KR100230718B1 - 등온 가닥 변위 핵산 증폭법 - Google Patents

등온 가닥 변위 핵산 증폭법 Download PDF

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다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프
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Abstract

5'엑소뉴클레아제 활성이 결여된 핵산 폴리머라제 및 한조의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 표적 핵산 서열을 증폭시키는 방법. 바람직하게는 프라이머 어레이가 사용된다. 프라이머 어레이는 2개 조의 프라이머를 함유한다. 한조는 2개 이상의 상보성 프라이머를 함유한다. 다른 한조는 2개 이상의 센스 프라이머를 함유한다. 기재된 방법을 사용하여, 엑소뉴클레아제 활성 또는 제한 엔도뉴클레아제 활성없이도 필수적으로 일정 환경 조건하에서 증폭시킬 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
등온 가닥 변위 핵산 증폭법
[도면의 간단한 설명]
도면은 서로 상대적인 프라이머 및 표적 서열의 위치를 설명한 일례이다. 도면은 4개의 상보성 프라이머 ("-"), 4개의 센스 프라이머 ("+"), 및 표적 서열의 우치 (직사각형 박스)를 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
(발명의 분야)
본 발명은 열 순환 공정을 거치지 않고 핵산 서열을 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
(발명의 배경)
본 발명은 진단 과정 및 핵산 서열을 증폭시키는 기술에 관한 것이다. 특이 핵산 서열 (예를 들면, 표적 서열)의 검색 및 정량화는 미생물을 동정 및 분류하고, 감염성 질환을 진단하고, 유전자 이상을 검색 및 특성화시키고, 암 관련 유전자의 변화를 규명하고, 질병에 대한 유전자의 감수성을 연구하고, 각종 치료 유형에 대한 반응을 측정하고, 범죄 용의자를 확인하고 부계 논쟁을 해결하는 방법을 포함하여 수많은 분야에서 응용되고 있는, 그 중요성이 점점 증가되고 있는 기술이다.
표적 핵산 서열을 검색하고 정량화하는 일반적인 방법은 핵산 혼성화 방법이다. 이 방법은 보통 표적 서열에 상보성인 핵산 서열을 갖는 표지화 핵산 프로브를 사용한다. 프로브를 혼성체 형성에 적합한 조건하에 표적 서열을 함유할 것으로 기대되는 시료와 혼합한다. 그 다음, 프로브를 시료에 존재하는 표적 서열에 혼성화한다. 혼성화는 당업계의 숙련자에게 공지된 각종 기술에 의해 검색될 수 있다. 상기 기술에는 비혼성화 프로브에 존재하는 표지를 선택적으로 분해시킨 다음, 잔존 혼성화 프로브와 관련된 표지의 양을 측정하는 방법이 포함된다 [아놀드(Arnold) 등의 PCT US88/02746 참조].
핵산 가닥 (이를 테면, 핵산 중합체)을 증폭시켜 표적 서열의 양을 증가시키는 수많은 방법이 활용되고 있다. 상기 방법은 표적 서열을 함유하는 상보성 핵산 가닥을 형성하기 위한 주형으로서 표적 서열을 함유하는 핵산 가닥을 사용한다. 상기 방법으로는 폴리머라제 연쇄 반응법 (PCR)을 들 수 있으며, 이 방법은 물리스(Mullis) 등의 미국 특허 제4,683,195호, 동 제4,683,202호 및 동 제4,800,159호 및 유럽 특허 출원 제86302298.4호, 동 제86302299.2호 및 동 제87300203.4호, 및 문헌 [Methods in Enzymology, Volume 155, 1987, pp. 335-350]에 기재되어 있다. PCR은 표적 서열을 함유하는 이중 가닥 DNA의 2개의 상보성 가닥을 위한 프라이머로서 특이 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하는 것과 연관이 있다. 프라이머를 선택하여 상보성 표적 가닥 각각의 말단, 즉 표적 서열의 3'에서 혼성화한다. 그 다음, 각 가닥에 대한 주형 의존성 DNA 합성을 적절한 시약의 존재하에 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용하여 접촉 반응시킬 수 있다. 열 순환 공정은 합성 전에 특이 혼성체를 형성한 다음 합성에 의해 형성된 이중 가닥 핵산을 변성시키는데 필요하다. 순환 공정을 반복하면 표적 서열이 기하급수적으로 증폭된다. 또한, PCR법은 DNA 주형을 형성하기 위해 RNA 의존성 DNA 폴리머라제를 사용하는 RNA 표적과 함께 사용할 수 있다.
PCR 법은 PCR 반응에서 사용되는 프라이머 중 하나에 프로모터 서열을 함입시킨 다음, PCR 법에 의해 증폭시킨 후 단일 가닥 RNA의 전사를 위한 주형으로서 이중 가닥 DNA를 사용하여 RNA 전사 과정에 커플링시키는 것이다 [무라까와 (Murakawa) 등의 DNA 7 : 287-295 (1988) 참조]. 다른 증폭 방법은 DNA 또는 RNA 표적을 증폭시키기 위해 RNA 지향 DNA 합성 과정 및 전사 과정을 다수회 반복시키는 공정을 사용한다 [버그 (Burg) 등의 WO 89/1050 ; 긴저라스 (Gingeras) 등의 WO 88/10315 (종종, 전사 증폭계 또는 TAS라 칭함) ; 케시앙 (Kacian) 및 훌쯔 (Fultz)의 EPO 출원 제89313154호 ; 데이비 (Davey) 및 말렉 (Malek)의 EPO 출원 제8811348.9호 ; 및 말렉 등의 WO 91/02818 참조]. 우데아 (Urdea)의 WO 91/10746에서는 T7 프로모터 서열을 사용하여 시그날 증폭을 얻는 방법에 대해 기술하고 있다.
리가아제 연쇄 반응 (LCR)은 유럽 특허 공보 제320,308호에 기재되어 있다. 이 방법은 4개 이상의 별개의 올리고뉴클레오티드를 필요로 하는데, 그 중 2개는 동일한 핵산 주형에 대해 혼성화되어, 그 개개의 3' 및 5' 말단이 라이게이션 (ligation)을 위해 근접 위치하도록 한다. 그 다음, 혼성화 올리고뉴클레오티드는 라이게이션되어 핵산 주형 상에 상보성 가닥을 형성한다. 이후, 이중 가닥 핵산은 변성되며, 제3 및 제4 올리고뉴클레오티드는 함께 결합된 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드에 의해 혼성화된다. 그 다음, 제3 및 제4 올리고뉴클레오티드는 함께 라이게이션된다. 증폭법은 추가의 혼성화, 라이게이션 및 변성의 순환 공정에 의해 이루어진다.
PCT 공보 제87-06270호 및 미국 특허 제4,786,600호에 기재된 Qβ 레플리카아제 (QβR) 법은 레플리카아제 효소에 의해 특이적으로 전사될 수 있는 특이 RNA 프로브를 사용하고 있다. 상기 방법은 레플리카아제 개시 부위를 갖는 RNA 프로브를 디자인하고 합성하는 단계를 필요로 한다.
회문구조 (palindromic) 프로브를 사용하는 증폭법은 유럽 특허 공개 공보 제0427073A호 및 제0427074A호에 기재되어 있다. 회문구조 프로브는 핵산 표적 서열과 함께 헤어핀 (hairpin)을 형성한다. 이 프로브는 RNA 전사체를 형성하는 헤어핀 영역에 위치하고 있는 기능성 프로모터를 함유하고 있다.
월커 (Walker) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:392-396 (Jan. 1992) 및 Nuc1. Acids Res. 20 : 1691-1696 (1992)]. 유럽 특허 공개 제0 497 272 A1호, 및 동 제0 500 224 A2호에서는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하는 올리고뉴클레오티드 유도 증폭법에 대해 기재하고 있다. 제한 엔도뉴클레아제는 DNA/DNA 착체를 니크 (nick)시켜 신장 (extention) 반응이 가능하도록 하고 따라서 이를 증폭시킬 수 있다.
벡커 (Becker) 등의 EPO 출원 제88306717.5호에서는 프라이머를 핵산 서열에 혼성화하고 생성된 이중체를 신장 반응 및 증폭 전에 절단시키는 증폭 방법에 대해 기재하고 있다.
케이. 이. 누난 (K.E. Noonan) 등의 문헌 [Nucl. Acids Res. 16. 10366 (1988)]에서는 랜덤 헥사머 (random hexamer)를 사용하여 역전사효소를 통하여 mRNA로부터 cDNA를 무작위 비특이 방식으로 합성하는 방법을 기술하고 있다. 목적하는 표적의 증폭은 PCR에 의해 달성된다.
에이. 피. 페인버그 (A.P. Feinberg)의 문헌 [Anal. Biochem. 132, 6 (1983)] 및 더블류, 리앙 (W. Liang) 등의 문헌 [Nucl. Acids Res. 16. 3579 (1988)]에서는 단일 가닥 DNA를 랜덤한 헥사뉴클레오티드 프라이머, 데옥시뉴클레오시드 삼인산염, 완충제, (E. coli) DNA 폴리머라제 Ⅰ의 클레나우 (Klenow) 프레그먼트, 및 표지화 데옥시뉴클레오시드 삼인산염을 결합시켜 DNA 주형에 상보성인 DNA 가닥을 합성하는 방법에 대해 기재하고 있다.
핵산을 증폭시키기 위한 랜덤 프라이밍 증폭법 (Random Priming Amplification : RPA)으로서 알려진 관련된 방법이 하틀리 (Hartley)의 미국 특허 제5,043,272호에 기재되어 있다. 상기 하틀리의 문헌, 컬럼 2 내지 3, 63-2행에서는 "본 방법은 과량의 랜덤한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 단일 가닥 주형 핵산 가닥을 프라이밍시키는 단계 및 단일 가닥 주형 핵산 가닥 및 과량의 랜덤한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 과량의 유도제 (inducing agent), 가닥 변위제 (strand-displacement agent), 및 뉴클레오시드 삼인산염 기질의 존재 하에 인큐베이션시키는 단계에 의해 핵산 가닥을 랜덤하게 증폭시키는 방법으로 이루어져 있다."라고 기술하고 있다.
(발명의 요약)
본 발명은 5'-엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 핵산 폴리머라제 및 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 표적 핵산 서열을 증폭시키는 방법을 그 특징으로 하고 있다. 별법으로, 본 발명의 방법은, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 프라이머의 핵산 분해를 방지 또는 감소시키는 5' 변형을 갖는 경우, 5'-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 폴리머라제를 사용하여 행할 수 있다. 바람직하게는, 증폭법은 2개 조의 프라이머를 포함하는 프라이머 어레이를 사용하여 행한다. 그 중 한조는 표적 핵산에 상보성인 2개 이상의 프라이머를 함유한다. 다른 한조는 표적 핵산과 동일한 의미를 갖는 2개 이상의 프라이머를 함유한다. 전술한 방법을 사용하면 증폭은 엑소뉴클레아제 활성 및 제한 엔도뉴클레아제의 필요성 없이도 필수적인 일정 환경 조건 하에 수행할 수 있다. 바람직하게는, 증폭은 DNA 주형, 및 5'-엑소뉴클레아제 활성이 결여된 변형된 바실루스 스테아로테르모필루스 (Bacillus stearothermophilus : Bst) DNA 폴리머라제 등의 DNA 폴리머라제를 사용하여 행한다.
프라이머 각조의 올리고뉴클레오티드 맴버는 상보성 핵산 가닥의 주형 의존 합성을 위한 그리고 합성된 상보성 가닥의 변위를 향상시키기 위한 개시점으로서 사용된다. 그러므로, 가닥 변위 및 핵산 합성은 일단계로 수행된다. 이러한 사실은 놀라운 발견이나, 본 출원인은 공정이 수행되는 정확한 메카니즘에 대해서는 명확히 이해하기가 어렵다.
다만, 한조의 프라이머만이 가닥 변화 및 핵산 합성을 행하기 위해 필요한 것으로 믿어진다. 프라이머 어레이는 바람직하게는 초기 주형 및 그의 상보물을 증폭시켜 표적 서열을 지수적으로 증폭시키기 위해 사용된다.
바람직하게는, 핵산 폴리머라제는 5'-엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있으며, 공정은 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 Ⅰ의 클레나우 프레그먼트 등의 효소가 최적 활성이 되는 온도보다 더 높은 온도에서 수행된다. 반응은 37℃에서 보다는 43℃에서 보다 효율적이다. 최적 효율은 50℃ 내지 70℃ 사이의 온도에서 얻어진다.
그 방법은 바람직하게는 DNA 상에서 사용된다. RNA 표적 서열은 예를 들면 역전사효소를 사용하여 DNA 복제물을 먼저 형성시킴으로써 증폭시키는 것이 바람직하다. 그 다음, DNA 복제물은 본원에 기재된 방법에 의해 증폭시킨다.
그런데, 본 발명은 RNA 주형 상에 RNA 상보성 가닥을 합성할 수 있는 효소를 사용하여 RNA 서열을 직접 증폭시킬 수 있어야 한다. 그러한 효소는 5'-엑소뉴클레아제 활성이 결여된 것이 바람직하다. 예를 들면, 망간과 함께 사용되는 QB 레플리카아제는 상기 목적에 적합하여야 한다.
그러므로, 본 발명의 제1면에서, 본 발명의 특징은 표적 서열을 함유하는 핵산 가닥을 5'-엑소뉴클레아제 활성이 결여된 핵산 폴리머라제 (5'-엑소-마이너스폴리머라제), 4개의 상이한 뉴클레오티드, 및 2개 이상의 상보성 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시켜 표적 핵산 서열을 증폭시키는 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 4개의 상이한 데옥시뉴클레오티드 및(또는) 보다 많은 수의 프라이머 중 3개의 프라이머가 사용된다. 증폭법은 필수적으로 일정한 온도에서 프라이머 신장 조건 하에 수행한다.
상기 본 발명의 제1면과 관련된 여러가지 측면에서, 증폭법은 5'-엑소뉴클레아제 활성이 억제되는 조건하에 5'-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 폴리머라제를 사용하여 행하고, 또한 증폭법은 상기 접촉 단계의 임의의 신장 반응의 생성물에 활성을 갖는 제한 엔도뉴클레아제의 부재 하에 2개 이상의 상보성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 행한다.
본 발명의 관련된 다른 일면에서, 본 발명의 특징은 표적 서열을 함유하는 핵산 가닥을 5'-엑소뉴클레아제 활성이 결여된 핵산 폴리머라제 (5'-엑소-마이너스폴리머라제), 4개의 상이한 뉴클레오티드, 및 2개 이상의 상보성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 2개 이상의 센서 프라이머와 접촉시켜 표적 핵산 서열을 증폭시키는 방법을 제공하는 것이다. 필수적으로 일정한 온도에서 프라이머 신장 조건하에 증폭시킨다. 바람직하게는, 상보성 프라이머와 센서 프라이머의 총수는 5를 초과한다.
증폭시키기 전에 존재하는 핵산 가닥은 표적 서열을 함유하는 상보성 가닥을 합성하기 위한 초기 핵산 주형으로서 작용한다. 상보성 가닥은 초기 핵산 주형과 유사성인 가닥을 형성하기 위한 핵산 주형으로서 작용할 수 있다. 유사성 가닥은 핵산 주형으로서 작용할 수 있다. 그러므로, 형성되는 표적 서열의 증폭은 기하급수적이다.
프라이머 신장 조건은 올리고뉴클레오티드 프라이머에서 개시되는 주형 의존 증폭이 발생할 수 있는 조건을 의미한다. 그러한 조건은 적절한 완충제, 및 임의로는 폴리머라제를 안정화시킬 수 있거나 또는 프라이머 신장 반응을 향상시킬 수 있는 다른 약품이 제공된 조건을 포함한다.
"주형"은 상보성 핵산 가닥의 합성을 위한 기질로서 작용할 수 있는 DNA 또는 RNA 등의 핵산 가닥을 의미한다.
"표적 서열"은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 분자의 단일 가닥에 함유되어 있는 특이 핵산 서열, 또는 이에 상보성인 핵산 서열을 의미한다.
"상보성 프라이머"란 핵산 주형에 존재하는 핵산 서열에 상보성인 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 나타낸다. 상보성 프라이머는 표적 서열의 3' 영역에서 핵산 주형 상 핵산 서열에 상보성이 되도록 디자인된다.
"상보성"이란 올리고뉴클레오티드 프라이머가 프라이머 신장 반응시에 신장될 수 있도록 접촉 단계 조건하에 핵산 주형의 영역에 혼성화할 수 있는 것을 의미한다. 일반적으로, 상기 올리고뉴클레오티드는 15 내지 100개의 염기, 바람직하게는 약 20 내지 50개의 염기의 주형에 상보성인 영역을 갖는다. 바람직하게는, 상보성 영역은 100% 상보성이다. 즉, 프라이머 상보성 영역에서의 각각의 뉴클레오티드는 단일 가닥 주형에 존재하는 뉴클레오티드와 수소 결합할 수 있다.
그런데, 당업계의 숙련자들은 주형에 대해 100% 미만의 상보성 영역을 갖는 프라이머를 이 방법에서 조작시킬 수 있다는 사실을 주지할 것이다. 일반적으로, 그러한 상보성은 18개의 인접 염기 중 15개와 같이 적을 수도 있다.
"센스 프라이머"는 핵산 주형에 존재하는 핵산 서열과 유사성인 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 센스 프라이머는 표적 서열의 주형 5' 상의 영역과 유사성이 되도록 디자인된다.
"유사성"이란 올리고뉴클레오티드가 핵산 주형의 서열과 필수적으로 동일하거나 또는 등가의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 나타낸다. 그러므로, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드는 핵산 주형에 존재하는 티민 대신에 우라실을 함유할 수 있다. 유사성 올리고뉴클레오티드는 이들이 프라이머 신장 조건하에 핵산 주형에 상보성인 핵산에 혼성화되는 경우 상보성 프라이머로서 작용할 수 있기에 충분한 주형의 복사체인 것이 바람직하다.
그러므로, 상보성 프라이머 및 센스 프라이머에 대해서는 특정의 주형과 관련하여 언급된다. 동일한 프라이머는 그 프라이머가 특정의 주형과 유사성인지 또는 그에 상보성인지에 따라서 상보성 프라이머 또는 센스 프라이머로서 작용할 수 있다.
핵산 주형에 존재하는 표적 서열의 프라이머 의존성 증폭은 접촉 단계에서 얻어진다. 증폭 정도는 프라이머의 수가 증가함에 따라 증가하는 것으로 밝혀졌다. 13개의 프라이머 (7개의 센스 및 6개의 상보성 프라이머)와 같은 다수의 프라이머 및 2개의 프라이머 (2개의 상보성 프라이머)와 같은 소수의 프라이머를 사용하는 예가 하기에 제공한다. 이 예는 증폭을 일으키기 위한 프라이머의 능력을 예시하고자 하는 것이지, 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다. 상보성 프라이머 조와 센스 프라이머 조는 각각 2개 보다 많은 프라이머를 함유하는 것이 바람직하다. 바랍직한 실시 태양에서, 4개 이상의 센스 프라이머와 4개 이상의 상보성 프라이머가 사용되고 ; 7개 이상의 센스 프라이머와 7개 이상의 상보성 프라이머가 사용되며 ; 10개 이상의 센스 프라이머와 10개 이상의 상보성 프라이머가 사용된다.
도면에 도시된 바와 같이, 한조의 상보성 프라이머는 표적 서열의 3' 영역에서 주형에 상보성인 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 한조의 센스 프라이머는 동일 가닥 상 표적 서열의 5' 영역에서 주형과 유사성인 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 올리고뉴클레오티드는, 프라이머 신장 반응이 다른 올리고뉴클레오티드 프라이머와 상이한 부위에서, 바람직하게는 다른 올리고뉴클레오티드 프라이머가 염기 쌍을 형성하는 영역과는 별개의 부위에서 핵산 주형 상에서 개시되도록 선정된다. 한조의 프라이머에서의 올리고뉴클레오티드는 그의 가장 가까운 5' 및 3' 말단에서 서로 1 내지 200개의 염기만큼 분리되는 것이 바람직하며, 1 내지 10개의 염기만큼 분리되는 것이 보다 바람직하다.
"4개의 상이한 뉴클레오티드"란 아데노신 (A), 구아노신 (G), 시티딘 (C), 티미딘 (T) 및 우리딘-(U) 삼인산염, 또는 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘 또는 우리딘 뉴클레오티드 삼인산염을 대체할 수 있는 등가의 뉴클레오티드가 핵산 합성을 위한 기질로서 존재하는 것을 나타낸다. 데옥시뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직하다.
"증폭시킴"이란 표적 서열의 수를 증가시킴을 의미한다.
"접촉시킴"이란 핵산 주형, 핵산 폴리머라제, 4개의 상이한 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 어레이가 프라이머 신장 조건하에 함께 접촉되는 것을 의미한다.
"필수적으로 일정한 온도"란 별도로 프라이머 신장 반응을 행하고 신장 생성물을 변성시키기 위해 폴리머라제 연쇄 반응에서 사용되는 바와 같은 임의의 심도 있는 방식으로 사용자가 온도를 상승시키거나 또는 저하시키려 하지 않는 것을 의미한다. 그러므로, 온도는 주형 : 프라이머 신장 생성물 이중체가 해리되는 온도미만에서 유지된다. 바람직하게는, 온도를 90℃미만에서 유지한다. 보다 바람직하게는, 반응 온도는 반응을 위한 최적 온도 정도에서 유지한다. 일반적으로, 그러한 최적 온도는 42 내지 60℃이며, 바람직하게는 50 내지 70℃이다.
바람직한 실시 태양에서, 조건에는 DMSO가 제공되며, 필수적으로 일정한 온도가 43℃ 이상, 가장 바람직하게는 50 내지 70℃이고 ; 조건에는 헬리카제 (helicase), 이. 콜라이의 RecA 단백질에 대응하는 활성을 갖는 단백질, 또는 단일 가닥 핵산 결합 단백질 등의 가닥 분리제 ; 하나 이상의 뉴클레오티드 삼인산염이 포함되며 ; DNA 폴리머라제는 5'-엑소-마이너스 Bst DNA 폴리머라제 Ⅰ 또는 변형된 Taq DNA 폴리머라제이며 ; 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5' 비상보성 영역을 함유한다. RecA 단백질은 본 발명에 있어서의 증폭에는 필요하지 않으나, 그러한 증폭을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
"5'-엑소뉴클레아제 마이너스"란 핵산 폴리머라제가 그와 연관된 5'-엑소뉴클레아제 활성을 필수적으로 갖지 않거나 또는 엑소뉴클레아제 활성이 감소 또는 불활성화되도록 처리된 것을 의미한다. 바람직한 핵산 폴리머라제는 5'-엑소뉴클레아제 마이너스 DNA 폴리머라제이다. 5'-엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라제의 예로는 바실루스 스테아로테르모필루스에서 유래한 DNA 폴리머라제 Ⅰ의 단백질 분해 프레그먼트, 및 하기 문헌에 기술된 바와 같이 5'-엑소뉴클레아제 활성을 암호화하는 도메인이 제거된 테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus)에서 유래한 DNA 폴리머라제가 있다 [Barnes, "Thermostable DNA Polymerase," PCT/US 91/07084]. 상기 언급한 월커에 의한 문헌에 기재된 클레나우 프레그먼트의 엑소뉴클레아제 마이너스 폴리머라제를 또한 사용할 수 있다.
관련 일면에서, 본 발명의 특징은 표적 서열을 함유하는 핵산을 활성 억제조건 하에서 5'-엑소뉴클레아제 활성을 가질 수 있는 핵산 폴리머라제와 접촉시키는 단계에 의해 핵산 표적 서열을 증폭시키는 방법 및 수단을 제공하는 것이다. 구체적으로, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 핵산 폴리머라제 중에 존재하는 임의의 5'-엑소뉴클레아제에 의한 핵산 분해에 대해 내성을 갖도록 변형된다. 바람직하게는, 하나 이상의 상보성 프라이머 및 하나 이상의 센스 프라이머는 5'-엑소뉴클레아제 활성에 내성을 갖도록 변형된다. 보다 바람직하게는, 모든 프라이머는 상기 분해에 대한 내성을 갖는다.
그러므로, 이 일면에서, 접촉 단계에서는 4개의 상이한 뉴클레오티드 삼인산염, 2개 이상의 상이한 상보성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 2개 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드 센스 프라이머를 함유하는 데, 그 중 하나 이상의 프라이머는 차단된다. 반응은 접촉 단계의 임의의 신장 반응의 생성물에 활성인 제한 엔도뉴클레아제의 부재하에서 필수적으로 일정한 온도에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 신장 조건하에 수행한다.
관련된 일면에서, 증폭은 프라이머 어레이 및 5'-엑소-마이너스 DNA 폴리머라제, 또는 5'-엑소뉴클레아제 내성 프라이머와 함께 사용되는 5'-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 행한다.
상기에서 주지한 바와 같이, 본 발명은 접촉 단계에서 생성되는 임의의 프라이머 신장 반응의 생성물에 활성인 제한 엔도뉴클레아제를 필요로 하지 않는다. 그러한 활성의 존재가 필수적인 것으로 간주된다는 상기 월커의 기술과는 반대로, 본 출원인은 놀랍게도 접촉 단계에서 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 사용될 수 있는 단일 가닥 영역을 형성하기 위해 어떠한 제한 효소도 필요로 하지 않는다는 사실을 발견하였다.
그러므로, 본 발명의 다른 일면에서, 본 발명의 특징은 표적 서열을 함유하는 핵산 가닥을 5'-엑소뉴클레아제 활성이 결여된 핵산 폴리머라제, 4개의 상이한 뉴클레오티드, 2개 이상의 상보성 올리고뉴클레오티드 프라이머 한조, 및 2개 이상의 센스 프라이머 한조와 접촉시켜 표적 핵산 서열을 증폭시키는 방법을 제공하는 것이다. 증폭은 임의의 신장 반응 생성물에 활성인 임의의 제한 엔도뉴클레아제의 부재하에 필수적으로 일정한 온도에서 프라이머 신장 조건하에 행한다. 바람직하게는, 전술한 바와 같이 증폭시킨다.
본 발명의 관련된 여러가지 측면에서, 증폭은 5'-엑소뉴클레아제 내성 프라이머와 함께 5'-엑소뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 폴리머라제 ; 또는 단일 가닥 DNA 기질 및 5'-엑소-마이너스 DNA 폴리머라제 또는 5'-엑소뉴클레아제 내성 프라이머와 함께 사용되는 5'-엑소뉴클레아제 활성을 함유하는 DNA 폴리머라제를 사용하는 임의의 신장 반응의 생성물에 활성인 임의의 제한 엔도뉴클레아제 없이 행한다. 그러한 증폭은 전술한 바와 같이 행하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 증폭은 표적 서열의 증폭 결과로서 누적되는 생성물에 따라 목적하는 시간 만큼 진행시킬 수 있다. 표적 서열이 분석 대상이 되는 경우, 본 발명의 방식으로 표적을 증폭시킨 다음 당업계의 공지 기술을 사용하여 누적된 증폭 생성물을 검색함으로써 표적 서열을 고감도로 검색할 수 있다.
본 발명의 증폭법은 다수의 상당한 잇점을 갖는다. 본 발명의 방법은 수개의 상이한 효소에 대비되는 바, 단지 하나의 핵산 폴리마라제를 필요로 하며, 특이 핵산 서열의 증폭이 보다 효과적이며 랜덤한 증폭법에 비해 시약의 필요성이 감소되며, 시간 소모가 없으며 번거로움 열 순환 공정을 행할 필요가 없다.
기타 본 발명의 특징 및 잇점은 하기 본 발명의 바람직한 실시 태양의 기재와 특허 청구의 범위로부터 명확할 것이다.
(바람직한 실시 태양의 기술)
본 발명은 핵산 폴리머라제 (예를 들면, DNA 폴리머라제) 및 올리고뉴클레오티드 프라이머, 바람직하게는 프라이머 어레이를 사용하여 특이적으로 프라이밍되는 주형 의존성 방식으로 핵산 서열을 합성하는 공정을 포함하는 방법에 의해 핵산 또는 핵산 혼합물에 존재하는 표시 핵산 서열을 증폭시키는 방법을 그 특징으로 한다. 프라이머 어레이는 한조의 상보성 프라이머와 한조의 센스 프라이머로 구성된다. 핵산 합성은 상보성 프라이머에서 개시된다. 특정 이론에 국한됨이 없이, 하나의 프라이머로부터 생기 프라이머 의존성 합성은 상이한 프라이머로부터 합성된 가닥의 가닥 변위를 유발시키는 것으로 여겨진다.
그러므로, 증폭을 행하고 증폭 동안 형성된 이중 가닥 핵산을 변성시키기 위하여 증폭 공정 동안의 온도, pH 또는 이온 농도 등의 반응 조건을 별도로 변형시키기 않고 증폭을 행할 수 있다. 또한, 증폭은 엑소뉴클레아제 활성 또는 제한 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 사용하여 단일 가닥 기질을 형성시키지 않고도 행할 수 있다.
그 방법은 증폭될 각각의 상이한 표적 서열을 위해 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 프라이머 어레이를 사용하여 주형 핵산 가닥을 프라이밍시키는 단계를 포함한다. 혼합물을 핵산 폴리머라제, 뉴클레오티드 기질 및 표적 핵산 서열을 증폭시키는데 필요한 임의의 필수 보조인자의 존재하에 인큐베이션시킨다.
본원에 기재된 방법의 결과로서, 주형 의존성 핵산 합성의 멀티플 라운드 (multiple round)가 사전에 합성된 가닥의 가닥 변위와 동시에 발생한다. 변위된 가닥은 이 상태에서 상보성 프라이머로서 작용하는 "센스 프라이머"와 함께 주형으로서 작용할 수 있다.
[올리고뉴클레오티드 프라이머]
"프라이머"라는 용어는 프라이머 신장 조건하에 접촉되는 경우 핵산 주형의 핵산 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드 (정제된 제한 다이제스트(digest)에서와 같이 천연 생성되거나 또는 합성됨)를 의미한다. 적절한 조건에는 뉴클레오티드 기질, 핵산 폴리머라제 (예를 들면, 5'-엑소-마이너스 DNA 폴리머라제)의 존재와 필수적으로 일정한 온도 및 적절한 pH가 포함된다. 핵산 합성은 새로이 합성되는 핵산 가닥의 서열이 핵산 주형의 서열에 상보성인 주형 의존성 방식으로 일어난다.
주형에 대한 프라이머의 혼성화는 분자내 또는 분자간 수소 결합에 의해 형성된 프라이머 이차 구조에 의해 억제될 수 있다. 그러므로, 프라이머는 이차 구조가 결여되며 단일 가닥으로 이루어지는 것이 바람직하다. 주형에 대한 혼성화를 억제하는 이차 구조를 갖는 프라이머는 증폭시키기 전에 그 가닥(들)을 변성시키거나 또는 분리시키기 위해 처리하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시뉴클레오티드이며 핵산 폴리머라제에 의한 신장 생성물의 합성을 위한 기질로서 사용되기에 충분히 길다. 적절한 프라이머의 길이는 온도, 프라이머의 구조와 어떠한 프라이머가 사용되는 지를 포함한 몇몇 요인에 따라 고려되어야 한다. 예를 들면, 진단에 응용하기 위해서는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 통상 표적 서열의 복잡성에 따라 15개 이상의 뉴클레오티드를 함유한다. 기타 응용시, 보다 짧은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 필요로 한다. 주형과 함께 안정한 혼성 복합체를 형성하기 위해 보다 낮은 온도에서 이들 다른 응용법을 행하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명에서 사용된 핵산 폴리머라제는 주형 의존성 방식으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 핵산 중합체 또는 핵산 가닥으로 합성할 수 있는 화학적, 물리적 또는 생물학적 제제를 의미한다. 핵산 폴리머라제의 예로는 DNA 폴리머라제가 포함된다. DNA 폴리머라제는 5' 에서 3' 방향으로 주형 의존성 방식으로 핵산을 합성한다. 주형 및 합성되는 가닥 간의 상보성으로 인하여, 상기 방향은 주형의 3' 영역에서 주형의 5' 영역으로의 방향이 된다. 바람직한 DNA 폴리머라제로는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 바실루스 스테아로테르모필루스에서 유래한 DNA 폴리머라제 Ⅰ의 대형 프레그먼트 (Bst DNA 폴리머라제 Ⅰ)가 있다. 다른 적합한 DNA 폴리머라제로는 클레나우 폴리머라제 및 박테리오파지 T7 DNA 폴리머라제가 있다. 핵산 분해에 민감하지 않는 5' 차단 프라이머를 사용하면 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있어야 한다.
상보성 프라이머는 핵산 주형에 상보성인 영역을 갖도록 선정되어야 한다. 프라이머 서열은 주형 서열을 정확히 반영할 필요는 없으나 주형 가닥과 혼성화할 수 있어야 한다. 신장 반응이 형성될 수 있도록 프라이머가 핵산 주형에서의 그의 대응 서열과 혼성화하기 위해 충분한 상보성을 갖는 경우, 비상보성 염기는 프라이머 중으로 산재될 수 있다. 일단 변위되면, 새로이 형성된 신장 생성물은 추가의 핵산 합성을 위한 주형으로서 작용할 수 있다.
바람직하게는, 프라이머는 비상보성 5' 영역을 함유한다. 그러므로, 바람직한 프라이머는 핵산 주형에 혼성화할 수 있는 상보성 영역, 및 비상보성 영역을 함유한다. 비상보성 영역이 존재하면 가닥 변위를 향상시킬 수 있는 것으로 판명되었다.
프라이머 서열은 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기, 즉 A, T, C 또는 G ; 및(또는) 하나 이상의 리보뉴클레오티드 염기, 즉 A, U, C 또는 G ; 및(또는) 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 (데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)를 함유할 수 있으며, 여기서 상기 변형은 핵산에 대한 프라이머의 혼성화, 또는 프라이머의 신장 또는 가닥 변위를 억제하지 않는다.
프라이머는 그 성능을 향상시키거나 또는 증폭 생성물의 특성화를 촉진시키기 위해 화학적 기에 의해 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 특정의 폴리머라제의 핵산 분해 활성에 대해 내성을 갖는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 등의 골격이 변형된 올리고뉴클레오티드에서는 상기 효소를 사용할 수 있다. 다른 변형의 예로는 프라이머의 신장을 간섭하지 않는 비뉴클레오티드 링커를 사용하는 것이다 [Arnold et al., EPA 88 308 766-0]. 마찬가지로, 목적하는 변형된 뉴클레오티드 및 천연 뉴클레오티드의 혼합물을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용할 수도 있다.
프라이머는 또한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 또는 RNA 폴리머라제의 프로모터 부위 등의 효소에 대한 반응 부위를 함유할 수도 있다. 상기 부위들을 사용하는 예로는 증폭 후 증폭 생성물의 클로닝 및 증폭 생성물의 전사를 들 수 있다. 그러한 부위들이 증폭을 위해 필요한 것은 아니나, 증폭시킨 핵산의 후속 조작에 도움을 준다.
본 발명의 프라이머는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 문현 [Caruthers et al., "Methods In Enzymology, vol, 154, p, 287 (1987)]에서는 포스포디에스테르 결합에 의해 뉴클레오티드를 결합시키기 위한 표준 포스포르아미디트 고상 화학을 사용하는 방법에 대해 기재하고 있다. 본 발명의 양수인인 젠-프로브 인코포레이티드에 양도된 배트(Bhatt)의 미국 특허 출원 제07/319,570호 (발명의 명칭 : "Method and reagent for sulfurization of organophosphorous compounds" ; 출원일 : 1989년 3월 6일)에서는 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법에 대해 기재하고 있다. 클렘 (Klem) 등의 PCT WO 92/07864 ("Improved process for the synthesis of oligomers")에서는 메틸포스포네이트 결합을 포함하여 상이한 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드 합성에 대해 기재하고 있다 (상기 문헌들은 본원에 참고 문헌으로서 채택됨).
또한, 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 자동화 합성기가 적절하다. 자동화 합성기에서, 5'-보호된 부동화 (3'-히드록실을 통함) 뉴클레오시드 잔기로 출발한다. 5'-탈보호 후, 포스파이트 에스테르 결합은 3'-포스포르아미디트, 5'-보호된 뉴클레오시드 잔기와의 반응에 의해 도입된다. 그 다음, 포스파이트 결합은 적절한 결합으로 산화되며, 합성 서열에 도입되는 목적하는 뉴클레오티드 잔기를 사용하여 공정을 순환시킨다. 산화 공정에 의해, 통상의 포스페이트 에스테르 또는 포스포로티오에이트 에스테르를 형성할 수 있다 [Arnold et al., supra, EPA 88 308 700-0]. 자동 합성 동안 비뉴클레오티드 포스포르아미디트 유도체를 도입시킬 수 있다. 또한, 합성된 올리고뉴클레오티드는 또한 추가의 합성법에 의해 변형될 수 있다 [미국 특허 제4,818,681호 참조].
프라이머의 5' 말단은 핵산 폴리머라제에 존재하는 5'-엑소뉴클레아제 활성에 대한 내성을 갖도록 변형될 수 있다. 그러한 변형은 본원에 참조 문헌으로서 채택되어 있는 하기 문헌에 기재된 기술을 사용하여 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드에 비뉴클레오티드 기를 첨가함으로써 수행할 수 있다 [Arnold et al., 미국 특허 출원 제07/319,422호, 발명의 명칭 : "Non-nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes" 및 라벨-ONTM시약의 사용에 대해 기술하고 있는 CLONTECH product catalogue 참조].
[시험 시료]
일반적으로 정제 또는 비정제 형태의 핵산 공급원은, 핵산 공급원이 표적 핵산 서열을 함유하거나 또는 표적 핵산 서열을 함유하는 것으로 예측된다는 전제하에, 출발 핵산(들)로서 사용될 수 있다. 핵산 공급원 및 순도에 따라서, 출발 핵산은 증폭시키기 전에 정제 단계를 요할 수도 있다. 핵산 공급원이 증폭을 억제하는 물질을 함유하는 경우 출발 핵산을 정제시키는 것이 바람직하다. 핵산 정제는 표준 기술을 사용하여 행할 수 있다.
표적 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 DNA 또는 RNA에 존재할 수 있다. 상기 핵산들의 혼합물 또는 사전 증폭에서 얻은 핵산을 또한 사용할 수 있다. 핵산 또는 핵산의 혼합물은 동일하거나 또는 상이할 수 있는 하나 초과의 표적 핵산 서열을 함유할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 동일하거나 또는 상이한 표적 핵산 가닥에 위치하고 있는 하나 이상의 상이한 표적 핵산 서열을 동시에 증폭시키는데 유용하다.
목적 표적 핵산을 함유하는 것으로 기대되거나 또는 알려진 시료는 각종 공급원으로부터 얻을 수 있다. 그러한 공급원으로는 생물학적 시료, 음식물 또는 농업상 시료, 환경적 시료, 체액 또는 체삼출액 (예 : 뇨, 혈액, 밀크, 뇌척수액, 담, 타액, 변, 폐 흡인물, 및 인후 또는 생식기 면봉 채집 분비물)을 들 수 있다.
증폭에 적합한 핵산을 얻기 위해 시험 시료를 처리하여 표적 핵산 서열을 방출, 추출 또는 변성시키는 것이 바람직하다. 그러한 처리에 의해 증폭을 억제하는 불순물을 제거할 수 있고, 핵산을 변성시켜 이차 구조(예를 들면, 이중 가닥 DNA 및 헤어핀 루프)를 최소화할 수 있다. 상기 처리법은 당업계에 공지되 수단에 의해 행할 수 있다.
프라이머는 표적 핵산의 특이 영역에 혼성화되도록 디자인된다. 2조의 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다. 한조의 프라이머, 즉 상보성 프라이머는 표적 서열에 대하여 주형 핵산의 3'쪽에 존재하는 핵산 서열에 혼성화되도록 디자인된다. 혼성화는 상보성 뉴클레오티드 간의 수소 결합을 기준으로 하여 수행한다. 다른 1조의 프라이머, 즉 센스 프라이머는 표적 서열에 대하여 주형 핵산의 5'쪽에 존재하는 영역에 유사성이 되도록 디자인된다. 각조의 프라이머의 요소들은 도면에 도시한 바와 같이 함께 직선상으로 배열된다.
각조의 프라이머 모두는, 주형에 존재하는 표적 서열 및 그 주형에 대한 상보물을 증폭시키도록 위치한다. DNA 폴리머라제는 5' 에서 3' 방향 (주형 뉴클레오티드에 있어서는 3' 주형 영역에서 5' 주형 영역으로 첨가됨)으로의 핵산 합성을 촉진시킨다. 상보성 가닥은 상보성 프라이머를 사용하여 초기 주형으로부터 제조된다. 상보성 가닥은 주형 의존성 핵산 합성을 위한 주형으로서 작용할 수 있다.
센스 프라이머가 표적 서열에 대하여 핵산 주형의 5'쪽 상의 영역에 유사성인 경우, 센스 프라이머는 상보성 가닥 상의 표적 서열에 대하여 3'쪽 영역에 상보성이 될 것이다. 센스 프라이머는 상보성 가닥에 대해 상보성 프라이머로서 작용할 수 있다. 주형의존성 핵산 합성은 상보성 가닥 상에서 형성될 수 있어, 보다 많은 표적 서열을 형성하게 된다.
상이한 수의 상보성 프라이머 및 센스 프라이머를 사용하여 표적 서열을 증폭시킬 수 있다. 프라이머의 수가 증가함에 따라, 증폭이 증가하는 것으로 간주된다. 그러므로, 상보성 프라이머 및 센스 프라이머의 총수는 5를 초과하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시 태양에서, 4개 이상의 센스 프라이머 및 4개 이상의 상보성 프라이머가 사용되며 ; 7개 이상의 센스 프라이머 및 7개 이상의 상보성 프라이머가 사용되며 ; 10개 이상의 센스 프라이머 및 10개 이상의 상보성 프라이머가 사용된다. 상보성 프라이머의 수는 센스 프라이머의 수와 동일할 필요는 없다. 예를 들면, 2개의 센스 프라이머 및 3개의 상보성 프라이머의 조합이 사용될 수 있다.
DMSO 등의 특정의 유기 용매가 증촉 반응에 첨가되고 승온이 사용되는 경우, 실질적 증폭 뿐만 아니라 긴축 반응이 관찰된다. 가닥 변위를 증가시키기 위해 승온이 사용되는 경우, 열안정성 DNA 폴리머라제 등의 열안정성 핵산 폴리머라제를 사용할 수 있다. 선택되는 온도는 효소가 활성을 갖는 온도 범위에 따라 좌우된다.
프라이머, 핵산 폴리머라제, 및 뉴클레오티드는 목적하는 증폭 정도를 지지하기 위한 충분한 양으로 사용되어야 한다. 염기 쌍, DNA 폴리머라제, 및 가닥 변위 관능기가 증폭이 목적하는 정도로 진행되지 않는 정도까지 역 영향을 미치지 않는 한, 뉴클레오티드 유사체는 치환 또는 첨가될 수 있다.
"가닥 변위"란 핵산 폴리머라제에 의한 주형 지향 핵산 합성에 기인하여 5' 에서 3' 방향으로 형성되는 핵산 가닥의 핵산 주형으로부터의 해리를 의미한다. 새로이 합성되고 변위된 핵산은 주형 핵산 서열에 상보성인 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
바람직하게는, 가닥 분리제를 사용하여 가닥 변위를 향상시킬 수 있다. 가닥 분리제에는 헬리카제 등의 효소, 헬리카제 활성을 갖는 효소 RecA, 및 단일 가닥 핵산 결합 단백질을 포함한다. 핵산 가닥을 분리시키기 위한 헬리카제의 사용이 문헌 [Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol. XLIII, "DNA : Replication and Recombination" (New York : Cold Spring Harbor Laboratory, 1978]에 기재되어 있으며 RecA의 사용은 문헌 [Redding, Ann. Rev. Genetics, 16 : 405 (1982)]에 기재되어 있다. 가닥 분리에 대해서는 문헌 [Kornberg, A., DNA Replication W. H. Freeman CO., San Francisco, CA., 1980]에 기재되어 있다. 하기 문헌에서는 핵산 혼성화 및 증폭에 있어서 RecA의 사용에 대해 기재하고 있다 [Zarling 등의 미국 특허 제5,223,414호 (1993년 6월)].
전술한 바와 같은 증폭은 표적 서열의 수의 증가를 의미한다. 증폭 정도는 프랑이밍의 속도 또는 정도, 또는 프라이머 신장을 증가시키는 조건 또는 제제를 사용하여 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 가닥 분리제는 DNA 폴리머라제의 가닥 변위 속도를 증가시킬 수 있다.
표적 서열을 검색하는 데, 각종 방법이 유효하게 사용될 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드 기질 또는 프라이머는 새로이 합성되는 DNA 중으로 이입되는 검색 가능 표지를 함유할 수 있다. 그 다음, 생성된 표지화 증폭 생성물을 사용되지 않은 표지화 뉴클레오티드 또는 프라이머로부터 분리시키고 분리시킨 생성물 분획에서 표지를 검색한다.
유용한 검색가능 표지로서 작용하는 물질은 당업계에 공지되어 있으며 방사능 동위원소 (예를 들면,32P,3H,125I 및14C), 형광성 화합물, 화학발광 화합물, 발색단 뿐만 아니라, 직접 검색가능 하지는 않지만 예를 들면 각각 아비딘 및 항체등의 그의 특이 결합 파트너의 표지화 형태와의 반응에 의해 용이하게 검색될 수 있는 비오틴 및 합텐 등의 리간드를 들 수 있다.
다른 방법으로는 검색가능한 핵산 프로브와 혼성화하고 생성된 혼성체를 통상의 방식으로 측정하여 증폭 생성물을 검색하는 방법이 있다. 특히, 생성물은 화학발광 아크리디늄 에스테르 표지화 핵산 프로브를 표적 서열에 혼성화이고, 비혼성화 프로브 상에 존재하는 아크리디늄 에스테르를 선택적으로 가수분해하고 잔존 아크리디늄 에스테르로부터 형성된 화학발광체를 발광측정계로 측정하여 분석할 수 있다 [Arnold 등의 상기 인용된 바 있는 PCT US88/02746, 및 Nelson 등의 Nonisotopic DNA Probe Techniques, p. 275 Academic Press, San Diego (Kricka, ed., 1992)] (상기 두 문헌 모두 본원에 참조 문헌으로서 채택됨).
[실시예]
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 예시하고자 하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : RNA 표적의 증폭
이 실시예는 DNA 주형을 생성하고 프라이머 어레이 및 5'-엑소-마이너스 DNA 폴리머라제를 사용하여 DNA 주형을 증폭시킴으로써 리보솜 RNA (rRNA)를 증폭시키는 방법에 대해 설명한 것이다. rRNA로부터의 DNA 주형의 생성 및 주형의 증폭은 DNA 주형의 생성 및 증폭에 필요한 제제를 함유하는 동일 반응 용기중에서 행하였다.
본 실시예에서 사용된 프라이머 어레이는 13개의 프라이머로 구성되어 있다. 프라이머는 표준 포스포르아미디트 화학에 따라 제조하였다. 프라이머 중 7개는 (rRNA 표적에 대해) 상보성 프라이머이다. 이들 프라이머는 하기 핵산 서열 (5' 에서 3' 방향으로 읽음)을 갖는다.
서열 번호 1 : CGCGTCTAGT CCTACTCAGG TGTTG
서열 번호 2 : CCCCAGATTC AGACTAGG
서열 번호 3 : CGGTCATTGA CTAGTATTTA GCCTT
서열 번호 4 : TTTCTTCATA GTACTGGTTC ACT
서열 번호 5 : ATTTCACTCC CTTAACAAGG GTT
서열 번호 6 : TTGTAAGCTA CAGGTTTCAG GT
서열 번호 7 : ACGGGCAATT GGTCTGCGAC C
프라이머 중 6개는 (rRNA 표적에 대해) 센스 프라이머이다. 이들 프라이머는 하기 핵산 서열 (5' 에서 3' 방향으로 읽음)을 갖는다.
서열 번호 8 : AGCAAAGACC CGGAGGTCCG AAT
서열 번호 9 : GAATACATAG GTATGCAAAG CGA
서열 번호 10 : CCTGCCGAAC TGAAACATCT TAGT
서열 번호 11 : CAGAGGAAAA GAAATCGAAG AGAT
서열 번호 12 : TGTAGGATTG AGGATAAAGG AT
서열 번호 13 : GGACTCCTAG TTGAACACAT CTGGAAAGA
표적 23S rRNA를 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis) (Glisin et al., Biochemistry 13 : 2633 (1974) 참조)로부터 얻고 이를 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 37.5 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM DTT)에 희석시켰다. 다양한 양의 rRNA 표적을 완충액 (7% DMSO, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 및 2 mM DTT) 20㎕ 중의 프라이머 (7 × 10-12mole)와 합하고 60℃에서 30분 동안 인큐베이션시켜 프라이머를 에비 혼성화하였다. 그 다음, 예비 혼성화시킨 프라이머를 0.2 mM ATP, 0.2 mM TTP, 0.2 mM CTP, 말로니 (Maloney)종 쥐의 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT)200 단위, 및 Bst DNA 폴리머라제 Ⅰ 2 단위로 처리하였다. 37℃에서 60분 동안 증폭시킨 다음, 계속해서 60℃에서 120분 동안 증폭시켰다.
그 다음, 증폭 생성물을 변성시키고 문헌 [Nelson et al., supra]에 따라 아크리디늄 에스테르 표지화 프로브를 사용하여 분석하였다. 변성은 95℃에서 5분 동안 배양시켜 행하였다. 아크리디늄 에스테르를 사용한 프로브 표지화는 문헌 [Nelson 등의 상기 인용된 문헌]에 기재한 바와 같이 행하였다. 아크리디늄 에스테르 표지화 프로브를 합성하여 SEQ. ID. NO. 27에 해당하는 핵산 서열을 얻었다. 아크리디늄 에스테르 표지화 프로브 (2 × 10-11mole)을 혼성화 완충액 (100 mM 리튬 숙시네이트 (pH 5.2), 8% 리튬 도데실 술페이트, 1.5 mM EDTA, 및 1.5 mM EGTA) 100㎕ 중에서 60℃에서 15분 동안 증폭 생성물을 사용하여 인큐베이션시켰다. 그 다음, 비혼성화 프로브에 존재하는 아크리디늄 에스테르를 시약 용액 (0.15 M 나트륨 테트라보레이트, pH 7.6, 및 5% (v/v) 트리톤 X-100)을 첨가하여 가수분해시키고 60℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 잔존 화학발광체를 발광측정계로 측정하였다. 표 1에 도시된 결과는 본 발명의 증폭법에서의 표적 핵산의 적정을 설명한 것이다.
[표 1]
실시예 2 : 임상 시험편의 증폭
본 실시예는 임상 시료 (경부 면봉 채집 시료)에 존재하는 rRNA 표적 서열의 증폭에 대해 설명한 것이다. 본 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오티드, 증폭 과정, 및 검색 과정은 실시예 1에 기재한 바와 동일하다. 본 실시예는 사용된 시료 유형 및 시료 표본에 있어서 실시예 1과 상이하다.
경부 면봉 채집 시료를 수거하고 음이온성 세재를 함유하는 완충액 (60 mM 인산염 완충액 (pH 6.8), 6% 리튬 도데실 술페이트, 2 mM EDTA, 및 2 mM EGTA)에 현탁시켰다. 임상 시험편을 23S 클라미디아 트라코마티스 rRNA 10-18mole로 스파이크 (spike) 처리하고 실시예 1에서와 같이 프라이머로 혼성화시키고 증폭시키고 검색하였다. 클라미디아 rRNA를 사용한 임상 시료가 클라미디아 rRNA가 없는 임상 시료보다 50배 이상 더 큰 RLU를 갖는다는 사실을 통하여 임상 시료에서의 표적 핵산이 성공적으로 증폭되었음이 확인되었다.
실시예 3 : 증폭 특이성
본 실시예는 표적 서열 및 비표적 서열 (예를 들면, 앰플리콘 (amplicon) 외부의 전사 영역)로 지향되는 프로브를 사용하여 특이 표적 서열을 증폭시키는 방법을 설명한 것이다. 본 실시예에서 사용된 표적 핵산은 T7 박테리오파아지 유전자 10으로부터 유래된 것이다. 구체적으로, T7 박테리오파아지의 유전자 10의 일부분을 함유하는 pGEMX1의 XmaⅠ 및 BanⅠ 다이제스트를 pUC19에 서브클로닝하였다. T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 삽입체를 발현시켜 길이가 863개의 염기에 해당하는 RNA 생성물을 얻었으며 이 전사체를 사용하여 DNA 주형을 형성한 다음, 증폭시켰다.
표적 서열을 증폭시키기 위해 사용된 프라이머 어레이는 하기 핵산 서열 (5' 에서 3' 방향으로 읽음), 즉
서열 확인 번호 14 : CTATAGGGAG ACCACAACGG TTT
서열 확인 번호 15 : CTAGAAATAA TTTTGTTTAA CTT
서열 확인 번호 16 : AGAAGGAGAT ATACATATGG CT
서열 확인 번호 17 : CATGACTGGT GGACAGCAAA TG
를 갖는 (RNA 전사체에 대한) 4개의 상보성 프라이머와, 하기 핵산 서열 (5' 에서 3' 방향으로 읽음.), 즉
서열 확인 번호 18 : GAGCGAACGC AGTCAGGA
서열 확인 번호 19 : GAGAAGTGGT CACGGAGGTA CGAGCGAACG CAGT
서열 확인 번호 20 : GGAGATGGAA CGTACCATGT
서열 확인 번호 21 : GGGAACTGAG CGGATTTACC GC
를 갖는, RNA 전사체와 동일한 센스 가닥을 갖는 4개의 센스 프라이머로 구성되어 있다.
혼성화, 증폭, 및 검색을 실시예 1에 기재한 바와 같이 수행하였다. 아크리디늄 에스테르 표지화 프로브인 서열 확인 번호 22 및 27을 사용하여 표적 서열의 존재를 검색하였다. 비표적 아크리디늄 에스테르 표지화 프로브 (서열 확인 번호 23)를 대조 프로브로서 사용하여 프라이머 영역 외부 (예를 들면, 상보성 프라이머의 3' 및 센스 프라이머의5')에서 형성된 비특이 증폭을 측정하였다. 표 2에 도시된 결과는 증폭이 특이성을 갖는다는 사실을 설명하고 있다.
[표 2]
실시예 4 : 가닥 변위의 향상
본 실시예는 프라이머에 결합된 비상보성 영역의 가닥 변위 및 증폭 향상 능력을 설명한 것이다. 가닥 변위는 2개의 상이한 상보성 프라이머 조합을 사용하여 측정하였다. 2개의 조합은 모두 5'-32P 표지화 프라이머 (서열 확인 번호 19) 및 추가의 프라이머를 함유하고 있다. 한 조합에서의 추가의 프라이머는 서열 확인 번호 24에 대응한다. 다른 조합에서의 추가의 프라이머는 서열 확인 번호 25에 대응한다. 서열 확인 번호 25의 프라이머는 서열 확인 번호 24의 프라이머와 유사하나, 5개 더 적은 상보성 뉴클레오티드를 갖고 5' 비상보성 영역을 함유하고 있다. 증폭은 T7 박테리오파아지 유전자 10의 일부에 해당하는 올리고데옥시뉴클레오티드 주형상에서 행하였다. 서열 확인 번호 26에 대응하는 주형을 실시예 1에 기재한 바와 같이 합성하였다.
프라이머 (4 × 10-12mole)를 완충액 (50 mM 트리스-염산 (pH 8.3), 37.5 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM DTT) 20㎕ 중에서 주형 (4 × 10-13mole)과 70℃에서 5분 동안 인큐베이션시켜 예비혼성화하고, 반응물을 약 2시간에 걸쳐 실온 (약 20 내지 25℃)으로 냉각시켰다. 0.1 mM ATP, 0.1 mM TTP, 0.1 mM GTP, 0.1 mM CTP 및 Bst DNA 폴리머라제 Ⅰ 4 단위를 첨가하여 증폭시키고 50℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 분취액을 포름아미드/EDTA 용액 (50% 포름아미드 10 mM 트리스-CHl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA)에 옮겨 시료를 5, 15 및 30분대에서 취하였다. 시료를 변성 15% 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하여 러닝 온 (running on) 시켰따. 신장 생성물 및 프라이머에 대응하는 밴드를 겔로부터 절제하고 신틸레이션 계수기로 세렌코브 (Cerenkov) 계수함으로써 분석하였다.
표 3에 도시한 결과는 5' 비상보성 영역을 갖는 프라이머를 사용하는 가닥 변위가 보다 효과적이라는 사실을 입증하고 있다. "생성물 백분율"은 신장 생성물의 양을 신장 생성물 및 프라이머의 양의 합으로 나눈 값을 나타낸다. 5' 비상보성 영역을 갖는 프라이머에 의해 관찰된 보다 높은 생성물 백분율은 증폭과 가닥 변위가 증가된 것을 나타내는 것이다.
[표 3]
표 3에 도시한 프라이머 이외에, 각 반응 혼합물은 서열 확인 번호 19의 뉴클레오티드 서열을 갖는 방사능표지 프라이머를 함유하고 있다.
본 발명의 실시 태양은 단지 예시라는 측면에서 고려되어야 할 것이며 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것은 아니며, 본 발명의 범주는 상기 기재 부분에 의해서라기 보다는 첨부된 청구의 범위에 의해 나타내어질 것이며, 따라서 청구의 범위의 균등물의 의미와 범위 내에 포함되는 모든 변화도 본원에 포함되어야 할 것이다.
기타 실시 태양이 하기 청구의 범위에 포함되어 있다.
[서열표]
(1) 일반적 정보 :
(ⅰ) 출원인 : 젠-프로브 인코포레이티드
(ⅱ) 발명의 명칭 : 등온 가닥 변위 핵산 증폭
(ⅲ) 서열 수 : 27
(ⅳ) 통신 주소
(A) 주소 : 젠-프로브 인코포레이티드
(B) 거리 주소 : 캠퍼스 포인트 드라이브 9880
(C) 도시 : 샌 디에고
(D) 주 : 캘리포니아주
(E) 국가 : 미국
(F) 우편 번호 (ZIP) : 92121
(ⅴ) 컴퓨터 판독형 :
(A) 매체 형태 : 3.5" 디스켓, 1.44 Mb 저장용량
(B) 컴퓨터 : IBM 호환용
(C) 운영 체계 : IBM P.C. DOS (버젼 5.0)
(D) 소프트웨어 : 워드퍼펙트 (버젼 5.1)
(ⅵ) 현 출원 데이타 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(ⅶ) 우선권 출원 데이타 :
하기 기재된 출원을 포함한 총 우선권 출원 : 없음
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(ⅸ) 변호사/대리인 정보
(A) 성명 : 헤버, 쉘던 오.
(B) 등록번호 : 38,179
(C) 참고/문서 번호 : 207/140
(ⅹ) 전자통신 주소
(A) 전화번호 : (619) 535-2807
(B) 팩스 : (619) 452-5848
(C) 텔렉스 : 67-3510
(2) 서열 확인 번호 1에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 25
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 1
CGCGTCTAGT CCTACTCAGG TGTTG 25
(3) 서열 확인 번호 2에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 18
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 2
CCCCAGATTC AGACTAGG 18
(4) 서열 확인 번호 3에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 25
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 3
CGGTCATTGA CTAGTATTTA GCCTT 25
(5) 서열 확인 번호 4 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 23
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 4
TTTCTTCATA GTACTGGTTC ACT 23
(6) 서열 확인 번호 5에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 23
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 5
ATTTCACTCC CTTAACAAGG GTT 23
(7) 서열 확인 번호 6에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 22
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 6
TTGTAAGCTA CAGGTTTCAG GT 22
(8) 서열 확인 번호 7에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 1
ACGGGCAATT GGTCTGCGAC C 21
(9) 서열 확인 번호 8에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 23
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 8
AGCAAAGACC CGGAGGTCCG AAT 23
(10) 서열 확인 번호 9에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 23
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 1
GAATACATAG GTATGCAAAGCGA 23
(11) 서열 확인 번호 10에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 10
CCTGCCGAAC TGAAACATCT TAGT 24
(12) 서열 확인 번호 11에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 11
CAGAGGAAAA GAAATCGAAG AGAT 24
(13) 서열 확인 번호 12에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 22
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 12
TGTAGGATTG AGGATAAAGG AT 22
(14) 서열 확인 번호 13에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 29
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 13
GGACTCCTAG TTGAACACAT CTGGAAAGA 29
(15) 서열 확인 번호 14에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 23
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 14
CTATAGGGAG ACCACAACGG TTT 23
(16) 서열 확인 번호 15에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 23
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 15
CTAGAAATAA TTTTGTTTAA CTT 23
(17) 서열 확인 번호 16에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 22
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 16
AGAAGGAGAT ATACATATGG CT 22
(18) 서열 확인 번호 17에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 22
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 17
CATGACTGGT GGACAGCAAA TG 22
(19) 서열 확인 번호 18에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 18
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 18
GAGCGAACGC AGTCAGGA 18
(20) 서열 확인 번호 19에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 34
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 19
GAGAAGTGGT CACGGAGGTA CGAGCGAACG CAGT 34
(21) 서열 확인 번호 20에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 20
GGAGATGGAA CGTACCATGT 20
(22) 서열 확인 번호 21에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 22
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 21
GGGAACTGAG CGGATTTACC GC 22
(23) 서열 확인 번호 22에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 27
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 22
GAACAACGCC AGTTTGATCT CCAGCAG 27
(24) 서열 확인 번호 23에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 26
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 23
CAACCTCAAA GGCCCATAAC GTTGCG 26
(25) 서열 확인 번호 24에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 29
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 24
GTCAGGACTT CACCGCCAAA TACCTTCAA 29
(26) 서열 확인 번호 25에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 50
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 25
GAAATTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACT TCACCGCCAA ATACCTTCAA 50
(27) 서열 확인 번호 26에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 137
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 26
CATGACTGGT GGACAGCAAA TGGGTACTAA CCAAGGTAAA GGTGTAGTTG
CTGCTGGAGA TAAACTGGCG TTGTTCTTGA AGGTATTTGG CGGTGAAGTC
CTGACTGCGT TCGCTCGTAC CTCCGTGACC ACTTCTC 137
(28) 서열 확인 번호 27에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 27
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 설명 : 서열 확인 번호 27
CCCGTAGACG AAAGGAGAGA AAGACCG 27

Claims (17)

  1. (2회 정정) a. 프라이머 신장 조건하에서 특징 핵산 표적 서열을 포함하는 핵산 가닥을 함유하는 시료에 ⅰ) 5'-엑소뉴클레아제 활성이 결여된 핵산 폴리머라제, ⅱ) 아데노신, 티미딘, 구아노신 및 시토신 삼인산염 중에서 선택되는 하나 이상의 뉴클레오시드 삼인산염, 및 ⅲ) 2개 이상의 상이한 상보성 프라이머 (각각의 상보성 프라이머는 상기 표적 서열의 3'에 위치한 상기 핵산 가닥 상의 핵산 서열에 상보성을 갖도록 고안된 뉴클레오티드 염기 서열을 함유하고, 상기 각각의 상보성 프라이머의 상기 뉴클레오티드 염기 서열은 상기 조건 하에 상기 핵산 가닥 상의 핵산 서열에 혼성화 할 수 있음)을 제공하는 단계 ; 및
    b. 필수적으로 일정한 온도 및 증폭 생성물에 활성인 제한 엔도뉴클레아제의 부재 하에 상기 표적 서열을 증폭하는 단계로 이루어지는, 비표적 서열보다 특정 핵산 표적 서열을 우선적으로 증폭하는 방법.
  2. (2회 정정) a. 프라이머 신장 조건하에서 특징 핵산 표적 서열을 포함하는 핵산 가닥을 함유하는 시료에 ⅰ) 핵산 폴리머라제, ⅱ) 아데노신, 티미딘, 구아노신 및 시토신 삼인산염 중에서 선택되는 하나 이상의 뉴클레오시드 삼인산염, 및 ⅲ) 2개 이상의 상이한 상보성 프라이머 (1개 이상의 상보성 프라이머는 5'-엑소뉴클레아제에 의한 핵산 분해에 내성이 되도록 변형되고, 상기 각각의 상보성 프라이머의 상기 표적 서열의 3'에 위치한 상기 핵산 가닥 상의 핵산 서열에 상보성을 갖도록 고안된 뉴클레오티드 염기 서열을 함유하고, 상기 각각의 상보성 프라이머의 상기 뉴클레오티드 염기 서열은 상기 조건 하에 상기 핵산 가닥 상의 핵산 서열에 혼성화 할 수 있음)을 제공하는 단계 ; 및
    b. 필수적으로 일정한 온도 및 증폭 생성물에 활성인 제한 엔도뉴클레아제의 부재 하에 상기 표적 서열을 증폭하는 단계로 이루어지는, 비표적 서열보다 특정 핵산 표적 서열을 우선적으로 증폭하는 방법.
  3. (정정) 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제공 단계가 2개 이상의 상이한 센스 프라이머를 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  4. (정정) 제3항 있어서, 상기 상보성 프라이머 및 상기 센스 프라이머가 5개 이상의 상이한 프라이머로 이루어진 프라이머 어레이를 포함하는 것인 방법.
  5. (정정) 제1항 또는 제2항에 있어서, 서로 인접한 상기 상보성 프라이머가 그의 가장 가까운 5' 및 3' 말단에서 1 내지 200 뉴클레오티드의 거리만큼 분리된 것인 방법.
  6. (2회 정정) 제5항에 있어서, 서로 인접하고 있는 상기 상보성 프라이머가 그의 가장 가까운 5' 및 3' 말단에서 10 뉴클레오티드 이하의 거리만큼 분리되어 있는 것인 방법.
  7. (2회 정정) 제1항 또는 제2항에 있어서, 서로 인접하고 있는 상기 센스 프라이머가 그의 가장 가까운 5' 및 3' 말단에서 1 내지 200 뉴클레오티드의 거리만큼 분리되어 있는 것인 방법.
  8. (2회 정정) 제7항에 있어서, 서로 인접하고 있는 상기 센스 프라이머가 그의 가장 가까운 5' 및 3' 말단에서 10 뉴클레오티드 이하의 거리만큼 분리되어 있는 것인 방법.
  9. (2회 정정) 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산 가닥이 단일 가닥의 DNA이고, 상기 폴리머라제가 DNA 폴러말제인 방법.
  10. (정정) 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조건이 DMSO를 포함하는 것인 방법.
  11. (정정) 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 필수적인 일정 온도가 43℃이상인 방법.
  12. (정정) 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 필수적인 일정 온도가 50℃ 내지 70℃인 방법.
  13. (정정) 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제공 단계가 가닥 변위제 (strand-displacing agent)를 제공하는 단계를 더 포함한 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 가닥 변위제가 헬리카제(helicase), RecA 단백질, 및 단일 가닥 핵산 결합 단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 Bst DNA 폴리머라제 Ⅰ 또는 변형된 Taq DNA 폴리머라제인 방법.
  16. (정정) 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 상보성 프라이머가 5' 비상보성 영역을 포함하는 것인 방법.
  17. (2회 정정) 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 센스 프라이머가 5'-엑소뉴클레아제에 의한 핵산 분해에 내성이 되도록 변형된 것인 방법.
KR1019960705103A 1994-03-16 1995-03-14 등온 가닥 변위 핵산 증폭법 KR100230718B1 (ko)

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US21508194A 1994-03-16 1994-03-16
US8/215,081 1994-03-16
PCT/US1995/003339 WO1995025180A1 (en) 1994-03-16 1995-03-14 Isothermal strand displacement nucleic acid amplification

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KR970701791A KR970701791A (ko) 1997-04-12
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