CN105339505B - 基于通用报告体的基因分型方法和材料 - Google Patents

Abstract

本披露关于用于使用基于通用FRET的报告体引物检测、定量和分析所关注核酸序列中的所关注核苷酸(例如SNP)的方法。

Description

基于通用报告体的基因分型方法和材料

技术领域

本发明一般涉及核酸杂交领域，并且更具体地说，涉及核酸扩增方法。

背景技术

鉴别已知序列内的改变或多态现象的核酸分析技术适用于科学、医学和法医领域的许多方面。举例来说，这些技术可用于对个体进行基因分型以诊断遗传性疾病或基于已知基因病变提供预后。所关注的基因型包括例如所关注核酸序列内的点突变、缺失、插入和倒置以及多态现象。这些技术也可以用于例如针对组织相容性的组织分型的临床目的或用于例如鉴别或父系判断的法医目的。此外，核酸分析技术可用于鉴别生物或区分或鉴别传染剂的病原生物。另外，这些技术适用于鉴别和监测经遗传修饰的农业生物，例如作物和家畜。

单核苷酸多态现象(SNP)为充足形式的遗传变异。人类基因组中大约每500bp会发生这些单核苷酸变化。几乎全部SNP都是双等位基因，也就是说仅存在两种不同等位基因。通常，一种等位基因存在于群体的大多数染色体中，并且替代变异体(也就是说次要等位基因)以较低频率存在。仅以大于1％的频率存在的等位基因视为多态现象。

SNP为用于测绘造成复杂疾病的敏感性突变的有前景工具。尽管大部分SNP为中性的并且不影响表型，但其可用作针对基因座的位置克隆的替代标记，因为相邻SNP的群组可共有的等位基因关联(称为连锁不平衡)。需要提供正确鉴别所关注的独特生物、疾病状态或临床条件所必需的高效和序列特异性并且还具有简化工作流程、较低开销和/或较快周转时间的替代方法。

发明内容

本文提供用于基因分型分析(包括(但不限于)SNP基因分型分析)的寡核苷酸、组合物、反应混合物、方法和试剂盒。在某些实施例中，寡核苷酸、组合物、反应混合物、方法和试剂盒包括基于通用FRET的报告体引物和等位基因特异性引物。

在某些实施例中，提供对具体等位基因或多态现象具有特异性的寡核苷酸。此类寡核苷酸在本文中称为等位基因特异性引物或ASP。此类等位基因特异性引物包括等位基因特异性部分和5'-通用尾；其中所述5'-通用尾包括针对基于通用FRET的报告体引物(本文称为“UFP”)的结合位点并且通用尾并不与目标核酸序列互补(参看图1)。在某些实施例中，5'-通用尾包括与基于通用FRET的报告体引物的序列相同的核苷酸序列。在某些实施例中，5'-通用尾包括与基于通用FRET的报告体引物的序列互补的核苷酸序列。在某些实施例中，等位基因特异性引物的3'-端可通过核酸聚合酶延长。在某些实施例中，等位基因特异性引物的3'端包括封端剂使得封端的端可以通过焦磷酸解酶活化。在某些实施例中，等位基因特异性引物的3'-端可通过核酸聚合酶延长。在某些实施例中，等位基因特异性引物的3'端包括封端剂使得封端的端可通过多磷酸解酶活化。在某些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在某些实施例中，等位基因特异性引物的长度为约29个核苷酸到约55个核苷酸。优选地，等位基因特异性引物的长度为约35个核苷酸到约50个核苷酸。最优选地，等位基因特异性引物的长度为约43个核苷酸。在某些实施例中，等位基因特异性部分的T_m为约53℃到约65℃，优选地约58℃到约62℃，最优选地约59℃。在某些实施例中，提供对目标核酸的具体基因座具有特异性的寡核苷酸。此类寡核苷酸在本文中称为基因座特异性引物或LSP。在某些实施例中，基因座特异性引物可用作本文所披露的扩增和基因分型方法中的反向引物。在某些实施例中，LSP的3'-端可通过核酸聚合酶延长。在某些实施例中，LSP的3'-端包括封端剂使得封端的端可通过焦磷酸解酶活化。在某些实施例中，LSP的3'-端包括封端剂使得封端的端可通过多磷酸解酶活化。在某些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在某些实施例中，LSP还可以对具体等位基因具有特异性。

在某些实施例中，提供的寡核苷酸可用于检测目标核酸的扩增和/或可用于监测或检测目标核酸中的等位基因的扩增或多态现象。此类寡核苷酸在本文中称为基于通用FRET的报告体引物(UFP)，其中所述基于通用FRET的报告体引物包括位于UFP的内部位置的至少一个淬灭剂部分和连接到UFP的5'-端的荧光团(参看图2)。荧光团和至少一种淬灭剂可参与基于FRET的淬灭。举例来说，当UFP并未与等位基因特异性引物或等位基因特异性引物延长产物的5'-通用尾杂交时，荧光团的荧光淬灭。然而，当UFP与其在5'-通用尾或5'-通用尾的补体中的目标序列杂交时，荧光团的荧光不再淬灭并且可检测。在某些实施例中，UFP的核苷酸序列与等位基因特异性引物的5'-通用尾相同。在某些实施例中，UFP的核苷酸序列与等位基因特异性引物的5'-通用尾互补。在某些实施例中，UFP可用于检测目标核酸中的特异性等位基因(例如第一和第二等位基因)或多态现象，其中对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物包括第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包括针对第一UFP的结合位点，其中第一UFP包括第一荧光团和至少一个淬灭剂部分；并且对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物包括第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包括针对第二UFP的结合位点，其中第二UFP包括第二荧光团和至少一个淬灭剂部分；其中第一和第二荧光团不同并且至少一个淬灭剂部分可相同或不同。在某些实施例中，可检测信号在UFP的3'-端通过核酸聚合酶延长时产生。

在各种实施例中，UFP具有连接到UFP的5'端的荧光团“F”或“V”，其中荧光团不可直接通过激发光激发，并且另外其中UFP不包括连接到UFP的淬灭剂部分。在这些实施例中，分析法中提供双股核酸插层型染料；其中双股核酸插层型染料通过激发光直接激发并且其荧光激发UFP中的荧光团。UFP与ASP的尾杂交之后，UFP聚合(例如延长)并且双股核酸插层型染料结合于延长的双螺旋体。插层型染料被配置成通过激发光直接激发，并且其荧光激发UFP的荧光团发荧光，由此提供可检测信号。

在一些实施例中，UFP的3'-端包含封端剂使得封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在各种实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。

在某些实施例中，UFP的长度为约10个核苷酸到约35个核苷酸。在一些实施例中，UFP的长度为约15个核苷酸到约35个核苷酸。在其它实施例中，UFP的长度为约25个核苷酸。在某些实施例中，UFP的T_m为约50℃到约75℃，优选地约60℃到约70℃，最优选地约58℃。在某些实施例中，内部淬灭剂部分与UFP的5'-端处的荧光团之间的距离为约8个核苷酸到约25个核苷酸。优选地，内部淬灭剂部分与5'-荧光团之间的距离为约12个核苷酸到约18个核苷酸，最优选地约15个核苷酸。在某些实施例中，UFP包括连接到一个或多个内部核苷酸的一个或多个淬灭剂部分。在某些实施例中，UFP包括连接到至少两个内部核苷酸的至少两个淬灭剂部分。在某些实施例中，UFP包括连接到两个或更多个内部核苷酸的两个或更多个淬灭剂部分。在某些实施例中，UFP包括线性构形(例如线性UFP)。在某些实施例中，UFP包括茎-环或发夹构形(例如茎-环UFP)。在某些实施例中，一个或多个内部淬灭剂部分连接到位于茎-环UFP的一个或多个环部分处的一个或多个核苷酸。在某些实施例中，一个或多个内部淬灭剂部分连接到茎-环UFP的一个或多个茎部分。在某些实施例中，一个或多个内部淬灭剂部分连接到茎-环UFP的一个或多个茎部分和一个或多个环部分。在某些实施例中，UFP的T_m可低于ASP的T_m。在某些实施例中，UFP的T_m可低于LSP的T_m。在某些实施例中，UFP的T_m可低于ASP和LSP两个的T_m。

在某些实施例中，提供的寡核苷酸可用于检测目标核酸的扩增和/或可用于监测或检测目标核酸中的等位基因的扩增或多态现象。此类寡核苷酸在本文中称为“基于通用FRET的检测器探针”，其中所述基于通用FRET的探针包括在探针的3'-端或在探针的内部位置处的至少一个淬灭剂部分以及连接到探针的5'-端的荧光团。荧光团和至少一种淬灭剂可参与基于FRET的淬灭。举例来说，当基于通用FRET的检测器探针并未与等位基因特异性引物或等位基因特异性引物延长产物的5'-通用尾杂交时，荧光团的荧光淬灭。然而，当基于通用FRET的探针与其在5'-通用尾或5'-通用尾的补体中的目标序列杂交时，荧光团的荧光淬灭降低并且荧光团可检测。当探针被聚合酶的5'-核酸酶活性消化时，荧光可进一步增加。

在某些实施例中，提供用于测定目标核酸分子的基因型的方法，所述方法包括：(1)提供一个或多个目标核酸分子和对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包括第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包括针对第一UFP的结合位点，其中第一UFP包括第一荧光团和至少一个第一淬灭剂部分；以及对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包括第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包括针对第二UFP的结合位点，其中第二UFP包括第二荧光团和至少一个第二淬灭剂部分；其中第一和第二荧光团不同并且至少第一淬灭剂部分和至少第二淬灭剂部分可相同或不同；(2)提供基因座特异性引物；(3)扩增目标核酸；(4)测量第一和第二荧光团的强度；(5)基于第一和第二荧光团的强度分析核酸基因型。在某些实施例中，第一荧光团和第二荧光团分别可位于第一和第二UFP的5'-端处，并且至少第一淬灭剂部分和至少第二淬灭剂部分可各自分别位于第一UFP和第二UFP的内部核苷酸处。在某些实施例中，UFP可为线性构形。在某些实施例中，UFP可为茎-环构形。在某些实施例中，一种UFP可为茎-环构形并且另一UFP可为线性构形。

在某些实施例中，等位基因特异性引物和/或基因座特异性引物中的至少一个的3'-端包括封端剂使得封端的端可通过焦磷酸解活化。在各种实施例中，等位基因特异性引物和/或基因座特异性引物中的至少一个的3'-端包括封端剂使得封端的端可通过多磷酸解活化。在某些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在某些实施例中，LSP浓度高于ASP的浓度。

在某些实施例中，第一或第二UFP中的至少一个的3'-端包括封端剂使得封端的端可通过焦磷酸解活化。在各种实施例中，第一或第二UFP的至少一个t的3'-端包括封端剂使得封端的端可通过多磷酸解活化。在一些实施例中，第一和第二UFP都包括封端剂使得封端的端可以通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在某些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。

在某些实施例中，UFP中的一个或多个置换成一个或多个基于通用FRET的检测器探针，其中基于通用FRET的检测器探针的一端包括至少一个淬灭剂并且基于通用FRET的检测器探针的另一端包括荧光团。在某些实施例中，使用至少两个基于通用FRET的检测器探针，其中第一UFP置换成第一基于通用FRET的检测器探针，其中第一基于通用FRET的检测器探针包括至少一个第一淬灭剂部分和第一荧光团；以及第二UFP置换成第二基于通用FRET的检测器探针，其中第二基于通用FRET的检测器探针包括至少一个第二淬灭剂部分和第二荧光团；其中第一和第二荧光团不同，并且至少第一淬灭剂部分和至少第二淬灭剂部分可相同或不同。在某些实施例中，第一或第二基于通用FRET的检测器探针中的至少一个的3'-端包括封端剂使得封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在一些实施例中，第一和第二基于通用FRET的检测器探针的3'-端都包括封端剂使得封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在各种实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在某些实施例中，第一或第二基于通用FRET的检测器探针中的至少一个的3'-端被配置成在扩增条件下不可延长。在某些实施例中，第一或第二基于通用FRET的检测器探针的3'-端都被配置成在扩增条件下不可延长。

在某些实施例中，UFP的长度为约10个核苷酸到约35个核苷酸。优选地，UFP的长度为约15个核苷酸到约35个核苷酸。最优选地，UFP的长度为约25个核苷酸。在某些实施例中，UFP的T_m为约50℃到约75℃，优选地约60℃到约70℃，最优选地约58℃。在某些实施例中，内部淬灭剂部分与UFP的5'-端处的荧光团之间的距离为约8个核苷酸到约25个核苷酸。优选地，内部淬灭剂部分与5'-荧光团之间的距离为约12个核苷酸到约18个核苷酸，最优选地约15个核苷酸。在某些实施例中，UFP包括连接到一个或多个内部核苷酸的一个或多个淬灭剂部分。在某些实施例中，UFP包括连接到至少两个内部核苷酸的至少两个淬灭剂部分。在某些实施例中，UFP包括连接到两个或更多个内部核苷酸的两个或更多个淬灭剂部分。在某些实施例中，UFP包括线性构形(例如线性UFP)。在某些实施例中，UFP包括茎-环或发夹构形(例如茎-环UFP)。在某些实施例中，一个或多个内部淬灭剂部分连接到位于茎-环UFP的一个或多个环部分处的一个或多个核苷酸。在某些实施例中，一个或多个内部淬灭剂部分连接到茎-环UFP的一个或多个茎部分。在某些实施例中，一个或多个内部淬灭剂部分连接到茎-环UFP的一个或多个茎部分和一个或多个环部分。在某些实施例中，UFP的T_m可低于ASP的T_m。在某些实施例中，UFP的T_m可低于LSP的T_m。在某些实施例中，UFP的T_m可低于ASP和LSP两个的T_m。

在某些实施例中，提供测定目标核酸分子的基因型的方法，所述方法包括：(1)提供一个或多个目标核酸分子和对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包括第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包括针对第一UFP的结合位点，其中第一UFP包括第一荧光团；以及对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包含第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包括针对第二UFP的结合位点，其中第二UFP包括第二荧光团；其中第一和第二荧光团不同并且不能被激发光直接激发；(2)提供基因座特异性引物；(3)提供双股核酸插层型染料；其中双股核酸插层型染料通过激发光直接激发并且其荧光激发UFP中的荧光团；(4)扩增目标核酸；(5)测量第一和第二荧光团的强度；(6)基于第一和第二荧光团的强度分析核酸基因型(参看图12)。在各种实施例中，第一荧光团和第二荧光团可分别位于第一UFP和第二UFP的5'-端处。在某些实施例中，UFP可为线性构形。在某些实施例中，UFP可为茎-环构形。在某些实施例中，一种UFP可为茎-环构形并且另一UFP可为线性构形。

在某些实施例中，等位基因特异性引物和/或基因座特异性引物中的至少一个的3'-端包括封端剂使得封端的端可通过焦磷酸解活化。在各种实施例中，等位基因特异性引物和/或基因座特异性引物中的至少一个的3'-端包括封端剂使得封端的端可通过多磷酸解活化。在某些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在某些实施例中，LSP浓度高于ASP的浓度。

在某些实施例中，UFP中的一个或多个置换成一个或多个基于通用FRET的检测器探针，其中基于通用FRET的检测器探针的一端包括至少一个淬灭剂并且基于通用FRET的检测器探针的另一端包括荧光团。在某些实施例中，使用至少两个基于通用FRET的检测器探针，其中第一UFP置换成第一基于通用FRET的检测器探针，其中第一基于通用FRET的检测器探针包括至少一个第一淬灭剂部分和第一荧光团；以及第二UFP置换成第二基于通用FRET的检测器探针，其中第二基于通用FRET的检测器探针包括至少一个第二淬灭剂部分和第二荧光团；其中第一和第二荧光团不同，并且至少第一淬灭剂部分和至少第二淬灭剂部分可相同或不同。

在某些实施例中，提供用于分析、定量或检测目标核酸中的一个或多个等位基因或多态现象的组合物和/或反应混合物，其中组合物和/或反应混合物包括一个或多个目标核酸分子和对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包括第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包括针对第一UFP结合位点，其中第一UFP包括第一荧光团和至少一个第一淬灭剂部分；以及对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包括第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包括针对第二UFP的结合位点，其中第二UFP包括第二荧光团和至少一个第二淬灭剂部分；其中第一和第二荧光团不同并且至少第一淬灭剂部分和至少第二淬灭剂部分可相同或不同。在组合物和/或反应混合物的多个实施例中，第一荧光团和第二荧光团分别位于第一UFP和第二UFP的5'-端处，并且至少第一淬灭剂部分和至少第二淬灭剂部分分别位于第一UFP和第二UFP的内部核苷酸处。在某些实施例中，UFP可为线性构形。在某些实施例中，UFP可为茎-环构形。在某些实施例中，一种UFP可为茎-环构形并且另一UFP可为线性构形。在各种实施例中，第一UFP置换成第一基于通用FRET的检测器探针，其中第一基于通用FRET的检测器探针包括至少一个第一淬灭剂部分和第一荧光团；以及第二UFP置换成第二基于通用FRET的检测器探针，其中第二基于通用FRET的检测器探针包括至少一个第二淬灭剂部分和第二荧光团；其中第一和第二荧光团不同，并且至少第一淬灭剂部分和至少第二淬灭剂部分可相同或不同。在某些实施例中，组合物和/或反应混合物进一步包括基因座特异性引物。在各种实施例中，第一等位基因特异性引物、第二等位基因特异性引物、第一UFP、第二UFP或基因座特异性引物中的至少一个的3'-端包括封端剂使得封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在各种实施例中，第一或第二基于通用FRET的检测器探针中的至少一个的3'-端包括封端剂使得封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在各种实施例中，第一等位基因特异性引物、第二等位基因特异性引物、第一基于通用FRET的检测器探针、第二基于通用FRET的检测器探针或基因座特异性引物中的至少一个的3'-端包括封端剂使得封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在一些实施例中，第一等位基因特异性引物、第二等位基因特异性引物、第一UFP、第二UFP或基因座特异性引物的任何组合包括封端剂使得封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在一些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在一些实施例中，第一等位基因特异性引物、第二等位基因特异性引物、第一基于通用FRET的检测器探针、第二基于通用FRET的检测器探针或基因座特异性引物的任何组合包括封端剂使得封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在一些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在各种实施例中，组合物和/或反应混合物进一步包括一个或多个多磷酸解剂。

在某些实施例中，组合物或反应混合物进一步包括一种或多种核酸聚合酶，例如热稳定聚合酶；一种或多种逆转录酶，或任何其它DNA或RNA聚合酶。在某些实施例中，组合物和/或反应混合物包括一种或多种焦磷酸解酶。在某些实施例中，组合物和/或反应混合物包括一种或多种多磷酸解酶。在一些实施例中，组合物和/或反应混合物包括一种或多种多磷酸解剂。在某些实施例中，反应混合物和/或组合物进一步包括基于通用FRET的检测器探针。在某些实施例中，反应混合物和/或组合物进一步包括一种或多种缓冲剂或缓冲盐；一种或多种核苷酸；一种或多种双脱氧核苷酸(ddN)；一种或多种目标/模板分子(其还可以用于测定反应性能，即控制反应)；以及用于分析或进一步操作本文所述的方法产生的产物或中间体的其它试剂。

在某些实施例中，提供可用于使用本文提供的寡核苷酸进行杂交、延长和扩增反应的试剂盒。优选试剂盒可包括一个或多个被配置成含有用于本文所述方法中的试剂的容器(例如小瓶、试管等)并且任选地可以含有使用所述试剂的说明书或方案。本文所述的试剂盒可包括选自由一种或多种本文所述的寡核苷酸组成的群组的一种或多种组分，包括(但不限于)一种或多种等位基因特异性引物、一种或多种基于通用FRET的报告体引物以及一种或多种基因座特异性引物；一种或多种核酸聚合酶，例如热稳定聚合酶；一种或多种逆转录酶，或任何其它DNA或RNA聚合酶。在一些实施例中，试剂盒包括对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包括第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包含针对第一基于通用FRET的报告体引物(UFP)的结合位点，其中第一UFP包括第一荧光团和至少一个第一淬灭剂部分；以及对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包括第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包括针对第二UFP的结合位点，其中第二UFP包括第二荧光团和至少一个第二淬灭剂部分；以及其中第一和第二荧光团可相同或不同。在一些实施例中，第一UFP的第一荧光团和第二UFP的第二荧光团分别位于第一UFP和第二UFP的5'-端处，并且至少第一淬灭剂部分和至少第二淬灭剂部分分别位于第一UFP和第二UFP的内部核苷酸处。在某些实施例中，本文所述的试剂盒包括一种或多种焦磷酸解酶。在某些实施例中，本文所述的试剂盒包括一种或多种多磷酸解酶。在各种实施例中，试剂盒包括一种或多种多磷酸解剂。在各种实施例中，第一或第二等位基因特异性引物或基因座特异性引物中的至少一个的3'-端包括封端剂，其中封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在各种实施例中，第一或第二UFP中的至少一个的3'-端包括封端剂使得封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在某些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在一些实施例中，第一和第二UFP为线性构形。在其它实施例中，第一和第二UFP为茎-环构形。在其它实施例中，第一UFP为茎-环构形并且第二UFP为线性构形。在某些实施例中，本文所述的试剂盒进一步包括基于通用FRET的检测器探针。在某些实施例中，本文所述的试剂盒进一步包括一种或多种缓冲剂或缓冲盐；一种或多种核苷酸；一种或多种双脱氧核苷酸(ddN)；一种或多种目标/模板分子(其还可以用于测定反应性能，即控制反应)；以及用于分析或进一步操作本文所述的方法产生的产物或中间体的其它试剂。此类额外组分可以包括用于克隆和/或定序的组分和用于检测或定量所关注的核酸分子所需的组分或设备。

在某些实施例中，进一步提供试剂盒用于合成核酸分子，所述试剂盒包括一种或多种本文所披露的寡核苷酸，包括一种或多种基于通用FRET的报告体引物和/或一种或多种等位基因特异性引物。在某些实施例中，提供试剂盒用于扩增核酸分子，所述试剂盒包括一种或多种本文所披露的寡核苷酸，包括一种或多种基于通用FRET的报告体引物和/或一种或多种等位基因特异性引物。在某些实施例中，提供试剂盒用于检测或测量包括所述试剂盒的核酸合成或扩增产物，所述试剂盒包括一种或多种本文所披露的寡核苷酸，包括一种或多种基于通用FRET的报告体引物和/或一种或多种等位基因特异性引物。

本文提供本传授内容的这些和其它特征。

附图说明

图1：根据本传授内容的某些实施例的基于UFP的SNP基因分型分析法的示意图。分析法由一对各自包括通用尾的等位基因特异性引物(ASP1和ASP2)、共用基因座特异性反向引物(LSP)以及一对针对两个等位基因中的每一个的基于通用FRET的报告体引物(UFP)(其各自包括荧光团(“F”或“V”)以及淬灭剂(“Q”))组成。UFP可具有线性或茎-环构形。

图2：根据本传授内容的某些实施例的线性和茎-环UFP的示意性图示。

图3A到图3B：基于引物的等位基因的辨别。基于引物的等位基因辨别在等位基因特异性BRAF分析法中证实，其中ASP1针对野生型(WT)等位基因设计并且ASP2针对突变(MT)等位基因设计。质粒模板用于命中目标序列和脱靶序列。图3A示出了随Cq变化的结果并且图3B示出了随ΔCq(DCq)变化的结果。

图4A到图4B：基于通用FRET的报告体引物(UFP)：荧光团(FAM)与淬灭剂(QSY7)之间的距离的分析。图4A：使用“3型”和“4型”UFP的可检测信号相对于荧光团与淬灭剂之间的距离的分析。图4B：使用“3型”和“4型”UFP的背景信号相对于荧光团与淬灭剂之间的距离的分析。

图5A到图5B：基于通用FRET的报告体引物(UFP)：线性(L)和茎-环(SL)UFP的分析。图5A：针对不同线性UFP设计的可检测信号和背景的分析。图5B：多种茎-环UFP设计的信噪比(S/N)的比较。

图6A到图6H：根据本传授内容的某些实施例的方法使用一组92gDNA的两种UFP设计的集群曲线分析。

图7A到图7H：本文所述的某些基于UFP的基因分型分析法与标准

SNP分析法之间的性能比较。基于通用报告体的基因分型分析法的等位基因辨别曲线与

SNP分析法比较。基于通用报告体的基因分型分析法的NTC(非模板对照)和背景信号低于

SNP分析法的NTC和背景信号。

图8：根据本传授内容的某些实施例的包括焦磷酸解或多磷酸解步骤的基于UFP的SNP分析法的示意图。分析法由一对各自包括通用尾和3'-ddN的等位基因特异性引物(ASP1和ASP2)、共用基因座特异性反向引物(LSP)以及一对针对两个等位基因中的每一个的基于通用FRET的报告体引物(UFP)(其各自包括荧光团(“F”或“V”)以及淬灭剂(“Q”))组成。UFP可具有线性或茎-环构形。示意图中的带尾ASP1、带尾ASP2、LSP以及基于通用FRET的检测器探针各自在其各别3'端具有菱形标示，并且因此指示为无焦磷酸解或多磷酸解活化步骤就不可延长。

图9：示出了根据本传授内容的某些实施例的包括通用检测器探针的以基于通用FRET的检测器探针为基础的SNP分析法的示意图，其中基于通用FRET的检测器探针代替SNP分析法中的UFP。分析法由一对各自包括通用尾的等位基因特异性引物(ASP1和ASP2)、共用基因座特异性反向引物(LSP)以及一对针对两个等位基因中的每一个的通用检测器探针(其各自包括荧光团(“F”或“V”)以及淬灭剂(“Q”))组成。通用检测器探针可具有线性或茎-环构形。在这一实施例中，通用检测器探针不可延长，但在扩增期间消化。示意图中的基于通用FRET的检测器探针不具有箭头标示，并且因此指示为不可延长。

图10：示出了根据本传授内容的某些实施例包括A-PCR的以基于通用FRET的检测器探针为基础的SNP分析法的示意图，其中基于通用FRET的检测器探针代替SNP分析法中的UFP。分析法由一对各自包括通用尾的等位基因特异性引物(ASP1和ASP2)、过量的共用基因座特异性反向引物(LSP)以及一对针对两个等位基因中的每一个的基于通用FRET的检测器探针(其各自包括荧光团(“F”或“V”)以及淬灭剂(“Q”))组成。基于通用FRET的检测器探针可具有线性或茎-环构形。示意图中的基于通用FRET的检测器探针不具有箭头标示，并且因此指示为不可延长。

图11：示出了根据本传授内容的某些实施例包括LATE-PCR的基于通用报告体的SNP分析法的示意图，其中基于通用FRET的检测器探针代替SNP分析法中的UFP。分析法由一对各自包括通用尾的等位基因特异性引物(ASP1和ASP2)、过量的共用基因座特异性反向引物(LSP)以及一对针对两个等位基因中的每一个的基于通用FRET的报告体探针(其各自包括荧光团(“F”或“V”)以及淬灭剂(“Q”))组成。在初始扩增回合中，目标核酸的扩增为指数级的。随后扩增为线性的。基于通用FRET的检测器探针可具有线性或茎-环构形。示意图中的基于通用FRET的检测器探针不具有箭头标示，并且因此指示为不可延长。

图12：根据本传授内容的某些实施例的基于UFP的SNP分析法的示意图，其包括双股核酸插层型染料和通用染料标记的报告体引物。分析法由一对各自包括通用尾的等位基因特异性引物(ASP1和ASP2)、共用基因座特异性反向引物(LSP)、双股核酸插层型染料以及一对针对两个等位基因中的每一个的基于通用FRET的报告体引物(本文标示为“染料标记的报告体引物”)(其各自包括荧光团(“F”或“V”))组成。通用染料标记的报告体引物可具有线性或茎-环构形。随着扩增进行，插层型染料结合到双股扩增产物并且染料标记的报告体引物并入到扩增产物中。通过照明光源激发插层型染料时，插层型染料发射的光用于激发染料标记的报告体引物的荧光团。

具体实施方式

本文提供了用于基因分型分析的寡核苷酸、组合物、反应混合物、方法和试剂盒。在某些实施例中，寡核苷酸、组合物、反应混合物、方法和试剂盒包括基于通用FRET的报告体引物和等位基因特异性引物。

本传授内容合并了基于通用FRET的报告体引物(UFP)的简单性与等位基因特异性引物的高特异性。如本文实例中所述，基于引物的等位基因辨别提供命中目标和脱靶核酸序列之间的高特异性。分析UFP的线性和茎-环配置并且分析内部淬灭剂部分与5'-荧光团之间的距离。

为了更清晰并简明地描述和指出本发明的主题，提供以下说明书和所附权利要求书中所用的特定术语的以下定义。在本说明书全文中，特定术语的范例应该被视为非限制性实例。

除非另外确切地说明，否则如本说明书所使用，措辞“一个/种(a/an)”意指至少一个/种。在本说明书中，除非另外确切地说明，否则单数的使用包括复数。举例来说，但不是限制性的，“一个目标核酸”意思是可以存在一个以上目标核酸；举例来说，一个具体目标核酸物质的一个或多个拷贝以及两个或更多个不同的目标核酸物质。术语“和/或”意思是在斜线之前和之后的术语可以连在一起或单独的。出于说明的目的，但不是作为限制，“X和/或Y”可意味着“X”或“Y”或“X”和“Y”。

应了解，在本发明中讨论的温度、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，使得微小并且非实质的偏差在本文中本传授内容的范围内。另外，使用“包含(comprise/comprises/comprising)”、“含有(contain/contains/containing)”和“包括(include/includes/including)”不打算为限制性的。应理解，以上一般描述和以下详细描述都仅是示范性和解释性的并且并不限制传授内容。

除非在以上说明书中专门指出，否则在以上说明书中叙述“包含”各种组分的实施例也涵盖“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；在说明书中叙述“由各种组分组成”的实施例也涵盖“包含所述组分”或“基本上由所述组分组成”；以及在说明书中叙述“基本上由各种组分组成”的实施例也涵盖“由所述组分组成”或“包含所述组分”(这种互换性不适用于这些术语在权利要求书中的使用)。

如本文所用的术语“或其组合”是指在所述术语前面所列术语的所有排列和组合。举例来说，“A、B、C或其组合”打算包括以下各项中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在特定情况下顺序是重要的，那么还有BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。继续这个实例，明确地包括含有一个或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。熟练技术人员应理解，除非另外从上下文显而易见，否则通常不存在对任何组合中的项目或术语的数量的限制。

本文中所用的章节标题仅用于组织目的并且不应解释为以任何方式限制所要主题。本说明书中引用的所有文献，包括(但不限于)专利、专利申请案、文章、书籍以及论文，全都出于任何目的以其全文引用的方式明确地并入本文中。在所并入的文献中的任一个与本说明书中所定义的任一术语相矛盾的情况下，以本说明书为准。虽然结合各种实施例来描述本传授内容，但是并不打算将本传授内容限制于这类实施例。相反地，如所属领域的技术人员将了解，本传授内容涵盖各种替代方案、修改和等效物。

如本文中所用，术语“扩增(amplification)”、“核酸扩增”或“扩增(amplifying)”是指产生多个核酸模板拷贝或产生多个与核酸模板互补的核酸序列拷贝。所述术语(包括术语“聚合”)还可以指延长核酸模板(例如通过聚合)。扩增反应可以是聚合酶介导的延伸反应，例如聚合酶链反应(PCR)。然而，任何已知扩增反应都适合如本文所述进行使用。通常是指目标核酸“指数”增加的术语“扩增”在本文中可用于描述核酸的所选目标序列数目的线性和指数增加两个。

术语“扩增反应混合物”和/或“主混合物”可指包括多种(一些或全部)用于扩增目标核酸的试剂的水溶液。所述反应还可以使用固体支撑物(例如阵列)来进行。所述反应还可以根据用户需要以单一或多重形式执行。这些反应通常包括酶、水性缓冲液、盐、扩增引物、目标核酸以及三磷酸核苷。视上下文而定，所述混合物可以是完全或不完全扩增反应混合物。用于扩增目标核酸的方法可以是本领域的技术人员可获得的任何方法。可以采用使目标核酸序列的拷贝倍增的任何体外手段。这些手段包括线性、对数和/或任何其它扩增方法。尽管本发明一般可论述PCR作为核酸扩增反应，但预期本文所述的寡核苷酸、反应混合物和/或组合物对其它类型的核酸扩增反应应有效，包括聚合酶介导的扩增反应(例如解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶-聚合酶扩增(RPA)以及滚环扩增(RCA))，以及接合酶介导的扩增反应(例如连接酶检测反应(LDR)、连接酶链式反应(LCR)以及各自的间隙型式)，以及核酸扩增反应的组合，例如LDR和PCR(参看例如美国专利6,797,470)。举例来说，本文所披露的寡核苷酸、反应混合物和/或组合物可用于例如多种接合介导的反应，其中例如接合探针用作PCR引物的对比。额外示范性方法尤其包括聚合酶链反应(PCR；参看例如美国专利第4,683,202号；第4,683,195号；第4,965,188号；和/或第5,035,996号)、等温程序(使用一种或多种RNA聚合酶(参看例如PCT公开案第WO 2006/081222号)、链置换(参看例如美国专利第RE39007E号)、引物分子的部分破坏(参看例如PCT公开案第WO 2006/087574号))、连接酶链式反应(LCR)(参看例如吴(Wu)等人,《基因组学》(Genomics)4：560-569(1990))，和/或巴拉尼(Barany)等人《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88:189-193(1991))、QβRNA复制酶系统(参看例如PCT公开案第WO 1994/016108号)、基于RNA转录的系统(例如，TAS、3SR)、滚环扩增(RCA)(参看例如美国专利第5,854,033号；美国专利申请公开案第2004/265897号；李查蒂(Lizardi)等人《自然·遗传学》(Nat.Genet.)19：225-232(1998)；和/或巴纳(Banér)等人《核酸研究》(Nucleic Acid Res.),26：5073-5078(1998))以及链置换扩增(SDA)(利特尔(Little)等人《临床化学》(Clin.Chem.)45:777-784(1999))。这些系统与熟练的业内人士可获得的许多其它系统一起可以适用于聚合和/或扩增如本文中所述使用的目标核酸。

“扩增效率”可以指可以经定量以测定拷贝数的任何产物(例如所述术语可以指PCR扩增子、LCR连接产物和/或类似产物)。扩增和/或聚合效率可以通过本领域中已知的各种方法来测定，包括(但不限于)测定校准稀释曲线和斜率计算，使用如赫勒曼斯(Hellemans)等人,《基因组生物学》(Genome Biology)8:R19(2007)中所述的qBase软件测定，使用如利瓦克(Livak)和施米特根(Schmittgen),《方法》(Methods)25:402(2001)所述的ΔΔCq计算测定，或通过如普法夫(Pfaffl),《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)29:e45(2001)所述的方法，所有这些都以其全文引用的方式并入本文中。

在某些实施例中，扩增技术包含至少一个扩增循环，例如(但不限于)以下步骤：使双股核酸变性以分离组分链；使引物杂交到目标侧接序列或扩增子的引物结合位点(或适当时任一个的互补序列)；以及使用DNA聚合酶以模板依赖性方式合成核苷酸股。所述循环可重复或不重复。在某些实施例中，扩增循环包含多个扩增循环，例如(但不限于)20个扩增循环、25个扩增循环、30个扩增循环、35个扩增循环、40个扩增循环、45个扩增循环或大于45个扩增循环。

在一些实施例中，扩增包含使用仪器进行热循环，所述仪器例如(但不限于)

PCR系统9700、9600、2700或2400热循环仪；Applied

ViiA^TM7实时PCR系统；Applied

7500快速实时PCR系统；7900HT快速实时PCR系统等(全部可购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA))。在某些实施例中，单股扩增子在例如(但不限于)不对称PCR或A-PCR(参看例如居连斯登(Gyllensten)和埃尔里奇(Erlich),《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:7652-7657(1988)和美国专利第5,066,584号)，或异步热循环(参看例如美国专利第No.6,87,664号)的扩增反应中产生。

在一些实施例中，扩增包含两步骤反应，包括(但不限于)预扩增步骤，在预扩增步骤中，发生有限数目的扩增循环(例如(但不限于)2、3、4或5个扩增循环)，然后对所得扩增子进行一般稀释并且使经稀释的扩增子部分在后一扩增步骤中经历额外扩增循环(参看例如美国专利第6,605,451号和美国专利申请公开案第2004/0175733号)。

在某些实施例中，扩增反应包含多重扩增，其中使用多个不同引物组同步扩增多个不同目标核酸和/或多个不同扩增产物物质。在某些实施例中，并行执行多重扩增反应和单重扩增反应，包括多个单重或较低重数反应(例如(但不限于)两重、三重、四重、五重或六重反应)。

如本文所用的术语“扩增子”和“扩增产物”一般是指扩增反应的产物。扩增子可以是双股或单股，并且可以包括通过使双股扩增产物变性获得的分开的组分股。在某些实施例中，一个扩增周期的扩增子可以充当后一扩增周期中的模板。

术语“退火(annealing)”和“杂交(hybridizing)”包括(但不限于)词根“杂交(hybridize)”和“退火(anneal)”的变体，可互换地使用并且意味着一个核酸与另一个核酸的核苷酸碱基配对相互相用，所述相互作用促使形成双螺旋体、三螺旋体或其它更高级结构。根据沃森-克里克(Watson-Crick)和胡斯坦(Hoogsteen)型氢键结，初级相互相用通常具有核苷酸碱基特异性，例如A:T、A:U和G:C。在某些实施例中，碱基堆积和疏水性相互作用也可以促成双螺旋体稳定性。引物和探针退火到互补序列的条件在本领域中是众所周知的，例如如在《核酸杂交的实用方法》(Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach),哈梅斯(Hames)和希金斯(Higgins)编,IRL出版社,华盛顿哥伦比亚特区 (Washington,D.C.)(1985)以及维特莫(Wetmur)和戴维森(Davidson),《分子生物学》 (Mol.Biol.)31:349(1968)中所述。

一般来说，所述退火是否发生尤其受以下各者的影响：引物的互补部分的长度和其在目标侧接序列和/或扩增子中的对应结合位点，或报告体探针和检测探针的对应互补部分和其结合位点；pH；温度；一价和二价阳离子的存在情况；杂交区中G和C核苷酸的比例；培养基的粘度；以及变性剂的存在情况。所述变量影响杂交所需的时间。因此，优选的退火条件将取决于具体应用。然而，在无过度实验的情况下，所述条件可以常规地由本领域的普通技术人员决定。优选地，选择以下退火条件：允许引物和/或探针选择性地与对应目标侧接序列或扩增子中的互补序列杂交，但不在第二反应温度下与反应组合物中的不同目标核酸或非目标序列杂交达到任何显著程度。

术语“选择性杂交”和其变体意思是在恰当严格的条件下，指定序列(例如(但不限于)引物或探针)与包含核苷酸互补条带的第二序列(例如(但不限于)目标侧接序列或扩增子的引物结合位点)退火，但不退火到不当序列，例如非目标核酸、探针或其它引物。通常，随着反应温度朝向特定双股序列的解链温度增加，选择性杂交的相对量一般增加并且错误引发一般减少。在本说明书中，一个序列与另一个序列杂交或选择性杂交的声明涵盖其中两个序列都整体彼此杂交或选择性杂交的情况，和其中所述序列中的一个或两个仅一部分杂交或选择性杂交到完整的另一个序列或另一个序列的一部分的情况。

如本文所用，术语“严格”用于定义将形成包含两个互补核苷酸序列的杂合物的温度和在杂交和后续加工步骤期间存在的溶剂组成。严格性也限定了同源性的量、必需条件以及在两个核苷酸序列之间形成的杂交的稳定性。随着严格性条件增加，选择性杂交是有利的并且非特异性交叉杂交是不利的。相对于在更可能发生错误引发的更低严格性条件下来说，增加的严格性条件通常对应于更高的培育温度、更低的盐浓度和/或更高的pH。本领域的普通技术人员理解，使引物或引物对能够选择性杂交到对应的目标侧接序列和/或扩增子的恰当严格性条件可以使用众所周知的技术并且在无过度实验的情况下常规地确定(参看例如《PCR：从后台到工作台的基础》(PCR：The Basics from Background to Bench),麦克弗森(McPherson)和摩勒(Moller),拜尔斯科学出版社(Bios ScientificPublishers),2000)。

如本文所用的术语“变性(denaturing/denaturation)”是指其中双股多核苷酸适当时被转化为两条单股多核苷酸或一条单股或实质上单股多核苷酸的任何过程，所述双股多核苷酸包括(但不限于)包含至少一个目标核酸的基因组DNA(gDNA)片段、双股扩增子或包含至少一个双股区段的多核苷酸。使双股多核苷酸变性包括(但不限于)使得双股核酸变成单股或实质上单股的各种热技术和化学技术，例如(但不限于)释放出包含两种寡核苷酸的双股多核苷酸或双螺旋体的两个单独的单股组分。本领域的普通技术人员将了解，所采用的变性技术一般不是限制性的，除非它实质上干扰扩增反应的后续退火或酶促步骤，或在某些方法中干扰荧光信号的检测。

如本文所用，术语“基因组DNA”或“gDNA”是指来自生物体的全部DNA，即生物体的DNA的全部补体。通常，这包括了内含子和外显子序列以及非编码调节序列，例如启动子和强化子序列。

术语“核酸聚合酶”和“DNA聚合酶”在本文中以广义使用并且是指可通过以模板依赖性方式添加脱氧核糖核苷酸和/或特定核苷酸类似物催化杂交引物5'-到-3'延长的任何多肽。例如(但不限于)在引物延长反应期间向退火到核酸模板的引物的3'端依次添加脱氧核糖核苷酸。DNA聚合酶的非限制性实例包括依赖RNA的DNA聚合酶，包括(但不限于)逆转录酶；和依赖DNA的DNA聚合酶。应了解，某些DNA聚合酶(例如(但不限于)某些真细菌A类DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶)可以进一步包含结构特异性核酸酶活性并且当扩增反应时包含侵入性裂解反应。

如本文所用，术语“T_m”用于指代解链温度。解链温度是一群双股核酸分子变得半解离成单股的温度。

如本文所用的术语“小沟结合剂”是指有时以序列特异性方式嵌入双股DNA的小沟中的小分子。一般来讲，小沟结合剂是可以采用新月状形状并且因此紧贴地嵌入双螺旋的小沟中，通常转移水的又长又平的分子。小沟结合分子通常包含若干个通过扭转自由的键连接的芳环，例如(但不限于)呋喃、苯或吡咯环。

术语“终点”测量是指其中数据收集仅发生在反应已经停止之后的方法。

术语“实时”和“实时连续”是可互换的并且是指其中数据收集通过定期监测发生在聚合反应过程期间的方法。因此，所述方法将扩增和检测合并成单一步骤。

如本文所用，术语“定量PCR”或“qPCR”是指使用聚合酶链反应(PCR)定量基因表达。

如本文所用，术语“C_t”和“循环阈值”是指荧光强度大于背景荧光的时间。其特征在于第一次检测目标扩增的时间点(或PCR循环)。因此，起始物质中目标DNA的数量越大，荧光信号的显著增加将出现得越快，产生更低的C_t。

如本文所用，术语“高分辨率解链”或“HRM”是指用于通过分析核酸的解链曲线测定核酸中的序列变异的技术。核酸可为双股或单股。在某些实施例中，可实时测量表示双股核酸的信号。在某些实施例中，PCR的实时测量(C_t)可用作例如HRM分析的解链分析的质量控制值。在某些实施例中，可采用终点分析。在某些实施例中，可分析单股核酸，例如单股核酸可折叠形成双螺旋体或可接着分析的其它更高级结构。此处，术语“高分辨率解链”或“HRM”还可以指用于通过分析解链曲线的形状(包括熔融温度和斜率)来测定两种不同核酸之间的序列变异的技术。

如本文所用，术语“引物”是指以合成方式或以生物方式产生的单股寡核苷酸，其在核酸分子的扩增或聚合期间通过核苷酸单体的共价键结延长。核酸扩增通常是基于通过核酸聚合酶或逆转录酶进行的核酸合成。许多所述核酸聚合酶或逆转录酶需要存在可以经延长以引发所述核酸合成的引物。如所属领域的技术人员将了解，本文所披露的寡核苷酸可以用作各种延长、合成或扩增反应中的一种或多种引物。根据某些实施例，核酸序列的扩增可涉及使用基因座特异性、基团特异性和/或等位基因特异性引物。基因座特异性引物(LSP)可用于扩增指定基因座处编码的全部等位基因，但并非全部等位基因都由其它基因座编码。等位基因特异性引物(ASP)扩增共用常见多态现象的等位基因家族。等位基因特异性引物可用于扩增单个等位基因并且能够在仅单个碱基变化差异不同的两种序列之间分化。根据某些实施例，扩增方法可包含基因座特异性引物的组合来扩增和分析异型接合样品中的两个等位基因，随后等位基因特异性扩增以分离两个等位基因中的一个来进一步表征。在某些实施例中，两种基因座特异性引物可在进行基因分型反应之前用于预扩增反应。

如本文所用，术语“等位基因特异性引物”或“ASP”是指结合于待扩增核酸的区上的特异性序列的引物。这些类型的引物可用于例如同时扩增和辨别基因的两个或更多个等位基因。两个等位基因之间的差异可为SNP、插入或缺失。一个或每一个等位基因特异性引物可独立地包含包括5'-通用尾的核苷酸序列，其中5'-通用尾并未与目标核酸互补。在一些实施例中，等位基因特异性引物中的至少一个含有5'-通用尾。举例来说，可在等位基因特异性引物中的一个或多个中提供至少一个SNP等位基因可杂交序列和至少一个核苷酸改变。在某些实施例中，等位基因特异性引物的3'-端可通过核酸聚合酶延长。在某些实施例中，等位基因特异性引物的3'-端可以通过所属领域中已知的技术封端使得封端的端可通过焦磷酸解酶或类似类型的酶活化。在各种实施例中，等位基因特异性引物的3'-端可通过所属领域中已知的技术封端使得封端的端可通过多磷酸解酶或类似类型的酶活化。

如本文所用，术语“基因座特异性引物”或“LSP”是指结合于待扩增核酸的具体区的引物。一般来说，等位基因特异性引物和基因座特异性引物用于对DNA的前导股和后随股或模板股和补体进行PCR。在某些实施例中，LSP的3'-端可通过核酸聚合酶延长。在某些实施例中，基因座特异性引物的3'-端可通过所属领域中已知的技术封端。封端的端可通过焦磷酸解酶或类似类型的酶活化。封端的端可通过多磷酸解酶或类似类型的酶活化。在某些实施例中，基因座特异性引物可能已与核酸杂交，随后杂交的核酸扩增，使得提供不需杂交基因座特异性引物的步骤的方法。

术语“互补性”和“互补的”是可互换的并且是指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常通过反向平行的多核苷酸股或区域中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补多核苷酸股或区域可以按沃森-克里克方式碱基配对(例如，A与T、A与U、C与G)。100％互补性是指其中一个多核苷酸股或区域的每个核苷酸单元都可以与第二多核苷酸股或区域的每个核苷酸单元发生氢键结的情况。“小于完全互补性”是指其中两个股或两个单元的一些但不是所有核苷酸单元可以彼此发生氢键结的情况。

如本文所用，术语“反向互补序列”是指根据由沃森-克里克碱基配对所定义的规则和DNA-DNA、RNA-RNA以及RNA-DNA双螺旋的反向平行性质，将退火/碱基配对或实质上退火/碱基配对到第二寡核苷酸的序列。因此，作为实例，RNA序列5'-AAUUUGC的反向互补序列将是5'-GCAAAUU。还可以在反向互补序列中包括替代性碱基配对方案，包括(但不限于)G-U配对。

如本文所用，术语“探针”是指通过设计或选择，含有允许其在所限定的严格性下特异性地(即优先地)杂交到目标核酸序列的特异性核苷酸序列的合成的或以生物方式产生的核酸(DNA或RNA)。在本传授内容中，探针可例如用荧光染料或包含荧光团报告体染料和淬灭剂的一对标签标记以使能够进行检测。

如本文所用，“实质上较不可延长”用于描述当寡核苷酸的3'最末端核苷酸与目标/模板核酸的对应碱基不互补时，在延长和/或扩增反应中无效率地延长或不延长的寡核苷酸的特征。

如本文所用，术语“模板”可与“目标分子”或“目标核酸”互换并且是指有待扩增、拷贝或延长、合成或定序的双股或单股核酸分子。在双股DNA分子的情况下，使其股变性形成第一条和第二条股来对这些分子进行扩增、定序或合成。与模板的一部分互补的引物在适当条件下杂交并且聚合酶(DNA聚合酶或逆转录酶)会随后合成与所述模板或其一部分互补的核酸分子。根据本发明，新合成的分子的长度可以与初始模板相等或比它短。在新合成的分子的合成或延长期间的错配并入会产生一个或多个错配的碱基对。因此，合成的分子不必与模板完全互补。模板可以是RNA分子、DNA分子或DNA/RNA混合分子。新合成的分子可以充当后续核酸合成或扩增的模板。

目标核酸可以从任何来源获得，并且可以包含任何数目的不同组成性组分。举例来说，目标可以是核酸(例如DNA或RNA)、cDNA、转移RNA(tRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或其它成熟小RNA，并且可以包含核酸类似物或其它核酸模拟物。目标可以经甲基化、非甲基化或两者。目标可以是被转化为尿嘧啶的经亚硫酸氢盐处理和非甲基化的胞嘧啶。此外，应了解“目标核酸”可以指目标核酸本身以及其代替物(例如扩增产物)以及原生序列。本传授内容的目标分子可以来源于任何数目的来源，包括(但不限于)病毒、古细菌、原生生物、原核生物和真核生物，例如(但不限于)植物、真菌和动物。这些来源可以包括(但不限于)全血、组织活检、淋巴、骨髓、羊水、毛发、皮肤、精液、生物战剂、肛门分泌物、阴道分泌物、汗液、唾液、口腔拭子、各种环境样品(例如农业、水和土壤)、一般研究样品、一般经纯化样品、经培养细胞以及溶解细胞。应了解，目标核酸可以使用本领域中已知的各种程序中的任一种从样品中分离，所述程序例如应用生物系统(Applied Biosystems)ABI

6100核酸制备站(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA))和ABI

6700自动化核酸工作站(生命技术公司)、

mirVana^TMRNA分离试剂盒(生命技术公司)等。应了解，目标核酸可以在分析之前进行切割或剪切，包括使用以下程序：例如机械力、声波处理、限制性核酸内切酶裂解或本领域中已知的任何方法。一般来说，本传授内容的目标核酸将是单股，但是在一些实施例中，目标核酸可以是双股，并且单股可以由变性产生。

如本文所用，术语“发夹”和“茎-环”是可互换的并且用于表示其中寡核苷酸的一个或多个部分与寡核苷酸的一个或多个其它部分形成碱基对的寡核苷酸结构。当两个部分碱基配对形成寡核苷酸的双股部分时，所述双股部分可以被称作茎。因此，取决于所用互补部分的数目，可以形成多个茎(优选地约1到约10个)。

如本文所用，术语“核酸结合染料”或“双股核酸插层染料”是指对双股多核苷酸具有特异性或当与双股多核苷酸缔合时与单股多核苷酸相比显示实质上更大荧光增强的荧光分子。通常，核酸结合染料分子通过插层到多核苷酸的双股区段的碱基对之间与所述双股区段结合，但结合在所述双股区段的大沟或小沟或两者当中。核酸结合染料的非限制性实例包括溴化乙锭、DAPI、赫斯特衍生物(Hoechst derivative)(包括(但不限于)赫斯特33258和赫斯特33342)、包含镧系螯合剂的插层剂(例如(但不限于)携带两个荧光四齿β-二酮-Eu³⁺螯合物的萘二酰亚胺衍生物(NDI-(BHHCT-Eu³⁺)₂)，参看例如野岛(Nojima)等人,《核 酸研究》(Nucl.Acids Res.)第1期增刊105(2001)，以及某些不对称花青染料，例如

Green、

GreenER^TM和

以及其衍生物。

如本文所用，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”互换使用并且是指核苷酸单体的单股和双股聚合物，包括(但不限于)通过核苷酸间磷酸二酯键结键联的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，或核苷酸间类似物，以及相关抗衡离子，例如H⁺、NH₄ ⁺、三烷基铵、Mg²⁺、Na⁺等。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸构成、完全由核糖核苷酸构成或由其嵌合混合物构成，并且可以包括核苷酸类似物。核苷酸单体单元可以包含本文中所述的核苷酸中的任一个，包括(但不限于)核苷酸和/或核苷酸类似物。多核苷酸的大小通常在几个单体单元到几千个单体核苷酸单元范围内，例如当它们有时在本领域中被称为寡核苷酸时，5-40个。除非另外指出，否则每当呈现多核苷酸序列时，都应理解，核苷酸从左到右是按5'-到-3'的顺序并且除非另外指出，否则“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。

术语“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，例如三磷酸酯，其中最常见的酯化位点是连接在戊糖的C-5位置的羟基。

术语“核苷”是指由连接到戊糖(包括2'-脱氧和2'-羟基形式)的1'位置的嘌呤、脱氮嘌呤或嘧啶核苷碱基组成的化合物，所述碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、脱氮腺嘌呤、脱氮鸟苷等。当核苷碱基是嘌呤或7-脱氮嘌呤时，戊糖连接到嘌呤或脱氮嘌呤的9位核碱基，并且当核碱基是嘧啶时，戊糖连接到嘧啶的1位核碱基。

术语“模拟物”包括具有修饰碱基部分、修饰糖部分和/或修饰磷酸酯部分的合成类似物。磷酸酯类似物一般包含其中磷原子呈+5氧化态并且氧原子中的一个或多个被例如硫的非氧部分置换的磷酸酯类似物。示范性磷酸酯类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯、二羟硼基磷酸酯，包括相关抗衡离子，例如H⁺、NH₄ ⁺、Na⁺。示范性碱基类似物包括：2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、C-5-丙炔、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-硫代嘧啶。示范性糖类似物包括：2'-或3'-位置是氢、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基以及苯氧基)、叠氮基、氨基或烷基氨基、氟、氯以及溴的2'-或3'-修饰。

如本文所用，术语“单核苷酸多态现象”(SNP)是指物种成员之间(或个体的成对染色体之间)的基因组中的单核苷酸(例如A、T、C或G)不同时发生的DNA序列变异。举例来说，来自不同个体的两个定序DNA片段(AAGCCTA到AAGCTTA)含有单核苷酸差异。在这种情况下，应理解存在两种等位基因：C和T。几乎全部常见SNP都只具有两种等位基因。

如本文所用，术语“反应器”一般是指根据本传授内容可以在其中发生反应的任何容器、腔室、装置或组合件。在一些实施例中，反应器可以是微管，例如(但不限于)0.2mL或0.5mL反应管，例如

光管(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)或微量离心管，或在分子生物学实验室的惯例中的那类其它容器。在一些实施例中，反应器包含多孔板的孔、在载玻片上的点或微流体装置的通道或腔室，包括(但不限于)

低密度阵列或

开放阵列实时PCR板(都来自生命技术公司)。例如(但不限于)可以在同一支撑物上存在多个反应器。在一些实施例中，可例如获自卡立珀(Caliper)、富鲁达(Fluidigm)和生命技术公司的芯片实验室状装置(包括离子316^TM和离子318^TM芯片)可以充当所公开方法中的反应器。将认识到，各种反应器是可商购的或可以被设计成适用于本传授内容的情况。

术语“报告体基团”在本文中在广义上使用并且是指任何可鉴别的标签、标记或部分。

术语“多磷酸解”是指在一种或多种多磷酸解剂和呈现多磷酸解活性的酶存在下从核酸去除不可延长的核苷酸(例如寡核苷酸)。

术语“多磷酸解酶”为催化三磷酸核苷聚合以及DNA双螺旋体在一种或多种多磷酸解剂存在下多磷酸解的DNA聚合酶。具有多磷酸解活性的示范性DNA聚合酶尤其包括(但不限于)热稳定Tfl、Taq和/或基因工程改造的DNA聚合酶(例如AMPLITAQFS、THERMOSEQUENASE)、具有活性位点突变F667Y或对如输入核苷酸等双脱氧核苷酸显示改善的亲和力(例如针对ddNTP的较小K_m)的F667Y等效物(例如在Tth中)的那些、如美国专利第7,422,872号中所述的RQ1以及其突变体(例如669经酪氨酸取代的RQY，这可以提供RNA的逆转录和/或直接定序)、THERMINATOR I(NEB)、THERMINATOR II、THERMINATOR III和/或THERMINATORγ(全部获自NEB)。这些和其它可能适合DNA聚合酶可描述于例如美国公开案2008/0254525A1、美国公开案2007/0020622A1、美国公开案2007/0009924A1、美国专利第4,889,818号、美国专利第4,965,188号、美国专利第5,047,342号、美国专利第5,079,352号、美国专利第5,270,179号、美国专利第5,374,553号、美国专利第5,436,149号、美国专利第5,512,462号、美国专利第5,614,365号和/或美国专利第6,228,628B1号中。已发现使用此类基因工程改造的DNA聚合酶可提高从核酸去除不可延长的核苷酸的效率，并且可随后聚合(延长)现在可延长的寡核苷酸。在一种或多种多磷酸解剂存在下通过多磷酸解酶去除末端不可延长核苷酸，随后聚合现在可延长的寡核苷酸的方法可称为通过多磷酸解(APP)反应活化。

在一些使用APP的实施例中，一种或多种多磷酸解剂可以由式I表示：

其中n为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多。在一些实施例中，一种或多种多磷酸解剂可由式II表示：

在表示式II化合物的一些实施例中，n和/或m可相同或不同。并且n和/或m可以是例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，其限制条件为n或m可以是0，但不都是0。因此，如果n是0，那么m可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。如果m是0，那么n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，n和m都大于或等于1。在一些实施例中，n和m都是1。在一些实施例中，n+m的和大于或等于2(例如n≥1并且m≥1，n≥2并且m≥0，n≥0并且m≥2)。在一些实施例中，例如如果(但不限于)n+m的和大于或等于2，那么X可以是例如

在一些实施例中，其中一种或多种多磷酸解剂由式II表示，例如如果(但不限于)n或m＝0，那么X可以是例如

例如：

在一些实施例中，一种或多种多磷酸解剂可以是：

(三磷酸酯)、

(四磷酸酯)、

(五磷酸酯)、

(六磷酸酯)、

和/或

本文所述的任何多磷酸解剂都可以与其它多磷酸解剂组合。在一些实施例中，一种或多种多磷酸解剂可以是焦磷酸(PP_i)与至少一个或更多个其它多磷酸解剂的组合。一种或多种多磷酸解剂中的任一个都可以盐(例如钠)形式使用。通常，本文所述的APP反应进一步包括一种或多种具有多磷酸解活性的生物催化剂(例如酶)来产生一种或多种三磷酸核苷。如上所述，例如亚氨二磷酸酯(IDP)使用氮链接磷酸酯部分；类似二磷酸酯化合物可用硫取代氮。在一些实施例中，多磷酸酯可以是具有两个或更多个磷酸酯部分的任何磷酸酯。在一些实施例中，多磷酸酯可为具有三个或更多个磷酸酯部分的任何磷酸酯。

术语“焦磷酸解活化聚合”是指依照逆反应进行DNA聚合并且导致去除退火寡核苷酸的3'-末端核苷酸的反应。在焦磷酸(PP_i)存在下使用焦磷酸解酶去除3'-末端核苷酸，并且随后通过聚合酶聚合(延长)现在可延长的退火寡核苷酸。其还可以称作“PAP”。

如本文所用，术语“焦磷酸解酶”是指可执行焦磷酸解活化聚合反应(例如焦磷酸解活化聚合链反应)的任何酶。焦磷酸解活化聚合方法可用于扩增RNA或DNA。当用于扩增DNA时，可活化寡核苷酸可包含2'-脱氧寡核苷酸(dN)并且不可延长3'末端可包含例如2',3'-双脱氧核苷酸(ddN)或无环核苷酸或所属领域中已知的其它阻断剂。三磷酸四核苷可包含三磷酸2'-脱氧核苷(dNTP)或其类似物，并且核酸聚合酶可包含DNA聚合酶。在某些实施例中，所用的DNA聚合酶也可以具有焦磷酸解活性。一些具有焦磷酸解活性的DNA聚合酶为热稳定Tfl、Taq以及基因工程改造的DNA聚合酶，例如获自生命技术(卡尔斯巴德(Carlsbad),加利福尼亚(CA))的AMPLITAQFS^TM以及获自通用电气医疗生物科学公司(皮斯卡塔威(Piscataway)，新泽西州(NJ))的THERMOSEQUENASE^TM。这些基因工程改造的DNA聚合酶具有突变F667Y或其活性位点中的等效突变。使用基因工程改造的DNA聚合酶(例如AMPLITAQFS^TM和THERMOSEQUENASE^TM)可大大提高焦磷酸解活化聚合的效率。当可活化寡核苷酸在3'-端处或3'-端的无环核苷酸处包含双脱氧核苷酸，这些I家族DNA聚合酶可根据本文所披露的方法的某些实施例使用。当可活化寡核苷酸为无环核苷酸时，可使用II家族古核生物DNA聚合酶。此类聚合酶的实例包括(但不限于)Vent(exo^-)和Pfu(exo^-)。这些聚合酶有效扩增3'-无环核苷酸封端的可活化寡核苷酸。在某些实施例中，一种反应中还可以使用两种或更多种核酸聚合酶。如果模板是RNA，那么核酸聚合酶可包含RNA聚合酶、逆转录酶、其变异体或其组合。可活化寡核苷酸可包含核糖核苷酸或2'-脱氧核苷酸。寡核苷酸的不可延长3'-末端可包含双脱氧核糖核苷酸或无环核苷酸。四种三磷酸核苷酸可包含三磷酸核苷、三磷酸2'-脱氧核苷或其类似物。为方便起见，下文的描述使用DNA作为模板。然而，RNA的处理也在本传授内容的范畴内。关于这些酶酶的更多细节、用途和方法可见于美国专利第7,033,763号中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。

术语“热稳定”当涉及酶使用时是指对因热失活具有抗性的酶(例如具有核酸聚合酶活性的多肽)。“热稳定”酶或聚合酶与“热不稳定”酶或聚合酶形成对比，其可通过热处理失活。热不稳定蛋白质可以在生理温度下失活，并且可以归类为中间热稳定(在约45℃到约65℃下失活)和热稳定(在大于约65℃下失活)。举例来说，热不稳定T5和T7DNA聚合酶的活性可以通过将所述酶暴露于约90℃的温度持续约30秒完全失活。热稳定聚合酶活性对热失活的抗性大于热不稳定聚合酶。然而，热稳定聚合酶不打算指完全抗热失活的酶；因此，热处理可以使聚合酶活性降低到一定程度。热稳定聚合酶的最佳温度通常还将高于热不稳定DNA聚合酶。

术语“工作浓度”是指在溶液中所用的最佳浓度下或接近所述最佳浓度以便执行具体功能(例如核酸分子的扩增或消化)的试剂浓度。试剂的工作浓度还等效地描述为试剂的“1×浓度”或“1×溶液”(如果试剂在溶液中)。因此，还可以基于工作浓度描述更高浓度的试剂；举例来说，试剂的“2×浓度”或“2×溶液”定义为高达试剂的工作浓度两倍的浓度或溶液；“5×浓度”或“5×溶液”高达工作浓度五倍等。

寡核苷酸和组合物/反应混合物：

在某些实施例中，提供对具体等位基因或多态现象具有特异性的寡核苷酸。此类寡核苷酸在本文中称为等位基因特异性引物或ASP。此类等位基因特异性引物包含等位基因特异性部分和5'-通用尾；其中所述5'-通用尾包括针对基于通用FRET的报告体引物(本文称为“UFP”)的结合位点并且通用尾并不与目标核酸序列互补(参看图1)。在某些实施例中，5'-通用尾包含与基于通用FRET的报告体引物的序列相同的核苷酸序列。在某些实施例中，5'-通用尾包含与基于通用FRET的报告体引物的序列互补的核苷酸序列。在某些实施例中，等位基因特异性引物的3'-端可通过核酸聚合酶延长。在某些实施例中，等位基因特异性引物的3'端包含封端剂使得封端的端可通过焦磷酸解酶或多磷酸解酶活化。在某些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在某些实施例中，等位基因特异性引物的长度为约29个核苷酸到约55个核苷酸。优选地，等位基因特异性引物的长度为约35个核苷酸到约50个核苷酸。最优选地，等位基因特异性引物的长度为约43个核苷酸。在某些实施例中，等位基因特异性部分的T_m为约53℃到约65℃，优选地约58℃到约62℃，最优选地约59℃。

在某些实施例中，提供对目标核酸的具体等位基因具有特异性的寡核苷酸。此类寡核苷酸在本文中称为基因座特异性引物或LSP。在某些实施例中，基因座特异性引物可用作本文所披露的扩增和基因分型方法中的反向引物。在某些实施例中，LSP的3'端包含封端剂使得封端的端可通过多磷酸解酶或焦磷酸解酶活化。在某些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在某些实施例中，LSP还可以对具体等位基因具有特异性。

在某些实施例中，提供的寡核苷酸可用于检测目标核酸的扩增和/或可用于监测或检测目标核酸中的等位基因的扩增或多态现象。此类寡核苷酸在本文中称为基于通用FRET的报告体引物(UFP)，其中所述基于通用FRET的报告体引物包含位于UFP的内部位置的至少一个淬灭剂部分和连接到UFP的5'-端的荧光团(参看图2)。荧光团和至少一种淬灭剂可参与基于FRET的淬灭。举例来说，当UFP并未与等位基因特异性引物或等位基因特异性引物延长产物的5'-通用尾杂交时，荧光团的荧光淬灭。然而，当UFP与其在5'-通用尾或5'-通用尾的补体中的目标序列杂交时，荧光团的荧光不再淬灭并且可检测。在某些实施例中，UFP的核苷酸序列与等位基因特异性引物的5'-通用尾相同。在某些实施例中，UFP的核苷酸序列与等位基因特异性引物的5'-通用尾互补。在某些实施例中，UFP可用于检测目标核酸中的特异性等位基因(例如第一和第二等位基因)或多态现象，其中对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物包含第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包含针对第一UFP的结合位点，其中第一UFP包含第一荧光团和至少一个淬灭剂部分；并且对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物包含第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包含针对第二UFP的结合位点，其中第二UFP包含第二荧光团和至少一个淬灭剂部分；其中第一和第二荧光团不同并且至少一个淬灭剂部分可相同或不同。在某些实施例中，可检测信号在UFP的3'-端通过核酸聚合酶延长时产生。

在某些实施例中，UFP的长度为约10个核苷酸到约35个核苷酸。优选地，UFP的长度为约15个核苷酸到约35个核苷酸。最优选地，UFP的长度为约25个核苷酸。在某些实施例中，UFP的T_m为约50℃到约75℃，优选地约60℃到约70℃，最优选地约58℃。在某些实施例中，内部淬灭剂部分与UFP的5'-端处的荧光团之间的距离为约8个核苷酸到约25个核苷酸。优选地，内部淬灭剂部分与5'-荧光团之间的距离为约12个核苷酸到约18个核苷酸，最优选地约15个核苷酸。在某些实施例中，UFP包含连接到一个或多个内部核苷酸的一个或多个淬灭剂部分。在某些实施例中，UFP包含连接到至少两个内部核苷酸的至少两个淬灭剂部分。在某些实施例中，UFP包含连接到两个或更多个内部核苷酸的两个或更多个淬灭剂部分。在某些实施例中，UFP包含线性构形(例如线性UFP)(参看图2)。在某些实施例中，UFP包含茎-环或发夹构形(例如茎-环UFP)(参看图2)。在某些实施例中，一个或多个内部淬灭剂部分连接到位于茎-环UFP的一个或多个环部分处的一个或多个核苷酸。在某些实施例中，一个或多个内部淬灭剂部分连接到茎-环UFP的一个或多个茎部分。在某些实施例中，一个或多个内部淬灭剂部分连接到茎-环UFP的一个或多个茎部分和一个或多个环部分。在某些实施例中，UFP的T_m可低于ASP的T_m。在某些实施例中，UFP的T_m可低于LSP的T_m。在某些实施例中，UFP的T_m可低于ASP和LSP两个的T_m。

在某些实施例中，UFP的3'端包含封端剂使得封端的端可通过多磷酸解酶或焦磷酸解酶活化。在某些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。

在某些实施例中，提供的寡核苷酸可用于检测目标核酸的扩增和/或可用于监测或检测目标核酸中的等位基因的扩增或多态现象。此类寡核苷酸在本文中称为“基于通用FRET的检测器探针”，其中基于通用FRET的检测器探针包含在探针的3'-端或探针的内部位置的至少一个淬灭剂部分或连接到探针的5'-端的荧光团。在一些实施例中，至少一个淬灭剂部分连接到来自探针的5'端的小于10个核苷酸的核苷酸。在其它实施例中，至少一个淬灭剂部分连接到来自探针的5'端的小于5个核苷酸的核苷酸。荧光团和至少一种淬灭剂可参与基于FRET的淬灭。举例来说，当基于通用FRET的检测器探针并未与等位基因特异性引物或等位基因特异性引物延长产物的5'-通用尾杂交时，荧光团的荧光淬灭。然而，当UFP与其在5'-通用尾或5'-通用尾的补体中的目标序列杂交时，荧光团的荧光不再淬灭并且可检测。当探针被聚合酶的5'-核酸酶活性消化时，荧光可进一步增加。

荧光团和至少一种淬灭剂可参与基于FRET的淬灭。举例来说，当基于通用FRET的检测器探针并未与等位基因特异性引物或等位基因特异性引物延长产物的5'-通用尾杂交时，荧光团的荧光淬灭。然而，当基于通用FRET的探针与其在5'-通用尾或5'-通用尾的补体中的目标序列杂交时，荧光团的荧光不再淬灭并且可检测。在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针的核苷酸序列与等位基因特异性引物的5'-通用尾相同。在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针的核苷酸序列与等位基因特异性引物的5'-通用尾互补。在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针可用于检测目标核酸中的特异性等位基因(例如第一和第二等位基因)或多态现象，其中对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物包含第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包含针对第一基于通用FRET的检测器探针的结合位点，其中第一基于通用FRET的检测器探针包含第一荧光团和至少一个第一淬灭剂部分；以及对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包含第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包含针对第二基于通用FRET的检测器探针的结合位点，其中第二基于通用FRET的检测器探针包含第二荧光团和至少一个第二淬灭剂部分；其中第一和第二荧光团不同并且至少第一淬灭剂部分和至少第二淬灭剂部分可相同或不同。

在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针的长度为约10个核苷酸到约35个核苷酸。在一些实施例中，基于通用FRET的检测器探针的长度为约15个核苷酸到约35个核苷酸。在其它实施例中，基于通用FRET的检测器探针的长度为约25个核苷酸。在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针的T_m为约50℃到约75℃，优选地约60℃到约70℃，最优选地约58℃。在某些实施例中，淬灭剂部分与基于通用FRET的检测器探针的5'-端处的荧光团之间的距离为约8个核苷酸到约25个核苷酸。优选地，淬灭剂部分与5'-荧光团之间的距离为约12个核苷酸到约18个核苷酸，最优选地约15个核苷酸。在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针包含连接到一个或多个核苷酸的一个或多个淬灭剂部分，其中一些可位于基于通用FRET的检测器探针的内部到3'端。在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针包含连接到至少两个内部核苷酸的至少两个淬灭剂部分。在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针包含连接到两个或更多个内部核苷酸的两个或更多个淬灭剂部分。在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针包含线性构形(例如线性基于通用FRET的检测器探针)。在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针包含茎-环或发夹构形(例如茎-环基于通用FRET的检测器探针)。在某些实施例中，一个或多个内部淬灭剂部分连接到定位于茎-环基于通用FRET的检测器探针的一个或多个环部分的一个或多个核苷酸。在某些实施例中，一个或多个内部淬灭剂部分连接到茎-环基于通用FRET的检测器探针的一个或多个茎部分。在某些实施例中，一个或多个内部淬灭剂部分连接到茎-环基于通用FRET的检测器探针的一个或多个茎部分和一个或多个环部分。在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针的T_m可低于ASP的T_m。在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针的T_m可低于LSP的T_m。在某些实施例中，基于通用FRET的检测器探针的T_m可低于ASP和LSP两个的T_m。

图9中示出了至少一个基于通用FRET的检测器探针置换UFP的示范性SNP分析法。分析法可包括一对各等位基因特异性包括通用尾的等位基因特异性引物(ASP1和ASP2)、共用基因座特异性反向引物(LSP)以及一对针对两个等位基因中的每一个的通用检测器探针(其各自包括荧光团(“F”或“V”)以及淬灭剂(“Q”))组成。荧光团“F”和“V”在光谱上可不同。第一和第二通用检测器探针的至少一个淬灭剂部分可相同或不同。ASP1和ASP2的通用尾可彼此不同。通用检测器探针可具有线性或茎-环构形。在这一实施例中，通用检测器探针不可延长，但在扩增期间消化。每一个等位基因的存在和/或量可通过检测“F”和/或“V”的不同荧光信号检测。

在某些实施例中，提供用于分析、定量或检测目标核酸中的一个或多个等位基因或多态现象的组合物和/或反应混合物，其中所述组合物和/或反应混合物包含一个或多个目标核酸分子和对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包含第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包含针对第一UFP的结合位点，其中所述第一UFP包含第一荧光团和至少一个淬灭剂部分；以及对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包含第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包含针对第二UFP的结合位点，其中所述第二UFP包含第二荧光团和至少一个淬灭剂部分；其中所述第一荧光团和所述第二荧光团不同并且所述至少一个淬灭剂部分可相同或不同。在某些实施例中，UFP可为线性构形。在某些实施例中，UFP可为茎-环构形。在某些实施例中，一种UFP可为茎-环构形并且另一UFP可为线性构形。在某些实施例中，组合物和/或反应混合物进一步包含基因座特异性引物。在某些实施例中，组合物和/或反应混合物进一步包含一种或多种核酸聚合酶，例如热稳定聚合酶；一种或多种逆转录酶，或任何其它DNA或RNA聚合酶。在某些实施例中，组合物和/或反应混合物包含一种或多种焦磷酸解酶。在某些实施例中，组合物和/或反应混合物包含一种或多种多磷酸解酶和一种或多种多磷酸解剂。在某些实施例中，反应混合物和/或组合物进一步包含基于通用FRET的检测器探针。在某些实施例中，反应混合物和/或组合物进一步包含一种或多种缓冲剂或缓冲盐；一种或多种核苷酸；一种或多种双脱氧核苷酸(ddN)；一种或多种目标/模板分子(其还可以用于测定反应性能，即控制反应)；以及用于分析或进一步操作本文所述的方法产生的产物或中间体的其它试剂。

使用方法：

在某些实施例中，提供用于测定包含SNP的目标核酸分子的基因型的方法，所述方法包含：(1)提供一个或多个目标核酸分子和对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包含第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包含针对第一UFP的结合位点，其中第一UFP包含第一荧光团和至少一个淬灭剂部分；以及对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包含第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包含针对第二UFP的结合位点，其中第二UFP包含第二荧光团和至少一个淬灭剂部分；其中第一和第二荧光团不同并且至少一个淬灭剂部分可相同或不同；(2)提供基因座特异性引物；(3)扩增目标核酸；(4)测量第一和第二荧光团的强度；(5)基于第一和第二荧光团的强度分析核酸基因型。在某些实施例中，UFP可为线性构形。在某些实施例中，UFP可为茎-环构形。在某些实施例中，一种UFP可为茎-环构形并且另一UFP可为线性构形。

在某些实施例中，等位基因特异性引物和/或基因座特异性引物中的至少一个的3'-端包含封端剂使得封端的端可通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在某些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在某些实施例中，LSP浓度高于ASP的浓度。(参看图10。)

在某些实施例中，UFP中的一个或多个置换成一个或多个基于通用FRET的检测器探针，其中基于通用FRET的检测器探针的一端包含至少一个淬灭剂并且基于通用FRET的检测器探针的另一端包含荧光团。一个或多个基于通用FRET的检测器探针可为不可延长的。在某些实施例中，使用至少两个基于通用FRET的检测器探针，其中第一UFP置换成第一通用检测器探针，其中第一通用检测器探针包含至少一个淬灭剂部分和第一荧光团；以及第二UFP置换成第二通用检测器探针，其中通用检测器探针包含至少一个淬灭剂部分和第二荧光团；其中第一和第二荧光团不同，并且第一和第二通用检测器探针的至少一个淬灭剂部分可相同或不同。在一些实施例中，LSP浓度高于ASP的浓度。

使用两个不同基于通用FRET的检测器探针的分析法的示范性流程示于图10中。分析法可包括一对各自包含通用尾的等位基因特异性引物(ASP1和ASP2)、过量共用基因座特异性反向引物(LSP)以及一对基于通用FRET的检测器探针，每个针对两个等位基因中的每一个。如图10中示出，基于通用FRET的检测器探针对不可延长。荧光团“F”和“V”在光谱上可不同。第一和第二通用检测器探针的至少一个淬灭剂部分可相同或不同。基于通用FRET的检测器探针包括荧光团(“F”或“V”)和淬灭剂(“Q”)。基于通用FRET的检测器探针可具有线性或茎-环构形。通过检测基于通用FRET的检测器探针分别与ASP1和ASP2的互补尾杂交(其降低“Q的淬灭作用”)时“F”和/或“V”的荧光来检测基于通用FRET的检测器探针的存在和/或量。

另一示范性分析法展现于图11中，其包括LATE-PCR。分析法可包括一对各自包含通用尾的等位基因特异性引物(ASP1和ASP2)、过量共用基因座特异性反向引物(LSP)以及一对基于通用FRET的检测器探针，每个针对两个等位基因中的每一个。用过量LSP指数扩增之后，在基于通用FRET的检测器探针对存在下进行线性扩增。如图11中示出，基于通用FRET的检测器探针对不可延长。基于通用FRET的检测器探针包括荧光团(“F”或“V”)和淬灭剂(“Q”)。荧光团“F”和“V”在光谱上可不同。第一通用检测器探针的至少第一淬灭剂部分与第二通用检测器探针的至少第二淬灭剂可相同或不同。基于通用FRET的检测器探针可具有线性或茎-环构形。通过检测基于通用FRET的检测器探针分别与ASP1和ASP2的互补尾杂交(其降低“Q的淬灭作用”)时“F”和/或“V”的荧光来检测基于通用FRET的检测器探针的存在和/或量。

在某些实施例中，提供用于测定包含SNP的目标核酸分子的基因型的方法，所述方法包含：(1)提供一个或多个目标核酸分子和对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包含第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包含针对第一UFP的结合位点，其中第一UFP包含第一荧光团；以及对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包含第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包含针对第二UFP的结合位点，其中第二UFP包含第二荧光团；其中第一和第二荧光团不同并且不能被激发光直接激发；(2)提供基因座特异性引物；(3)提供双股核酸插层型染料；其中双股核酸插层型染料通过激发光直接激发并且其荧光激发UFP中的荧光团；(4)扩增目标核酸；(5)测量第一和第二荧光团的强度；(6)基于第一和第二荧光团的强度分析核酸基因型(参看图12)。在某些实施例中，UFP可为线性构形。在某些实施例中，UFP可为茎-环构形。在某些实施例中，一种UFP可为茎-环构形并且另一UFP可为线性构形。随着扩增进行，插层型染料结合到双股扩增产物并且染料标记的报告体引物并入到扩增产物中。通过照明光源激发插层型染料时，插层型染料发射的光用于激发染料标记的报告体引物的荧光团。

用于聚合和/或扩增核酸的示范性方法包括例如聚合酶介导的延长反应。举例来说，聚合酶介导的延长反应可以是聚合酶链反应(PCR)。在其它实施例中，核酸扩增反应可以是多重反应。举例来说，适于如本文所述使用的用于聚合和/或扩增以及检测核酸的示范性方法可作为

分析法商购(参看例如美国专利第4,889,818号；第5,079,352号；第5,210,015号；第5,436,134号；第5,487,972号；第5,658,751号；第5,210,015号；第5,487,972号；第5,538,848号；第5,618,711号；第5,677,152号；第5,723,591号；第5,773,258号；第5,789,224号；第5,801,155号；第5,804,375号；第5,876,930号；第5,994,056号；第6,030,787号；第6,084,102号；第6,127,155号；第6,171,785号；第6,214,979号；第6,258,569号；第6,814,934号；第6,821,727号；第7,141,377号；和/或第7,445,900号，所述专利都以全文引用的方式并入本文中)。

分析通常通过使用具有5'-到-3'核酸酶活性的核酸聚合酶、能够杂交到目标多核苷酸的引物以及能够相对于所述引物杂交到所述目标多核苷酸3'的寡核苷酸探针，对目标多核苷酸进行核酸扩增来进行。寡核苷酸探针通常包括可检测标记(例如荧光报告体分子)和能够淬灭所述报告体分子的荧光的淬灭剂分子。通常，可检测标记和淬灭剂分子是单个探针的一部分。随着扩增进行，聚合酶消化探针以分离可检测标记与淬灭剂分子。在反应期间监测可检测标记(例如荧光)，其中标记的检测对应于核酸扩增的发生(例如信号越高，扩增量越大)。

分析的变体(例如LNA^TM外加

分析)在本领域中是已知的并且将适用于本文中所述的方法中。

如本文所用，术语“检测器探针”是指用于扩增反应中，通常用于定量或实时PCR分析以及终点分析的分子。所述检测器探针可以用于监测目标多核苷酸的扩增。在一些实施例中，扩增反应中所存在的检测器探针适用于监测随时间产生的扩增子的量。此类检测器探针包括(但不限于)5'-核酸外切酶分析法(本文所述的

探针(还参看美国专利第5,538,848号))、多种茎-环分子信标(参看例如美国专利第6，103,476号和第5,925,517号以及亚吉(Tyagi)和克拉默(Kramer),《自然·生物技术》14:303-308(1996))、无茎或线性信标(参看例如PCT公开案第WO 99/21881号)、PNA分子Beacons^TM(参看例如美国专利第6,355,421号以及第6,593,091号)、线性PNA信标(参看例如库比斯塔(Kubista)等人,SPIE4264:53-58(2001))、非FRET探针(参看例如美国专利第6,150,097号)、

探针(美国专利第6,548,250号)、茎-环和双螺旋Scorpion探针(索利纳斯(Solinas)等人,《核酸研究》(Nucleic Acids Research)29:E96(2001)以及美国专利第6,589,743号)、凸环探针(美国专利第6,590,091号)、伪结探针(美国专利第6,589,250号)、Cyclicons(美国专利第6,383,752号)、MGB Eclipse^TM探针(爱博克生物科学(EpochBiosciences))、发夹探针(美国专利第6,596,490号)、肽核酸(PNA)点火探针、自组装纳米粒子探针以及二茂铁改性探针，例如美国专利第6,485,901号；马哈郎加(Mhlanga)等人,《方法》(Methods)25:463-471(2001)；惠特科姆(Whitcombe)等人,《自然·生物技术》.17:804-807(1999)；伊萨克森(Isacsson)等人,《分子细胞探针》(Molecular Cell Probes).14:321-328(2000)；斯万维克(Svanvik)等人,《分析生物化学》(Anal Biochem.)281:26-35(2000)；沃尔夫(Wolffs)等人,《生物技术》(Biotechniques)766:769-771(2001)；特索卡斯(Tsourkas)等人,《核酸研究》(Nucleic Acids Research.)30:4208-4215(2002)；里切利(Riccelli)等人,《核酸研究》(Nucleic Acids Research)30:4088-4093(2002)；张(Zhang)等人,《上海》(Shanghai.)34:329-332(2002)；麦克斯维尔(Maxwell)等人,《美国化学学会 杂志》(J.Am.Chem.Soc.)124:9606-9612(2002)；布劳德(Broude)等人,《生物技术趋势》 (Trends Biotechnol.)20:249-56(2002)；黄(Huang)等人,《毒物学化学研究》(Chem Res.Toxicol.)15:118-126(2002)；以及于(Yu)等人,《美国化学学会志》(J.Am.Chem.Soc)14:11155-11161(2001)中所述。检测器探针还可以包含淬灭剂，包括(但不限于)黑洞淬灭剂(生物谷猎头(Biosearch))、爱荷华黑(Iowa Black)(IDT)、QSY淬灭剂(分子探针公司(Molecular Probes))以及二甲氨基偶氮苯甲酰(Dabsyl)和Dabcel磺酸酯/甲酸酯淬灭剂(爱博克(Epoch))。检测器探针还可以包含两个探针，其中例如荧光剂在一个探针上，并且淬灭剂在另一个探针上，其中两个探针在目标上杂交在一起淬灭信号，或其中在目标上杂交通过改变荧光改变了信号特征。检测器探针还可以包含用SO₃代替羧酸酯基的荧光素染料的磺酸酯衍生物、荧光素的亚磷酰胺形式、Cy5的亚磷酰胺形式(可从通用电气医疗集团商购)。在一些实施例中，使用插层标记，例如溴化乙锭、

Green I、

GreenER^TM以及

(生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)，由此允许在无检测器探针存在下实时观测或在终点观测扩增产物。在一些实施例中，实时观测可包含插层检测器探针和基于序列的检测器探针。在一些实施例中，检测器探针在扩增反应中未杂交到互补序列时被至少部分淬灭，并且在扩增反应中杂交到互补序列时至少部分未淬灭。在一些实施例中，本传授内容的检测器探针的T_m是约63℃到约69℃，但是应了解，通过本传授内容的引导，常规实验可以产生具有其它T_m的检测器探针。在一些实施例中，探针可以进一步包含各种修饰，例如小沟结合剂(参看例如美国专利6,486,308)，用于进一步提供所要热力学特征。

适于如本文所述使用的另一示范性系统在置换杂交法中利用双股探针(参看例如莫里森(Morrison)等人《分析生物化学》(Anal.Biochem.),18:231-244(1989)；和/或李(Li)等人《核酸研究》(Nucleic Acids Res.),30(2,e5)(2002))。在所述方法中，探针通常包括两个具有不同长度的互补寡核苷酸，其中一个包括可检测标记并且另一个包括淬灭剂分子。当未结合到目标核酸时，淬灭剂抑制可检测标记的信号。在与目标核酸置换杂交之后，探针变成可检测的。可以使用多个探针，每个含有不同的可检测标记，以使得可以在单一反应中查询多个目标核酸。

适用于如本文中所述用于聚合和/或扩增并且检测目标核酸的额外示范性方法涉及“分子信标”，其是单股发夹状寡核苷酸探针。在目标序列存在下，探针去折叠、结合并且发射信号(例如发荧光)。分子信标通常包括至少四种组分：1)“环”，18-30个核苷酸区域，它与目标序列互补；2)两个5-7个核苷酸“茎”，其存在于环的任一端上并且彼此互补；3)在5'端，可检测标记；以及4)在3'端，淬灭剂部分，其在探针呈闭环形状时(例如未结合到目标核酸)防止可检测标记发出单信号。因此，在互补目标存在下，信标的“茎”部分分离出来，导致探针杂交到目标。还已知其它类型的分子信标并且它们可以适用于本文所述的方法中。分子信标可以用于各种分析系统中。一个所述系统是基于核酸序列的扩增

用于在无温度循环的情况下将RNA聚合和/或扩增到双股DNA的单步骤等温法。NASBA反应通常需要禽成髓细胞瘤病毒(AMV)、逆转录酶(RT)、T7RNA聚合酶、RNA酶H以及两个寡核苷酸引物。在扩增之后，可以使用分子信标检测经扩增的目标核酸。分子信标的其它用途在本领域中是已知的并且将适用于本文中所述的方法中。

Scorpions^TM系统是可以用于本文中所述的方法中的另一种示范性分析形式。Scorpions^TM引物是双官能分子，其中引物与可检测标记(例如荧光团)和淬灭可检测标记的荧光的不可检测的淬灭剂部分一起被共价连接到探针。在目标核酸存在下，可检测标记和淬灭剂分离，这导致从可检测标记发射的信号增加。通常，扩增反应中所用的引物包括在5'端的探针元件以及在发夹环开始时的“PCR阻断剂”元件(例如六乙二醇(HEG)单体(惠特科姆(Whitcombe)等人《自然·生物技术》(Nat.Biotech.)17：804-807(1999))。探针通常包括在一个末端含可检测标记并且在另一个末端含淬灭剂的自身互补茎序列。在初始扩增循环(例如PCR)中，引物杂交到目标并且由于聚合酶的作用而发生延长。Scorpions^TM系统可以使用多个可不同标记以在探针之间加以区分的探针，用于检查并且鉴别点突变。使用PCR作为实例，在完成一个延长循环之后，新合成的目标区将连接到与探针相同的股。在第二个变性和退火循环之后，探针和目标杂交。然后发夹序列杂交到新产生的PCR产物的一部分。这导致可检测标记与淬灭剂分离并引起信号发射。所述经标记探针的其它用途在本领域中是已知的并且将适用于本文中所述的方法中。

在某些实施例中，对所关注突变或SNP所处的目标DNA区中的实时PCR产生的双股DNA样品进行解链曲线分析。分析可包含HRM分析。扩增子DNA从约50℃升温到约95℃导致DNA的两个股解链并且可特征上测量到解离。实际上，在高分辨率下并且实时监测解链过程。在某些实施例中，荧光染料可用作解离的指示剂。在某些实施例中，在测量双股DNA的解链时，可使用特异性结合于双股DNA并且只要保持结合到双股DNA就以特征和可测量程度发荧光的插层染料。在具体双股实体的熔融温度下，荧光改变。举例来说，高水平的荧光指示样品中的双股实体群体，随着温度上升，双股DNA的两个股分离并且荧光因此改变。解链事件的高分辨率检测获得显示荧光随温度改变的解链曲线和熔融温度(T_m)。根据某些实施例，检测可用于揭示序列变异体中的差异，例如来判断样品是基因的第一等位基因的同型接合子、基因的第二等位基因的同型接合子还是异型接合子。

在某些实施例中，扩增等位基因特异性目标核酸的方法包括通过多磷酸解(APP)反应活化以提供目标RNA或其cDNA的高特异性扩增。在某些实施例中，多磷酸解可活化寡核苷酸(APP寡核苷酸)为在3'末端具有双脱氧核苷酸的等位基因特异性寡核苷酸。3'末端双脱氧核苷酸抑制通过聚合酶直接延长，但可以在多磷酸解剂和目标的互补股存在下通过多磷酸解去除。一般来说，如果APP寡核苷酸与其杂交搭配物之间存在错配，那么双脱氧核苷酸未去除。通常，APP寡核苷酸经设计以具有区别一个目标与另一目标的核苷酸，例如区别靠近3'端的主要等位基因DNA目标序列与次要等位基因DNA目标序列。APP可用于聚合和/或扩增核酸分子，包括(但不限于)核糖核酸(例如RNA)和/或脱氧核糖核酸(例如DNA)或其杂交物。APP反应和其此类用途描述于2011年12月13日申请并且作为美国专利公开案第2012/0196329号公开的美国第13/324,676号，其以全文引用的方式并入本文中。

APP通过将不可延长寡核苷酸转化成可延长寡核苷酸，使寡核苷酸延长产生所要核酸股(例如目标核酸的互补拷贝)以及任选地扩增和检测所要核酸股来提供寡核苷酸延长。不可延长核苷酸是指核苷酸，其并入到核酸中时防止核酸例如通过至少一种生物催化剂(例如酶)进一步延长。核苷酸可通过一种酶延长，但不可通过另一种酶延长。一种酶不可延长的核苷酸在不同条件下可以变得可延长或部分可延长。可延长核苷酸可指通过反应中存在的生物催化剂(例如酶)在可延长核苷酸的糖部分的3'-位置处可添加或共价键结至少一种其它核苷酸的核苷酸。延长还可以从核苷酸的2'-OH开始，所述核苷酸可具有或不具有可延长3'-OH。延长核酸是指向指定核酸添加或并入一个或多个核苷酸。延长的寡核苷酸通常是已添加或用其它方式并入(例如共价键结)一个或多个额外核苷酸的寡核苷酸(例如引物核酸)。APP通常使用以下步骤进行：(a)使具有不可延长3'端(“P*”)的第一寡核苷酸退火到核酸，所述3'端可通过多磷酸解去除(即可活化)；(b)使用多磷酸解剂和具有多磷酸解活性的酶(即DNA聚合酶)去除所述3'不可延长末端产生未封端的寡核苷酸；以及(c)延长未封端的寡核苷酸产生所要核酸股。还可以包括如下文所述检测所要核酸股的其它步骤。

反应混合物中可包括任何适合浓度的一种或多种多磷酸解剂。举例来说，适合浓度可以是约1-500μM。其它适合多磷酸解剂浓度范围可包括(但不限于)约1-10μM、10-20μM、20-30μM、30-40μM、40-50μM、高达50μM、50-60μM、60-70μM、70-80μM、90-100μM、高达100μM、100-150μM、150-200μM、高达200μM、200-250μM、250-300μM、高达300μM、300-350μM、350-400μM、高达400μM、400-450μM、450-500μM。其它适合多磷酸解剂浓度包括(但不限于)1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、125μM、150μM、175μM、200μM、225μM、250μM、275μM、300μM、325μM、350μM、375μM、400μM、425μM、450μM、475μM以及500μM。多磷酸解剂的具体适合浓度可包括(但不限于)约25μM、40μM、50μM以及100μM、150μM、200μM以及250μM。如所属领域技术人员所理解的多磷酸解剂的其它适合浓度也可能适合，并且还预期为本说明书的部分。

本文所述的使用APP的方法可使用若干不同形式进行。在一些实施例中，所述方法包含连续进行的以下步骤：

(a)将互补可活化寡核苷酸“P*”退火到模板股。这一可活化寡核苷酸在其3'末端具有不可延长核苷酸。其在3'端处或附近不具有与模板股上的相应核苷酸错配的核苷酸。因此，当寡核苷酸P*退火时，末端核苷酸与模板股杂交。

(b)用本文所述的至少一种多磷酸解剂和具有多磷酸解活性的酶对退火的可活化寡核苷酸P*进行多磷酸解。这通过去除杂交末端核苷酸活化寡核苷酸P*。

(c)在三磷酸四核苷和核酸聚合酶存在下通过延长模板股上的活化寡核苷酸P*聚合，合成所要核酸股。

APP方法还可以通过例如添加以下额外步骤用于扩增所要核酸股：(d)分离步骤(c)的所要核酸股与模板股，以及(e)重复步骤(a)-(d)直到达到所需的所要核酸股扩增水平。APP的步骤(a)到(c)可在热循环仪上作为两个或更多个温度阶段依序进行，或其可在热循环仪上作为一个温度阶段进行。

如上文所述，APP可用于扩增核酸分子，包括(但不限于)核糖核酸(例如RNA)和/或脱氧核糖核酸(例如DNA)。当用于扩增DNA时，不可延长可活化寡核苷酸P*通常为2'-脱氧寡核苷酸，末端脱氧核苷酸可以是2',3'-双脱氧核苷酸，三磷酸四核苷是三磷酸2'-脱氧核苷，并且核酸聚合酶是DNA聚合酶。用于步骤(c)的DNA聚合酶也可以是步骤(b)中所用的具有多磷酸解活性的酶。通过APP扩增可以是线性扩增或指数扩增。可活化寡核苷酸P*是仅用的互补寡核苷酸时，获得线性扩增。存在与所要核酸股互补的第二寡核苷酸(例如如PCR中)时，获得指数扩增。第二寡核苷酸可以是可延长寡核苷酸或可活化的不可延长寡核苷酸。可活化寡核苷酸P*和第二寡核苷酸侧接扩增所靶向的区。在步骤(a)中，第二寡核苷酸退火到步骤(d)的分离的所要核酸股产物。在步骤(c)中，聚合使所要核酸股上的第二寡核苷酸延长来合成核酸模板股的拷贝。在步骤(d)中，分离合成核酸模板股与所要核酸股。接着可重复步骤(a)到(d)直到已达到所要水平的指数扩增。

在某些实施例中，使用APP方法扩增等位基因特异性目标核酸，其可为DNA序列。可活化(例如不可延长)寡核苷酸P*在目标等位基因特异性DNA序列的3'末端附近不具有错配并且在其3'端处或附近具有至少一个与非目标替代等位基因特异性DNA序列的相应核苷酸错配的核苷酸。因为错配，在APP方法的步骤(a)中，寡核苷酸P*的末端不可延长核苷酸未与非目标等位基因特异性DNA杂交。在步骤(b)中，多磷酸解不会从退火到非目标DNA的可活化寡核苷酸P*实质上去除未杂交末端或靠近末端的核苷酸。在步骤(c)中，因此，寡核苷酸P*未通过非目标DNA上的聚合实质上延长。因此，在模板股上合成的目标等位基因特异性DNA的所要核酸链优选地在非目标等位基因特异性DNA上合成的任何核酸股上扩增。在一个实施例中，APP方法用于含有一种或多种其它(非目标)DNA物质的混合物中的特异性(目标)DNA物质的指数扩增。

在某些实施例中，提供的扩增等位基因特异性目标核酸的方法包含在至少一种多磷酸解剂存在下使用通过多磷酸解(APP)活化的目标核酸扩增步骤。在某些实施例中，至少一种多磷酸解剂为二磷酸酯、三磷酸酯、四磷酸酯、五磷酸酯或六磷酸酯。在所提供的方法的某些实施例中，多磷酸解剂为三磷酸酯。在所提供的方法的某些实施例中，多磷酸解剂为六磷酸酯。

在某些实施例中，扩增目标核酸的方法使用通过焦磷酸解活化的聚合(PAP)反应活化。PAP可用于聚合和/或扩增核酸分子，包括(但不限于)核糖核酸(例如RNA)和/或脱氧核糖核酸(例如DNA)或其杂交物。PAP反应和其在聚合和扩增反应中的用途描述于例如美国专利第7,033,763号中，所述专利以全文引用的方式并入本文中。在PAP中，退火的可活化寡核苷酸P*用焦磷酸酯和展现焦磷酸解活性的酶焦磷酸化。这通过去除杂交不可延长3'末端去除寡核苷酸P*。因此，在某些实施例中，目标miRNA cDNA的扩增使用PAP和焦磷酸作为焦磷酸解剂。

在某些实施例中，对于使用APP或PAP的目标核酸扩增反应，第一等位基因特异性引物(ASP1)、第二等位基因特异性引物(ASP2)、基因座特异性引物(LSP)、第一基于通用FRET的报告体引物(URP)、第二基于通用FRET的报告体引物(URP)、一个或多个基于通用FRET的检测器探针中的一个或多个在3'末端可包括不可延长核苷酸，其可使用APP或PAP活化。在某些实施例中，对于使用APP或PAP的目标核酸扩增反应，第一基于通用FRET的报告体引物(URP)、第二基于通用FRET的报告体引物(URP)都在3'末端处包含不可延长核苷酸，其可使用APP或PAP活化。在某些实施例中，对于使用APP或PAP的目标核酸扩增反应，可与第一等位基因特异性引物(ASP1)的尾选择性杂交的第一基于通用FRET的检测器探针和可与第二等位基因特异性引物(ASP2)的尾选择性杂交的第二基于通用FRET的检测器探针在3'末端可包括不可延长核苷酸，其可使用APP或PAP活化。

一种利用APP或PAP的示范性(但非限制性)分析法示于图8中。显示包含焦磷酸解或多磷酸解步骤的基于通用FRET的检测器探针SNP分析法的示意图。分析法包括一对各自包含通用尾和3'-ddN的等位基因特异性引物(ASP1和ASP2)、共用基因座特异性反向引物(LSP)以及一对每个针对两个等位基因中的每一个的基于通用FRET的报告体引物，基于通用FRET的检测器探针对中的每一个包括荧光团(“F”或“V”)以及淬灭剂(“Q”)。基于通用FRET的检测器探针可具有线性或茎-环构形。ASP1、ASP2、LSP以及如图8中不具有箭头标示所示的基于通用FRET的检测器探针中的每一个不使用APP或PAP就不可延长。菱形标示指示被APP或PAP活化的能力。在其它实施例中，基于通用FRET的检测器探针对各自具有3"ddN并且不使用APP或PAP就不可延长，并且可与可延长或不可延长的ASP1、ASP2或LSP(即具有可使用APP或PAP延长的3'ddN)中的任一个以任何组合使用。

根据某些实施例，使用具有通用尾的等位基因特异性引物或具有其它核苷酸改变的引物的等位基因特异性焦磷酸解活化的聚合或通过多磷酸解的等位基因特异性活化，随后解链曲线分析，提供可用于分析大部分并且在许多情况下全部SNP(不仅SNP的次单元)的分析法。通过根据所要PCR扩增子的长度和序列调整等位基因特异性来大大提高SNP分析法的解析度。

根据某些实施例，HRM分析法可以定量方式用于例如SNP的等位基因定量，因为两个等位基因特异性扩增子的解链曲线明确分离。根据某些实施例，焦磷酸解活化的聚合(PAP)或通过多磷酸解活化(APP)的高特异性可用于大大降低非特异性PCR扩增的风险和提高HRM分析法的特异性以及灵敏度。

根据某些实施例，基于HRM的序列分析用作SNP基因分型和突变筛选的有效技术。使用通用带尾引物或具有其它核苷酸改变的引物的等位基因特异性焦磷酸解活化的聚合或多磷酸解活化的聚合，随后根据本传授内容的某些实施例的HRM分析，将HRM平台转化成能够分析任何SNP的稳定并且定量突变筛选平台。PCR扩增子之间提高的等位基因特异性解析度允许定量基因分型应用，如等位基因定量或等位基因特异性基因表达分析。本文所述的本发明稳定分析平台可用于针对临床研究以及诊断应用的分析法。

在一些实施例中，所述方法在定序反应之前进行或与定序反应一起进行。术语“定序”在本文中在广义上使用并且是指本领域中已知允许鉴别至少一部分多核苷酸(例如(但不限于)目标核酸或扩增子)中的至少一些连续核苷酸的顺序的任何技术。定序技术的一些非限制性实例包括桑格(Sanger)的双脱氧终止子法以及马克塞姆(Maxam)与吉尔伯特(Gilbert)的化学裂解法，包括那些方法的变体；通过杂交定序；通过合成定序；以及限制性酶切作图。一些定序方法包含电泳，包括毛细管电泳和凝胶电泳；通过杂交定序，包括微阵列杂交；质谱；单分子检测；以及离子/质子检测。在一些实施例中，定序包含直接定序、双重定序、循环定序、单碱基延伸定序(SBE)、固相定序或其组合。在一些实施例中，定序包含使用仪器检测定序产物，所述仪器例如(但不限于)ABI

377 DNA定序仪；ABI

310、3100、3100-Avant、3730或3730xl遗传分析仪；ABI

3700 DNA分析仪；Ion PGM^TM定序仪或Ion Proton^TM定序仪(全部可购自加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)或质谱仪。在一些实施例中，定序包含向扩增产物中并入dNTP，包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP或其组合，并且包括dNTP的双脱氧核糖核苷酸类似物。

在本文所披露的方法、组合物和试剂盒的某些实施例中，可使用一种或多种核酸聚合酶。可以用于所披露的核酸扩增反应中的核酸聚合酶可以是用于进行所要反应的任何核酸聚合酶，包括例如原核生物的、真菌的、病毒的、噬菌体、植物和/或真核生物的核酸聚合酶。如本文所用，术语“DNA聚合酶”是指使用核酸股作为模板从头合成DNA股的酶。DNA聚合酶使用现有DNA或RNA作为DNA合成模板并且沿着其所读取的模板股催化脱氧核糖核苷酸的聚合。新合成的DNA股与模板股互补。DNA聚合酶可以向新形成股的3'-羟基端仅添加游离核苷酸。它通过将单磷酸核苷从三磷酸脱氧核苷(dNTP)转移到正在生长的寡核苷酸股的3'-羟基来合成寡核苷酸。这导致新股沿着5'到3'的方向伸长。因为DNA聚合酶可以仅添加核苷酸到预先存在的3'-OH基团上，所以为了开始DNA合成反应，DNA聚合酶需要可以向其添加第一核苷酸的引物。适合引物可以包含RNA或DNA的寡核苷酸或其嵌合体(例如RNA/DNA嵌合引物)。DNA聚合酶可以是天然存在的DNA聚合酶或具有上文提及的活性的天然酶的变异体。举例来说，其可包括具有股置换活性的DNA聚合酶、不具有5'-到-3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶、具有逆转录酶活性的DNA聚合酶、具有核酸内切酶活性的DNA聚合酶或具有焦磷酸解活化的聚合酶或多磷酸解活化的聚合酶活性的DNA聚合酶。

适合核酸聚合酶还可以包含全酶、全酶的功能性部分、嵌合聚合酶或可以实现核酸分子的合成的任何经修饰聚合酶。在本发明内，DNA聚合酶还可以包括聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒酶和/或多核苷酸磷酸化酶。聚合酶的非限制性实例可包括例如T7DNA聚合酶、真核生物线粒体DNA聚合酶γ、原核生物DNA聚合酶I、II、III、IV和/或V；真核生物聚合酶α、β、γ、δ、ε、η、ζ、ι和/或κ；大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I；大肠杆菌DNA聚合酶IIIα和/或ε亚单位；大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V；栖热水生菌(T.aquaticus)DNA聚合酶I；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)DNA聚合酶I；广古菌(Euryarchaeota)聚合酶；末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)；酿酒酵母(S.cerevisiae)聚合酶4；跨损伤合成聚合酶；逆转录酶；和/或端粒酶。可以使用的适合热稳定DNA聚合酶的非限制性实例包括(但不限于)嗜热栖热菌(Thermus thermophilus；Tth)DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermusaquaticus；Taq)DNA聚合酶、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neopolitana；Tne)DNA聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima；Tma)DNA聚合酶、海滨嗜热球菌(Thermococcuslitoralis；Tli或VENT^TM)DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus；Pfu)DNA聚合酶、DEEPVENT^TMDNA聚合酶、沃斯火球菌(Pyrococcus woosii；Pwo)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus sterothermophilus；Bst)DNA聚合酶、极端芽孢杆菌(Bacilluscaldophilus；Bca)DNA聚合酶、嗜酸热硫化叶菌(Sulfobus acidocaldarius；Sac)DNA聚合酶、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum；Tac)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus；Tfl/Tub)DNA聚合酶、红色栖热菌(Thermus ruber；Tru)DNA聚合酶、布氏栖热菌(Thermusbrockianus；例如DYNAZYME^TM)DNA聚合酶、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum；Mth)DNA聚合酶、分枝杆菌(mycobacterium)DNA聚合酶(Mtb、Mlep)以及其突变体和变异体以及衍生物。根据本传授内容还可以使用RNA聚合酶，例如T3、T5和SP6以及其突变体、变异体和衍生物。一般来说，可以根据本传授内容使用任何I型DNA聚合酶，但是可以使用其它DNA聚合酶，包括(但不限于)III型或家族A、B、C等DNA聚合酶。另外，任何基因工程改造的DNA聚合酶、具有降低或不显著3'-到-5'核酸外切酶活性的任何酶(例如Superscript^TM DNA聚合酶)和/或基因工程改造的DNA聚合酶(例如具有活性位点突变F667Y或F667Y等效物的那些(例如Tth中)、

ThermoSequenase^TM)、

Gold、

Taq DNA聚合酶、Therminator I、Therminator II、Therminator III、Therminatorγ(全部获自新英格兰生物实验室，贝弗利，马萨诸塞州)和/或其任何衍生物和片段，可根据本传授内容使用。如所属领域的技术人员将理解，其它核酸聚合酶也可以是合适的。

根据本传授内容使用的聚合酶可以是通常沿着5'-到-3'方向从核酸模板合成核酸分子的任何酶。本文中所披露的方法中所用的核酸聚合酶可以是嗜温性或嗜热性的。示范性嗜温性DNA聚合酶包括T7DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、克列诺(Klenow)片段DNA聚合酶、DNA聚合酶III等。可用于本传授内容的方法的示范性热稳定DNA聚合酶包括Taq、Tne、Tma、Pfu、Tfl、Tth、斯托菲尔片段(Stoffel fragment)、VENT^TM以及DEEPVENT^TM DNA聚合酶，以及其突变体、变异体和衍生物(美国专利第5,436,149号；第4,889,818号；第4,965,188号；第5,079,352号；第5,614,365号；第5,374,553号；第5,270,179号；第5,047,342号以及第5,512,462号；PCT公开案第WO 92/06188号、第WO 92/06200号以及第WO 96/10640号；巴尔内斯(Barnes),《基因》(Gene)112:29-35(1992)；劳耶(Lawyer)等人,《PCR方法和应用》(PCR Meth.Appl.)2:275-287(1993)；弗拉曼(Flaman)等人,《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)22:3259-3260(1994))。实质上缺乏3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶的实例包括(但不限于)Taq、Tne(exo)、Tma(exo)、Pfu(exo)、Pwo(exo)以及Tth DNA聚合酶以及其突变体、变异体和衍生物。这些聚合酶可用于与如本文所述的焦磷酸解酶或多磷酸解酶的任何适合组合。

适用于本文中所披露的方法中的DNA聚合酶可以在商业上例如从生命技术公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德)、法玛西亚(Pharmacia)(新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway,N.J.))、西格玛(Sigma)(密苏里州圣路易斯(St.Louis,Mo.))以及宝灵曼(BoehringerMannheim)(新泽西州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN))获得。

用于本文提供的组合物、反应混合物、方法、组合物以及试剂盒的酶还可包括具有逆转录酶活性的任何酶。此类酶包括(但不限于)逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、B型肝炎逆转录酶、花椰菜嵌纹病毒逆转录酶、细菌逆转录酶、Tth DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶(佐伯(Saiki)等人,《科学》(Science)239:487-491(1988)；美国专利第4,889,818号和第4,965,188号)、Tne DNA聚合酶(PCT公开案第WO 96/10640号)、Tma DNA聚合酶(美国专利第5,374,553号)以及其突变体、片段、变异体或衍生物(参看例如共同拥有同在申请中的美国专利申请案第08/706,702号和第08/706,706号，都在1996年9月9日申请，所述申请案以全文引用的方式并入本文中)。如所属领域的普通技术人员将了解，经修饰的逆转录酶和具有逆转录酶活性的DNA聚合酶可以通过本领域中众所周知的重组或基因工程技术获得。突变体逆转录酶或聚合酶可以例如通过定点或随机突变诱发使编码所关注逆转录酶或聚合酶的基因突变来获得。所述突变可以包括点突变、缺失突变和插入突变。在一些实施例中，使用一个或多个点突变(例如用一个或多个不同氨基酸取代一个或多个氨基酸)来构造适用于本发明的突变体逆转录酶或聚合酶。逆转录酶或聚合酶的片段还可以通过所属领域中众所周知的的重组技术通过缺失突变，或使用许多种众所周知的蛋白水解酶中的任一种，通过相关逆转录酶或聚合酶的酶消化来获得。

在一些实施例中，适用于本文中提供的方法中的酶包括RNA酶H活性降低或实质上降低的那些。RNA酶H活性降低或实质上降低的所述酶可以通过例如如上所述的一个或多个点突变、一个或多个缺失突变或一个或多个插入突变，使相关逆转录酶内的RNA酶H结构域突变来获得。“RNA酶H活性实质上降低”的酶是指具有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约7.5％或小于约5％、或小于约5％或小于约2％的对应野生型或RNA酶H⁺酶的RNA酶H活性的酶，所述野生型或RNA酶H⁺酶例如野生型莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus；M-MLV)、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)或劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus；RSV)逆转录酶。任何酶的RNA酶H活性可以通过多种分析法测定，例如美国专利第5,244,797号；科托维奇(Kotewicz)等人,《核酸研究》16:265(1988)；杰勒德(Gerard)等人,《病灶》(FOCUS)14:91(1992)以及美国专利第5,668,005号中所述的那些，其全部披露内容全部以引用的方式并入本文中。

适用于本文中提供的方法中的具有逆转录酶活性的多肽可以例如从生命技术公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德)、法玛西亚(新泽西州皮斯卡塔韦)、西格玛(密苏里州圣路易斯)或宝灵曼生物化学品(Boehringer Mannheim Biochemicals)(印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,Ind.))购得。或者，具有逆转录酶活性的多肽可以根据所属领域的普通技术人员众所周知的用于分离和纯化天然蛋白质的标准程序从其天然病毒或细菌来源中分离(参看例如霍茨(Houts)等人,《病毒学杂志》(J.Virol.)29:517(1979))。另外，具有逆转录酶活性的多肽可以通过所属领域的普通技术人员所熟悉的重组DNA技术来制备(参看例如科托维奇(Kotewicz)等人,《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)16:265(1988)；索尔蒂斯(Soltis)和斯卡尔卡(Skalka),《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:3372-3376(1988))。

适用于本文中提供的方法中的具有逆转录酶活性的示范性多肽包括M-MLV逆转录酶、RSV逆转录酶、AMV逆转录酶、劳斯相关病毒(Rous Associated Virus；RAV)逆转录酶、成髓细胞瘤相关病毒(Myeloblastosis Associated Virus；MAV)逆转录酶和人类免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶和在PCT公开案第WO 98/47921号中所述的其它多肽以及其衍生物、变异体、片段或突变体、以及其组合。在另一实施例中，逆转录酶的RNA酶H活性降低或实质上降低，并且可以选自由以下组成的群组：M-MLV H^-逆转录酶、RSV H^-逆转录酶、AMV H^-逆转录酶、RAV H^-逆转录酶、MAV H^-逆转录酶和HIV H^-逆转录酶以及其衍生物、变异体、片段或突变体以及其组合。尤其关注的逆转录酶包括AMV RT和M-MLV RT，以及具有降低或实质上降低的RNA酶H活性的任选地AMV RT和M-MLV RT(例如AMV RTαH^-/BH⁺和M-MLV RT H^-)。用于本传授内容的逆转录酶包括Superscript^TM、SuperScript^TM II、ThermoScript^TM以及ThermoScript^TM II，可获自生命技术公司。一般参看PCT公开案第WO 98/47921号、美国专利第5,244,797号和第5,668,005号，所述专利中的每一个的完整内容以引用的方式并入本文中。

在另一方面，本发明提供用于聚合和/或扩增所关注核酸序列(例如目标序列)的反应混合物。在一些实施例中，反应混合物可以进一步包含可检测标记。所述方法还可以包括一个或多个用于检测可检测标记以定量经扩增核酸的步骤。如本文中所用，术语“可检测标记”是指指示扩增的各种信号传导分子中的任一个。举例来说，

绿和其它DNA结合染料是可检测标记。所述可检测标记可以包含或可以是例如核酸插层剂或非插层剂。如本文中所用，插层剂是能够非共价插层到双股核酸分子的堆叠碱基对之间的试剂或部分。非插层剂是不插层到双股核酸分子中的试剂。核酸粘合剂可以直接地或间接地产生可检测信号。所述信号可以使用例如荧光和/或吸光度直接地可检测，或使用例如可检测地受与双股核酸的接近性影响的任何合适的部分或配体间接地可检测，例如连接到核酸粘合剂的被取代的标记部分或结合配体。核酸结合剂在结合到双股核酸时通常必需产生可与当相同试剂在溶液中或结合到单股核酸时所产生的信号相区别的可检测信号。举例来说，例如溴化乙锭的插层剂在插层到双股DNA中时发出的荧光比在结合到单股DNA、RNA或在溶液中时强烈(参看例如美国专利第5,994,056号；第6,171,785号；和/或第6,814,934号)。类似地，放线菌素D在结合到单股核酸时在紫外/可见光谱的红色部分中发荧光，并且当结合到双股核酸时在紫外/可见光谱的绿色部分中发荧光。并且在另一个实例中，已经报告了光反应性的补骨脂素4-氨甲基-4-5',8-三甲基补骨脂素(AMT)在插层到双股DNA中之后展现在长波长下的吸收和荧光减少(约翰逊(Johnson)等人《光化学和光生物学》(Photochem.& Photobiol.),33:785-791(1981))。举例来说，美国专利第4,257,774号描述了荧光插层剂(例如乙锭盐、道诺霉素(daunomycin)、麦帕克林(mepacrine)和吖啶橙、4',6-二脒基-α-苯基吲哚)与DNA的直接结合。非插层剂(例如如本文中所述的小沟结合剂，例如赫斯特33258、偏端霉素(distamycin)、纺锤菌素(netropsin))也可以是适用的。举例来说，赫斯特33258(瑟尔(Searle)等人《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)18(13):3753-3762(1990))在增加目标量的情况下展现出有所改变的荧光。小沟结合剂在本文中其它地方更详细地加以描述。

其它DNA结合染料对于所属领域的技术人员来说是可获得的并且可以单独或与分析系统的其它试剂和/或组分组合使用。示范性DNA结合染料尤其可包括例如吖啶(例如吖啶橙、吖啶黄)、放线菌素D(杰恩(Jain)等人《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)68:21(1972))、氨茴霉素(anthramycin)、BOBO^TM-1、BOBO^TM-3、BO-PRO^TM-1、色霉素(cbromomycin)、DAPI(卡皮申斯基(Kapuseinski)等人《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)6(112)：3519(1979))、道诺霉素、偏端霉素(例如偏端霉素D)、在美国专利第7,387,887号中所述的染料、玫瑰树碱、乙锭盐(例如溴化乙锭)、氟库满宁(fluorcoumanin)、如美国专利第4,257,774号中所述的荧光插层剂、

(缅因州罗克兰的康伯司生物科学罗克兰公司(CambrexBio Science Rockland Inc.,Rockland,Me.))、赫斯特33258(瑟尔和安布雷(Embrey),《核 酸研究》(Nucl.Acids Res.)18:3753-3762(1990))、赫斯特33342、乙菲啶(homidium)、JO-PRO^TM-1、LIZ染料、LO-PRO^TM-1、麦帕克林、光神霉素(mithramycin)、NED^TM染料、纺锤菌素、4',6-二脒基-α-苯基吲哚、普罗黄素(proflavine)、POPO^TM-1、POPO^TM-3、PO-PRO^TM-1、碘化丙啶、多吡啶钌、S5、

金色、

绿色I(美国专利第5,436,134号和第5,658,751号)、

绿色II、

绿色ER^TM、

蓝色、

绿色、

43、

44、

45、

蓝色、

11、

13、

15、

16、

20、

23、噻唑橙(威斯康星州密尔沃基的奥德里奇化学公司(AldrichChemical Co.,Milwaukee,Wis.))、

和

(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)。举例来说，

绿色I(参看例如美国专利第5,436,134号；第5,658,751号；和/或第6,569,927号)已经用于监测PCR反应。如所属领域的技术人员将了解，其它DNA结合染料也可以是合适的。

关于如本文中所述的用途，一个或多个可检测标记和/或淬灭剂可以连接到一个或多个引物和/或探针(例如可检测标记)。可检测标记在游离时或在结合到目标核酸中的一个时可以发射信号。可检测标记还可以在接近另一种可检测标记时发射信号。可检测标记还可以与淬灭剂分子一起使用以使得信号仅仅在与淬灭剂分子不足够接近时才可检测。举例来说，在一些实施例中，分析系统可以引起可检测标记从淬灭分子释放。可以使用若干可检测标记中的任一个来标记在本文中所述方法中所用的引物和探针。如上文所述，在一些实施例中，可检测标记可以连接到可并入到引物中的探针，或可以按其它方式结合到经扩增目标核酸(例如可检测核酸结合剂，例如插层或非插层染料)。当使用一个以上可检测标记时，每一个的光谱特性应该不同以使得所述标记可以彼此区分，或以使得可检测标记合起来发射任一可检测标记单独不发射的信号。示范性可检测标记包括例如荧光染料或荧光团(例如可以通过光激发以发射荧光或磷光的化学基团)、能够淬灭荧光供体染料的荧光信号的“受体染料”等。适合可检测标记可以包括例如荧光素(例如5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM^TM)；5-羟基色胺(5-HAT)；6-JOE^TM；6-羧基荧光素(6-FAM^TM)；FITC；6-羧基-1,4-二氯-2',7'-二氯荧光素(TET^TM)；6-羧基-1,4-二氯-2',4',5',7'-四氯荧光素(HEX^TM)；6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE^TM)；Alexa

荧光团(例如350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750)；

荧光团(例如492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-X、650/665-X、665/676、FL、FL ATP、FI-神经酰胺、R6GSE、TMR、TMR-X结合物、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE)、香豆素(例如7-氨基-4-甲基香豆素、AMC、AMCA、AMCA-S、AMCA-X、ABQ、CPM甲基香豆素、香豆素鬼笔环肽(coumarinphalloidin)、羟基香豆素、CMFDA、甲氧基香豆素)、钙黄绿素、钙黄绿素AM、钙黄绿素蓝、钙染料(例如钙深红色、钙绿、钙橙、荧光增白剂(calcofluor white))、级联蓝、级联黄；Cy^TM染料(例如3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7)、青色GFP、环状AMP氟传感器(FiCRhR)、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(例如GFP.EGFP)、蓝色荧光蛋白(例如BFP、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)、青色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet)、黄色荧光蛋白(例如YFP、Citrine、Venus、YPet)、FRET供体/受体对(例如荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素、EDANS/dabcyl、荧光素/荧光素、

FL、荧光素/QSY7和QSY9)、

和LysoSensor^TM(例如

蓝色DND-22、

蓝色-白色DPX、

黄色HCK-123、

绿色DND-26、

红色DND-99、LysoSensor^TM蓝色DND-167、LysoSensor^TM绿色DND-189、LysoSensor^TM绿色DND-153、LysoSensor^TM黄色/蓝色DND-160、LysoSensor^TM黄色/蓝色10,000MW葡聚糖)、俄勒冈绿(Oregon Green)(例如488、488-X、500、514)；若丹明(rhodamine)(例如110、123、B、B 200、BB、BG、B extra、5-羧基四甲基若丹明(5-TAMRA^TM)、5GLD、6-羧基罗丹明6G、丽丝胺(Lissamine)、丽丝胺若丹明B、Phallicidine、鬼笔环肽、红色、Rhod-2、ROX^TM(6-羧基-X-若丹明)、5-ROX^TM(羧基-X-若丹明)、磺酰罗丹明B can C、磺酰罗丹明G Extra、TAMRA^TM(6-羧基四甲基若丹明)、四甲基罗丹明(TRITC)、WT)、德克萨斯红(Texas

)、德克萨斯红-X、

以及在例如美国专利申请公开案第2009/0197254号(以全文引用的方式并入本文中)中所述的其它标记，以及如所属领域的普通技术人员应已知的其它标记。如所属领域的普通技术人员将已知，还可以使用其它可检测标记(参看例如美国专利申请公开案第2009/0197254号(以全文引用的方式并入本文中))。可以使用这些系统和可检测标记以及许多其它系统和可检测标记中的任一个来检测经扩增目标核酸。

一些可检测标记可为基于序列的探针，例如5'-核酸酶探针。所述探针可以包含一个或多个可检测标记。所属领域中已知多种可检测标记，例如本文所述的

探针(还参看美国专利第5,538,848号(以全文引用的方式并入本文中))、多种茎-环分子信标(参看例如美国专利第6,103,476号和第5,925,517号，以及亚吉(Tyagi)和克拉默(Kramer),《自 然·生物技术》14:303-308(1996))、无茎或线性信标(参看例如PCT公开案第WO99/21881号；美国专利第6,485,901号)、PNA分子信标^TM(参看例如美国专利第6,355,421号和第6,593,091号)、线性PNA信标(参看例如库比斯塔(Kubista)等人,国际光学工程学会(SPIE)4264:53-58(2001))、非FRET探针(参看例如美国专利第6,150,097号)、

探针(美国专利第6,548,250号)、茎-环和双螺旋体Scorpions^TM探针(索利纳斯(Solinas)等人,《核酸研究》29:E96(2001)以及美国专利第6,589,743号)、凸环探针(美国专利第6,590,091号)、伪结探针(美国专利第6,589,250号)、Cyclicons(美国专利第6,383,752号)、MGB Eclipse^TM探针(时代生物科学)、发夹探针(美国专利第6,596,490号)、肽核酸(PNA)点火探针(斯万维克(Svanvik)等人,《分析生物化学》(Anal Biochem)281:26-35(2001))、自组装纳米粒子探针、二茂铁改性探针(描述于例如美国专利第6,485,901号；马哈郎加(Mhlanga)等人,《方法》(Methods)25:463-471(2001)；惠特科姆(Whitcombe)等人,《自然·生物技术》17:804-807(1999)；伊萨克森(Isacsson)等人,《分子 细胞探针》(Molecular Cell Probes).14:321-328(2000)；斯万维克(Svanvik)等人,《分析 生物化学》(Anal Biochem).281:26-35(2000)；沃尔夫(Wolffs)等人,《生物技术》 (Biotechniques)766:769-771(2001)；特索卡斯(Tsourkas)等人,《核酸研究》(Nucleic Acids Research).30:4208-4215(2002)；里切利(Riccelli)等人,《核酸研究》30:4088-4093(2002)；张(Zhang)等人,《生物化学与生物物理学报》(Acta Biochimica et Biophysica Sinica)(上海(Shanghai)).34:329-332(2002)；麦克斯维尔(Maxwell)等人,《美国化学学会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)124:9606-9612(2002)；布劳德(Broude)等人,《生 物技术趋势》(Trends Biotechnol.)20:249-56(2002)；黄(Huang)等人,《毒物学化学研究》15:118-126(2002)；以及于(Yu)等人,《美国化学学会志》14:11155-11161(2001)；

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(弗伦奇(French)等人,《分子细胞探针》 (Mol.Cell.Probes)15:363-374(2001))、移位探针(李(Li)等人,《核酸研究》30:e5(2002))、《杂交探针》(HybProbes)(卡杜罗(Cardullo)等人,《美国国家科学院院刊》85:8790-8794(1988))、MGB Alert(www.nanogen.com)、Q-PNA(费安达卡(Fiandaca)等人,《基 因组研究》(Genome Res.)11:609-611(2001))、

(www.Promega.com)、LUX^TM引物(纳扎兰科(Nazarenko)等人,《核酸研究》30:e37(2002))、DzyNA引物(托德(Todd)等人,《临床 化学》46:625-630(2000))。可检测标记还可以包含淬灭可检测标记的荧光的不可检测的淬灭剂部分，包括例如黑洞淬灭剂(生物谷猎头)、Iowa

淬灭剂(IDT)、QSY淬灭剂(生命技术公司)以及二甲氨基偶氮苯甲酰(Dabsyl)和Dabcel磺酸酯/甲酸酯淬灭剂(爱博克)。可检测标记还可以包含两个探针，其中例如荧光团在一个探针上，并且淬灭剂在另一个探针上，其中两个探针在目标上杂交在一起淬灭信号，或其中在目标上杂交通过改变荧光改变了信号特征。示范性系统还可以包括FRET、水杨酸酯/DTPA配体系统(参看例如奥泽(Oser)等人《应用化学英语版》(Angew.Chem.Int.Engl.)29(10):1167(1990))、置换杂交、同源探针和/或在欧洲专利第EP 070685号和/或美国专利第6,238,927号中所述的分析。可检测标记还可以包含荧光素染料与SO₃而不是羧酸酯基团的磺酸酯衍生物、荧光素的亚磷酰胺形式、Cy5的亚磷酰胺形式(可购自例如通用电气医疗集团)。以上引用的所有参考文献都特此以其全文引用的方式并入本文中。

本文中所述的组合物和方法可以适用于检测和/或定量测试样品的各种目标核酸。目标核酸是设计分析系统来鉴别它或检测它存在(或不存在)于测试样品中和/或对它进行定量的任何核酸。所述核酸可以包括例如传染剂(例如病毒、细菌、寄生虫等)、疾病过程(例如癌症、糖尿病等)或用于测量免疫反应的那些核酸。示范性“测试样品”包括不同类型的样品，例如生物样品。示范性生物样品包括例如体液(例如血液、唾液、脊髓液)、组织样品、食物(例如肉)或饮料(例如牛奶)产品等。经表达核酸可以包括例如其表达(或缺乏其表达)与例如传染病(例如细菌、病毒、真菌、原虫感染)或癌症的医学病况相关的基因。本文中所述的方法还可以用于检测药物、食物或饮料产品中的污染物(例如细菌、病毒、真菌和/或原虫)。本文中所述的方法还可以用于在存在野生型等位基因的情况下检测稀有等位基因(例如在存在10⁶-10⁹个野生型等位基因情况下的一个突变体等位基因)。所述方法适用于例如检测微小残留病(例如在缓解期间的稀有残余癌细胞，尤其是p53基因或先前在肿瘤内鉴别到的其它肿瘤抑制因子基因的突变)，和/或测量突变负荷(例如正常组织(例如血液或尿液)中所存在的特异性体细胞突变的频率)。

可以使用检测荧光团的荧光变化的任何试剂或仪器来检测信号。举例来说，可以使用任何分光光度热循环仪执行检测。分光光度热循环仪的实例包括(但不限于)应用生物系统公司(Applied Biosystems；AB)

7000、AB 7300实时PCR系统、AB 7500实时PCR系统、AB

7900HT、拜耳雷德(Bio-Rad)ICycler IQ^TM、西菲义德(Cepheid)

II、科贝特研究(Corbett Research)Rotor-Gene 3000、爱达荷技术(IdahoTechnologies)R.A.P.I.D.^TM、MJ研究Chromo 4^TM、罗氏应用科学(Roche Applied Science)

罗氏应用科学

斯塔津(Stratagene)Mx3000P^TM以及斯塔津Mx4000^TM。应注意，正在快速开发新仪器并且任何类似仪器都可以用于所述方法。

根据本传授内容的另一具体实例，本文所披露的方法可用于鉴别疾病和/或判断患者对用特定药物、药剂或治疗方法治疗的反应的诊断和/或预后方法。可能与多态现象有关的示范性条件为癌症。因此，本传授内容提供一种诊断对癌症的敏感性、对癌症治疗的结果预后或基于样品中鉴别的基因型对癌症分阶段和/或鉴别的方法。

本传授内容的预后方法适用于判断患者是否处于复发风险中。癌症复发为多种癌症类型相关的关注点。举例来说，完全手术去除结肠癌的患者中，25-40％II期结肠癌患者和约50％III期结肠癌患者经历癌症复发。癌症复发的一种解释为相对早期疾病(例如II期或III期)患者已经有少量癌症扩散到未通过手术去除的受影响器官之外。这些癌细胞称为微小转移灶，通常不能用当前可用测试检测出来。

本文所披露的预后方法可用于鉴别可能经历癌症复发的以手术方式治疗的患者，使得可提供额外治疗选择，包括手术前或手术后辅助，例如化学疗法、放射、生物学调节剂和其它适合疗法。所述方法尤其有效测定在检验或手术时表明不可测量的癌转移的患者中的癌转移风险。

根据某些实施例的预后方法还适用于测定患有癌症的患者的适当疗程。疗程是指诊断或治疗癌症之后患者采取的治疗措施。举例来说，判断癌症复发、扩散或患者存活率的可能性的判断可帮助判断是否应采取更保守或更激进的治疗方法，或是否应组合治疗模态。举例来说，当可能癌症复发时，可为有利的是在手术治疗之前或之后使用化学疗法、放射、免疫疗法、生物学修饰的疗法、基因疗法、疫苗等，或调整治疗患者期间的时间跨度。

可以使用本文所揭示的方法评估的示范性癌症尤其包括(但不限于)造血系统赘瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、淋巴性赘瘤、多形性大细胞淋巴瘤、髓样赘瘤、组织细胞增多病、霍奇金病(Hodgkin Diseases，HD)、前体B淋巴细胞白血病/淋巴瘤(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、前体T淋巴细胞白血病/淋巴瘤(ALL)、骨髓发育不良综合症(Myelodysplasticsyndromes)、慢性骨髓增生性病症、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、淋巴浆细胞淋巴瘤、真性红细胞增多症、套细胞淋巴瘤、原发性血小板增多症、滤泡性淋巴瘤、髓样化生性骨髓纤维化、边缘区淋巴瘤、毛状细胞白血病、血管瘤、浆细胞瘤/浆细胞骨髓瘤、淋巴管瘤、血管球瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、卡波西肉瘤(KaposiSarcoma)、血管内皮瘤、伯基特淋巴瘤(Burkirt lymphoma)、血管肉瘤、T细胞慢性淋巴细胞性白血病、血管外皮瘤、大颗粒淋巴细胞白血病、头颈部癌、基底细胞癌、蕈样肉芽肿以及塞扎里综合征(sezary syndrome)、鳞状细胞癌、耵聍腺瘤、周边T细胞淋巴瘤、骨瘤、非嗜铬性副节瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、听神经瘤、腺样囊性癌、血管中心性淋巴瘤、粘液表皮样癌、NK/T细胞淋巴瘤、恶性混合肿瘤、肠道T细胞淋巴瘤、腺癌、恶性间皮瘤、纤维肉瘤、肉瘤型肺癌、骨肉瘤、上皮细胞型肺癌、软骨肉瘤、黑素瘤、胃肠道癌、嗅神经母细胞瘤、鳞状细胞癌、分隔浆细胞瘤、腺癌、内翻性乳头状瘤、良性肿瘤、未分化性癌、恶性黑素瘤、粘液表皮样癌、腺癌、腺泡细胞癌、胃癌、恶性混合肿瘤、胃淋巴瘤、胃基质细胞肿瘤、成釉细胞瘤、淋巴瘤、牙瘤、肠道基质细胞肿瘤、胸腺癌、恶性胸腺瘤、良性肿瘤(Carcinids)、I型(侵入性胸腺瘤)、恶性间皮瘤、II型(胸腺癌)、非粘蛋白产生腺癌、鳞状细胞癌、淋巴上皮瘤、肝脏和胆道癌、鳞状细胞癌、肝细胞癌、腺癌、胆管癌、肝母细胞瘤、乳头状癌、血管肉瘤、实体细支气管肺癌、纤维板层样癌、小细胞癌、胆囊癌、中间细胞癌、大细胞癌、鳞状细胞癌、未分化癌、胰腺癌、女性生殖道癌、鳞状细胞癌、囊腺癌、基底细胞癌、胰岛素瘤、黑素瘤、胃泌素瘤、纤维肉瘤、胰升血糖素瘤、上皮内癌、腺癌胚胎、肾癌、横纹肌肉瘤、肾细胞癌、大细胞癌、肾胚细胞瘤(威姆氏瘤(Wilm's tumor))、神经内分泌或燕麦细胞癌、下尿道癌、腺鳞癌、尿道上皮瘤、未分化性瘤、鳞状细胞癌、女性生殖道癌、混合癌、腺棘皮癌、肉瘤、小细胞癌、癌肉瘤、平滑肌肉瘤、子宫内膜间质肉瘤、男性生殖道癌、浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌、癌(Sarcinoma)、子宫内膜样肿瘤、精母细胞癌、胚胎癌、胶质母细胞瘤、绒膜癌、畸胎瘤、透明细胞癌、雷迪格细胞肿瘤(Leydig Cell Tumor)、未分类癌、塞特利氏细胞肿瘤(SertoliCell Tumor)、粒层-卵泡膜细胞瘤、塞特利氏-雷迪格细胞肿瘤(Sertoli-Leydig CellTumor)、无性细胞瘤、未分化前列腺癌、畸胎瘤、移行腺管癌、乳癌、叶状肿瘤、骨关节和软组织癌、佩吉特氏病(Paget's Disease)、多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma)、原位癌、恶性淋巴瘤、浸润性癌、软骨肉瘤、间叶细胞软骨肉瘤、内分泌系统癌、骨肉瘤、腺瘤、尤文氏瘤(Ewing Tumor)、内分泌癌、恶性巨细胞瘤、脑脊髓膜瘤、釉质瘤、颅咽管瘤、恶性纤维组织细胞瘤、乳头状癌、组织细胞瘤、滤泡癌、成纤维性纤维瘤、髓质癌、纤维肉瘤、退形成癌、脊索瘤、腺瘤、血管内皮瘤、血管周细胞瘤、嗜铬细胞瘤、脂肪肉瘤、神经母细胞瘤、副神经节瘤、组织细胞瘤、松果体癌、横纹肌肉瘤、成松果体细胞瘤、平滑肌肉瘤、成松果体细胞瘤、血管肉瘤、皮肤癌、神经系统癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、黑素瘤、神经鞘瘤、鳞状细胞癌、神经纤维瘤、基底细胞癌、恶性外周神经鞘膜瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、鞘瘤、乳房外佩吉特病(Extramamary Paget's Disease)、星形细胞瘤、乳头佩吉特病(Paget's Disease of the nipple)、纤维星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、毛细胞型星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、组织细胞增多病、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、神经节细胞瘤、大脑神经母细胞瘤、中枢神经细胞瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、神经管胚细胞瘤、恶性脑膜瘤、原发性脑淋巴瘤、原发性脑生殖细胞瘤、眼癌、鳞状细胞癌、粘液表皮样癌、黑素瘤、成视网膜细胞瘤、神经胶质瘤、脑膜瘤、心脏癌、粘液瘤、纤维瘤、脂肪瘤、乳头状纤维瘤、横纹肌瘤或血管肉瘤。

试剂盒：

还提供了用于执行本文中所述的方法的试剂盒。如本文中所用，术语“试剂盒”是指一组包装好的相关组分，通常是一种或多种化合物或组合物。所述试剂盒可以包含用于聚合和/或扩增来自样品的至少一个目标核酸的寡核苷酸对、一种或多种清洁剂、核酸聚合酶和/或对应的一个或多个用可检测标记进行标记的探针。所述试剂盒还可以包括含有用于对照反应中的预定义目标核酸的样品。所述试剂盒还可以任选地包括储备溶液、缓冲液、酶、可检测标记或检测所需试剂、可以用于完成扩增反应的管子、膜等。在一些实施例中，包括多个引物组。在一个实施例中，所述试剂盒可以包括以下各者中的一个或多个：例如缓冲液(例如Tris)、一种或多种盐(例如KCl)、甘油、dNTP(dA、dT、dG、dC、dU)、重组BSA(牛血清白蛋白)、染料(例如ROX^TM惰性参比染料)、一种或多种清洁剂、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和/或明胶(例如鱼或牛源)。所属领域的技术人员应理解，还涵盖具体系统和试剂盒的其它实施例。

在某些实施例中，提供可用于使用本文提供的寡核苷酸进行杂交、延长和扩增反应的试剂盒。优选试剂盒可包含一个或多个被配置成含有用于本文所述方法中的试剂的容器(例如小瓶、试管等)并且任选地可以含有使用所述试剂的说明书或方案。本文所述的试剂盒可包含选自由一种或多种本文所述的寡核苷酸组成的群组的一种或多种组分，包括(但不限于)一种或多种等位基因特异性引物、一种或多种基于通用FRET的报告体引物以及一种或多种基因座特异性引物；一种或多种核酸聚合酶，例如热稳定聚合酶；一种或多种逆转录酶，或任何其它DNA或RNA聚合酶。

在一些实施例中，试剂盒包括对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包括第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包含针对第一基于通用FRET的报告体引物(UFP)的结合位点，其中第一UFP包括第一荧光团和至少一个第一淬灭剂部分；以及对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包括第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包括针对第二UFP的结合位点，其中第二UFP包括第二荧光团和至少一个第二淬灭剂部分；以及其中第一和第二荧光团可相同或不同。在一些实施例中，第一UFP的第一荧光团和第二UFP的第二荧光团分别位于第一UFP和第二UFP的5'-端处，并且至少第一淬灭剂部分和至少第二淬灭剂部分分别位于第一UFP和第二UFP的内部核苷酸处。在一些实施例中，试剂盒可进一步包含基因座特异性引物。在某些实施例中，试剂盒可包括一种或多种焦磷酸解酶。在某些实施例中，试剂盒可包括一种或多种多磷酸解酶。在各种实施例中，试剂盒包括一种或多种多磷酸解剂。在各种实施例中，第一或第二等位基因特异性引物或基因座特异性引物中的至少一个的3'-端包括封端剂，其中封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在各种实施例中，第一或第二UFP中的至少一个的3'-端包括封端剂使得封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在某些实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在一些实施例中，第一和第二UFP为线性构形。在其它实施例中，第一和第二UFP为茎-环构形。在其它实施例中，第一UFP为茎-环构形并且第二UFP为线性构形。在某些实施例中，本文所述的试剂盒进一步包括基于通用FRET的检测器探针。在某些实施例中，本文所述的试剂盒进一步包括一种或多种缓冲剂或缓冲盐；一种或多种核苷酸；一种或多种双脱氧核苷酸(ddN)；一种或多种目标/模板分子(其还可以用于测定反应性能，即控制反应)；以及用于分析或进一步操作本文所述的方法产生的产物或中间体的其它试剂。此类额外组分可以包括用于克隆和/或定序的组分和用于检测或定量所关注的核酸分子所需的组分或设备。

在某些实施例中，提供用于分析、定量或检测目标核酸中的一个或多个等位基因或多态现象的试剂盒，其中试剂盒包括对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包括第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包括针对第一基于通用FRET的检测器探针的结合位点，其中第一基于通用FRET的检测器探针包括第一荧光团和至少一个第一淬灭剂部分；以及对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包括第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包括针对第二基于通用FRET的检测器探针的结合位点，其中第二基于通用FRET的检测器探针包括第二荧光团和至少一个第二淬灭剂部分；其中第一和第二荧光团不同并且至少第一淬灭剂部分和至少第二淬灭剂部分可相同或不同。在一些实施例中，第一荧光团和第二荧光团分别位于第一基于通用FRET的检测器探针和第二基于通用FRET的检测器探针的5'-端处。在一些实施例中，第一基于通用FRET的检测器探针的至少第一淬灭剂部分连接到3'末端或3'末端的10个核苷酸内的核苷酸处并且第二基于通用FRET的检测器探针的至少第二淬灭剂部分连接到3'末端或3'末端的10个核苷酸内的核苷酸处。在其它实施例中，试剂盒可包括基因座特异性引物，其中LSP可包括本文所述的特征的任何组合。试剂盒可包括一种或多种核酸聚合酶。在其它实施例中，试剂盒可包括焦磷酸解酶。在其它实施例中，试剂盒可包括焦磷酸解酶。在一些实施例中，第一等位基因特异性引物和/或第二等位基因特异性引物和/或基因座特异性引物包括包含封端剂的3'端，其中封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在一些实施例中，第一UFP和/或第二UFP的3'端包括封端剂使得封端的端被配置成通过焦磷酸解或多磷酸解活化。在各种实施例中，封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。在某些实施例中，第一和第二基于通用FRET的检测器探针为线性构形。在其它实施例中，第一和第二基于通用FRET的检测器探针为茎-环构形。在其它实施例中，第一基于通用FRET的检测器探针为茎-环构形并且第二基于通用FRET的检测器探针为线性构形。

在一些实施例中，试剂盒包括对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包括第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包含针对第一基于通用FRET的报告体引物(UFP)的结合位点，其中第一UFP包括第一荧光团；以及对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包括第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包括针对第二UFP的结合位点，其中第二UFP包括第二荧光团；以及其中第一和第二荧光团可相同或不同。在一些实施例中，第一UFP的第一荧光团和第二UFP的第二荧光团分别位于第一UFP和第二UFP的5'-端处。在各种实施例中，试剂盒包括基因座特异性引物。在某些实施例中，试剂盒包括双股插层型染料。在一些实施例中，第一和第二UFP为线性构形。在其它实施例中，第一和第二UFP为茎-环构形。在其它实施例中，第一UFP为茎-环构形并且第二UFP为线性构形。

在某些实施例中，本文所述的任何试剂盒进一步包含一种或多种缓冲剂或缓冲盐；一种或多种核苷酸；一种或多种双脱氧核苷酸(ddN)；一种或多种目标/模板分子(其还可以用于测定反应性能，即控制反应)；以及用于分析或进一步操作本文所述的方法产生的产物或中间体的其它试剂。此类额外组分可以包括用于克隆和/或定序的组分和用于检测或定量所关注的核酸分子所需的组分或设备。

在某些实施例中，进一步提供试剂盒用于合成核酸分子，所述试剂盒包含一种或多种本文所披露的寡核苷酸，包括一种或多种基于通用FRET的报告体引物和/或一种或多种等位基因特异性引物。在某些实施例中，提供试剂盒用于扩增核酸分子，所述试剂盒包含一种或多种本文所披露的寡核苷酸，包括一种或多种基于通用FRET的报告体引物和/或一种或多种等位基因特异性引物。在某些实施例中，提供试剂盒用于检测或测量包含所述试剂盒的核酸合成或扩增产物，所述试剂盒包含一种或多种本文所披露的寡核苷酸，包括一种或多种基于通用FRET的报告体引物和/或一种或多种等位基因特异性引物。

虽然已在这些示范性实施例方面描述本传授内容，但熟练技术人员将容易理解在不过度实验情况下这些示范性实施例的大量变化和修改是可能的。所有此类变化和修改都在本传授内容的范围内。可以根据以下实例来进一步理解本传授内容的方面，所述实例不应该理解为以任何方式限制本传授内容的范围。

实例

实例1：基于引物的等位基因辨别(参看图3)

通过测量等位基因1和等位基因2的命中目标序列和脱靶序列的Ct值来评估基于引物的等位基因辨别。等位基因1-特异性引物(ASP1)和等位基因2-特异性引物(ASP2)使用置于ASP的3'-端处的SNP设计。基因座特异性引物(LSP)用作与ASP1和ASP2一起起作用的保留引物。等位基因特异性质粒用作PCR反应的模板并且

探针用于信号检测。各反应中ASP1和ASP2的引物浓度为300nM并且LSP为900nM。使用标准

PCR条件持续45个周期并且在58℃-65.5℃范围内测试不同退火温度。

实例2：UFP分析(参看图4A-图4B和图5A-图5B)

用于本实例的UFP含有在其5'-端的荧光团(FAM^TM或

)以及通过氨基连接基团连接到所选核苷酸(dT或dC)的内部淬灭剂部分

向等位基因特异性引物的5'-端添加与基于通用FRET的报告体引物(UFP)相同的等位基因特异性引物尾序列。设计不同型式的UFP并且研究UFP的5'-端处的荧光团与其内部淬灭剂之间的距离对信号和背景的影响。3型和4型的构成UFP的序列长度与等位基因特异性引物尾的序列的长度的差异。4型的序列比3型的序列长并且为杂交UFP/等位基因特异性引物尾对提供较高Tm。如图4A中可以看出，荧光团与淬灭剂之间的距离增加，信号强度也提高；然而，如图4B所示，背景噪声也提高。

设计不同型式的线性(L)和茎-环(SL)UFP并且比较其信号和背景(参看图5A)。此处显示三种不同茎-环型式SL1、SL2和SL3。研究UFP的5'-端处的荧光团与其内部淬灭剂之间的距离。为了使信噪比(S/N)最大化，研究UFP的茎-环结构中的茎长度(参看图5B)。举例来说，SL1_5为具有5bp茎长度的1型茎-环设计。另外，SL1-dq1和SL1-dq2表示具有双重淬灭剂标记的1型茎-环设计，两种淬灭剂部分使用不同连接点。ASP1的UFP标记有FAM^TM并且ASP2的UFP标记有

比较等位基因1(FAM^TM)和等位基因2

的命中目标信号和脱靶信号。选择其两对(SL1_6和SL2_7)作为候选物，因为其产生甚至更低的背景，因此双螺旋体背景中的S/N较高并且FAM^TM和

信号更平衡，其中命中目标(WT)和脱靶(MT)模板上的ASP1和ASP2以及其两个都在同一井中操作。

实例3：分析法设计(参看图6A-图6H)

使用一组92gDNA(3ng/井)测试基于UFP化学方法的基因分型分析法，各UFP使用25nM并且各ASP使用300nM，各反应中的LSP使用900nM。ASP1的UFP标记有FAM^TM并且ASP2的UFP标记有

循环条件是：[95℃，10min]、[(92℃，15sec)(58℃，1min)]×5次循环、[(92℃，15sec)(60℃，1min)]×45次循环。图6A-图6H中所示的等位基因辨别曲线显示同型接合等位基因l(曲线的右下角)；同型接合等位基因2(曲线的左上角)；异型接合(每个同型接合信号的中间或对角)；以及无模板对照(NTC)(在曲线的近左下角显示为X)的分布。这一分布由等位基因1和2的不同标记产生，并且结果混合异型接合产生的信号。不能区别为具有这些三种条件中的一个的任何样品井都标示为“x”。随着分析法设计参数改善，分析法性能也改善。这在图6A-图6H的每一个的比较中有所证实。评估四种不同SNP的结果，包括hCV1117072(图6A和图6B)；hCV2017662(图6C和图6D)；hCV1115414(图6E和图6F)；以及hCV25473309(图6G和图6H)。在图6A、图6C、图6E以及图6G的每一个中，使用ASP的设计1。在图6B、图6D、图6F和图6H的每一个中，使用ASP的设计2。等位基因辨别图显示设计2提供好得多的等位基因辨别，因为图6B相较于图6A；图6D相较于图6C；图6F相较于图6E；以及图6H相较于图6G存在低得多的不必要样品井数目以及更紧密的观测信号群集。

实例4：使用

基因分型分析法比较(参看图7A-图7H)

通过使用基于UFP的基因分型分析法和

分析法比较等位基因辨别的性能。基于产生三种不同集群的

分析法选择目标，并且包括hCV1113699、hCV2623923、hCV1117072以及hCV1150692。如上文所述使用ASP、UFP以及LSP进行基于UFP的基因分型分析法。在制造商推荐的条件[(92℃，15sec)(60℃，1min)]下进行

基因分型分析法，但进行40次循环。图7A示出了使用基于UFP的基因分型分析法的hCV1113699SNP分析法的等位基因辨别曲线并且图7B示出了

分析法的等位基因辨别曲线。图7C示出了使用基于UFP的基因分型分析法的hCV2623923SNP分析法的等位基因辨别曲线并且图7D示出了

分析法的等位基因辨别曲线。图7E示出了使用基于UFP的基因分型分析法的hCV1117072SNP分析法的等位基因辨别曲线并且图7F示出了

分析法的等位基因辨别曲线。最终，图7G示出了使用基于UFP的基因分型分析法的hCV1150692SNP分析法的等位基因辨别曲线并且图7H示出了hCV1150692

SNP分析法的等位基因辨别曲线。尽管基于UFP的基因分型分析法的整体信号略弱，但NTC和背景信号还是较低，因此S/N比不再较低。集群分离类似或产生略好的角，因此表明基于UFP的基因分型分析法可提供与可商购

技术一样的灵敏和精确结果。集群紧密性和展示可以通过进一步分析法设计和分析法化学性质最佳化来改善，以提供甚至更好的有差别动力。

Claims (23)

1.一种非疾病诊断或治疗目的的用于测定目标核酸分子的基因型的方法，所述方法包含：

(a)提供混合物，所述混合物包含：

一个或多个目标核酸分子；

对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包含第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包含针对第一基于通用FRET的报告体引物(UFP)的结合位点，其中所述第一UFP包含第一荧光团和至少一个第一淬灭剂部分；

对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包含第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包含针对第二UFP的结合位点，其中所述第二UFP包含第二荧光团和至少一个第二淬灭剂部分；其中所述第一和第二荧光团不同并且所述第一淬灭剂部分和所述第二淬灭剂部分相同或不同，其中所述第一UFP为线性构形或所述第一和第二UFP为线性构形；和

基因座特异性引物，其中所述基因座特异性引物的浓度高于所述第一和/或第二等位基因特异性引物的浓度；

(b)扩增所述目标核酸；

(c)测量所述第一和第二荧光团的强度；以及

(d)基于所述第一和第二荧光团的所述强度分析核酸基因型。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一荧光团和所述第二荧光团分别位于所述第一和第二UFP的5'-端处，并且所述第一淬灭剂部分和所述第二淬灭剂部分各自分别位于所述第一UFP和所述第二UFP的内部核苷酸处。

3.根据权利要求1到2中任一项所述的方法，其中所述第一或第二等位基因特异性引物或基因座特异性引物中的至少一个的3'-端包含封端剂使得所述封端的端被配置成通过焦磷酸解活化。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。

5.根据权利要求1到2中任一项所述的方法，其中所述等位基因特异性引物或基因座特异性引物中的至少一个的3'端包含封端剂使得所述封端的端被配置成通过多磷酸解活化。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。

7.根据权利要求1到2中任一项所述的方法，其中所述基因座特异性引物的浓度大于所述第一和第二等位基因特异性引物的浓度。

8.根据权利要求1到2中任一项所述的方法，其中所述第一UFP置换成第一基于通用FRET的检测器探针，其中所述第一基于通用FRET的检测器探针包含至少一个第一淬灭剂部分和第一荧光团；以及所述第二UFP置换成第二基于通用FRET的检测器探针，其中所述第二基于通用FRET的检测器探针包含至少一个第二淬灭剂部分和第二荧光团；其中所述第一和第二荧光团不同，并且所述第一淬灭剂部分和所述第二淬灭剂部分相同或不同。

9.一种非疾病诊断或治疗目的的用于测定目标核酸分子的基因型的方法，所述方法包含：

(a)提供混合物，所述混合物包含：

一个或多个目标核酸分子；

对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包含第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包含针对第一UFP的结合位点，其中所述第一UFP包含第一荧光团；

对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包含第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包含针对第二UFP的结合位点，其中所述第二UFP包含第二荧光团；其中所述第一和第二荧光团不同并且不通过激发光直接激发，其中所述第一UFP为线性构形或所述第一和第二UFP为线性构形；

基因座特异性引物，其中所述基因座特异性引物的浓度高于所述第一和/或第二等位基因特异性引物的浓度；和

双股核酸插层型染料；其中所述双股核酸插层型染料配置成通过所述激发光直接激发并且其荧光激发所述第一和第二荧光团；

(b)扩增所述目标核酸；

(c)测量所述第一和第二荧光团的强度；以及

(d)基于所述第一和第二荧光团的所述强度分析核酸基因型。

10.根据权利要求9所述的方法，所述第一荧光团和所述第二荧光团分别位于所述第一UFP和所述第二UFP的5'-端处。

11.根据权利要求9到10中任一项所述的方法，其中所述等位基因特异性引物或基因座特异性引物中的至少一个的3'-端包含封端剂使得所述封端的端被配置成通过焦磷酸解活化。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。

13.根据权利要求9到10中任一项所述的方法，其中所述等位基因特异性引物或基因座特异性引物中的至少一个的3'端包含封端剂使得所述封端的端被配置成通过多磷酸解活化。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述封端剂为双脱氧核苷酸(ddN)。

15.一种用于分析、定量或检测目标核酸中的一个或多个等位基因或多态现象的反应混合物，其中所述反应混合物包含

对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包含第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包含针对第一基于通用FRET的报告体引物(UFP)的结合位点，其中所述第一UFP包含第一荧光团和至少一个第一淬灭剂部分；

对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包含第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包含针对第二UFP的结合位点，其中所述第二UFP包含第二荧光团和至少一个第二淬灭剂部分；其中所述第一荧光团和所述第二荧光团不同并且所述第一淬灭剂部分和所述第二淬灭剂部分相同或不同，其中所述第一UFP为线性构形或所述第一和第二UFP为线性构形；和

基因座特异性引物，其中所述基因座特异性引物的浓度高于所述第一和/或第二等位基因特异性引物的浓度。

16.根据权利要求15所述的反应混合物，其中所述第一荧光团和所述第二荧光团分别位于所述第一UFP和所述第二UFP的5'-端处，并且所述第一淬灭剂部分和所述第二淬灭剂部分分别位于所述第一UFP和所述第二UFP的内部核苷酸处。

17.根据权利要求15到16中任一项所述的反应混合物，其进一步包含一种或多种核酸聚合酶。

18.根据权利要求15到16中任一项所述的反应混合物，其进一步包含多磷酸解酶。

19.根据权利要求18所述的反应混合物，其进一步包含一种或多种多磷酸解剂。

20.一种用于权利要求1或9所述方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含

对第一等位基因具有特异性的第一等位基因特异性引物，其包含第一5'-通用尾，所述第一5'-通用尾包含针对第一基于通用FRET的报告体引物(UFP)的结合位点，其中所述第一UFP包含第一荧光团和至少一个第一淬灭剂部分；

对第二等位基因具有特异性的第二等位基因特异性引物，其包含第二5'-通用尾，所述第二5'-通用尾包含针对第二UFP的结合位点，其中所述第二UFP包含第二荧光团和至少一个第二淬灭剂部分；其中所述第一和第二荧光团不同并且所述第一淬灭剂部分和所述第二淬灭剂部分相同或不同，其中所述第一UFP为线性构形或所述第一和第二UFP为线性构形；和

基因座特异性引物，其中在使用时，所述基因座特异性引物的浓度高于所述第一和/或第二等位基因特异性引物的浓度。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述第一荧光团和所述第二荧光团分别位于所述第一UFP和所述第二UFP的5'-端处，并且所述第一淬灭剂部分和所述第二淬灭剂部分分别位于所述第一UFP和所述第二UFP的内部核苷酸处。

22.根据权利要求20所述的试剂盒，其进一步包含一种或多种核酸聚合酶。

23.根据权利要求20所述的试剂盒，其进一步包含一种或多种多磷酸解剂。

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