ES2623805T3

ES2623805T3 - Descubrimiento innovador de composiciones terapéuticas, de diagnóstico y de anticuerpos relacionadas con fragmentos de proteínas de fenilalanil-alfa-ARNt sintetasas

Info

Publication number: ES2623805T3
Application number: ES11778205.2T
Authority: ES
Inventors: Leslie Ann Greene; Kyle P. Chiang; Fei Hong; Alain P. Vasserot; Wing-Sze Lo; Jeffry D. Watkins; John D. Mendlein; Cheryl L. Quinn
Original assignee: Pangu Biopharma Ltd; aTyr Pharma Inc
Current assignee: Pangu Biopharma Ltd; aTyr Pharma Inc
Priority date: 2010-05-03
Filing date: 2011-05-03
Publication date: 2017-07-12
Anticipated expiration: 2031-05-03
Also published as: US20170247678A1; WO2011140132A2; CA2797977C; JP2015211694A; AU2011248227A1; WO2011140132A9; JP2013533733A; US20150361410A1; US20130195832A1; AU2011248227B2; CA2797977A1; JP6008840B2; US9593323B2; EP2566495A4; US9034321B2; WO2011140132A3; CN103096912A; EP2566495B1; CN105820252A; US10179906B2

Abstract

Una composicion terapeutica, que comprende un polipeptido de aminoacil-ARNt sintetasa (AARS) aislado de 140 a 300 aminoacidos de longitud y que comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 90 %, 95 %, 98 % o 100 % identica a SEQ ID NO: 45, 12, 19 o 43, en la que el polipeptido tiene una actividad de senalizacion extracelular y tiene una solubilidad de al menos 5 mg/ml, y en la que la composicion tiene una pureza de al menos el 95 % en proteinas y menos de 10 UE de endotoxina/mg de proteina.

Description

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TABLA DE CONTENIDOS

VISIÓN DE CONJUNTO ..................................................................................................... 14 5 II. DEFINICIONES ....................................................................................... 15

III. FRAGMENTOS PROTEICOS DE PheRSa PURIFICADOS Y VARIANTES ....... 27

IV.: POLINUCLEÓTIDOS DE PheRSa .................................................... 58

V.: ANTICUERPOS ........................................................................................ 70

VI. ALTERNATIVAS A ANTICUERPOS Y OTROS AGENTES DE UNIÓN ................. 75

VII. BIOENSAYOS Y ENSAYOS ANALÍTICOS .............................................. 80

VIII. SISTEMAS DE EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN ......................................... 82

IX.: MÉTODOS Y COMPOSICIONES DE DIAGNÓSTICO ...................................... 95

X.: AGENTES ANTISENTIDO Y DE ARNI ........................................................ 110

A. AGENTES ANTISENTIDO ................................................................. 111 15 B. AGENTES DE INTERFERENCIA DE ARN .................................................. 119

XI. DESCUBRIMIENTO DE FÁRMACOS ............................................................................ 127

XII. MÉTODOS DE USO ............................................................................. 135

XIII. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS, ADMINISTRACIÓN Y KITS .... 139

XIV. EJEMPLOS ........................................................................................ 148

I. VISIÓN DE CONJUNTO

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

25 La presente invención se dirige, al menos en parte, al descubrimiento de nuevos polipéptidos de AARS, y métodos para su preparación y uso, que representan la transformación de proteínas de tipo silvestre nativas en nuevas formas que muestran características notablemente diferentes en comparación con los genes de fenilalanil-subunidad alfa ARNt sintetasa de longitud completa de origen natural. Dichos polipéptidos de PheRSa se identificaron basándose en secuencia extensiva y análisis de espectro de masas de fenilalanil-subunidad alfa ARNt sintetasa expresada en diferentes tejidos, seguido de la producción sistemática y el ensayo de cada polipéptido de PheRSa potencial para identificar secuencias proteicas que representan dominios proteicos estables y solubles que muestran nuevas actividades biológicas, y características farmacológicas terapéuticas favorables.

Basándose en este análisis, se han identificado al menos dos familias nuevas de polipéptidos de PheRSa derivados 35 de fenilalanil-subunidad alfa ARNt sintetasa.

En un aspecto, dichos polipéptidos de PheRSa derivados de fenilalanil-subunidad alfa ARN sintetasa comprenden secuencias polipeptídicas que comprenden aproximadamente los aminoácidos 1-226 de fenilalanil-subunidad alfa ARNt sintetasa.

En un segundo aspecto, dichos polipéptidos de PheRSa derivados de fenilalanil-subunidad alfa ARNt sintetasa comprenden secuencias polipeptídicas que comprenden aproximadamente los aminoácidos 1-152 de fenilalanilsubunidad alfa ARNt sintetasa.

45 Estas nuevas familias de polipéptidos de PheRSa representan nuevos productos proteicos previamente desconocidos que muestran entre otros i) nueva actividad biológica, ii) características de estabilidad y agregación de proteínas favorables, y iii) la capacidad de expresarse y producirse a alto nivel en sistemas de expresión procariotas, que son características materialmente diferentes no halladas en la proteína de tipo silvestre intacta.

II. DEFINICIONES

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por los expertos habituales en la materia a la que pertenece la invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el

55 presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen métodos y materiales preferidos. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen posteriormente.

Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. Como ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.

Por “aproximadamente” se entiende una cantidad, un nivel, un valor, un número, una frecuencia, un porcentaje, una dimensión, un tamaño, una cantidad, un peso o una longitud que varía en hasta 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % con respecto a una cantidad, un nivel, un valor, un número, una frecuencia, un porcentaje, una dimensión,

65 un tamaño, una cantidad, un peso o una longitud de referencia. Un “agonista” se refiere a una molécula que intensifica o imita una actividad, por ejemplo, una actividad biológica no

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entre la línea basal y el máximo después de algún tiempo de exposición especificado; la CE50 de una curva de respuesta a dosis graduada representa por lo tanto la concentración de un compuesto a la que se observa 50 % de su efecto máximo. En ciertas realizaciones, la CE50 de un agente proporcionado en el presente documento se indica en relación con una actividad “no canónica”, como se ha indicado anteriormente. CE50 también representa la

5 concentración en plasma requerida para obtener el 50 % de un efecto máximo in vivo. De forma similar, la “CE90” se refiere a la concentración de un agente o composición a la que se observa el 90 % de su efecto máximo. La “CE90” puede calcularse a partir de la “CE50” y la pendiente de Hill, o puede determinarse a partir de los datos directamente, usando conocimiento rutinario en la técnica. En algunas realizaciones, la CE50 de un fragmento proteico de PheRSa, anticuerpo u otro agente es menor de aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 nM. Preferentemente, la composición bioterapéutica tendrá un valor de CE50 de aproximadamente 1 nM o menos.

El término “modular” incluye “aumentar” o “estimular”, así como “reducir” o “disminuir”, normalmente en una cantidad estadísticamente significativa o una fisiológicamente significativa en comparación con un control. En consecuencia 15 un “modulador” puede ser un agonista, un antagonista, o cualquier mezcla de los mismos dependiendo de las condiciones usadas. Una cantidad “aumentada” o “potenciada” es normalmente una cantidad “estadísticamente significativa”, y puede incluir un aumento que es 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluyendo todos los números enteros y puntos decimales entre medias y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) la cantidad producida por ausencia de composición (la ausencia de un agente

o compuesto) o una composición de control. Una cantidad “disminuida” o reducida es normalmente una cantidad “estadísticamente significativa”, y puede incluir una disminución de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15%, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40%, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % en la cantidad producida por ausencia de composición (la ausencia de un agente o compuesto) o una composición de control, incluyendo todos los números enteros entre

25 medias. Como un ejemplo no limitante, un control en la comparación de actividades canónicas y no canónicas podría incluir el fragmento de interés de proteína PheRSa en comparación con su PheRSa de longitud completa correspondiente, o un fragmento de PheRSa que tiene actividad canónica comparable a su PheRSa de longitud completa correspondiente. Se describen en el presente documento otros ejemplos de cantidades “estadísticamente significativas”.

Por “obtenerse de” se entiende que una muestra tal como, por ejemplo, un extracto polinucleotídico o extracto polipeptídico se aísla de, o deriva de, una fuente particular del sujeto. Por ejemplo, el extracto puede obtenerse a partir de un tejido o un fluido biológico aislado directamente del sujeto. “Derivado” u “obtenido de” también puede referirse a la fuente de una secuencia polipeptídica o polinucleotídica. Por ejemplo, una secuencia de PheRSa de la

35 presente invención puede “derivar” de la información de secuencia de un fragmento proteolítico de PheRSa o variante de corte y empalme de PheRSa, o una parte del mismo, bien de origen natural o bien generado artificialmente, y puede por lo tanto comprender, consistir esencialmente en o consistir en esa secuencia.

Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a un polímero de restos de aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos y de origen natural de los mismos. Por lo tanto, estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos son aminoácidos de origen no natural sintéticos, tales como un análogo químico de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y derivados químicos de origen natural de los mismos. Dichos derivados incluyen, por ejemplo, modificaciones postraduccionales y productos de degradación

45 que incluyen variantes de piroglutamilo, isoaspartilo, proteolíticas, fosforiladas, glucosiladas, oxidadas, isomerizadas y desaminadas del fragmento de referencia de PheRSa.

Las indicaciones “identidad de secuencia” o, por ejemplo, que comprende una “secuencia 50 % idéntica a”, como se usa en el presente documento, se refieren a la medida en que las secuencias son idénticas nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido sobre una ventana de comparación. Por lo tanto, un “porcentaje de identidad de secuencia” puede calcularse comparando dos secuencias alineadas de forma óptima sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo A, T, C, G, I) o el resto de aminoácido idéntico (por ejemplo Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) aparece en ambas secuencias para producir el número de posiciones

55 coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

Los términos usados para describir relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen “secuencia de referencia”, “ventana de comparación”, “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia” e “identidad sustancial”. Una “secuencia de referencia” es de al menos 12, pero frecuentemente de 15 a 18 y con frecuencia de al menos 25 unidades monoméricas, incluyendo restos de nucleótidos y aminoácidos, de longitud. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solamente una parte de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que 65 es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan normalmente comparando secuencias de los dos polinucleótidos sobre una “ventana de comparación” para

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La cantidad en equilibrio máxima de soluto que puede disolverse por cantidad de disolvente es la solubilidad de ese soluto en ese disolvente en las condiciones especificadas, incluyendo temperatura, presión, pH y la naturaleza del disolvente. En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide a pH fisiológico. En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide en agua o un tampón fisiológico tal como PBS. En ciertas realizaciones, la solubilidad se mide en un fluido

5 biológico (disolvente) tal como sangre o suero. En ciertas realizaciones, la temperatura puede ser aproximadamente temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25 ºC) o aproximadamente temperatura corporal (37 ºC). En ciertas realizaciones, un agente tal como un fragmento proteico de PheRSa tiene una solubilidad de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 mg/ml a temperatura ambiente o a 37 ºC.

Un “punto de unión de corte y empalme” como se usa en el presente documento incluye la región en un transcrito de ARNm maduro o el polipéptido codificado en el que el extremo 3’ de un primer exón se une con el extremo 5’ de un segundo exón. El tamaño de la región puede variar, y puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más (incluyendo todos los números

15 enteros entre medias) restos de nucleótidos o aminoácidos en uno de los lados de los restos exactos donde el extremo 3’ de un exón se une con el extremo 5’ de otro exón. Un “exón” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está representada en la forma madura de una molécula de ARN después de haberse retirado por corte y empalme en cis partes de un ARN precursor (intrones) o haberse ligado por corte y empalme en trans dos o más moléculas de ARN precursoras. La molécula de ARN madura puede ser un ARN mensajero o una forma funcional de un ARN no codificante tal como ARNr o ARNt. Dependiendo del contexto, un exón puede referirse a la secuencia en el ADN o su transcrito de ARN. Un “intrón” se refiere a una región de ácido nucleico no codificante dentro de un gen, que no se traduce a una proteína. Se transcriben secciones intrónicas no codificantes a ARNm precursor (preARNm) y algunos otros ARN (tales como ARN no codificantes largos) y posteriormente se retiran por corte y empalme durante el procesamiento a ARN maduro.

25 Una “variante de corte y empalme” se refiere a un ARNm maduro y su proteína codificada que se producen por corte y empalme alternativo, un proceso por el que los exones del ARN (un transcrito génico primario o preARNm) se reconectan de múltiples maneras durante el corte y empalme de ARN. Los ARNm diferentes resultantes pueden traducirse a diferentes isoformas proteicas, lo que permite que un único gen codifique múltiples proteínas.

Un “sujeto”, como se usa en el presente documento, incluye cualquier animal que muestre un síntoma, o esté en riesgo de mostrar un síntoma, que puede tratarse o diagnosticarse con un polinucleótido o polipéptido de PheRSa de la invención. También se incluyen sujetos para los que es deseable perfilar niveles de polipéptidos y/o polinucleótidos de PheRSa de la invención, para fines de diagnóstico u otros. Los sujetos adecuados (pacientes)

35 incluyen animales de laboratorio (tales como ratón, rata, conejo o cobaya), animales de granja y animales domésticos o mascotas (tales como gato o perro). Se incluyen primates no humanos y, preferentemente, pacientes humanos.

“Tratamiento” o “tratar”, como se usa en el presente documento, incluye cualquier efecto deseable en los síntomas o la patología de una enfermedad o afección que puede efectuarse por las actividades no canónicas de un polinucleótido o polipéptido de PheRSa, como se describe en el presente documento, y pueden incluir incluso cambios mínimos o mejoras en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que se trate. También se incluyen tratamientos que están relacionados con terapias no PheRSa, en los que una secuencia de PheRSa descrita en el presente documento proporciona un marcador clínico de tratamiento. “Tratamiento” o “tratar” no

45 indican necesariamente la erradicación completa o cura de la enfermedad o afección, o síntomas asociados con la misma. El sujeto que recibe este tratamiento es cualquier sujeto que lo necesite. Los marcadores a modo de ejemplo de mejora clínica resultarán evidentes para los expertos en la materia.

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica, muchos de los cuales se describen posteriormente con el fin de ilustrar. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª Edición, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. 55 Hames y S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin y Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R. I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Techniques, 5ª Ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3ª Edición 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3ª Edición 2005), Methods of Enzymology: DNA Structure Part

A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-3,4-2), 1855. Handbook of Drug Screening, editado por Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, Nueva York, N. Y., Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); y

65 Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams y Linda Rodgers, (2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3).

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PheRSa1N1: ADN / Humana / imagen13 SEQ.ID. NO.13

Tabla 1B Péptidos de enlace inferidos y detectados por espectrometría de masas de PheRSa1N1 Tipo / especie

Secuencia

SEQ.ID. NO. Proteína / ratón

SEQ.ID. NO.14

imagen14

Proteína / ratón

imagen15SEQ.ID. NO.15 Proteína / ratón

imagen16SEQ.ID. NO.16

Proteína / ratón

imagen15SEQ.ID. NO.17

imagen17

17

imagen18

PheRSa1N4: ADN / Humana imagen19 SEQ.ID. NO.22

19

PheRSa1N5: Proteína / Humana / 1-198 + SEQ.ID.

S199R + 243-508: imagen20 NO.23

imagen21

20

PheRSa1N5: ADN / Humana imagen22 SEQ.ID. NO.24

21

PheRSa1N6: Proteína / Humana / 1-168 + 31 aa imagen23 SEQ.ID. NO.25

PheRSa1N6: ADN / Humana imagen24 SEQ.ID. NO.26

PheRSa1N7: Proteína / Humana / 1-399 + 426-508 imagen25 SEQ.ID. NO.27

22

PheRSa1N7: ADN / Humana imagen26 SEQ.ID. NO.28

23

PheRSa1N8: Proteína / Humana / 1-242 + 31 aa imagen27 SEQ.ID. NO.29

PheRSa1N8: ADN / Humana imagen28 SEQ.ID. NO.30

imagen29

Tabla 2B Punto de unión de corte y empalme únicos de polipéptidos de PheRSa

Nombre: Tipo / especie Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico en las cercanías del punto de unión de corte y empalme único SEQ.ID. NO.

FA-AS01: ADN / Humana / imagen30 SEQ.ID. NO.31

Proteína / Humana /: imagen15 SEQ.ID. NO.32

24

FA-AS02: ADN Humana / / imagen31 SEQ.ID. NO.33

Proteína Humana /: / imagen15 SEQ.ID. NO.34

FA-AS03: ADN Humana / / imagen32 SEQ.ID. NO.35

Proteína /: imagen15 SEQ.ID.

Humana /: NO.36

FA-AS04: ADN Humana / / imagen33 SEQ.ID. NO.37

Proteína Humana /: / imagen15 SEQ.ID. NO.38

FA-AS05: ADN Humana / / imagen34 SEQ.ID. NO.39

Proteína Humana /: / imagen15 SEQ.ID. NO.40

FA-AS06: ADN Humana / / imagen35 SEQ.ID. NO.41

Proteína Humana /: / imagen15 SEQ.ID. NO.42

Tabla 3 Polipéptidos y ácidos nucleicos de PheRSa identificados por Bioinformática

Nombre: Tipo / especie / Restos Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ.ID. NO.

PheRSa1N2: Proteína / Humana / 1219 imagen36 SEQ.ID. NO.43

PheRSa1N2: ADN / Humana imagen37 SEQ.ID. NO.44

25

imagen38

PheRSa1N9: Proteína / Humana / 1 SEQ.ID.

152: imagen39 NO.45

PheRSa1N9: ADN / Humana imagen40 SEQ.ID. NO.46

Polipéptidos de PheRSa C terminales: (Tablas 4, 5 y 6)

Tabla 4A Polipéptidos de PheRSa identificados por EM

Tabla 4B Péptidos de enlace inferidos y detectados por péptidos de espectrometría de masas

Tipo / especie: Secuencia SEQ.ID. NO.

Tabla 4C Secuencias concatenadas basadas en péptidos detectados por espectrometría de masas

Tipo / especie: Secuencia SEQ.ID. NO.

Tabla 5 Polipéptidos de PheRSa y transcritos alternativos identificados por Secuenciación Profunda

Nombre: Tipo / especie / Resto Secuencias de Aminoácidos y Ácido Nucleico SEQ.ID. NO.

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imagen41

PheRSa1C2: ADN / Humana imagen42 SEQ.ID. NO.76

28

PheRSa1C3: Proteína / Humana 290-508 / imagen43 SEQ.ID. NO.77

PheRSa1C3: ADN / Humana imagen44 SEQ.ID. NO.78

imagen45

Tabla 5B Puntos de unión de corte y empalme únicos de polipéptidos de PheRSa

FA-AS01: ADN / Humana / imagen46 SEQ.ID. NO.79

Proteína / Humana /: imagen15 SEQ.ID. NO.80

FA-AS04: ADN / Humana / imagen47 SEQ.ID. NO.81

Proteína / Humana /: N/D

Tabla 6 Polipéptidos y ácidos nucleicos de PheRSa identificados por Bioinformática

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imagen49

Ciertas realizaciones se refieren a polipéptidos de PheRSa aislados, que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en secuencias de aminoácidos que se han derivado de fragmentos polipeptídicos de PheRSa de origen natural, endógenos y composiciones farmacéuticas que comprenden dichos fragmentos, y métodos de uso de los mismos. Estas realizaciones y otras relacionadas pueden generarse o identificarse in vivo, ex vivo y/o in vitro. En 5 ciertas realizaciones in vitro preferidas, se generan o identifican fragmentos proteolíticos de PheRSa incubando un polipéptido de PheRSa, tal como un polipéptido de PheRSa de longitud completa, con una o más proteasas humanas aisladas, principalmente las proteasas que son endógenas o naturales de seres humanos, tales como elastasa y otras descritas en el presente documento y conocidas en la técnica. Otras realizaciones se refieren a polipéptidos de PheRSa aislados, que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en secuencias de

10 aminoácidos que se han derivado de variantes de corte y empalme de PheRSa de origen natural, endógenas, y composiciones farmacéuticas que comprenden dichos fragmentos, y métodos de uso de los mismos. Esencialmente, un fragmento proteico de PheRSa puede aislarse de muestras que se han expuesto a proteasas, bien in vivo o bien in vitro.

15 En ciertas realizaciones, pueden identificarse fragmentos proteicos de PheRSa mediante técnicas tales como espectrometría de masas, o técnicas equivalentes. Únicamente como ilustración y no como limitación, en ciertas realizaciones los proteomas de diversos tipos celulares, tejidos o fluidos corporales de diversos estados fisiológicos (por ejemplo, hipoxia, dieta, edad, enfermedad) o fracciones de los mismos pueden separarse por SDS-PAGE 1D y los carriles de los geles cortarse en bandas a intervalos fijos; después de lo cual las bandas pueden digerirse

20 opcionalmente con una proteasa apropiada, tal como tripsina, para liberar los péptidos, que pueden después analizarse por CL-EM/EM de fase inversa ID. Los datos proteómicos resultantes pueden integrarse en los denominados peptógrafos que representan, en el panel izquierdo, la cobertura de secuencia para una proteína dada en la dimensión horizontal (del extremo N a C terminal, de izquierda a derecha) frente a migración en SDS-PAGE en dimensión vertical (peso molecular de alto a bajo, de arriba a abajo). Los fragmentos peptídicos específicos pueden

25 después secuenciarse o mapearse. En ciertas realizaciones, el fragmento de referencia de PheRSa puede caracterizarse por su peso molecular único, en comparación, por ejemplo, con el peso molecular de la PheRSa de longitud completa correspondiente.

Como se indica anteriormente, las realizaciones de la presente invención incluyen los polipéptidos PheRSa

30 expuestos en la Tabla o las Tablas 1-3, o la Tabla o las Tablas 4-6, o la Tabla o las Tablas 7-9. También se incluyen "variantes" de los polipéptidos de referencia de PheRSa. La indicación "variante" polipeptídica se refiere a polipéptidos que se distinguen de un polipéptido de PheRSa de referencia mediante la adición, la deleción y/o la sustitución de al menos un resto de aminoácido, y que normalmente conservan (por ejemplo, imitan) o modulan (por ejemplo, antagonizan) una o más actividades no canónicas de un polipéptido de PheRSa de referencia.

35 Además, las Fenilalanil-a ARNt sintetasas humanas incluyen varios cientos de formas polimórficas altamente relacionadas, y se sabe en la técnica que estas son al menos parcialmente funcionalmente intercambiables. Sería por lo tanto un asunto rutinario seleccionar una variante de origen natural de Fenilalanil-a ARNt sintetasa, incluyendo, por ejemplo, las formas polimórficas de un único nucleótido enumeradas en la Tabla A para crear un

40 polipéptido PheRSa que contiene uno o más cambios de aminoácidos basados en la secuencia de cualquiera de los homólogos, ortólogos e isoformas de origen natural de ser humano así como otras especies de Fenilalanil-a ARNt sintetasa.

Tabla A SNP de Fenilalanil subunidad alfa ARNt sintetasa humana

Número de Referencia de GenBank: Cambio de Nucleótidos Número de Referencia de GenBank Cambio de Nucleótidos

rs117997664: G/T rs78379286 -/A

rs117532528: A/C rs78214285 C/G

rs117397150: C/T rs78009727 C/G

rs117345957: A/G rs77667575 C/G

rs117111613: A/G rs77471408 G/T

rs116999707: C/T rs77464836 A/G

rs116992783: C/T rs77258442 A/G

rs116324221: A/T rs77l36463 A/G

rs116144034: G/T rs77O92376 C/T

rs115925430: C/T rs76848673 A/G

rs115255943: C/T rs7672O345 A/T

rs115117231: A/C rs76491506 A/C

rs114790582: A/G rs75O98395 G/T

rs114717980: C/T rs74181681 A/G

rs114495724: A/G rs73925236 A/G

rs114312478: A/G rs73004683 A/T

rs114095713: A/G rs71168639 -/AA

rs113987774: C/T rs71168638 -/A

32

rs113870503: C/T rs71168637 -/TTT

rs113802496: C/G rs71168636 -/TT

rs113779830: A/G rs6663O592 A/G

rs11337574: -/T rs62109865 A/G

rs113324767: A/T rs61737507 G/T

rs113303874: C/T rs61242190 C/G

rs112863124: A/T rs6O848235 A/C

rs112443302: A/G rs60167882 A/G

rs112332431: A/G rs5953332l A/G

rs112235079: -/A rs57449367 A/T

rs111851259: C/T rs55923989 A/G

rs111757774: A/G rs455l2394 A/C

rs111730933: A/C rs36074715 -/G

ras111325496: C/G rs357O5523 -/T

rs111317860: A/C rs35636827 -/G

rs79300376: C/T rs35503400 -/C

rs79130552: A/C rs35498150 -/A

rs78937739: A/G rs35O87277 C/T

rs78601726: A/G rs347954O8 C/T

rs34586259: -/AAA rs5016037 A/G

rs34118249: A/G rs4542773 A/G

rs34026093: -/A rs3111317 A/G

rs33925420: A/G rs3111316 C/T

rs33919090: -/A rs297475O A/C

rs16978813: C/T rs2974749 A/G

rs12151216: C/T rs2967893 A/C

rs11673346: C/T rs2967890 C/T

rs11538254: C/T rs2967889 G/T

rs11538253: A/G rs2293683 A/G

rs10419627: A/G rs2009222 C/T

rs8108826: A/G rs2009218 A/G

rs8107173: A/G rs1804567 C/T

rs7508226: A/G rs1045913 C/T

rs7508225: A/G rs7252705 A/G

En ciertas realizaciones, una variante polipeptídica se distingue de un polipéptido de referencia en una o más sustituciones, que pueden ser conservativas o no conservativas, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. En ciertas realizaciones, la variante polipeptídica comprende sustituciones conservativas y, a

5 este respecto, se entiende bien en la técnica que algunos aminoácidos pueden cambiarse a otros con propiedades ampliamente similares sin cambiar la naturaleza de la actividad del polipéptido.

En ciertas realizaciones, una variante polipeptídica incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 10 97 %, 98 % o más identidad de secuencia o similitud con una secuencia correspondiente de un polipéptido de referencia de PheRSa, como se describe en el presente documento, y conserva sustancialmente la actividad no canónica de ese polipéptido de referencia. También se incluyen secuencias que difieren de las secuencias de PheRSa de referencia por la adición, la deleción o la sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o más aminoácidos pero que conservan las 15 propiedades del polipéptido de PheRSa de referencia. En ciertas realizaciones, las adiciones o supresiones de aminoácidos suceden en el extremo C-terminal y/o en el extremo N-terminal del polipéptido de referencia de PheRSa. En ciertas realizaciones, las adiciones de aminoácidos incluyen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más restos de tipo silvestre (es decir, del polipéptido de PheRSa de longitud completa correspondiente) que están próximos al extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal del polipéptido de

20 referencia de PheRSa.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos variantes difieren de las secuencias de referencia de PheRSa correspondientes en al menos un 1 %, pero menos del 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de los restos. (Si esta comparación requiere alineamiento, las secuencias deberían alinearse para similitud máxima. Las secuencias “omitidas” de

25 supresiones o inserciones, o desapareamientos, se consideran diferencias). Las diferencias son, convenientemente, las diferencias o cambios en un resto no esencial o una sustitución conservativa. En ciertas realizaciones, el peso molecular de un polipéptido de PheRSa variante difiere del polipéptido de referencia de PheRSa en aproximadamente 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% %, 11%, 12%, 13%, 14 %,15 %, 16%, 17 %,18 %, 19 %, 20% omás.

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división de MORPHOSYS™, Martinsried/Planegg, Alemania) usando técnicas de enriquecimiento de afinidad (selección). Los anticuerpos enriquecidos después de múltiples ciclos de exploración con los fragmentos de fenilalanil subunidad alfa ARNt sintetasas se caracterizan posteriormente por ELISA con respecto a reactividad con los fragmentos, y con la enzima de longitud completa parental. Se caracterizan adicionalmente clones que

5 demuestran unión preferente (por ejemplo, afinidad ≥ 10 veces mayor) con los fragmentos de fenillalanil subunidad alfa ARNt sintetasa.

Si no se consigue la especificidad necesaria al final de este proceso, se usan estrategias de resta, tales como etapas de preadsorción con la enzima de longitud completa y/o contraexploración, para eliminar anticuerpos de

10 reacción cruzada y conducir el proceso de selección hacia el epítopo o los epítopos únicos en los fragmentos de fenilalanil subunidad alfa ARNt sintetasa.

EJEMPLO 7

15 IDENTIFICACIÓN DE VARIANTE DE CORTE Y EMPALME USANDO PCR SISTEMÁTICA

Se transcriben de forma inversa moldes de ADNc para reacciones de PCR a partir de extractos de ARN totales de tejidos o células (p.ej., cerebro humano, IMR-32 y HEK293T). Se realizan reacciones de PCR usando cebadores específicos de fenilalanil subunidad alfa ARNt sintetasa, emparejando un cebador directo (FP1) diseñado para 20 hibridar con la región no traducida 5’ o exones en la mitad 5' del gen con un cebador inverso (RP1) diseñado para hibridar con exones en la mitad de 3’ del gen o la 3'UTR. Se analizan productos de ADN amplificados por electroforesis en gel de agarosa para identificar productos de PCR que son de un tamaño diferente que el fragmento amplificado de los transcritos canónicos. Estos productos de PCR diferentes se escinden y se purifican a partir del gel y se ligan en un vector de clonación convencional para análisis de secuencia de ADN. Se identifican variantes de

25 corte y empalme alternativas como secuencias diferentes de los transcritos canónicos. Se muestran variantes de corte y empalme identificadas por este enfoque de PCR sistemática en las Tablas 2, 5 y 8.

EJEMPLO 8

30 OPTIMIZACIÓN DE CODONES DE POLINUCLEÓTIDOS DE PHERSA SELECCIONADOS

Se seleccionan polipéptidos de PheRSa representativos (resumidos en la Tabla E2) para caracterización bioquímica, biofísica y funcional adicional basada en uno o más de los siguientes criterios, i) la identificación de fragmentos proteolíticos de polipéptidos de PheRSa, ii) la identificación de las variantes de corte y empalme de

35 polipéptidos de PheRSa, iii) la identificación de polipéptidos de PheRSa por análisis bioinformático, iv) pruebas de expresión diferencial de polipéptidos de PheRSa específicos, v) la estructura de dominio de la proteína de PheRSa, vi) el tamaño del polipéptido de PheRSa y vii) la minimización de secuencias duplicativas similares.

Tabla E2 Sumario de Polipéptidos de PheRSa Seleccionados para Optimización de Codones y Expresión Bacteriana

Nombre del polipéptido de PheRSa: SEQ ID NO para Polipéptidos de PheRSa marcados con epítopos SEQ ID NO para Polinucleótidos de PheRSa Restos de proteína PheRSa Localización de marcador epitópico Método de clonación/síntesis usado

PheRSa1N1: SEQ ID NO 48 SEQ ID NO 66 1226 Nterminal 1

PheRSa1N1: SEQ ID NO 49 SEQ ID NO 66 1226 Cterminal 1

PheRSa1N2: SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 67 1219 Nterminal 1

PheRSa1N2: SEQ ID NO 51 SEQ ID NO 67 1219 Cterminal 1

PheRSa1N3: SEQ ID NO 52 SEQ ID NO 68 1128 + 13 aa Nterminal 1

PheRSa1N3: SEQ ID NO 53 SEQ ID NO 68 1128 + 13 aa Cterminal 1

PheRSa1N4: SEQ ID NO 54 SEQ ID NO 69 1168 + 200508 Nterminal 1

PheRSa1N4: SEQ ID NO 55 SEQ ID NO 69 1168 + 200508 Cterminal 1

PheRSa1N5: SEQ ID NO 56 SEQ ID NO 70 1198 + S199R + 243508 Nterminal 1

PheRSa1N5: SEQ ID NO 57 SEQ ID NO 70 1198 + S199R + 243508 Cterminal 1

PheRSa1N6: SEQ ID NO 58 SEQ ID NO 71 1168 + 31 aa Nterminal 1

PheRSa1N6: SEQ ID NO 59 SEQ ID NO 71 1168 + 31 aa Cterminal 1

PheRSa1N7: SEQ ID NO 60 SEQ ID NO 72 1399 + 426508 Nterminal 1

PheRSa1N7: SEQ ID NO 61 SEQ ID NO 72 1399 + 426508 Cterminal 1

PheRSa1N8: SEQ ID NO 62 SEQ ID NO 73 1242 + 31 aa Nterminal 1

PheRSa1N8: SEQ ID NO 63 SEQ ID NO 73 1242 + 31 aa Cterminal 1

PheRSa1N9: SEQ ID NO 64 SEQ ID NO 74 1152 Nterminal 1

PheRSa1N9: SEQ ID NO 65 SEQ ID NO 74 1152 Cterminal 1

PheRSa1C1: SEQ ID NO 84 SEQ ID NO 90 459508 Nterminal 1

PheRSa1C1: SEQ ID NO 85 SEQ ID NO 90 459508 Cterminal 1

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PheRSa1C2: SEQ ID NO 86 SEQ ID NO 91 53 aa + 169508 Nterminal 1

PheRSa1C2: SEQ ID NO 87 SEQ ID NO 91 53 aa + 169508 Cterminal 1

PheRSa1C3: SEQ ID NO 88 SEQ ID NO 92 290508 Nterminal 1

PheRSa1C3: SEQ ID NO 89 SEQ ID NO 92 290508 Cterminal 1

Se sintetizan polinucleótidos que codifican los polipéptidos de PheRSa seleccionados enumerados en la Tabla E2, junto con el marcador epitópico N o C-terminal apropiado, y se clonan como se describe en la sección de Materiales y Métodos Generales usando la metodología de síntesis génica enumerada en la Tabla E2.

5

EJEMPLO 9

EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN BACTERIANA A PEQUEÑA ESCALA

10 Los polipéptidos de PheRSa enumerados en la Tabla E2 se expresan en E. coli, como se describe en la sección de Materiales y Métodos Generales. La expresión relativa de polipéptidos de PheRSa localizados en cuerpos de inclusión y solubles se resume en la Tabla E3 a continuación.

Tabla E3 Sumario de Características de Expresión Bacteriana de Polipéptidos de PheRSa

Polipéptido de PheRSa: Localización de Marcador Epitópico Cantidad de Proteínas Recuperada de Fracción Soluble Cantidad de Proteínas Recuperada de Cuerpos de Inclusión

PheRSa1N1: Nterminal +++ ND

PheRSa1Ni: Cterminal ++ ND

PheRSa1N2: Nterminal +++ ND

PheRSa1N2: Cterminal ++++ ND

PheRSa1N3: Nterminal + ND

PheRSa1N3: Cterminal ++++ ND

PheRSa1N4: Nterminal + ND

PheRSa1N4: Cterminal + ND

PheRSa1N5: Nterminal + ND

PheRSa1N5: Cterminal + ND

PheRSa1N6: Nterminal + ND

PheRSa1N6: Cterminal + ND

PheRSa1N7: Nterminal + ND

PheRSa1N7: Cterminal + ND

PheRSa1N8: Nterminal + ND

PheRSa1N8: Cterminal + ND

PheRSa1N9: Nterminal + ND

PheRSa1N9: Cterminal + ND

PheRSa1C1: Nterminal + +

PheRSa1C1: Cterminal + +

PheRSa1C2: Nterminal + +

PheRSa1C2: Cterminal + +

PheRSa1C3: Nterminal + +

PheRSa1C3: Cterminal + +

"+" representa 01 mg/l de expresión de polipéptido de PheRSa "++" representa 15 mg/l de expresión de polipéptido de PheRSa; "+++" representa 510 mg/l de expresión de polipéptido de PheRSa; "++++" representa 1015 mg/l de expresión de polipéptido de PheRSa; "+++++" representa ≥ 15 mg/l de expresión de polipéptido de PheRSa;

ND: no determinada

15 Sorprendentemente, los datos de expresión de proteínas demuestran la existencia de al menos dos dominios proteicos que muestran alto nivel de expresión de proteína soluble cuando se expresa en E. coli. Específicamente, los datos demuestran que los polipéptidos PheRSa PheRSa1N1 (aminoácidos 1-226), y PheRSa1N2 (aminoácidos 1129), definen los límites de un primer dominio proteico nuevo que se expresa en gran medida en E. coli. Adicionalmente, los datos demuestran que el polipéptido de PheRSa PheRSa1N3 (aminoácidos 1-128 + 13aa) define

20 el límite de un segundo dominio proteico nuevo que está altamente expresado en E. coli.

EJEMPLO 10

PRODUCCIÓN A GRAN ESCALA DE POLIPÉPTIDOS DE PHERSA

25 Se preparan polipéptidos de PheRSa representativos en cantidades mayores para permitir la caracterización funcional y biofísica adicional. Los polipéptidos de PheRSa enumerados en la Tabla E4 se expresan en E. coli en

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Los resultados de estos estudios establecen que proteínas de PheRSa representativas de la familia de PheRSa1N2 de proteínas de PheRSa, muestran rendimientos de expresión y características de solubilidad de proteínas iniciales razonables.

5 EJEMPLO 11

PERFIL DE TRANSCRIPCIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE PHERSA REPRESENTATIVOS

Para ensayar con respecto a la capacidad de los polipéptidos de PheRSa para modular la expresión génica, se

10 incubaron polipéptidos de PheRSa seleccionados con células madre mesenquimales o células del músculo esquelético humano durante los tiempos y a las concentraciones mostradas en la Tabla E5.

Tabla E5 Perfil de Transcripción de Polipéptidos de PheRSa Representativos en Células Madre Mesenquimales (MSC) o Células de Músculo Esquelético Humano (HSkMC)

Descripción de la Muestra de Ensayo: Tipo Celular y Tiempo de Exposición

Polipéptidos de PheRSa: Localización de Marcador Epitópico Concentración nM MSC 24 horas MSC 72 horas HSkMC 24 horas HSkMC 72 horas

PheRSa1N1: N-terminal 250 3 2 4 8

PheRSa1N1: C-terminal 250 2 3 6 13

PheRSa1N2: N-terminal 250 1 6 5 8

PheRSa1N2: C-terminal 250 7 13 9 18

PheRSa1N3: C-terminal 250 0 4 5 8

PheRSa1N9: C-terminal 250 5 4 3 11

Controles

Promedio entre todos los polipéptidos de PheRSa explorados: 3 5 6 7

Cóctel de Osteogénesis: 17 20 11 16

Cóctel de Condrogénesis: 17 19 14 19

Cóctel de Adipogénesis: 19 15 16 18

Ctrl Pos de SKMC: 11 8 5 4

No tratado: 0 0 1 1

En la Tabla E5, los números en cada columna representan el número de genes que se modularon, bien

15 positivamente o bien negativamente, al menos 4 veces en comparación con los genes de control, como se describe en la sección de métodos generales. Los datos muestran que formas específicas de los polipéptidos de PheRSa ensayados tienen la sorprendente capacidad de regular la transcripción, y por lo tanto modulan potencialmente el destino de desarrollo o estado de diferenciación cuando se añaden a Células Madre Mesenquimales (MSC) y/o Células de Músculo Esquelético Humano (HSkMC). Las células sombreadas con números en negrita en la tabla

20 representan ejemplos en los que el polipéptido de PheRSa muestra una influencia significativa en la regulación de la transcripción génica en las líneas celulares y los tiempos indicados en la tabla.

Se concluye que PheRSa1N1, PheRSa1N2 y PheRSa1N3 parecen ser reguladores importantes de la expresión génica de células mesenquimales y/o células del músculo esquelético humano.

25 EJEMPLO 12

PERFILES FUNCIONALES DE POLIPÉPTIDOS DE PHERSA

30 Para ensayar con respecto a la capacidad de los polipéptidos de PheRSa para modular una serie de procesos fenotípicos, se incubaron polipéptidos de PheRSa seleccionados con los tipos celulares, y las condiciones proporcionadas en la sección de métodos generales, y las Tablas E5 y E6.

Tabla E6 Clave para Ensayos y criterios para indicar un acierto

Ensayos de proliferación

Fuente y tipo celular: Número de Ensayo

Células de leucemia megacariocítica humana/Mo7e: A1

Células de leucemia promielocítica aguda humana/HL60: A2

Linfoblasto humano (línea celular de cáncer)/RPMI8226: A3

Células madre mesenquimales humanas/hMSC: A4

Astrocitos humanos: A5

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Células de aspirado de Médula Ósea humana/Células de Médula Ósea: A6

Células de aspirado de Médula Ósea humana/Células de Médula Ósea (Cultivo a Largo Plazo): A7

Sinoviocito Humano/HFLS-SynRA: A8

Células preadipocíticas humanas/hPAD: A9

Célula de músculo liso de arteria pulmonar humana/hPASMC: A10

Célula de músculo esquelético humano/hSKMC: A11

Se realizó análisis de datos para ensayos de proliferación dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de PheRSa eran proliferativos si estaban a más de 3 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva. Se consideró que un polipéptido de PheRSa derivado de ARNt sintetasa era citotóxico si estaba a más de 3 DT de distancia del valor de PBS en la dirección negativa. Se utilizó un compuesto citotóxico como un control negativo y el valor promedio para esto estuvo siempre a más de 3 DT de distancia del valor promedio de PBS.

Ensayos de diferenciación y fenotipo celular

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Captación de LDL acetilada por hepatocito humano (Células HepG2C3a): B1

Se realizó análisis de datos para ensayo de captación de ac-LDL dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de PheRSa eran un modulador de la captación de ac-LDL si estaban a más de 2 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Se realizó una comprobación visual para confirmar los resultados del lector de placas usando un microscopio fluorescente,

Ensayos de Neutrófilos Humanos

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Elastasa de Neutrófilo: C1

Estallido oxidativo de Neutrófilo (agonista): C2

Estallido oxidativo de Neutrófilo (antagonista): C3

Se realizó análisis de datos para ensayos de neutrófilos dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de PheRSa eran un modulador de la producción de elastasa o biología de estallido oxidativo de neutrófilos si estaban a más de 2 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa.

Modulación de Receptores de Tipo Toll (TLR)

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Activación de TLR en células RAW BLUE: D1

Antagonismo de TLR en células RAW BLUE: D2

Activación de hTLR2: D3

Activación de hTLR4: D4

Se realiza análisis de datos para ensayos de modulación de TLR dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de PheRSa eran un modulador de la biología específica de TLR si estaban más de 3 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Los controles positivos, incluyendo el LPS y el reactivo de detección, fueron siempre significativamente distintos y >3 DT del valor promedio del PBS.

Liberación de Citocina

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Producción de citocinas por sinoviocitos humanos (liberación de IL6): E1

Producción de citocinas por células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC) (liberación de IL6): E2

Producción de citocinas por células de músculo esquelético humano (hSKMC) (liberación de IL6): E3

Producción de citocinas por astrocitos humanos (liberación de IL6): E4

Liberación de IL6 de sangre completa: E5

Producción de citocinas por células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC) (liberación de IL8) Incubación de 72 h: E6

Producción de IL8

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Producción de citocinas por sinoviocitos humanos (liberación de IL8): E7

Producción de citocinas por células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC) (liberación de IL8): E8

Producción de citocinas por células de músculo esquelético humano (hSKMC) (liberación de IL8): E9

Producción de citocinas por astrocitos humanos (liberación de IL8): E10

Liberación de IL8 por hepatocitos humanos (células HepG2C3a): E11

Células de leucemia promielocítica aguda humana / HL60 (liberación de IL8): E12

Linfoblasto humano (línea celular de cáncer) / RPMI8226 (liberación de IL8): E13

Producción de TNF alfa

Producción de citocinas por sinoviocitos humanos (liberación de TNF alfa): E14

Liberación de TNF alfa de sangre completa: E15

Liberación de IL10

Células de leucemia promielocítica aguda humana / HL60 (liberación de IL10): E16

Células mononucleares de sangre primaria humana (liberación de IL10): E17

Se realizaron análisis de datos para ensayos de liberación de citocinas dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de PheRSa eran un modulador de la producción de citocinas o biología relacionada con citocinas si el valor medido estaba a más de 2 DT de distancia de valor de PBS en la dirección positiva o negativa. Se procesó un patrón proteico (específico para cada kit de ensayo) en cada placa para asegurar la buena calidad de ensayo. Solamente se eligieron ensayos con curvas patrón de proteínas que tenían un valor R2 > 0,9 para análisis de datos

Adhesión celular y quimiotaxis

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Adhesión celular de monocito THP 1/ Célula endotelial de vena umbilical humana (HUVEC): F1

Hepatocito humano (células HepG2C3a) (liberación de ICAM): F2

Regulación de la adhesión celular de células endoteliales microvasculares pulmonares humanas (HLMVEC) (liberación de ICAM): F3

Regulación de la adhesión celular de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) (liberación de VCAM): F4

Regulación de la adhesión celular de células madre mesenquimales humanas (hMSC) (Liberación de VCAM): F5

Regulación de la adhesión celular de células del músculo esquelético humano (hSKMC) (Liberación de VCAM): F6

Regulación de la adhesión celular de células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC) (liberación de VCAM): F7

Se realizó análisis de datos para ensayos de regulación de adhesión celular dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Se consideró que los polipéptidos de PheRSa eran un modulador de la adhesión celular o un regulador de la biología relacionada con la adhesión celular si se obtuvo un valor a más de 2 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa. En el caso de los ensayos de ELISA, se procesó un patrón proteico (específico para cada kit de ensayo) en cada placa para asegurar la buena calidad de ensayo. Solamente se seleccionaron ensayos con curvas patrón de proteínas que tenían un valor R2 > 0,9 para análisis de datos.

Diferenciación Celular

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

Diferenciación de células preadipocíticas humanas (hPAD): G1

Diferenciación de células de músculo esquelético humano (hSKMC): G2

Diferenciación de células madre mesenquimales humanas (hMSC): G3

Diferenciación de células de músculo liso de arteria pulmonar humana (hPASMC): G4

Se realizó análisis de datos para ensayos de diferenciación celular dividiendo el valor numérico en el pocillo de ensayo por el valor de PBS promedio para la placa de ensayo. Los ensayos de diferenciación se puntuaron basándose en la intensidad de fluorescencia de anticuerpos particulares como se describe en la sección de métodos. Se consideró que los polipéptidos de PheRSa eran un modulador de la diferenciación celular si un valor de intensidad para un marcador específico de diferenciación estaba a más de 2 DT de distancia del valor de PBS en la dirección positiva o negativa en un pocillo tratado dado. Para el análisis de hSKMC, se tomaron fotos digitales de todos los pocillos y las fotos se puntuaron con ocultación por tres personas usando un sistema de puntuación de 4 puntos en el que una puntuación de “4” indicó tinción de actina de músculo esquelético intensa y formación de miotubos evidente y una puntuación de "1" indicaba una falta de diferenciación o una supresión de la diferenciación. Se usó el valor promedio de la puntuación visual y solamente se consideraron aciertos pocillos con un valor promedio de ≥ 3. Los pocillos tratados con control de diferenciación en este ensayo normalmente puntuaron ≥ 2, mientras que los pocillos tratados con PBS puntuaron ≤ 2.

Unión Celular

Descripción del Ensayo: Número de Ensayo

PBMC: H1

Linfocito T primario: H2

Linfocito B primario: H3

Monocito primario: H4

HepG2: H5

3T3L1: H6

C2C12: H7

THP1: H8

Jurkat: H9

Raji: H10

Se consideró que los polipéptidos de PheRSa se unían con un tipo celular particular si esa proteína tenía unión específica que era mayor que el 25 % de una población celular, en la que el anticuerpo solo no tuvo señal significativa.

Tabla E7 Resultados de Estudios de Perfiles Funcional de Polipéptidos de PheRSa

Polipéptidos de PheRSa: Localización de marcador Epitópico Concentración [nM] Aciertos de Ensayo

PheRSa1N1: N-terminal 250 A7(Proliferación)

PheRSa1N1: C- terminal 250

PheRSa1N2: N-terminal 250 E6 (Liberación de Citocinas) G2(Diferenciación)

PheRSa1N2: C- terminal 250 E7 (Liberación de Citocinas) G1 (Diferenciación)

G2(Diferenciación)

PheRSa1N3: C- terminal 250 C2 (Activación de Neutrófilo) G2(Diferenciación)

PheRSa1N9: C- terminal 250 E4 (Liberación de Citocinas)

Se concluye que PheRSa1N1, PheRSa1N2, PheRSa1N3 y PheRSa1N9 parecen ser reguladores importantes de la proliferación, diferenciación, liberación de citocinas y activación de neutrófilos.

5 Cuando se ven en el contexto de los estudios de perfiles transcripcional, los datos de exploración fenotípicos demuestran que los polipéptidos de PheRSa PheRSa1N1 (aminoácidos 1-226) y PheRSa1N2 (aminoácidos 1-219) definen los límites de un primer dominio proteico nuevo que está altamente activo en una amplia serie de ensayos de exploración fenotípicos. Debe observarse que en la mayoría de los casos hay una diferencia significativa en la

10 actividad relativa de las versiones marcadas en el extremo N-terminal y las versiones marcadas en el extremo Cterminal de los polipéptidos de PheRSa particularmente en los experimentos de perfiles de transcripción, así como en los experimentos de exploración fenotípica. Los datos son coherentes con la hipótesis de que con estos polipéptidos de PheRSa, la nueva actividad biológica se suprime cuando el polipéptido de PheRSa es parte de la ARNt sintetasa intacta o está fusionado de forma traduccional con otra proteína, pero que esta actividad biológica se

15 revela cuando los polipéptidos de PheRSa tienen un extremo amino terminal o C-terminal libre.

En consecuencia se concluye que los polipéptidos de PheRSa que comprenden los aminoácidos 1-226 de la fenilalanil subunidad alfa ARNt sintetasa definen los límites aproximados (es decir en el intervalo de aproximadamente +/- 5 aminoácidos) de un primer dominio de polipéptido de PheRSa altamente activo, nuevo, que

20 es i) altamente funcionalmente activo, ii) puede prepararse fácilmente y producirse en E. coli, y iii) muestra características de estabilidad y agregación de proteínas favorables.

Los expertos en la materia apreciarán que cualquier polipéptido de PheRSa que comprenda tan pocos como los primeros 219 aminoácidos de la fenilalanil subunidad alfa de ARNt sintetasa, hasta tan grandes como polipéptidos 25 que comprenden los primeros 226 aminoácidos de la fenilalanil subunidad alfa de ARNt sintetasa representa equivalentes funcionales de los polipéptidos de PheRSa específicos descritos.

Los datos de exploración fenotípica también demuestran que los polipéptidos de PheRSa PheRSa1N3 (aminoácidos 1-128 +13aa) y PheRSa1N9 (aminoácidos 1-152) definen los límites de un segundo dominio proteico nuevo que está 30 altamente activo en una amplia serie de ensayos de exploración fenotípica.

En consecuencia, se concluye que los polipéptidos de PheRSa que comprenden los aminoácidos 1-152 de la fenilalanil subunidad alfa ARNt sintetasa definen los límites aproximados (es decir dentro de aproximadamente +/- 5 aminoácidos) de un segundo dominio de polipéptido de PheRSa, altamente activo nuevo, que i) es altamente

35 funcionalmente activo, ii) puede prepararse fácilmente y producirse en E. coli, y iii) muestra características de estabilidad y agregación de proteínas favorables.

Los expertos en la técnica apreciarán que cualquier polipéptido de PheRSa que comprenda tan pocos como los aminoácidos 1-128 de la fenilalanil subunidad alfa ARNt sintetasa, hasta tan grandes como polipéptidos que 40 comprenden los aminoácidos 1-152 de la fenilalanil subunidad alfa ARNt sintetasa representan equivalentes funcionales de los polipéptidos de PheRSa específicos descritos.

EJEMPLO 13

45 ESTUDIOS EN ANIMALES

Para ensayar la capacidad de los polipéptidos de PheRSa de modular la hematopoyesis y las respuestas inflamatorias, se administró un polipéptido de PheRSa representativo, PheRSa1N9, a ratones de tipo silvestre y DIO,

122

Claims

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