入れる）。大腸菌（E. coli）菌株DG116 のアン
ピシリン耐性形質転換体を30℃で選択し、望ましい組換
え型プラスミドについてスクリーニングした。プラスミ
ドpZ05A292は、例２のPLSG8 でコードされたタンパク質
と類似した、 544アミノ酸、５′→３′エキソヌクレア
ーゼ欠損テルムス（Thermus)スペーシスＺ05熱安定性DN
A ポリメラーゼをコードする。DNA ポリメラーゼ活性
は、例２と同様に精製される。精製されたタンパク質
は、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性が欠損してお
り、対応する天然酵素に比べ耐熱性があり、Ｇ＋Ｃの豊
富な鋳型のPCR において特に有用である。
【０２３５】
【表１１】
【０２３６】例９．アミノ酸 288〜830 を含むテルムス
(Thermus) スペーシスsps17 の５′→３′エキソヌクレ
アーゼ欠損熱安定性DNA ポリメラーゼの誘導と発現 テルムス（Thermus)スペーシスsps17 から５′→３′エ
キソヌクレアーゼ欠損熱安定性DNA ポリメラーゼをコー
ドするDNA フラグメントを得るためには、アミノ酸 288
〜830 を含むDNA ポリメラーゼの一部分を、10mMのトリ
ス−HCl pH8.3,50mM のKCl を含み 100μｌの鉱油が上
に被さった80μｌの溶液： 50pmolesのTSA288 50pmolesのTSR01 10ngのテルムス（Thermus)スペーシスsps17 ゲノムDNA 2.5 単位のAmpli Taq DNA ポリメラーゼ、 各々50μＭのdATP, dGTP，dCTP, dTTP、 中で順方向プライマTSA288及び逆方向プライマTSR01 を
用いるPCR において選択的に増幅させた。80℃の予熱さ
れたサイクラー内に管を入れた後 7.5mMのMgCl 2 を含む
20μｌを添加することによって反応を開始した。
【０２３７】ゲノムDNA を98℃で５分間変性し、０℃ま
で急速に冷却させた。以下のプロフィールに従ってPerk
in-Elmen Cetusサーマルサイクラ内で、試料を循環させ
た： 96℃までステップ循環させ、20秒間保持する。55℃まで
ステップ循環させ、30秒間保持する。30秒にわたり72℃
まで上昇させ１分間保持する。プロフィルを３サイクル
反復する。96℃までステップ循環させ、20秒間保持す
る。65℃までステップ循環させ、２分間保持する。プロ
フィルを25サイクル反復する。最後のサイクルの後５分
間保持する。
【０２３８】アガロースゲル電気泳動法により、意図さ
れた1.65kbのPCR 生成物を精製し、フェノールクロロホ
ルム抽出及びエタノール沈澱の後回収した。精製された
生成物を、制限エンドヌクレアーゼNde Ｉ及びBql IIで
消化し、Nde Ｉ／Bam H Ｉで消化され脱リン酸されたプ
ラスミドベクタpDG164に連結した（1989年12月12日付出
願の米国特許出願第 455,967号、例６Ｂ）。大腸菌（E.
coli）菌株DG116 のアンピシリ耐性形質転換体を30℃
で選択し、望ましい組換えプラスミドについてスクリー
ニングした。プラスミドpSPSA288は、例２のpLSG8 でコ
ードされたタンパク質と類似した、544 アミノ酸、５′
→３′エキソヌクレアーゼ欠損テルムス（Thermus)スペ
ーシスsps17 熱安定性DNA ポリメラーゼをコードする。
DNA ポリメラーゼ活性を、例２と同様に精製する。精製
されたタンパク質は５′→３′エキソヌクレアーゼ活性
が欠損しており、対応する天然酵素に比べ耐熱性が高
く、Ｇ＋Ｃの豊富な鋳型のPCR において特に有用であ
る。
【０２３９】
【表１２】
【０２４０】例10．アミノ酸 292から 834を含むテルム
ス・サーモフィルス (Thermus Ther mophilus) の５′→
３′エキソヌクレアーゼ欠損熱安定性DNA ポリメラーゼ
の誘導と発現 テルムス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）か
ら５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損熱安定性DNA ポリ
メラーゼをコードするDNA フラグメントを得るために、
アミノ酸 292〜834 を含むDNA ポリメラーゼ遺伝子の一
部分を、10mMのトリス−HCl pH8.3, 50mM のKCl を含み
上に 100μｌの鉱油が被さっている80μｌの溶液： 50pmolesのTZA292 50pmolesのDG122 １ngのEco RI消化されたプラスミドpLSG22 2.5 単位のAmpli Taq DNA ポリメラーゼ 各々50μＭのdATP, dGTP，dCTP, dTTP 中で順方向プライマTZA292及び逆方向プライマDG122 を
用いるPCR において選択的に増幅させる。80℃の予熱さ
れたサイクラの中に管を入れた後、 7.5mMのMgCl2 を含
む20μｌを付加することによって反応を開始させた。
【０２４１】プラスミドpLSG22 (1989年12月22日付出願
の米国特許出願第455,967 号；この記載は引用により本
明細書に組み込まれる）を制限エンドヌクレアーゼEco
RIで完全に消化し、98℃で５分間変性し、急速に０℃ま
で冷却した。以下のプロフィルに従って、Perkin-Elmer
Cetusサーマルサイクラ内で、試料を循環させた： 96℃までステップ循環させ、20秒間保持する。55℃まで
ステップ循環させ、30秒間保持する。30秒にわたり72℃
まで上昇させ１分間保持する。プロフィルを３サイクル
反復する。96℃までステップ循環させ、20秒間保持す
る。65℃までステップ循環させ２分間保持する。プロフ
ィルを25サイクル反復する。最後のサイクルの後５分間
保持する。
【０２４２】アガロースゲル電気泳動法により、意図さ
れた1.66kbのPCR 生成物を精製し、フェノール−クロロ
ホルム抽出及びエタノール沈澱の後回収する。精製され
た生成物を、制限エンドヌクレアーゼNde Ｉ及びBgl II
で消化し、Nde Ｉ／Bam HIで消化され脱リン酸されたプ
ラスミドベクタpDG164と連結する（1989年12月12日付出
願の米国特許出願第 455,967号、例６Ｂ）。大腸菌（E.
coli）菌株DG116 のアンピシリン耐性形質転換体を30
℃で選択し、望ましい組換えプラスミドについてスクリ
ーニングする。プラスミドpTTHA292は、例２のpLSG8 で
コードされたタンパク質と類似した、544 アミノ酸、
５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損テルムス・サーモフ
ィルス（Thermus thermophilus）熱安定性DNA ポリメラ
ーゼをコードする。DNA ポリメラーゼ活性を、例２と同
様に精製する。精製されたタンパク質は５′→３′エキ
ソヌクレアーゼ活性が欠損しており、対応する天然酵素
に比べ耐熱性が高く、Ｇ＋Ｃの豊富な鋳型のPCR におい
て特に有用である。
【０２４３】
【表１３】
【０２４４】例11．アミノ酸 285〜892 を含むテルモシ
ポ・アフリカヌス（Thermosipho Af ricanus)の５′→
３′エキソヌクレアーゼ欠損熱安定性DNA ポリメラーゼ
の誘導と発現 テルモシポ・アフリカヌス（Thermosipho africanus ）
から５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損熱安定性DNA ポ
リメラーゼをコードするDNA フラグメントを得るために
は、アミノ酸 285〜892 を含むDNA ポリメラーゼ遺伝子
の一部分を、10mMのトリス−HCl pH8.3, 50mM のKCl を
含み 100μｌの鉱油が上に被さった80μｌの溶液： 50pmolesのTAFI285 50pmolesのTAFR01 １ngのプラスミドpBSM : TafRV３′DNA 2.5 単位のAmpli Taq DNA ポリメラーゼ 各々50μＭのdATP, dGTP，dCTP, dTTP 中で順方向でプライマTAFI285 及び逆方向プライマTAFR
01を用いるPCR において選択的に増幅させる。80℃の予
熱されたサイクラー内に管を入れた後 7.5mMのMgCl2 を
含む20μｌを付加することによって反応を開始させた。
【０２４５】プラスミドpBSM TafRV′３（CETUS CASE25
83, １，EX４，ｐ53内に記されている通りに得られたも
の；引用により本明細書に組み入れる）を完全にEco RI
で消化し、DNA を98℃で５分間変性させ、０℃まで急速
に冷却した。以下のプロフィルに従ってPerkin-Elmer C
etusサーマルサイクラ内で試料を循環させた。 95℃までステップ循環させ、30秒間保持する。55℃まで
ステップ循環させ、30秒間保持する。30秒にわたり72℃
まで上昇させ、１分間保持する。プロフィルを３サイク
ル反復する。95℃までステップ循環させ、30秒間保持す
る。65℃までステップ循環させ、２分間保持する。プロ
フィルを20サイクル反復する。最後のサイクルの後、５
分間保持する。
【０２４６】アガロースゲル電気泳動法により、意図さ
れた1.86kbのPCR 生成物を精製し、フェノールクロロホ
ルム抽出及びエタノール沈澱の後回収する。精製された
生成物を、制限エンドヌクレアーゼNde Ｉ及びBam H Ｉ
で消化し、NdeI／BamHＩで消化され脱リン酸されたプラ
スミドベクターpDG164と連結する（1989年12月22日付出
願の米国特許出願第 455,967号、例６Ｂ）。大腸菌（E.
coli）菌株DG116 のアンピリシン耐性形質転換体を30
℃で選択し、望ましい組換え型プラスミドについてスク
リーニングする。プラスミドpTAFI285は例３のPTM15 で
コードされたタンパク質に類似した、609 アミノ酸、
５′→３′エキソヌクレアーゼ欠損テルモシポ・アフリ
カヌス(Thermosipho africanus) 熱安定性DNA ポリメラ
ーゼをコードする。DNA ポリメラーゼ活性を、例３と同
様に精製される。精製されたタンパク質は５′→３′エ
キソヌクレアーゼ活性が欠損しており、対応する未変性
酵素に比べて耐熱性が高く、Ｇ＋Ｃの豊富な鋳型のPCR
において特に有用である。
【０２４７】
【表１４】
【０２４８】以上の明細書は当業者が本発明を実施でき
るようにするのに充分なものであると考えられる。本発
明は、寄託された細胞系によってその範囲が限定される
ものではない。寄託された態様は本発明の一態様を単に
例証するためのものであり、機能的に等価のあらゆる細
胞系が本発明の範囲内に入るのである。ここで、材料の
寄託は、本書に含まれている記述が本発明の最良の態様
を含むあらゆる態様の実施を可能にするのに不適当であ
ることを容認するものではなく、又、寄託はそれが代表
している特定の例に請求の範囲を制限するものであると
みなされるべきものではない。実際、本書で示し記述し
たものに加えて、当業者には、前述の説明から本発明の
さまざまな変形態様が明らかになると思われ、これらの
変形態様は、添付のクレームの範囲内に入るものであ
る。
【０２４９】
【配列表】
（２）配列番号：１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：2499 塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic) （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （vi）由来： （Ａ）生物：Thermus aquaticus （ix）特徴： （Ａ）NAME/key：CDS （Ｂ）位置：1..2496 （xi）配列の記載：配列番号：１： ATG AGG GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG GGC CGG GTC CTC CTG 48 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 GTG GAC GGC CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTC CAC GCC CTG AAG GGC 96 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 CTC ACC ACC AGC CGG GGG GAG CCG GTG CAG GCG GTC TAC GGC TTC GCC 144 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 AAG AGC CTC CTC AAG GCC CTC AAG GAG GAC GGG GAC GCG GTG ATC GTG 192 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 GTC TTT GAC GCC AAG GCC CCC TCC TTC CGC CAC GAG GCC TAC GGG GGG 240 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 TAC AAG GCG GGC CGG GCC CCC ACG CCG GAG GAC TTT CCC CGG CAA CTC 288 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 GCC CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC CTC CTG GGG CTG GCG CGC CTC GAG 336 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 GTC CCG GGC TAC GAG GCG GAC GAC GTC CTG GCC AGC CTG GCC AAG AAG 384 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 GCG GAA AAG GAG GGC TAC GAG GTC CGC ATC CTC ACC GCC GAC AAA GAC 432 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 CTT TAC CAG CTC CTT TCC GAC CGC ATC CAC GTC CTC CAC CCC GAG GGG 480 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 TAC CTC ATC ACC CCG GCC TGG CTT TGG GAA AAG TAC GGC CTG AGG CCC 528 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 GAC CAG TGG GCC GAC TAC CGG GCC CTG ACC GGG GAC GAG TCC GAC AAC 576 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 CTT CCC GGG GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACG GCG AGG AAG CTT CTG 624 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 GAG GAG TGG GGG AGC CTG GAA GCC CTC CTC AAG AAC CTG GAC CGG CTG 672 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 AAG CCC GCC ATC CGG GAG AAG ATC CTG GCC CAC ATG GAC GAT CTG AAG 720 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 CTC TCC TGG GAC CTG GCC AAG GTG CGC ACC GAC CTG CCC CTG GAG GTG 768 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 GAC TTC GCC AAA AGG CGG GAG CCC GAC CGG GAG AGG CTT AGG GCC TTT 816 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 CTG GAG AGG CTT GAG TTT GGC AGC CTC CTC CAC GAG TTC GGC CTT CTG 864 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 GAA AGC CCC AAG GCC CTG GAG GAG GCC CCC TGG CCC CCG CCG GAA GGG 912 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 GCC TTC GTG GGC TTT GTG CTT TCC CGC AAG GAG CCC ATG TGG GCC GAT 960 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 CTT CTG GCC CTG GCC GCC GCC AGG GGG GGC CGG GTC CAC CGG GCC CCC 1008 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 GAG CCT TAT AAA GCC CTC AGG GAC CTG AAG GAG GCG CGG GGG CTT CTC 1056 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 GCC AAA GAC CTG AGC GTT CTG GCC CTG AGG GAA GGC CTT GGC CTC CCG 1104 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 CCC GGC GAC GAC CCC ATG CTC CTC GCC TAC CTC CTG GAC CCT TCC AAC 1152 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 ACC ACC CCC GAG GGG GTG GCC CGG CGC TAC GGC GGG GAG TGG ACG GAG 1200 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 GAG GCG GGG GAG CGG GCC GCC CTT TCC GAG AGG CTC TTC GCC AAC CTG 1248 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 TGG GGG AGG CTT GAG GGG GAG GAG AGG CTC CTT TGG CTT TAC CGG GAG 1296 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 GTG GAG AGG CCC CTT TCC GCT GTC CTG GCC CAC ATG GAG GCC ACG GGG 1344 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 GTG CGC CTG GAC GTG GCC TAT CTC AGG GCC TTG TCC CTG GAG GTG GCC 1392 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 GAG GAG ATC GCC CGC CTC GAG GCC GAG GTC TTC CGC CTG GCC GGC CAC 1440 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 CCC TTC AAC CTC AAC TCC CGG GAC CAG CTG GAA AGG GTC CTC TTT GAC 1488 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 GAG CTA GGG CTT CCC GCC ATC GGC AAG ACG GAG AAG ACC GGC AAG CGC 1536 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 TCC ACC AGC GCC GCC GTC CTG GAG GCC CTC CGC GAG GCC CAC CCC ATC 1584 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 GTG GAG AAG ATC CTG CAG TAC CGG GAG CTC ACC AAG CTG AAG AGC ACC 1632 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 TAC ATT GAC CCC TTG CCG GAC CTC ATC CAC CCC AGG ACG GGC CGC CTC 1680 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACG GCC ACG GCC ACG GGC AGG CTA AGT AGC 1728 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 TCC GAT CCC AAC CTC CAG AAC ATC CCC GTC CGC ACC CCG CTT GGG CAG 1776 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 AGG ATC CGC CGG GCC TTC ATC GCC GAG GAG GGG TGG CTA TTG GTG GCC 1824 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 CTG GAC TAT AGC CAG ATA GAG CTC AGG GTG CTG GCC CAC CTC TCC GGC 1872 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 GAC GAG AAC CTG ATC CGG GTC TTC CAG GAG GGG CGG GAC ATC CAC ACG 1920 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 GAG ACC GCC AGC TGG ATG TTC GGC GTC CCC CGG GAG GCC GTG GAC CCC 1968 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 CTG ATG CGC CGG GCG GCC AAG ACC ATC AAC TTC GGG GTC CTC TAC GGC 2016 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 ATG TCG GCC CAC CGC CTC TCC CAG GAG CTA GCC ATC CCT TAC GAG GAG 2064 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 GCC CAG GCC TTC ATT GAG CGC TAC TTT CAG AGC TTC CCC AAG GTG CGG 2112 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 GCC TGG ATT GAG AAG ACC CTG GAG GAG GGC AGG AGG CGG GGG TAC GTG 2160 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 GAG ACC CTC TTC GGC CGC CGC CGC TAC GTG CCA GAC CTA GAG GCC CGG 2208 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 GTG AAG AGC GTG CGG GAG GCG GCC GAG CGC ATG GCC TTC AAC ATG CCC 2256 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG AAG CTG GCT ATG GTG AAG CTC 2304 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 TTC CCC AGG CTG GAG GAA ATG GGG GCC AGG ATG CTC CTT CAG GTC CAC 2352 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 GAC GAG CTG GTC CTC GAG GCC CCA AAA GAG AGG GCG GAG GCC GTG GCC 2400 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 CGG CTG GCC AAG GAG GTC ATG GAG GGG GTG TAT CCC CTG GCC GTG CCC 2448 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 CTG GAG GTG GAG GTG GGG ATA GGG GAG GAC TGG CTC TCC GCC AAG GAG 2496 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 TGA 2499
【０２５０】（２）配列番号：２： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：832 アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：蛋白質 （xi）配列の記載：配列番号：２： Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830
【０２５１】（２）配列番号：３： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：2682 塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic) （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （vi）由来： （Ａ）生物：Thermotoga maritima （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY : CDS （Ｂ）位置：1..2679 （xi）配列の記載：配列番号：３： ATG GCG AGA CTA TTT CTC TTT GAT GGA ACT GCT CTG GCC TAC AGA GCG 48 Met Ala Arg Leu Phe Leu Phe Asp Gly Thr Ala Leu Ala Tyr Arg Ala 1 5 10 15 TAC TAT GCG CTC GAT AGA TCG CTT TCT ACT TCC ACC GGC ATT CCC ACA 96 Tyr Tyr Ala Leu Asp Arg Ser Leu Ser Thr Ser Thr Gly Ile Pro Thr 20 25 30 AAC GCC ACA TAC GGT GTG GCG AGG ATG CTG GTG AGA TTC ATC AAA GAC 144 Asn Ala Thr Tyr Gly Val Ala Arg Met Leu Val Arg Phe Ile Lys Asp 35 40 45 CAT ATC ATT GTC GGA AAA GAC TAC GTT GCT GTG GCT TTC GAC AAA AAA 192 His Ile Ile Val Gly Lys Asp Tyr Val Ala Val Ala Phe Asp Lys Lys 50 55 60 GCT GCC ACC TTC AGA CAC AAG CTC CTC GAG ACT TAC AAG GCT CAA AGA 240 Ala Ala Thr Phe Arg His Lys Leu Leu Glu Thr Tyr Lys Ala Gln Arg 65 70 75 80 CCA AAG ACT CCG GAT CTC CTG ATT CAG CAG CTT CCG TAC ATA AAG AAG 288 Pro Lys Thr Pro Asp Leu Leu Ile Gln Gln Leu Pro Tyr Ile Lys Lys 85 90 95 CTG GTC GAA GCC CTT GGA ATG AAA GTG CTG GAG GTA GAA GGA TAC GAA 336 Leu Val Glu Ala Leu Gly Met Lys Val Leu Glu Val Glu Gly Tyr Glu 100 105 110 GCG GAC GAT ATA ATT GCC ACT CTG GCT GTG AAG GGG CTT CCG CTT TTT 384 Ala Asp Asp Ile Ile Ala Thr Leu Ala Val Lys Gly Leu Pro Leu Phe 115 120 125 GAT GAA ATA TTC ATA GTG ACC GGA GAT AAA GAC ATG CTT CAG CTT GTG 432 Asp Glu Ile Phe Ile Val Thr Gly Asp Lys Asp Met Leu Gln Leu Val 130 135 140 AAC GAA AAG ATC AAG GTG TGG CGA ATC GTA AAA GGG ATA TCC GAT CTG 480 Asn Glu Lys Ile Lys Val Trp Arg Ile Val Lys Gly Ile Ser Asp Leu 145 150 155 160 GAA CTT TAC GAT GCG CAG AAG GTG AAG GAA AAA TAC GGT GTT GAA CCC 528 Glu Leu Tyr Asp Ala Gln Lys Val Lys Glu Lys Tyr Gly Val Glu Pro 165 170 175 CAG CAG ATC CCG GAT CTT CTG GCT CTA ACC GGA GAT GAA ATA GAC AAC 576 Gln Gln Ile Pro Asp Leu Leu Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ile Asp Asn 180 185 190 ATC CCC GGT GTA ACT GGG ATA GGT GAA AAG ACT GCT GTT CAG CTT CTA 624 Ile Pro Gly Val Thr Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Val Gln Leu Leu 195 200 205 GAG AAG TAC AAA GAC CTC GAA GAC ATA CTG AAT CAT GTT CGC GAA CTT 672 Glu Lys Tyr Lys Asp Leu Glu Asp Ile Leu Asn His Val Arg Glu Leu 210 215 220 CCT CAA AAG GTG AGA AAA GCC CTG CTT CGA GAC AGA GAA AAC GCC ATT 720 Pro Gln Lys Val Arg Lys Ala Leu Leu Arg Asp Arg Glu Asn Ala Ile 225 230 235 240 CTC AGC AAA AAG CTG GCG ATT CTG GAA ACA AAC GTT CCC ATT GAA ATA 768 Leu Ser Lys Lys Leu Ala Ile Leu Glu Thr Asn Val Pro Ile Glu Ile 245 250 255 AAC TGG GAA GAA CTT CGC TAC CAG GGC TAC GAC AGA GAG AAA CTC TTA 816 Asn Trp Glu Glu Leu Arg Tyr Gln Gly Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Leu 260 265 270 CCA CTT TTG AAA GAA CTG GAA TTC GCA TCC ATC ATG AAG GAA CTT CAA 864 Pro Leu Leu Lys Glu Leu Glu Phe Ala Ser Ile Met Lys Glu Leu Gln 275 280 285 CTG TAC GAA GAG TCC GAA CCC GTT GGA TAC AGA ATA GTG AAA GAC CTA 912 Leu Tyr Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg Ile Val Lys Asp Leu 290 295 300 GTG GAA TTT GAA AAA CTC ATA GAG AAA CTG AGA GAA TCC CCT TCG TTC 960 Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320 GCC ATA GAT CTT GAG ACG TCT TCC CTC GAT CCT TTC GAC TGC GAC ATT 1008 Ala Ile Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile 325 330 335 GTC GGT ATC TCT GTG TCT TTC AAA CCA AAG GAA GCG TAC TAC ATA CCA 1056 Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro 340 345 350 CTC CAT CAT AGA AAC GCC CAG AAC CTG GAC GAA AAA GAG GTT CTG AAA 1104 Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys 355 360 365 AAG CTC AAA GAA ATT CTG GAG GAC CCC GGA GCA AAG ATC GTT GCT CAG 1152 Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln 370 375 380 AAT TTG AAA TTC GAT TAC AAG GTG TTG ATG GTG AAG GGT GTT GAA CCT 1200 Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Val Glu Pro 385 390 395 400 GTT CCT CCT TAC TTC GAC ACG ATG ATA GCG GCT TAC CTT CTT GAG CCG 1248 Val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415 AAC GAA AAG AAG TTC AAT CTG GAC GAT CTC GCA TTG AAA TTT CTT GGA 1296 Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly 420 425 430 TAC AAA ATG ACA TCT TAC CAA GAG CTC ATG TCC TTC TCT TTT CCG CTG 1344 Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu 435 440 445 TTT GGT TTC AGT TTT GCC GAT GTT CCT GTA GAA AAA GCA GCG AAC TAC 1392 Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460 TCC TGT GAA GAT GCA GAC ATC ACC TAC AGA CTT TAC AAG ACC CTG AGC 1440 Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480 TTA AAA CTC CAC GAG GCA GAT CTG GAA AAC GTG TTC TAC AAG ATA GAA 1488 Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys Ile Glu 485 490 495 ATG CCC CTT GTG AAC GTG CTT GCA CGG ATG GAA CTG AAC GGT GTG TAT 1536 Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr 500 505 510 GTG GAC ACA GAG TTC CTG AAG AAA CTC TCA GAA GAG TAC GGA AAA AAA 1584 Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525 CTC GAA GAA CTG GCA GAG GAA ATA TAC AGG ATA GCT GGA GAG CCG TTC 1632 Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540 AAC ATA AAC TCA CCG AAG CAG GTT TCA AGG ATC CTT TTT GAA AAA CTC 1680 Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu 545 550 555 560 GGC ATA AAA CCA CGT GGT AAA ACG ACG AAA ACG GGA GAC TAT TCA ACA 1728 Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr 565 570 575 CGC ATA GAA GTC CTC GAG GAA CTT GCC GGT GAA CAC GAA ATC ATT CCT 1776 Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro 580 585 590 CTG ATT CTT GAA TAC AGA AAG ATA CAG AAA TTG AAA TCA ACC TAC ATA 1824 Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile 595 600 605 GAC GCT CTT CCC AAG ATG GTC AAC CCA AAG ACC GGA AGG ATT CAT GCT 1872 Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Ile His Ala 610 615 620 TCT TTC AAT CAA ACG GGG ACT GCC ACT GGA AGA CTT AGC AGC AGC GAT 1920 Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp 625 630 635 640 CCC AAT CTT CAG AAC CTC CCG ACG AAA AGT GAA GAG GGA AAA GAA ATC 1968 Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile 645 650 655 AGG AAA GCG ATA GTT CCT CAG GAT CCA AAC TGG TGG ATC GTC AGT GCC 2016 Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile Val Ser Ala 660 665 670 GAC TAC TCC CAA ATA GAA CTG AGG ATC CTC GCC CAT CTC AGT GGT GAT 2064 Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly Asp 675 680 685 GAG AAT CTT TTG AGG GCA TTC GAA GAG GGC ATC GAC GTC CAC ACT CTA 2112 Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr Leu 690 695 700 ACA GCT TCC AGA ATA TTC AAC GTG AAA CCC GAA GAA GTA ACC GAA GAA 2160 Thr Ala Ser Arg Ile Phe Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu 705 710 715 720 ATG CGC CGC GCT GGT AAA ATG GTT AAT TTT TCC ATC ATA TAC GGT GTA 2208 Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val 725 730 735 ACA CCT TAC GGT CTG TCT GTG AGG CTT GGA GTA CCT GTG AAA GAA GCA 2256 Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu Ala 740 745 750 GAA AAG ATG ATC GTC AAC TAC TTC GTC CTC TAC CCA AAG GTG CGC GAT 2304 Glu Lys Met Ile Val Asn Tyr Phe Val Leu Tyr Pro Lys Val Arg Asp 755 760 765 TAC ATT CAG AGG GTC GTA TCG GAA GCG AAA GAA AAA GGC TAT GTT AGA 2352 Tyr Ile Gln Arg Val Val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg 770 775 780 ACG CTG TTT GGA AGA AAA AGA GAC ATA CCA CAG CTC ATG GCC CCG GAC 2400 Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile Pro Gln Leu Met Ala Arg Asp 785 790 795 800 AGG AAC ACA CAG GCT GAA GGA GAA CGA ATT GCC ATA AAC ACT CCC ATA 2448 Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile 805 810 815 CAG GGT ACA GCA GCG GAT ATA ATA AAG CTG GCT ATG ATA GAA ATA GAC 2496 Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile Asp 820 825 830 AGG GAA CTG AAA GAA AGA AAA ATG AGA TCG AAG ATG ATC ATA CAG GTC 2544 Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln Val 835 840 845 CAC GAC GAA CTG GTT TTT GAA GTG CCC AAT GAG GAA AAG GAC GCG CTC 2592 His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu 850 855 860 GTC GAG CTG GTG AAA GAC AGA ATG ACG AAT GTG GTA AAG CTT TCA GTG 2640 Val Glu Leu Val Lys Asp Arg Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val 865 870 875 880 CCG CTC GAA GTG GAT GTA ACC ATC GGC AAA ACA TGG TCG TGA 2682 Pro Leu Glu Val Asp Val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser 885 890
【０２５２】（２）配列番号：４： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：893 アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：蛋白質 （xi）配列の記載：配列番号：４： Met Ala Arg Leu Phe Leu Phe Asp Gly Thr Ala Leu Ala Tyr Arg Ala 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Leu Asp Arg Ser Leu Ser Thr Ser Thr Gly Ile Pro Thr 20 25 30 Asn Ala Thr Tyr Gly Val Ala Arg Met Leu Val Arg Phe Ile Lys Asp 35 40 45 His Ile Ile Val Gly Lys Asp Tyr Val Ala Val Ala Phe Asp Lys Lys 50 55 60 Ala Ala Thr Phe Arg His Lys Leu Leu Glu Thr Tyr Lys Ala Gln Arg 65 70 75 80 Pro Lys Thr Pro Asp Leu Leu Ile Gln Gln Leu Pro Tyr Ile Lys Lys 85 90 95 Leu Val Glu Ala Leu Gly Met Lys Val Leu Glu Val Glu Gly Tyr Glu 100 105 110 Ala Asp Asp Ile Ile Ala Thr Leu Ala Val Lys Gly Leu Pro Leu Phe 115 120 125 Asp Glu Ile Phe Ile Val Thr Gly Asp Lys Asp Met Leu Gln Leu Val 130 135 140 Asn Glu Lys Ile Lys Val Trp Arg Ile Val Lys Gly Ile Ser Asp Leu 145 150 155 160 Glu Leu Tyr Asp Ala Gln Lys Val Lys Glu Lys Tyr Gly Val Glu Pro 165 170 175 Gln Gln Ile Pro Asp Leu Leu Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ile Asp Asn 180 185 190 Ile Pro Gly Val Thr Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Val Gln Leu Leu 195 200 205 Glu Lys Tyr Lys Asp Leu Glu Asp Ile Leu Asn His Val Arg Glu Leu 210 215 220 Pro Gln Lys Val Arg Lys Ala Leu Leu Arg Asp Arg Glu Asn Ala Ile 225 230 235 240 Leu Ser Lys Lys Leu Ala Ile Leu Glu Thr Asn Val Pro Ile Glu Ile 245 250 255 Asn Trp Glu Glu Leu Arg Tyr Gln Gly Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Leu 260 265 270 Pro Leu Leu Lys Glu Leu Glu Phe Ala Ser Ile Met Lys Glu Leu Gln 275 280 285 Leu Tyr Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg Ile Val Lys Asp Leu 290 295 300 Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe 305 310 315 320 Ala Ile Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile 325 330 335 Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro 340 345 350 Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys 355 360 365 Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln 370 375 380 Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Val Glu Pro 385 390 395 400 Val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro 405 410 415 Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly 420 425 430 Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu 435 440 445 Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr 450 455 460 Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser 465 470 475 480 Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys Ile Glu 485 490 495 Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr 500 505 510 Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys 515 520 525 Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe 530 535 540 Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu 545 550 555 560 Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr 565 570 575 Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro 580 585 590 Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile 595 600 605 Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Ile His Ala 610 615 620 Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp 625 630 635 640 Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile 645 650 655 Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile Val Ser Ala 660 665 670 Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly Asp 675 680 685 Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr Leu 690 695 700 Thr Ala Ser Arg Ile Phe Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu 705 710 715 720 Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val 725 730 735 Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu Ala 740 745 750 Glu Lys Met Ile Val Asn Tyr Phe Val Leu Tyr Pro Lys Val Arg Asp 755 760 765 Tyr Ile Gln Arg Val Val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg 770 775 780 Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile Pro Gln Leu Met Ala Arg Asp 785 790 795 800 Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile 805 810 815 Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile Asp 820 825 830 Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln Val 835 840 845 His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu 850 855 860 Val Glu Leu Val Lys Asp Arg Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val 865 870 875 880 Pro Leu Glu Val Asp Val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser 885 890
【０２５３】（２）配列番号：５： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：2493 塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic) （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （vi）由来： （Ａ）生物：Thermus species sps17 （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY : CDS （Ｂ）位置：1..2490 （xi）配列の記載：配列番号：５： ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG GGC CGG GTC CTC CTG GTG GAC GGC 48 Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp Gly 1 5 10 15 CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTT TTC GCC CTC AAG GGC CTC ACC ACC 96 His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly Leu Thr Thr 20 25 30 AGC CGG GGC GAG CCC GTG CAG GCG GTT TAT GGC TTC GCC AAA AGC CTC 144 Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys Ser Leu 35 40 45 CTC AAG GCC CTG AAG GAG GAT GGG GAG GTG GCC ATC GTG GTC TTT GAC 192 Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Glu Val Ala Ile Val Val Phe Asp 50 55 60 GCC AAG GCC CCC TCC TTC CGC CAC GAG GCC TAC GAG GCC TAC AAG GCG 240 Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr Lys Ala 65 70 75 80 GGC CGG GCC CCC ACC CCG GAG GAC TTT CCC CGG CAG CTC GCC CTC ATC 288 Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala Leu Ile 85 90 95 AAG GAG CTG GTG GAC CTT TTG GGC CTC GTG CGC CTT GAG GTC CCG GGC 336 Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Val Arg Leu Glu Val Pro Gly 100 105 110 TTT GAG GCG GAC GAT GTC CTC GCC ACC CTG GCC AAG AAG GCA GAA AGG 384 Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys Lys Ala Glu Arg 115 120 125 GAG GGG TAC GAG GTG CGC ATC CTG AGC GCG GAC CGC GAC CTC TAC CAG 432 Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Ser Ala Asp Arg Asp Leu Tyr Gln 130 135 140 CTC CTT TCC GAC CGG ATC CAC CTC CTC CAC CCC GAG GGG GAG GTC CTG 480 Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Leu Leu His Pro Glu Gly Glu Val Leu 145 150 155 160 ACC CCC GGG TGG CTC CAG GAG CGC TAC GGC CTC TCC CCG GAG AGG TGG 528 Thr Pro Gly Trp Leu Gln Glu Arg Tyr Gly Leu Ser Pro Glu Arg Trp 165 170 175 GTG GAG TAC CGG GCC CTG GTG GGG GAC CCT TCG GAC AAC CTC CCC GGG 576 Val Glu Tyr Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp Asn Leu Pro Gly 180 185 190 GTG CCC GGC ATC GGG GAG AAG ACC GCC CTG AAG CTC CTG AAG GAG TGG 624 Val Pro Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys Glu Trp 195 200 205 GGT AGC CTG GAA GCG ATT CTA AAG AAC CTG GAC CAG GTG AAG CCG GAA 672 Gly Ser Leu Glu Ala Ile Leu Lys Asn Leu Asp Gln Val Lys Pro Glu 210 215 220 AGG GTG CGG GAG GCC ATC CGG AAT AAC CTG GAT AAG CTC CAG ATG TCC 720 Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Asn Asn Leu Asp Lys Leu Gln Met Ser 225 230 235 240 CTG GAG CTT TCC CGC CTC CGC ACC GAC CTC CCC CTG GAG GTG GAC TTC 768 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val Asp Phe 245 250 255 GCC AAG AGG CGG GAG CCC GAC TGG GAG GGG CTT AAG GCC TTT TTG GAG 816 Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Trp Glu Gly Leu Lys Ala Phe Leu Glu 260 265 270 CGG CTT GAG TTC GGA AGC CTC CTC CAC GAG TTC GGC CTT CTG GAG GCC 864 Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ala 275 280 285 CCC AAG GAG GCG GAG GAG GCC CCC TGG CCC CCG CCT GGA GGG GCC TTT 912 Pro Lys Glu Ala Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Gly Gly Ala Phe 290 295 300 TTG GGC TTC CTC CTC TCC CGC CCC GAG CCC ATG TGG GCG GAG CTT TTG 960 Leu Gly Phe Leu Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp Ala Glu Leu Leu 305 310 315 320 GCC CTG GCG GGG GCC AAG GAG GGG CGG GTC CAT CGG GCG GAA GAC CCC 1008 Ala Leu Ala Gly Ala Lys Glu Gly Arg Val His Arg Ala Glu Asp Pro 325 330 335 GTG GGG GCC CTA AAG GAC CTG AAG GAG ATC CGG GGC CTC CTC GCC AAG 1056 Val Gly Ala Leu Lys Asp Leu Lys Glu Ile Arg Gly Leu Leu Ala Lys 340 345 350 GAC CTC TCG GTC CTG GCC CTG AGG GAG GGC CGG GAG ATC CCG CCG GGG 1104 Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Arg Glu Ile Pro Pro Gly 355 360 365 GAC GAC CCC ATG CTC CTC GCC TAC CTC CTG GAC CCG GGG AAC ACC AAC 1152 Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Gly Asn Thr Asn 370 375 380 CCC GAG GGG GTG GCC CGG CGG TAC GGG GGG GAG TGG AAG GAG GAC GCC 1200 Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Lys Glu Asp Ala 385 390 395 400 GCC GCC CGG GCC CTC CTT TCG GAA AGG CTC TGG CAG GCC CTT TAC CCC 1248 Ala Ala Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu Trp Gln Ala Leu Tyr Pro 405 410 415 CGG GTG GCG GAG GAG GAA AGG CTC CTT TGG CTC TAC CGG GAG GTG GAG 1296 Arg Val Ala Glu Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu 420 425 430 CGG CCC CTC GCC CAG GTC CTC GCC CAC ATG GAG GCC ACG GGG GTG CGG 1344 Arg Pro Leu Ala Gln Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg 435 440 445 CTG GAT GTG CCC TAC CTG GAG GCC CTT TCC CAG GAG GTG GCC TTT GAG 1392 Leu Asp Val Pro Tyr Leu Glu Ala Leu Ser Gln Glu Val Ala Phe Glu 450 455 460 CTG GAG CGC CTC GAG GCC GAG GTC CAC CGC CTG GCG GGC CAC CCC TTC 1440 Leu Glu Arg Leu Glu Ala Glu Val His Arg Leu Ala Gly His Pro Phe 465 470 475 480 AAC CTG AAC TCT AGG GAC CAG CTG GAG CGG GTC CTC TTT GAC GAG CTC 1488 Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu 485 490 495 GGC CTA CCC CCC ATC GGC AAG ACG GAG AAG ACG GGC AAG CGC TCC ACC 1536 Gly Leu Pro Pro Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr 500 505 510 AGC GCC GCC GTC CTG GAG CTC TTA AGG GAG GCC CAC CCC ATC GTG GGG 1584 Ser Ala Ala Val Leu Glu Leu Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Gly 515 520 525 CGG ATC CTG GAG TAC CGG GAG CTC ATG AAG CTC AAG AGC ACC TAC ATA 1632 Arg Ile Leu Glu Tyr Arg Glu Leu Met Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile 530 535 540 GAC CCC CTC CCC AGG CTG GTC CAC CCC AAA ACC GGC CGG CTC CAC ACC 1680 Asp Pro Leu Pro Arg Leu Val His Pro Lys Thr Gly Arg Leu His Thr 545 550 555 560 CGC TTC AAC CAG ACG GCC ACC GCC ACG GGC CGC CTC TCC AGC TCC GAC 1728 Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp 565 570 575 CCC AAC CTG CAG AAC ATC CCC GTG CGC ACC CCC TTA GGC CAG CGC ATC 1776 Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile 580 585 590 CGC AAG GCC TTC ATT GCC GAG GAG GGC CAT CTC CTG GTG GCC CTG GAC 1824 Arg Lys Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly His Leu Leu Val Ala Leu Asp 595 600 605 TAT AGC CAG ATC GAG CTC CGG GTC CTC GCC CAC CTC TCG GGG GAC GAG 1872 Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu 610 615 620 AAC CTC ATC CGG GTC TTC CGG GAA GGG AAG GAC ATC CAC ACC GAG ACC 1920 Asn Leu Ile Arg Val Phe Arg Glu Gly Lys Asp Ile His Thr Glu 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Ala Phe Asn Met Pro Val Gln 740 745 750 GGC ACC GCC GCG GAC CTC ATG AAG CTG GCC ATG GTG AAG CTC TTC CCC 2304 Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro 755 760 765 AGG CTC AGG CCC TTG GGC GTT CGC ATC CTC CTC CAG GTG CAC GAC GAG 2352 Arg Leu Arg Pro Leu Gly Val Arg Ile Leu Leu Gln Val His Asp Glu 770 775 780 CTG GTC TTG GAG GCC CCA AAG GCG CGG GCG GAG GAG GCC GCC CAG TTG 2400 Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Ala Arg Ala Glu Glu Ala Ala Gln Leu 785 790 795 800 GCC AAG GAG ACC ATG GAA GGG GTT TAC CCC CTC TCC GTC CCC CTG GAG 2448 Ala Lys Glu Thr Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ser Val Pro Leu Glu 805 810 815 GTG GAG GTG GGG ATG GGG GAG GAC TGG CTT TCC GCC AAG GCC 2490 Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Ala 820 825 830 TAG 2493
【０２５４】（２）配列番号：６： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：830 アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：蛋白質 （xi）配列の記載：配列番号：６： Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp Gly 1 5 10 15 His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly Leu Thr Thr 20 25 30 Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys Ser Leu 35 40 45 Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Glu Val Ala Ile Val Val Phe Asp 50 55 60 Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr Lys Ala 65 70 75 80 Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala Leu Ile 85 90 95 Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Val Arg Leu Glu Val Pro Gly 100 105 110 Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys Lys Ala Glu Arg 115 120 125 Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Ser Ala Asp Arg Asp Leu Tyr Gln 130 135 140 Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Leu Leu His Pro Glu Gly Glu Val Leu 145 150 155 160 Thr Pro Gly Trp Leu Gln Glu Arg Tyr Gly Leu Ser Pro Glu Arg Trp 165 170 175 Val Glu Tyr Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp Asn Leu Pro Gly 180 185 190 Val Pro Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys Glu Trp 195 200 205 Gly Ser Leu Glu Ala Ile Leu Lys Asn Leu Asp Gln Val Lys Pro Glu 210 215 220 Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Asn Asn Leu Asp Lys Leu Gln Met Ser 225 230 235 240 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val Asp Phe 245 250 255 Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Trp Glu Gly Leu Lys Ala Phe Leu Glu 260 265 270 Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ala 275 280 285 Pro Lys Glu Ala Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Gly Gly Ala Phe 290 295 300 Leu Gly Phe Leu Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp Ala Glu Leu Leu 305 310 315 320 Ala Leu Ala Gly Ala Lys Glu Gly Arg Val His Arg Ala Glu Asp Pro 325 330 335 Val Gly Ala Leu Lys Asp Leu Lys Glu Ile Arg Gly Leu Leu Ala Lys 340 345 350 Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Arg Glu Ile Pro Pro Gly 355 360 365 Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Gly Asn Thr Asn 370 375 380 Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Lys Glu Asp Ala 385 390 395 400 Ala Ala Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu Trp Gln Ala Leu Tyr Pro 405 410 415 Arg Val Ala Glu Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu 420 425 430 Arg Pro Leu Ala Gln Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg 435 440 445 Leu Asp Val Pro Tyr Leu Glu Ala Leu Ser Gln Glu Val Ala Phe Glu 450 455 460 Leu Glu Arg Leu Glu Ala Glu Val His Arg Leu Ala Gly His Pro Phe 465 470 475 480 Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu 485 490 495 Gly Leu Pro Pro Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr 500 505 510 Ser Ala Ala Val Leu Glu Leu Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Gly 515 520 525 Arg Ile Leu Glu Tyr Arg Glu Leu Met Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile 530 535 540 Asp Pro Leu Pro Arg Leu Val His Pro Lys Thr Gly Arg Leu His Thr 545 550 555 560 Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp 565 570 575 Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile 580 585 590 Arg Lys Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly His Leu Leu Val Ala Leu Asp 595 600 605 Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu 610 615 620 Asn Leu Ile Arg Val Phe Arg Glu Gly Lys Asp Ile His Thr Glu Thr 625 630 635 640 Ala Ala Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Gly Val Asp Gly Ala Met 645 650 655 Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser 660 665 670 Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Ala 675 680 685 Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp 690 695 700 Ile Ala Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Lys Gly Tyr Val Glu Thr 705 710 715 720 Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn Ala Arg Val Lys 725 730 735 Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln 740 745 750 Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro 755 760 765 Arg Leu Arg Pro Leu Gly Val Arg Ile Leu Leu Gln Val His Asp Glu 770 775 780 Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Ala Arg Ala Glu Glu Ala Ala Gln Leu 785 790 795 800 Ala Lys Glu Thr Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ser Val Pro Leu Glu 805 810 815 Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Ala 820 825 830
【０２５５】（２）配列番号：７： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：2505塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：DNA (genomic) （iii)ハイポセティカル：NO （iv) アンチ−センス：NO （vi）由来： （Ａ）生物：Thermus species Z05 （ix) 特徴： （Ａ）NAME/KEY : CDS （Ｂ）位置：1..2502 （xi）配列の記載：配列番号：７： ATG AAG GCG ATG CTT CCG CTC TTT GAA CCC AAA GGC CGG GTT CTC CTG 48 Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 GTG GAC GGC CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTC TTC GCC CTA AAG GGC 96 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 CTC ACC ACG AGC CGG GGC GAA CCG GTG CAG GCG GTT TAC GGC TTC GCC 144 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 AAG AGC CTC CTC AAG GCC CTG AAG GAG GAC GGG TAC AAG GCC GTC TTC 192 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 GTG GTC TTT GAC GCC AAG GCC CCT TCC TTC CGC CAC GAG GCC TAC GAG 240 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 GCC TAC AAG GCA GGC CGC GCC CCG ACC CCC GAG GAC TTC CCC CGG CAG 288 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 CTC GCC CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC CTC CTG GGG TTT ACT CGC CTC 336 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 GAG GTT CCG GGC TTT GAG GCG GAC GAC GTC CTC GCC ACC CTG GCC AAG 384 Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 AAG GCG GAA AGG GAG GGG TAC GAG GTG CGC ATC CTC ACC GCC GAC CGG 432 Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 GAC CTT TAC CAG CTC GTC TCC GAC CGC GTC GCC GTC CTC CAC CCC GAG 480 Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 GGC CAC CTC ATC ACC CCG GAG TGG CTT TGG GAG AAG TAC GGC CTT AAG 528 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175 CCG GAG CAG TGG GTG GAC TTC CGC GCC CTC GTG GGG GAC CCC TCC GAC 576 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 AAC CTC CCC GGG GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACC GCC CTC AAG 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ATC GTG GAG AAG ATC CTC CAG CAC CGG GAG CTC ACC AAG CTC AAG 1632 Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys 530 535 540 AAC ACC TAC GTG GAC CCC CTC CCG GGC CTC GTC CAC CCG AGG ACG GGC 1680 Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly 545 550 555 560 CGC CTC CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACA GCC ACG GCC ACG GGA AGG CTC 1728 Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu 565 570 575 TCT AGC TCC GAC CCC AAC CTG CAG AAC ATC CCC ATC CGC ACC CCC TTG 1776 Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu 580 585 590 GGC CAG AGG ATC CGC CGG GCC TTC GTG GCC GAG GCG GGA TGG GCG TTG 1824 Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu 595 600 605 GTG GCC CTG GAC TAT AGC CAG ATA GAG CTC CGG GTC CTC GCC CAC CTC 1872 Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu 610 615 620 TCC GGG GAC GAG AAC CTG ATC AGG GTC TTC CAG GAG GGG AAG GAC ATC 1920 Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp 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Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn 740 745 750 ATG CCC GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG AAG CTC GCC ATG GTG 2304 Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val 755 760 765 AAG CTC TTC CCC CAC CTC CGG GAG ATG GGG GCC CGC ATG CTC CTC CAG 2352 Lys Leu Phe Pro His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln 770 775 780 GTC CAC GAC GAG CTC CTC CTG GAG GCC CCC CAA GCG CGG GCC GAG GAG 2400 Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu 785 790 795 800 GTG GCG GCT TTG GCC AAG GAG GCC ATG GAG AAG GCC TAT CCC CTC GCC 2448 Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala 805 810 815 GTG CCC CTG GAG GTG GAG GTG GGG ATC GGG GAG GAC TGG CTT TCC GCC 2496 Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala 820 825 830 AAG GGC TGA 2505 Lys Gly
【０２５６】（２）配列番号：８： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：834 アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：蛋白質 （xi）配列の記載：配列番号：８： Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu 245 250 255 Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro 290 295 300 Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp 305 310 315 320 Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Glu Gly Arg Val His Arg 325 330 335 Ala Lys Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly 340 345 350 Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Asp 355 360 365 Leu Ala Pro Ser Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro 370 375 380 Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp 385 390 395 400 Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Gln Gln 405 410 415 Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr 420 425 430 Gln Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala 435 440 445 Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu 450 455 460 Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala 465 470 475 480 Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu 485 490 495 Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly 500 505 510 Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His 515 520 525 Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys 530 535 540 Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly 545 550 555 560 Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu 565 570 575 Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu 580 585 590 Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu 595 600 605 Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu 610 615 620 Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile 625 630 635 640 His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser Pro Glu Ala Val 645 650 655 Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu 660 665 670 Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr 675 680 685 Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys 690 695 700 Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly 705 710 715 720 Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn 725 730 735 Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn 740 745 750 Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val 755 760 765 Lys Leu Phe Pro His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln 770 775 780 Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu 785 790 795 800 Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala 805 810 815 Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala 820 825 830 Lys Gly
【０２５７】（２）配列番号：９： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：2505 塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：DNA (genomic) （iii)ハイポセティカル：NO （iv) アンチ−センス：NO （vi）由来： （Ａ）生物：Thermus thermophilus （ix) 特徴： （Ａ）NAME/KEY : CDS （Ｂ）位置：1..2502 （xi）配列の記載：配列番号：９： ATG GAG GCG ATG CTT CCG CTC TTT GAA CCC AAA GGC CGG GTC CTC CTG 48 Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 GTG GAC GGC CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTC TTC GCC CTG AAG GGC 96 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 CTC ACC ACG AGC CGG GGC GAA CCG GTG CAG GCG GTC TAC GGC TTC GCC 144 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 AAG AGC CTC CTC AAG GCC CTG AAG GAG GAC GGG TAC AAG GCC GTC TTC 192 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 GTG GTC TTT GAC GCC AAG GCC CCC TCC TTC CGC CAC GAG GCC TAC GAG 240 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 GCC TAC AAG GCG GGG AGG GCC CCG ACC CCC GAG GAC TTC CCC CGG CAG 288 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 CTC GCC CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC CTC CTG GGG TTT ACC CGC CTC 336 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 GAG GTC CCC GGC TAC GAG GCG GAC GAC GTT CTC GCC ACC CTG GCC AAG 384 Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 AAG GCG GAA AAG GAG GGG TAC GAG GTG CGC ATC CTC ACC GCC GAC CGC 432 Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 GAC CTC TAC CAA CTC GTC TCC GAC CGC GTC GCC GTC CTC CAC CCC GAG 480 Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 GGC CAC CTC ATC ACC CCG GAG TGG CTT TGG GAG AAG TAC GGC CTC AGG 528 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg 165 170 175 CCG GAG CAG TGG GTG GAC TTC CGC GCC CTC GTG GGG GAC CCC TCC GAC 576 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 AAC CTC CCC GGG GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACC GCC CTC AAG CTC 624 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 CTC AAG GAG TGG GGA AGC CTG GAA AAC CTC CTC AAG AAC CTG GAC CGG 672 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 GTA AAG CCA GAA AAC GTC CGG GAG AAG ATC AAG GCC CAC CTG GAA GAC 720 Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 CTC AGG CTC TCC TTG GAG CTC TCC CGG GTG CGC ACC GAC CTC CCC CTG 768 Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu 245 250 255 GAG GTG GAC CTC GCC CAG GGG CGG GAG CCC GAC CGG GAG GGG CTT AGG 816 Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 GCC TTC CTG GAG AGG CTG GAG TTC GGC AGC CTC CTC CAC GAG TTC GGC 864 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 CTC CTG GAG GCC CCC GCC CCC CTG GAG GAG GCC CCC TGG CCC CCG CCG 912 Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro 290 295 300 GAA GGG GCC TTC GTG GGC TTC GTC CTC TCC CGC CCC GAG CCC ATG TGG 960 Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp 305 310 315 320 GCG GAG CTT AAA GCC CTG GCC GCC TGC AGG GAC GGC CGG GTG CAC CGG 1008 Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg 325 330 335 GCA GCA GAC CCC TTG GCG GGG CTA AAG GAC CTC AAG GAG GTC CGG GGC 1056 Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly 340 345 350 CTC CTC GCC AAG GAC CTC GCC GTC TTG GCC TCG AGG GAG GGG CTA GAC 1104 Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp 355 360 365 CTC GTG CCC GGG GAC GAC CCC ATG CTC CTC GCC TAC CTC CTG GAC CCC 1152 Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro 370 375 380 TCC AAC ACC ACC CCC GAG GGG GTG GCG CGG CGC TAC GGG GGG GAG TGG 1200 Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp 385 390 395 400 ACG GAG GAC GCC GCC CAC CGG GCC CTC CTC TCG GAG AGG CTC CAT CGG 1248 Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg 405 410 415 AAC CTC CTT AAG CGC CTC GAG GGG GAG GAG AAG CTC CTT TGG CTC TAC 1296 Asn Leu Leu Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr 420 425 430 CAC GAG GTG GAA AAG CCC CTC TCC CGG GTC CTG GCC CAC ATG GAG GCC 1344 His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala 435 440 445 ACC GGG GTA CGG CTG GAC GTG GCC TAC CTT CAG GCC CTT TCC CTG GAG 1392 Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu 450 455 460 CTT GCG GAG GAG ATC CGC CGC CTC GAG GAG GAG GTC TTC CGC TTG GCG 1440 Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala 465 470 475 480 GGC CAC CCC TTC AAC CTC AAC TCC CGG GAC CAG CTG GAA AGG GTG CTC 1488 Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu 485 490 495 TTT GAC GAG CTT AGG CTT CCC GCC TTG GGG AAG ACG CAA AAG ACA GGC 1536 Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly 500 505 510 AAG CGC TCC ACC AGC GCC GCG GTG CTG GAG GCC CTA CGG GAG GCC CAC 1584 Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His 515 520 525 CCC ATC GTG GAG AAG ATC CTC CAG CAC CGG GAG CTC ACC AAG CTC AAG 1632 Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys 530 535 540 AAC ACC TAC GTG GAC CCC CTC CCA AGC CTC GTC CAC CCG AGG ACG GGC 1680 Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly 545 550 555 560 CGC CTC CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACG GCC ACG GCC ACG GGG AGG CTT 1728 Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu 565 570 575 AGT AGC TCC GAC CCC AAC CTG CAG AAC ATC CCC GTC CGC ACC CCC TTG 1776 Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu 580 585 590 GGC CAG AGG ATC CGC CGG GCC TTC GTG GCC GAG GCG GGT TGG GCG TTG 1824 Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu 595 600 605 GTG GCC CTG GAC TAT AGC CAG ATA GAG CTC CGC GTC CTC GCC CAC CTC 1872 Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu 610 615 620 TCC GGG GAC GAA AAC CTG ATC AGG GTC TTC CAG GAG GGG AAG GAC ATC 1920 Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp 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Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn 740 745 750 ATG CCC GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG AAG CTC GCC ATG GTG 2304 Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val 755 760 765 AAG CTC TTC CCC CGC CTC CGG GAG ATG GGG GCC CGC ATG CTC CTC CAG 2352 Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln 770 775 780 GTC CAC GAC GAG CTC CTC CTG GAG GCC CCC CAA GCG CGG GCC GAG GAG 2400 Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu 785 790 795 800 GTG GCG GCT TTG GCC AAG GAG GCC ATG GAG AAG GCC TAT CCC CTC GCC 2448 Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala 805 810 815 GTG CCC CTG GAG GTG GAG GTG GGG ATG GGG GAG GAC TGG CTT TCC GCC 2496 Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala 820 825 830 AAG GGT TAG 2505 Lys Gly
【０２５８】（２）配列番号：10： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：834 アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：蛋白質 （xi）配列の記載：配列番号：10： Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg 165 170 175 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu 245 250 255 Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro 290 295 300 Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp 305 310 315 320 Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg 325 330 335 Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly 340 345 350 Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp 355 360 365 Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro 370 375 380 Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp 385 390 395 400 Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg 405 410 415 Asn Leu Leu Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr 420 425 430 His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala 435 440 445 Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu 450 455 460 Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala 465 470 475 480 Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu 485 490 495 Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly 500 505 510 Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His 515 520 525 Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys 530 535 540 Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly 545 550 555 560 Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu 565 570 575 Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu 580 585 590 Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu 595 600 605 Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu 610 615 620 Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile 625 630 635 640 His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val 645 650 655 Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu 660 665 670 Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr 675 680 685 Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys 690 695 700 Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly 705 710 715 720 Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn 725 730 735 Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn 740 745 750 Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val 755 760 765 Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln 770 775 780 Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu 785 790 795 800 Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala 805 810 815 Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala 820 825 830 Lys Gly
【０２５９】（２）配列番号：11： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：2679 塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：DNA (genomic) （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （vi）由来： （Ａ）生物：Thermosipho africanus （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY : CDS （Ｂ）位置：1..2676 （xi）配列の記載：配列番号：11： ATG GGA AAG ATG TTT CTA TTT GAT GGA ACT GGA TTA GTA TAC AGA GCA 48 Met Gly Lys Met Phe Leu Phe Asp Gly Thr Gly Leu Val Tyr Arg Ala 1 5 10 15 TTT TAT GCT ATA GAT CAA TCT CTT CAA ACT TCG TCT GGT TTA CAC ACT 96 Phe Tyr Ala Ile Asp Gln Ser Leu Gln Thr Ser Ser Gly Leu His Thr 20 25 30 AAT GCT GTA TAC GGA CTT ACT AAA ATG CTT ATA AAA TTT TTA AAA GAA 144 Asn Ala Val Tyr Gly Leu Thr Lys Met Leu Ile Lys Phe Leu Lys Glu 35 40 45 CAT ATC AGT ATT GGA AAA GAT GCT TGT GTT TTT GTT TTA GAT TCA AAA 192 His Ile Ser Ile Gly Lys Asp Ala Cys Val Phe Val Leu Asp Ser Lys 50 55 60 GGT GGT AGC AAA AAA AGA AAG GAT ATT CTT GAA ACA TAT AAA GCA AAT 240 Gly Gly Ser Lys Lys Arg Lys Asp Ile Leu Glu Thr Tyr Lys Ala Asn 65 70 75 80 AGG CCA TCA ACG CCT GAT TTA CTT TTA GAG CAA ATT CCA TAT GTA GAA 288 Arg Pro Ser Thr Pro Asp Leu Leu Leu Glu Gln Ile Pro Tyr Val Glu 85 90 95 GAA CTT GTT GAT GCT CTT GGA ATA AAA GTT TTA AAA ATA GAA GGC TTT 336 Glu Leu Val Asp Ala Leu Gly Ile Lys Val Leu Lys Ile Glu Gly Phe 100 105 110 GAA GCT GAT GAC ATT ATT GCT ACG CTT TCT AAA AAA TTT GAA AGT GAT 384 Glu Ala Asp Asp Ile Ile Ala Thr Leu Ser Lys Lys Phe Glu Ser Asp 115 120 125 TTT GAA AAG GTA AAC ATA ATA ACT GGA GAT AAA GAT CTT TTA CAA CTT 432 Phe Glu Lys Val Asn Ile Ile Thr Gly Asp Lys Asp Leu Leu Gln Leu 130 135 140 GTT TCT GAT AAG GTT TTT GTT TGG AGA GTA GAA AGA GGA ATA ACA GAT 480 Val Ser Asp Lys Val Phe Val Trp Arg Val Glu Arg Gly Ile Thr Asp 145 150 155 160 TTG GTA TTG TAC GAT AGA AAT AAA GTG ATT GAA AAA TAT GGA ATC TAC 528 Leu Val Leu Tyr Asp Arg Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Tyr 165 170 175 CCA GAA CAA TTC AAA GAT TAT TTA TCT CTT GTC GGT GAT CAG ATT GAT 576 Pro Glu Gln Phe Lys Asp Tyr Leu Ser Leu Val Gly Asp Gln Ile Asp 180 185 190 AAT ATC CCA GGA GTT AAA GGA ATA GGA AAG AAA ACA GCT GTT TCG CTT 624 Asn Ile Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Lys Lys Thr Ala Val Ser Leu 195 200 205 TTG AAA AAA TAT AAT AGC TTG GAA AAT GTA TTA AAA AAT ATT AAC CTT 672 Leu Lys Lys Tyr Asn Ser Leu Glu Asn Val Leu Lys Asn Ile Asn Leu 210 215 220 TTG ACG GAA AAA TTA AGA AGG CTT TTG GAA GAT TCA AAG GAA GAT TTG 720 Leu Thr Glu Lys Leu Arg Arg Leu Leu Glu Asp Ser Lys Glu Asp Leu 225 230 235 240 CAA AAA AGT ATA GAA CTT GTG GAG TTG ATA TAT GAT GTA CCA ATG GAT 768 Gln Lys Ser Ile Glu Leu Val Glu Leu Ile Tyr Asp Val Pro Met Asp 245 250 255 GTG GAA AAA GAT GAA ATA ATT TAT AGA GGG TAT AAT CCA GAT AAG CTT 816 Val Glu Lys Asp Glu Ile Ile Tyr Arg Gly Tyr Asn Pro Asp Lys Leu 260 265 270 TTA AAG GTA TTA AAA AAG TAC GAA TTT TCA TCT ATA ATT AAG GAG TTA 864 Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Glu Phe Ser Ser Ile Ile Lys Glu Leu 275 280 285 AAT TTA CAA GAA AAA TTA GAA AAG GAA TAT ATA CTG GTA GAT AAT GAA 912 Asn Leu Gln Glu Lys Leu Glu Lys Glu Tyr Ile Leu Val Asp Asn Glu 290 295 300 GAT AAA TTG AAA AAA CTT GCA GAA GAG ATA GAA AAA TAC AAA ACT TTT 960 Asp Lys Leu Lys Lys Leu Ala Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Lys Thr Phe 305 310 315 320 TCA ATT GAT ACG GAA ACA ACT TCA CTT GAT CCA TTT GAA GCT AAA CTG 1008 Ser Ile Asp Thr Glu Thr Thr Ser Leu Asp Pro Phe Glu Ala Lys Leu 325 330 335 GTT GGG ATC TCT ATT TCC ACA ATG GAA GGG AAG GCG TAT TAT ATT CCG 1056 Val Gly Ile Ser Ile Ser Thr Met Glu Gly Lys Ala Tyr Tyr Ile Pro 340 345 350 GTG TCT CAT TTT GGA GCT AAG AAT ATT TCC AAA AGT TTA ATA GAT AAA 1104 Val Ser His Phe Gly Ala Lys Asn Ile Ser Lys Ser Leu Ile Asp Lys 355 360 365 TTT CTA AAA CAA ATT TTG CAA GAG AAG GAT TAT AAT ATC GTT GGT CAG 1152 Phe Leu Lys Gln Ile Leu Gln Glu Lys Asp Tyr Asn Ile Val Gly Gln 370 375 380 AAT TTA AAA TTT GAC TAT GAG ATT TTT AAA AGC ATG GGT TTT TCT CCA 1200 Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Glu Ile Phe Lys Ser Met Gly Phe Ser Pro 385 390 395 400 AAT GTT CCG CAT TTT GAT ACG ATG ATT GCA GCC TAT CTT TTA AAT CCA 1248 Asn Val Pro His Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Asn Pro 405 410 415 GAT GAA AAA CGT TTT AAT CTT GAA GAG CTA TCC TTA AAA TAT TTA GGT 1296 Asp Glu Lys Arg Phe Asn Leu Glu Glu Leu Ser Leu Lys Tyr Leu Gly 420 425 430 TAT AAA ATG ATC TCG TTT GAT GAA TTA GTA AAT GAA AAT GTA CCA TTG 1344 Tyr Lys Met Ile Ser Phe Asp Glu Leu Val Asn Glu Asn Val Pro Leu 435 440 445 TTT GGA AAT GAC TTT TCG TAT GTT CCA CTA GAA AGA GCC GTT GAG TAT 1392 Phe Gly Asn Asp Phe Ser Tyr Val Pro Leu Glu Arg Ala Val Glu Tyr 450 455 460 TCC TGT GAA GAT GCC GAT GTG ACA TAC AGA ATA TTT AGA AAG CTT GGT 1440 Ser Cys Glu Asp Ala Asp Val Thr Tyr Arg Ile Phe Arg Lys Leu Gly 465 470 475 480 AGG AAG ATA TAT GAA AAT GAG ATG GAA AAG TTG TTT TAC GAA ATT GAG 1488 Arg Lys Ile Tyr Glu Asn Glu Met Glu Lys Leu Phe Tyr Glu Ile Glu 485 490 495 ATG CCC TTA ATT GAT GTT CTT TCA GAA ATG GAA CTA AAT GGA GTG TAT 1536 Met Pro Leu Ile Asp Val Leu Ser Glu Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr 500 505 510 TTT GAT GAG GAA TAT TTA AAA GAA TTA TCA AAA AAA TAT CAA GAA AAA 1584 Phe Asp Glu Glu Tyr Leu Lys Glu Leu Ser Lys Lys Tyr Gln Glu Lys 515 520 525 ATG 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Pro 625 630 635 640 AAT TTG CAA AAT CTT CCA ACA AGA AGC GAA GAA GGA AAA GAA ATA AGA 1968 Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Arg Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile Arg 645 650 655 AAA GCA GTA AGA CCT CAA AGA CAA GAT TGG TGG ATT TTA GGT GCT GAC 2016 Lys Ala Val Arg Pro Gln Arg Gln Asp Trp Trp Ile Leu Gly Ala Asp 660 665 670 TAT TCT CAG ATA GAA CTA AGG GTT TTA GCG CAT GTA AGT AAA GAT GAA 2064 Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Val Ser Lys Asp Glu 675 680 685 AAT CTA CTT AAA GCA TTT AAA GAA GAT TTA GAT ATT CAT ACA ATT ACT 2112 Asn Leu Leu Lys Ala Phe Lys Glu Asp Leu Asp Ile His Thr Ile Thr 690 695 700 GCT GCC AAA ATT TTT GGT GTT TCA GAG ATG TTT GTT AGT GAA CAA ATG 2160 Ala Ala Lys Ile Phe Gly Val Ser Glu Met Phe Val Ser Glu Gln Met 705 710 715 720 AGA AGA GTT GGA AAG ATG GTA AAT TTT GCA ATT ATT TAT GGA GTT TCA 2208 Arg Arg Val Gly Lys Met Val Asn Phe Ala Ile Ile Tyr Gly Val Ser 725 730 735 CCT TAT GGT CTT TCA AAG AGA ATT GGT CTT AGT GTT TCA GAG ACT AAA 2256 Pro Tyr Gly Leu Ser Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser Glu Thr Lys 740 745 750 AAA ATA ATA GAT AAC TAT TTT AGA TAC TAT AAA GGA GTT TTT GAA TAT 2304 Lys Ile Ile Asp Asn Tyr Phe Arg Tyr Tyr Lys Gly Val Phe Glu Tyr 755 760 765 TTA AAA AGG ATG AAA GAT GAA GCA AGG AAA AAA GGT TAT GTT ACA ACG 2352 Leu Lys Arg Met Lys Asp Glu Ala Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr Thr 770 775 780 CTT TTT GGA AGG CGC AGA TAT ATT CCA CAG TTA AGA TCG AAA AAT GGT 2400 Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Ile Pro Gln Leu Arg Ser Lys Asn Gly 785 790 795 800 AAT AGA GTT CAA GAA GGA GAA AGA ATA GCT GTA AAC ACT CCA ATT CAA 2448 Asn Arg Val Gln Glu Gly Glu Arg Ile Ala Val Asn Thr Pro Ile Gln 805 810 815 GGA ACA GCA GCT GAT ATA ATA AAG ATA GCT ATG ATT AAT ATT CAT AAT 2496 Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Ile Ala Met Ile Asn Ile His Asn 820 825 830 AGA TTG AAG AAG GAA AAT CTA CGT TCA AAA ATG ATA TTG CAG GTT CAT 2544 Arg Leu Lys Lys Glu Asn Leu Arg Ser Lys Met Ile Leu Gln Val His 835 840 845 GAC GAG TTA GTT TTT GAA GTG CCC GAT AAT GAA CTG GAG ATT GTA AAA 2592 Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asp Asn Glu Leu Glu Ile Val Lys 850 855 860 GAT TTA GTA AGA GAT GAG ATG GAA AAT GCA GTT AAG CTA GAC GTT CCT 2640 Asp Leu Val Arg Asp Glu Met Glu Asn Ala Val Lys Leu Asp Val Pro 865 870 875 880 TTA AAA GTA GAT GTT TAT TAT GGA AAA GAG TGG GAA TAA 2679 Leu Lys Val Asp Val Tyr Tyr Gly Lys Glu Trp Glu 885 890
【０２６０】（２）配列番号：12： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：892 アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：蛋白質 （xi）配列の記載：配列番号：12： Met Gly Lys Met Phe Leu Phe Asp Gly Thr Gly Leu Val Tyr Arg Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Ala Ile Asp Gln Ser Leu Gln Thr Ser Ser Gly Leu His Thr 20 25 30 Asn Ala Val Tyr Gly Leu Thr Lys Met Leu Ile Lys Phe Leu Lys Glu 35 40 45 His Ile Ser Ile Gly Lys Asp Ala Cys Val Phe Val Leu Asp Ser Lys 50 55 60 Gly Gly Ser Lys Lys Arg Lys Asp Ile Leu Glu Thr Tyr Lys Ala Asn 65 70 75 80 Arg Pro Ser Thr Pro Asp Leu Leu Leu Glu Gln Ile Pro Tyr Val Glu 85 90 95 Glu Leu Val Asp Ala Leu Gly Ile Lys Val Leu Lys Ile Glu Gly Phe 100 105 110 Glu Ala Asp Asp Ile Ile Ala Thr Leu Ser Lys Lys Phe Glu Ser Asp 115 120 125 Phe Glu Lys Val Asn Ile Ile Thr Gly Asp Lys Asp Leu Leu Gln Leu 130 135 140 Val Ser Asp Lys Val Phe Val Trp Arg Val Glu Arg Gly Ile Thr Asp 145 150 155 160 Leu Val Leu Tyr Asp Arg Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Tyr 165 170 175 Pro Glu Gln Phe Lys Asp Tyr Leu Ser Leu Val Gly Asp Gln Ile Asp 180 185 190 Asn Ile Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Lys Lys Thr Ala Val Ser Leu 195 200 205 Leu Lys Lys Tyr Asn Ser Leu Glu Asn Val Leu Lys Asn Ile Asn Leu 210 215 220 Leu Thr Glu Lys Leu Arg Arg Leu Leu Glu Asp Ser Lys Glu Asp Leu 225 230 235 240 Gln Lys Ser Ile Glu Leu Val Glu Leu Ile Tyr Asp Val Pro Met Asp 245 250 255 Val Glu Lys Asp Glu Ile Ile Tyr Arg Gly Tyr Asn Pro Asp Lys Leu 260 265 270 Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Glu Phe Ser Ser Ile Ile Lys Glu Leu 275 280 285 Asn Leu Gln Glu Lys Leu Glu Lys Glu Tyr Ile Leu Val Asp Asn Glu 290 295 300 Asp Lys Leu Lys Lys Leu Ala Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Lys Thr Phe 305 310 315 320 Ser Ile Asp Thr Glu Thr Thr Ser Leu Asp Pro Phe Glu Ala Lys Leu 325 330 335 Val Gly Ile Ser Ile Ser Thr Met Glu Gly Lys Ala Tyr Tyr Ile Pro 340 345 350 Val Ser His Phe Gly Ala Lys Asn Ile Ser Lys Ser Leu Ile Asp Lys 355 360 365 Phe Leu Lys Gln Ile Leu Gln Glu Lys Asp Tyr Asn Ile Val Gly Gln 370 375 380 Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Glu Ile Phe Lys Ser Met Gly Phe Ser Pro 385 390 395 400 Asn Val Pro His Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Asn Pro 405 410 415 Asp Glu Lys Arg Phe Asn Leu Glu Glu Leu Ser Leu Lys Tyr Leu Gly 420 425 430 Tyr Lys Met Ile Ser Phe Asp Glu Leu Val Asn Glu Asn Val Pro Leu 435 440 445 Phe Gly Asn Asp Phe Ser Tyr Val Pro Leu Glu Arg Ala Val Glu Tyr 450 455 460 Ser Cys Glu Asp Ala Asp Val Thr Tyr Arg Ile Phe Arg Lys Leu Gly 465 470 475 480 Arg Lys Ile Tyr Glu Asn Glu Met Glu Lys Leu Phe Tyr Glu Ile Glu 485 490 495 Met Pro Leu Ile Asp Val Leu Ser Glu Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr 500 505 510 Phe Asp Glu Glu Tyr Leu Lys Glu Leu Ser Lys Lys Tyr Gln Glu Lys 515 520 525 Met Asp Gly Ile Lys Glu Lys Val Phe Glu Ile Ala Gly Glu Thr Phe 530 535 540 Asn Leu Asn Ser Ser Thr Gln Val Ala Tyr Ile Leu Phe Glu Lys Leu 545 550 555 560 Asn Ile Ala Pro Tyr Lys Lys Thr Ala Thr Gly Lys Phe Ser Thr Asn 565 570 575 Ala Glu Val Leu Glu Glu Leu Ser Lys Glu His Glu Ile Ala Lys Leu 580 585 590 Leu Leu Glu Tyr Arg Lys Tyr Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp 595 600 605 Ser Ile Pro Leu Ser Ile Asn Arg Lys Thr Asn Arg Val His Thr Thr 610 615 620 Phe His Gln Thr Gly Thr Ser Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asn Pro 625 630 635 640 Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Arg Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile Arg 645 650 655 Lys Ala Val Arg Pro Gln Arg Gln Asp Trp Trp Ile Leu Gly Ala Asp 660 665 670 Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Val Ser Lys Asp Glu 675 680 685 Asn Leu Leu Lys Ala Phe Lys Glu Asp Leu Asp Ile His Thr Ile Thr 690 695 700 Ala Ala Lys Ile Phe Gly Val Ser Glu Met Phe Val Ser Glu Gln Met 705 710 715 720 Arg Arg Val Gly Lys Met Val Asn Phe Ala Ile Ile Tyr Gly Val Ser 725 730 735 Pro Tyr Gly Leu Ser Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser Glu Thr Lys 740 745 750 Lys Ile Ile Asp Asn Tyr Phe Arg Tyr Tyr Lys Gly Val Phe Glu Tyr 755 760 765 Leu Lys Arg Met Lys Asp Glu Ala Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr Thr 770 775 780 Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Ile Pro Gln Leu Arg Ser Lys Asn Gly 785 790 795 800 Asn Arg Val Gln Glu Gly Glu Arg Ile Ala Val Asn Thr Pro Ile Gln 805 810 815 Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Ile Ala Met Ile Asn Ile His Asn 820 825 830 Arg Leu Lys Lys Glu Asn Leu Arg Ser Lys Met Ile Leu Gln Val His 835 840 845 Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asp Asn Glu Leu Glu Ile Val Lys 850 855 860 Asp Leu Val Arg Asp Glu Met Glu Asn Ala Val Lys Leu Asp Val Pro 865 870 875 880 Leu Lys Val Asp Val Tyr Tyr Gly Lys Glu Trp Glu 885 890
【０２６１】（２）配列番号：13： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：33 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：DNA プローブ BW33 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：13： GATCGCTGCG CGTAACCACC ACACCCGCCG CGC 33
【０２６２】（２）配列番号：14： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：30 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：DNA プローブ BW37 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：14： GCGCTAGGGC GCTGGCAAGT GTAGCGGTCA 30
【０２６３】（２）配列番号：15： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４ アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：ペプチド （iii)ハイポセティカル：YES （iv）アンチ−センス：NO （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY :ペプチド （Ｂ）位置：1..4 （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Xaa ／注＝“Xaa ＝Val 又は Thr” （xi）配列の記載：配列番号：15： Ala Xaa Tyr Gly 1
【０２６４】（２）配列番号：16： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５ アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：ペプチド （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （ｖ）フラグメント型：internal （xi）配列の記載：配列番号：16： His Glu Ala Tyr Gly 1 5
【０２６５】（２）配列番号：17： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５ アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：ペプチド （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （ｖ）フラグメント型：internal （xi）配列の記載：配列番号：17： His Glu Ala Tyr Glu 1 5
【０２６６】（２）配列番号：18： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４ アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：ペプチド （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （ｖ）フラグメント型：internal （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY :ペプチド （Ｂ）位置：1..4 （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Xaa ／注＝“Xaa ＝Leu 又は Ile” （xi）配列の記載：配列番号：18： Xaa Leu Glu Thr 1
【０２６７】（２）配列番号：19： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７ アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：ペプチド （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （ｖ）フラグメント型：internal （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY :ペプチド （Ｂ）位置：1..7 （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Xaa ／注＝“Xaa ＝Leu 又は Ile” （xi）配列の記載：配列番号：19： Xaa Leu Glu Thr Tyr Lys Ala 1 5
【０２６８】（２）配列番号：20： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７ アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：ペプチド （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （ｖ）フラグメント型：internal （ix）特徴： （Ａ）NAME/KEY :ペプチド （Ｂ）位置：1..7 （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Xaal-4 ／注＝“Xaal＝Ile 又はLeu 又はAla ; Xaa2-4, それぞれ任意のアミノ酸 （xi）配列の記載：配列番号：20： Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Lys Ala 1 5
【０２６９】（２）配列番号：21： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：22 ヌクレオチド （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii) 分子の型：DNA プライマー MK61 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：21： AGGACTACAA CTGCCACACA CC 22
【０２７０】（２）配列番号：22： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：38 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー RA01 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：22： CGAGGCGCGC CAGCCCCAGG AGATCTACCA GCTCCTTG 38
【０２７１】（２）配列番号：23： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：20 核酸 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：単鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー DG29 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：23： AGCTTATGTC TCCAAAAGCT 20
【０２７２】（２）配列番号：24： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：16 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー DG30 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：24： AGCTTTTGGA GACATA 16
【０２７３】（２）配列番号：25： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：25 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー PL10 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：25： GGCGTACCTT TGTCTCACGG GCAAC 25
【０２７４】（２）配列番号：26： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：28 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー FL63 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：26： GATAAAGGCA TGCTTCAGCT TGTGAACG 28
【０２７５】（２）配列番号：27： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：27 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー FL69 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：27： TGTACTTCTC TAGAAGCTGA ACAGCAG 27
【０２７６】（２）配列番号：28： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：36 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー FL64 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：28： CTGAAGCATG TCTTTGTCAC CGGTTACTAT CAATAT 36
【０２７７】（２）配列番号：29： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：18 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー FL65 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：29： TAGTAACCGG TGACAAAG 18
【０２７８】（２）配列番号：30： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：31 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー FL66 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：30： CTATGCCATG GATAGATCGC TTTCTACTTC C 31
【０２７９】（２）配列番号：31： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：31 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー FL67 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：31： CAAGCCCATG GAAACTTACA AGGCTCAAAG A 31
【０２８０】（２）配列番号：32： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：49 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー TZA292 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：32： GTCGGCATAT GGCTCCTGCT CCTCTTGAGG AGGCCCCCTG GCCCCCGCC 49
【０２８１】（２）配列番号：33： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：37 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー TZR01 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：33： GACGCAGATC TCAGCCCTTG GCGGAAAGCC AGTCCTC 37
【０２８２】（２）配列番号：34： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：49 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー TSA288 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：34： GTCGGCATAT GGCTCCTAAA GAAGCTGAGG AGGCCCCCTG GCCCCCGCC 49
【０２８３】（２）配列番号：35： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：37 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー TSR01 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：35： GACGCAGATC TCAGGCCTTG GCGGAAAGCC AGTCCTC 37
【０２８４】（２）配列番号：36： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：41 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー DG122 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：36： CCTCTAAACG GCAGATCTGA TATCAACCCT TGGCGGAAAG C 41
【０２８５】（２）配列番号：37： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：48 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー TAFI285 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：37： GTCGGCATAT GATTAAAGAA CTTAATTTAC AAGAAAAATT AGAAAAGG 48
【０２８６】（２）配列番号：38： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：46 ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA プライマー TAFR01 （iii)ハイポセティカル：NO （iv）アンチ−センス：NO （xi）配列の記載：配列番号：38： CCTTTACCCC AGGATCCTCA TTCCCACTCT TTTCCATAAT AAACAT 46
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 アブラムソン，リチャード ディー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94618，オークランド，ナンバー30，ブ ロード ウェイ 5901 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．264（11) ｐ．6427−6437（1989) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/54 C12N 9/12 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの
    ５′→３′エキソヌクレアーゼ活性に比べて低い５′→
    ３′エキソヌクレアーゼ活性を示すか又は５′→３′エ
    キソヌクレアーゼ活性を失っている短縮型熱安定性ＤＮ
    Ａポリメラーゼであって、 （１）配列番号：４のアミノ酸残基３８〜８９３から本
    質上成るアミノ酸配列、 （２）配列番号：４のアミノ酸残基２１〜８９３から本
    質上成るアミノ酸配列、 （３）配列番号：４のアミノ酸残基７４〜８９３から本
    質上成るアミノ酸配列、 （４）配列番号：４のアミノ酸残基１４０〜８９３から
    本質上成るアミノ酸配列、 （５）配列番号：４のアミノ酸残基２８４〜８９３から
    本質上成るアミノ酸配列、 （６）配列番号：１０のアミノ酸残基４７〜８３４から
    本質上成るアミノ酸配列、 （７）配列番号：１０のアミノ酸残基７８〜８３４から
    本質上成るアミノ酸配列、 （８）配列番号：１０のアミノ酸残基１５６〜８３４か
    ら本質上成るアミノ酸配列、 （９）配列番号：１０のアミノ酸残基２０４〜８３４か
    ら本質上成るアミノ酸配列、 （10）配列番号：１０のアミノ酸残基２９２〜８３４か
    ら本質上成るアミノ酸配列、 （11）配列番号：１２のアミノ酸残基３８〜８９２から
    本質上成るアミノ酸配列、 （12）配列番号：１２のアミノ酸残基９４〜８９２から
    本質上成るアミノ酸配列、 （13）配列番号：１２のアミノ酸残基１４０〜８９２か
    ら本質上成るアミノ酸配列、 （14）配列番号：１２のアミノ酸残基２０４〜８９２か
    ら本質上成るアミノ酸配列、又は （15）配列番号：１２のアミノ酸残基２８５〜８９２か
    ら本質上成るアミノ酸配列、 のいずれかを有する短縮型熱安定性ＤＮＡポリメラー
    ゼ。
  2. 【請求項２】 Ｎ−末端に追加のメチオニン残基が存在
    する、請求項１に記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
  3. 【請求項３】 酸化、還元又は他の誘導体化により修飾
    されている、請求項１又は２に記載の熱安定性ＤＮＡポ
    リメラーゼ。
  4. 【請求項４】 請求項１又は２に記載の熱安定性ＤＮＡ
    ポリメラーゼをコードするＤＮＡ。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡを含んで成る組
    換えＤＮＡベクター。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の組換ＤＮＡベクターに
    より形質転換された組換え宿主細胞。
  7. 【請求項７】 請求項１又は２に記載の熱安定性ＤＮＡ
    ポリメラーゼ酵素の製造方法であって、 （ａ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤ
    ＮＡ配列を含んで成る組換ＤＮＡベクターにより形質転
    換された宿主細胞を培養し；そして （ｂ）前記宿主細胞で生産された熱安定性ＤＮＡポリメ
    ラーゼを単離する；ことを特徴とする方法。
  8. 【請求項８】 １又は複数のポリマー界面活性剤を含有
    する緩衝液中に請求項１〜３のいずれか１項に記載の熱
    安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成る安定な酵素組成
    物。
  9. 【請求項９】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の熱
    安定性ＤＮＡポリメラーゼ、並びにプライマー対、プロ
    ーブ及び１セットのヌクレオシドホスフェート前駆体か
    ら成る群から選択された１又は複数の他の、ＰＣＲ反応
    を行うために有用な試薬を含んで成るキット。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の
    熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、並びにプライマー、ヌク
    レオチドトリホスエート前駆体及びドオキシヌクレオチ
    ド−５′−トリホスフェートのごとき鎖停止ヌクレオチ
    ドトリホスフェートから成る群から選択された、核酸の
    配列決定のために有用な１又は複数の他の試薬を含んで
    成るキット。
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