JPH09510351A - 等温鎖置換核酸増幅法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポリメラーゼおよび１組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる標的核酸配列の増幅方法。好ましくは、プライマーアレイが用いられる。該プライマーアレイは、２組のプライマーを含有する。１組は、少なくとも２個の相補的プライマーを含有する。他の組は、少なくとも２個のセンスプライマーを含有する。当該方法を用いると、増幅は、エキソヌクレアーゼ活性または制限エンドヌクレアーゼ活性を必要とせず、実質的に一定の環境条件下で行われ得る。

Description

【発明の詳細な説明】 等温鎖置換核酸増幅法 発明の分野 本発明は、熱サイクリングを用いずに核酸配列を増幅させるための方法に関す る。 発明の背景 本発明は、診断方法および核酸配列を増幅させるための技術に関する。特異的 な核酸配列（すなわち、標的核酸）の検出および定量化は、微生物の同定および クラス分け、感染疾患の診断、遺伝子異常性の検出および特徴付け、癌に関連す る遺伝子変化の同定、疾患に対する遺伝的罹病性の研究、種々のタイプの治療に 対する反応の測定、犯罪容疑者の同定、ならびに実父論争（paternity dispute ）の解決を含む多くの用途を有するますます重要になってきた技術である。 標的核酸配列の検出および定量化の一般的な方法は、核酸ハイブリダイゼーシ ョンである。核酸ハイブリダイゼーションは、典型的には、標的配列に相補的な 核酸配列を有する標識核酸プローブを用いる。該プローブは、ハイブリッド形成 に好適な条件下、標的配列を含有すると推測される試料と混合される。次いで、 該プローブは、試料中に存在する標的配列にハイブリダイズする。ハイブリダイ ゼーションは、当該技術分野でよく知られている種々の方法によって検出され得 る。これらの技術は、非ハイブリダイズプローブ上に存在する標識を選択的に分 解し、次いで、残存するハイブリダイズプローブと関連する標識の量を測定する ことを含む［アーノルド（Ａrnold）ら、ＰＣＴＵＳ８８／０２７４６］。 多くの方法は、核酸鎖（すなわち、核酸ポリマー）を増幅させて、標的配列の 量を増加させるのに利用可能である。これらの方法は、鋳型として標的配列を含 有する核酸鎖を用いて、標的配列を含有する相補的核酸鎖を産生する。かかる方 法としては、ムリス（Ｍullis）らによって開示されたような、ポリメラーゼ連 鎖反応法（ＰＣＲ）が挙げられる［Ｕ.Ｓ.特許第４,６８３,１９５号、第４,６ ８３,２０２号、および第４,８００,１５９号、ならびに、欧州特許出願第８６ ３０２２９８.４号、第８６３０２２９９.２号、および第８７３００２０３.４ 号、およびメソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)、第１ ５５巻、１９８７、第３３５−３５０頁を参照］。ＰＣＲは、標的配列を含有す る二本鎖ＤＮＡの２本の相補鎖についてのプライマーとしての一対の特異的なオ リゴヌクレオチドの使用を含む。該プライマーは、各相補的標的鎖の末端で、標 的配列の３'をハイブリダイズするように選択される。鋳型依存性ＤＮＡ合成法 は、各鎖について、適切な試薬の存在下、熱安定ＤＮＡポリメラーゼを用いて触 媒化され得る。熱サイクリングプロセスは、合成前に特異的なハイブリッドを形 成し、合成によって形成された二本鎖核酸を変性させることを必要とする。該サ イクリングプロセスを繰り返すと、標的核酸が幾何級数的に増幅する。ＰＣＲ法 は、ＤＮＡ鋳型を作製するためにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＲＮ Ａ標的と一緒に用いられてもよい。 ＰＣＲ法は、ＰＣＲ反応において用いられるプライマーのうち１個にプロモー ター配列を取り込み、次いで、ＰＣＲ法による増幅の後、一本鎖ＲＮＡ転写用鋳 型として二本鎖ＤＮＡを用いることによってＲＮＡ転写と結び付けられる［例え ば、ムラカワ（Ｍurakawa）ら、ＤＮＡ７：２８７−２９５（１９８８）を参照 ］。他の増幅法は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡ合成および転写の多サイクルを用いて、 ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を増幅させる［バーグ（Ｂurg）ら、ＷＯ８９／１０５ ０；ジンジャラス（Ｇingeras）ら、ＷＯ ８８／１０３１５（しばしば、転写増 幅系またはＴＡＳと称される）；カシアン（Ｋacian）およびフルツ(Ｆultz)、 ＥＰＯ出願第８９３１３１５４号；デイヴィ（Ｄavey）およびマレク(Ｍalek)、 ＥＰＯ出願第８８１１３９４８.９号；マレク（Ｍalek）ら、ＷＯ ９１／０２８ １８を参照］。アーディア(Ｕrdeａ)、ＷＯ ９１／１０７４６には、Ｔ７プロモ ーター配列を用いてシグナル増幅を達成する方法が開示されている。 リガーゼ連鎖反応（ＬＳＲ）は、欧州特許公開３２０,３０８に開示されてい る。この方法は、少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドを必要とし、そのうち の２つは、それらの各々の３'および５'末端がライゲーションのために並置され るように同一の核酸鋳型にハイブリダイズする。次に、ハイブリダイズしたオリ ゴヌクレオチドがライゲートされて、核酸鋳型上で相補鎖を形成する。次に、二 本鎖核酸は、変性され、第３および第４のオリゴヌクレオチドは、一緒に結合さ れた第１および第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。次いで、第 ３および第４のオリゴヌクレオチドは、一緒にライゲートされる。増幅は、ハイ ブリダイセーション、ライゲーション、および変性のさらなるサイクルによって 達成される。 ＰＣＴ公開第８７−０６２７０号およびＵ.Ｓ.特許第４,７８６,６００号に開 示されたＱβレプリカーゼ（ＱβＲ）法は、レプリカーゼ酵素による特異的転写 能を有する特異的なＲＮＡプローブを用いる。該方法は、レプリカーゼ開始部位 を有するＲＮＡプローブの設計および合成を必要とする。 パリンドロームプローブを用いる増幅法は、ＥＰＯ公開番号０４２７０７３Ａ および０４２７０７４Ａに開示されている。パリンドロームプローブは、核酸標 的配列を有するヘアピンを形成する。該プローブは、ＲＮＡ転写産物が産生され るヘアピン領域に位置する機能的プロモーターを含有する。 ウォーカー（Ｗalker）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ ミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,Ｕ. Ｓ.Ａ.）８９：３９２−３９６（１９９２年１月）、ウォーカーら、ニュークリ イック・アシッズ・リサーチ（Ｎucl.Ａcids Ｒes.）２０：１６９１−１６９６ （１９９２）、欧州特許出願番号ＥＰＯ ４９７２７２Ａ１、およひ欧州特許出 願番号ＥＰ ０ ５００ ２２４ Ａ２には、制限エンドヌクレアーゼを用いるオリ ゴヌクレオチド駆動式増幅法が開示されている。制限エンドヌクレアーゼは、Ｄ ＮＡ／ＤＮＡ複合体を切断して、伸長反応を可能にし、したがって、増幅を可能 にする。 ベッカー（Ｂecker）ら、ＥＰＯ出願番号第８８３０６７１７.５号には、プラ イマーが核酸配列にハイブリダイズされ、得られた二本鎖を伸長反応および増幅 の前に開裂する増幅方法が開示されている。 ノーナン,ケイ・イー（Ｎoonan,Ｋ.Ｅ.）ら、ニュークリイック・アシッズ・ リサーチ（Ｎucl.Ａcids Ｒes.）１６、１０３６６（１９８８）には、ｍＲＮＡ からのｃＤＮＡの合成のためのランダムな非特異的方法においてリバーストラン スクリプターゼをプライムするためにランダムヘキサマーを用いることが開示さ れている。所望の標的の増幅は、ＰＣＲを用いて行われる。 ファインバーグ,エイ・ピー（Ｆeinberg,Ａ.Ｐ.）ら、Ａnal.Ｂiochem.１３２ 、６（１９８３）およびリャン,ダブリュ（Ｌiang,Ｗ.）ら、ニュークリイック ・アシッズ・リサーチ（Ｎucl.Ａcids Ｒes.）１６、３５７９（１９８８）には 、一本鎖ＤＮＡを、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオ シド三リン酸、緩衝液、イー・コリ（Ｅ.coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ ウフラグメント、および標識デオキシヌクレオシド三リン酸と合わせることによ るＤＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡ鎖の合成が開示されている。 核酸を増幅するためのランダムプライミング増幅法（ＲＰＡ）として知られて いる関連方法は、ハートリィ（Ｈaetley）のＵ.Ｓ.特許第５,０４３,２７２号に よって開示されている。ハートリィの第２−３欄、第６３−２行によると、 該方法は、一本鎖鋳型核酸鎖を過剰のランダムオリゴヌクレオチドプライマ ーでプライムし、過剰量の誘発剤、鎖置換剤、およびヌクレオシド三リン酸基質 の存在下、一本鎖鋳型核酸鎖および過剰のランダムオリゴヌクレオチドプライマ ーをインキュベートして、核酸鎖をランダムに増幅させる工程を含む。 発明の概要 本発明は、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポリメラーゼおよび オリゴヌクレオチドプライマーを用いる標的核酸配列の増幅方法を特徴とする。 別法としては、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドプライマーが、プライマー のヌクレオリティック（nucleolytic）消化を防止または減少させる５'修飾を有 する場合、５'エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いて行わ れてもよい。好ましくは、増幅は、２組のプライマーからなるプライマーアレイ を用いて行われる。１組は、標的核酸に相補的な少なくとも２個のプライマーを 含有する。他の組は、標的核酸と同一センスの少なくとも２個のプライマーを含 有する。当該方法を用いると、増幅は、エキソヌクレアーゼ活性または制限エン ドヌクレアーゼ活性を必要とせずに実質的に一定の環境条件下で行うことができ る。好ましくは、増幅は、ＤＮＡ鋳型、および５'エキソヌクレアーゼ活性を欠 いている修飾バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂacillus stearothermophil us（Ｂst）ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。 各プライマーセットのオリゴヌクレオチドメンバーは、相補核酸鎖の鋳型依存 性合成のための開始点として、合成された相補鎖の置換を増強するために用いら れる。かくして、鎖置換および核酸合成は、１つの工程で行われる。これは、驚 くべき発見であり、本発明者らは、当該方法が機能する正確なメカニズムについ て不明確である。 プライマー１組だけが、鎖置換および核酸合成を行うのに必要であると思われ る。好ましくは、プライマーアレイを用いて、最初の鋳型およびその補体の両方 を増幅して、標的配列を指数関数的に増幅する。 好ましくは、核酸ポリメラーゼは、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いており 、当該方法は、イー・コリ（Ｅ.coli）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグ メントなどの酵素が最適に活性である温度よりも高い温度で行われる。該反応は 、３７℃よりも４３℃の方が有効である。最適な効率は、５０℃〜７０℃の温度 で得られる。 該方法は、好ましくは、ＤＮＡ上で用いられる。ＲＮＡ標的配列は、好ましく は、まず、例えばリバーストランスクリプターゼを用いてＤＮＡコピーを創作す ることによって増幅される。次いで、本明細書に記載する方法によって、ＤＮＡ コピーを増幅する。 しかしながら、本発明は、ＲＮＡ鋳型上でＲＮＡ相補鎖を合成する能力を有す る酵素を用いてＲＮＡ配列を直接増幅することができる。かかる酵素は、好まし くは、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている。例えば、マンガンと共に用い られるＱＢレプリカーゼは、この目的のために好適である。 かくして、第１の態様では、本発明は、標的核酸配列を含有する核酸鎖を、 ５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポリメラーゼ（５'−エキソ−マイ ナス（minus）ポリメラーゼ）、４種類のヌクレオチド、および少なくとも２個 の相補的オリゴヌクレオチドプライマーと接触させることによる標的核酸配列の 増幅方法を特徴とする。好ましくは、４種類のデオキシヌクレオチドおよび／ま たは３個以上のプライマーを用いる。増幅は、実質的に一定の温度で、プライマ ー伸長条件下で行われる。 関連する態様では、増幅は、５'エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメ ラーゼを用いるが、かかる活性が阻害される条件下で行われ、増幅は、接触工程 の伸長反応産生物に対して活性な制限エンドヌクレアーゼの不在下で少なくとも ２個の相補的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる。 別の関連する態様では、本発明は、標的核酸配列を含有する核酸鎖を、５'エ キソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポリメラーゼ（５'−エキソ−マイナス ポリメラーゼ）、４種類のヌクレオチド、少なくとも２個の相補的オリゴヌクレ オチドプライマー、および少なくとも２個のセンスプライマーと接触させること による標的核酸配列の増幅方法を特徴とするものである。増幅は、実質的に一定 の温度で、プライマー伸長条件下で行われる。好ましくは、相補的プライマーお よびセンスプライマーの合計数は、５より大きい。 増幅の前に存在する核酸鎖は、標的配列を含有する相補鎖の合成のための最初 の核酸鋳型として供される。該相補鎖は、核酸鋳型として作用して、最初の核酸 鋳型と類似の鎖を産生することができる。類似の鎖は、核酸鋳型として作用する ことができる。かくして、得られた標的配列の増幅は、幾何級数的である。 プライマー伸長条件は、オリゴヌクレオチドプライマーで開始される鋳型依存 性増幅が生じることができる条件を意味する。かかる条件は、一般的に、適切な 緩衝液、および、所望により、ポリメラーゼを安定化するかまたはプライマー伸 長反応を増強する他の化学物質の供給を含む。 「鋳型」とは、相補的核酸鎖の合成のための基質として供することができる、 ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸鎖を表す。 「標的配列」とは、オリゴヌクレオチドまたは核酸分子の単一の鎖の上に含有 される特異的な核酸配列またはそれに相補的な核酸配列を表す。 「相補的プライマー」とは、核酸鋳型上に存在する核酸配列に相補的な核酸配 列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを表す。相補的プライマーは、標的配 列に対して３'の領域において、核酸鋳型上で、核酸配列に相補的であるように 設計される。 「相補的」とは、オリゴヌクレオチドプライマーが、プライマー伸長反応で伸 長され得るような接触工程の条件下、核酸鋳型の領域にハイブリダイズすること ができることを意味する。一般的に、かかるオリゴヌクレオチドは、１５〜１０ ０塩基、好ましくは、約２０〜５０塩基の鋳型に対する相補性を有する領域を有 する。好ましくは、相補性を有する領域は、１００％相補的である。すなわち、 プライマー相補的領域における各ヌクレオチドは、一本鎖鋳型上に存在するヌク レオチドと水素結合することができる。 しかしながら、当業者は、鋳型に１００％未満相補的である相補的領域を有す るプライマーがこの方法で機能すると認識するであろう。一般に、かかる相補性 は、１８個の隣接塩基の中から１５個程度である。 「センスプライマー」は、核酸鋳型上に存在する核酸配列に類似のオリゴヌク レオチドを表す。センスプライマーは、標的配列に対して５'の鋳型上領域に類 似であるように設計される。 「類似の」とは、オリゴヌクレオチドが、必須的に、核酸鋳型におけるヌクレ オチド配列と同一または等価のヌクレオチド配列を有することを意味する。かく して、例えば、オリゴヌクレオチドは、核酸鋳型に存在するチミンの代わりにウ レシルを含有してもよい。類似のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、プライマ ー伸長条件下、核酸鋳型に相補的である核酸にハイブリダイズする場合、それら が相補的プライマーとして作用することができるような鋳型の充分な複製である 。 かくして、相補的プライマーおよびセンスプライマーへの言及は、特定の鋳型 に関して行われる。同一のプライマーが、特定の鋳型に類似であるかまたは相補 的であるかに依存して、相補的プライマーまたはセンスプライマーとして作用す ることができる。 核酸鋳型上に存在する標的配列のプライマー依存性増幅は、接触工程で行われ る。増幅の程度は、プライマーの数の増加に伴って増加することが判明した。１ ３個のプライマー（センスプライマー７個および相補的プライマー６個）を用い た実施例および２個のプライマー（相補的プライマー２個）を用いた実施例を以 下に示す。これらの実施例は、プライマーの、増幅を生じさせる能力を説明する が、本発明を限定するものではない。好ましくは、相補的プライマーセットおよ びセンスプライマーセットは、各々、２個よりも多くのプライマーを含有する。 好ましい具体例では、少なくとも４個のセンスプライマーおよび４個の相補的プ ライマーを用いる；少なくとも７個のセンスプライマーおよび７個の相補的プラ イマーを用いる；少なくとも１０個のセンスプライマーおよび１０個の相補的プ ライマーを用いる。 図面で説明するとおり、１組の相補的プライマーは、標的配列に対して３'の 領域において鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドからなる。１組のセンスプライ マーは、同一の鎖上での標的配列の５'領域において鋳型に類似のオリゴヌクレ オチドからなる。オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長反応が、他のオリゴヌ クレオチドプライマーとは異なる部位で、好ましくは、他のオリゴヌクレオチド プライマーが塩基対を形成する領域とは異なる部位で、核酸鋳型上で開始される ように選択される。好ましくは、プライマーセットにおけるオリゴヌクレオチド は、それらの最も近い５'および３'末端で１〜２００塩基によってお互いに離れ ており、好ましくは、１〜１０塩基によって離れている。 「４種類のヌクレオチド」とは、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチ ジン（Ｃ）チミジン（Ｔ）およびウリジン（Ｕ）の三リン酸塩、またはアデノシ ン、グアノシン、シチジン、チミジンまたはウリジンのヌクレオチド三リン酸の 代わりに用いることができる等価のヌクレオチドが核酸合成のための基質として 存在することを意味する。好ましくは、デオキシヌクレオチドが用いられる。 「増幅する」とは、標的配列の数を増加させることを意味する。 「接触する」とは、核酸鋳型、核酸ポリメラーゼ、４種類のヌクレオチド、お よびオリゴヌクレオチドプライマーアレイがプライマー伸長条件下で一緒にさせ られることを意味する。 「実質的に一定の温度」とは、プライマー伸長および該伸長産生物の変性を交 互に行うために、ポリメラーゼ連鎖反応において用いられるようないずれの意味 深い方法においても、ユーザーが温度を上昇または降下させようとしないことを 意味する。かくして、該温度は、鋳型:プライマー伸長産生物二本鎖が分解する 温度よりも低く維持される。好ましくは、該温度は、９０℃より低く維持される 。より好ましくは、該反応温度は、反応についての最適な温度付近に維持される 。一般的に、かかる最適値は、４２℃〜６０℃であり、好ましくは、５０℃〜７ ０℃である。 好ましい具体例では、該条件は、ＤＭＳＯの供給を含み；実質的に一定の温度 は、少なくとも４３℃、最も好ましくは、５０℃〜７０℃であり；該条件は、ヘ リカーゼなどの鎖分離剤、イー・コリ（Ｅ.coli）のＲecＡタンパクに対応する 活性を有するタンパクまたは一本鎖核酸結合タンパクから選択される少なくとも １個のヌクレオチド三リン酸を含み；ＤＮＡポリメラーゼは、５'エキソマイナ スＢstＤＮＡポリメラーゼＩまたは修飾Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼであり；オリ ゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１個は、５'非相補的領域を含む。Ｒec Ａタンパクは、本発明における増幅に必要ではなく、むしろ、かかる増幅を増強 させるために用いることができる。 「５'エキソヌクレアーゼマイナス」とは、核酸ポリメラーゼがそれに関連す る５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しないか、または、エキソヌクレア ーゼ活性が低下または不活化するように処理されたことを意味する。好ましい核 酸ポリメラーゼは、５'エキソヌクレアーゼマイナスＤＮＡポリメラーゼである 。５'エキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼの例としては、バ シラス・ステアロサーモフィラス（Ｂacillus stearothermophilus）由来のＤＮ ＡポリメラーゼＩのタンパク溶解性フラグメント、および、バーンズ(Ｂarnes) 、「熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ」(Ｔhermostable ＤＮＡ Ｐolymerase)、ＰＣ Ｔ／ＵＳ９１／０７０８４によって開示されているような除去された５'エキソ ヌクレアーゼ活性をコードするドメインを有するテルムス・アクアティカス （Ｔhermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。前掲のウォー カーによって開示されたクレノウフラグメントのエキソヌクレアーゼマイナスポ リメラーゼも使用され得る。 関連する態様では、本発明は、核酸標的配列を含有する核酸を、５'エキソヌ クレアーゼ活性を阻害する条件下であるが、該５'エキソヌクレアーゼ活性を有 してもよい核酸ポリメラーゼと接触させる工程によって核酸標的配列を増幅させ るための方法および手段を特徴とする。特に、少なくとも１個のオリゴヌクレオ チドプライマーは、核酸ポリメラーゼ中に存在する５'−エキソヌクレアーゼに よるヌクレオリティック分解に対して耐性であるように修飾される。好ましくは 、少なくとも１個の相補的プライマーおよび１個のセンスプライマーは、５'− エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性であるように修飾される。さらに好ましく は、全てのプライマーは、かかる分解に対して耐性である。 かくして、この態様では、接触工程は、４種類のオリゴヌクレオチド三リン酸 、少なくとも２種類の相補的オリゴヌクレオチドプライマーおよび少なくとも２ 種類のオリゴヌクレオチドセンスプライマー（このうち１個以上は、ブロックさ れている）を含有する。該反応は、接触工程の伸長反応産生物に対して活性であ る制限エンドヌクレアーゼの不在下、実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチ ドプライマー伸長条件下で行われる。 関連する態様では、増幅は、プライマーアレイ、および、５'−エキソ−マイ ナスＤＮＡポリメラーゼまたは５'−エキソヌクレアーゼ耐性プライマーと一緒 に用いられる５'−エキソヌクレアーゼ活性を含有するＤＮＡポリメラーゼのい ずれかを用いて行われる。 前記のとおり、本発明は、接触工程から得られるプライマー伸長反応の産生物 に対して活性である制限エンドヌクレアーゼを必要としない。かかる活性の存在 が必須であることが明白である前掲のウォーカーにおける開示とは対照的に、本 発明者らは、驚くべきことに、制限酵素が、接触工程でオリゴヌクレオチドプラ イマーによって用いられ得る一本鎖領域を創作するために必要とされないことを 見いだした。 かくして、別の態様では、本発明は、標的核酸配列を含有する核酸鎖を、５' エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポリメラーゼ、４種類のヌクレオチド 、１組の少なくとも２個の相補的オリゴヌクレオチドプライマー、および１組の 少なくとも２個のセンスプライマーと接触させることによる標的核酸配列の増幅 方法を特徴とする。該増幅は、伸長反応の産生物に対して活性である制限エンド ヌクレアーゼの不在下、実質的に一定の温度で、プライマー伸長条件下で行われ る。該増幅は、好ましくは、前記のとおり行われる。 関連する態様では、増幅は、５'−エキソヌクレアーゼ耐性プライマーと一緒 に５'エキソヌクレアーゼ活性を含有する核酸ポリメラーゼ；あるいは一本鎖Ｄ ＮＡ基質および５'−エキソ−マイナスＤＮＡポリメラーゼ、または、５'−エキ ソヌクレアーゼ耐性プライマーと一緒に用いられる５'エキソヌクレアーゼ活性 を含有するＤＮＡポリメラーゼのいずれかを用いる伸長反応の産生物に対して活 性である制限エンドヌクレアーゼを用いずに行われる。かかる増幅は、好ましく は、前記のとおり行われる。 本発明では、増幅は、標的配列の増幅の結果として蓄積する産生物を用いて、 所望の時間、進行させることができる。標的配列が分析的に関心のあるものであ る場合、標的配列の高感度検出は、本発明の方法で標的を増幅させ、次いで、当 該技術分野で知られている技術を用いて蓄積された増幅産生物を検出することに よって行われ得る。 本発明の増幅法は、多くの有意な利益を提供する。本発明の方法は、数種類の 酵素とは対照的に核酸ポリメラーゼだけを必要とし、特異的な核酸配列の増幅は 、より有効であり、ランダム増幅プロセスよりも試薬を必要とせず、時間の浪費 および扱いにくい熱サイクリングを必要としない。 本発明の他の特徴および長所は、好ましい具体例の以下の説明および請求の範 囲から明らかであろう。 図面の簡単な説明 図は、お互いに関連するプライマーおよび標的配列の位置を示す例である。該 図は、４個の相補的プライマー（「−」）、４個のセンス（「＋」）プライマー および標的配列（矩形ボックス）の位置を示す。 好ましい具体例の説明 本発明は、特異的にプライムされた鋳型依存性方法における核酸配列の核酸ポ リメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）およびオリゴヌクレオチドプライマ ー、好ましくはプライマーアレイとの合成を含む方法による、核酸または核酸混 合物中に存在する標的核酸配列の増幅方法を特徴とする。プライマーアレイは、 １組の相補的プライマーおよび１組のセンスプライマーからなる。核酸合成は、 相補的プライマーで開始される。理論に結び付けられずに、１個のプライマーか ら生じるプライマー依存性合成は、別のプライマーから合成された鎖の鎖置換を 生じると思われる。 かくして、増幅は、増幅および増幅の間に産生された二本鎖核酸の変性を交互 に行うために、増幅工程の間、温度、pＨ、またはイオン強度などの反応条件を 変えずに行うことができる。さらに、増幅は、エキソヌクレアーゼ活性または制 限エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて一本鎖基質を産生せずに行うこ とができる。 当該プロセスは、増幅されるべき異なる標的配列の各々についての、配列特異 的オリゴヌクレオチドプライマーのプライマーアレイで鋳型核酸鎖をプライムす る工程を含む。該混合物は、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド基質、および標的 核酸配列を増幅させるのに必要される必要なコファクターの存在下でインキュベ ートされる。 本明細書に記載される方法の結果としては、鋳型依存性核酸合成の多ラウンド が、予め合成された鎖の鎖置換を付随して生じる。置換された鎖は、「センスプ ライマー」と一緒に鋳型として作用することができ、これは、相補的プライマー として作用する。 オリゴヌクレオチドプライマー 「プライマー」なる用語は、プライマー伸長条件下で接触させた場合、核酸鋳 型上で核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチド（精製 した制限消化物におけるような天然または合成的に生成された）を意味する。適 切な条件としては、ヌクレオチド基質の存在、核酸ポリメラーゼ (例えば、５' −エキソ−マイナスＤＮＡポリメラーゼ)、実質的に一定の温度および好適なpＨ が挙げられる。核酸合成は、新しく合成された核酸鎖の配列が核酸鋳型の配列に 相補的である鋳型依存性手段で生じる。 プライマーの鋳型へのハイブリダイゼーションは、分子内または分子間水素結 合により生じるプライマー二次構造によって阻害される。かくして、該プライマ ーは、好ましくは、二次構造を欠いており、一本鎖化されている。鋳型へのハイ ブリダイゼーションを阻害する二次構造を有するプライマーは、増幅前に、その 鎖を処理して、変性させるかまたは分離するのが好ましい。 好ましくは、該プライマーは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、核酸ポリ メラーゼによる伸長産生物の合成のための基質として用いられるのに充分な長さ である。適切なプライマー長さは、温度、プライマーの構造、および該プライマ ーが用いられる方法を含むいくつかのファクターを考慮すべきである。例えば、 診断的用途については、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、標的配 列の複雑さに依存する少なくとも１５個のヌクレオチドを含有する。他の用途は 、短いオリゴヌクレオチドプライマーを必要とする。鋳型との安定なハイブリッ ド複合体を形成するために冷たい温度でこれらの他の用途を行うのが望ましい。 本発明で用いられるような核酸ポリメラーゼは、鋳型依存性手段において、リ ボ−またはデオキシリボ−ヌクレオチドの核酸ポリマーまたは鎖への合成を引き 起こす化学的、物理的、または生物学的薬物を意味する。核酸ポリメラーゼの例 としては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、５^'→３^' 方向で鋳型依存性手段において核酸合成を引き起こす。鋳型と合成鎖との間の相 補性のために、この方向は、鋳型上の３'領域から鋳型上の５'領域に向かってで ある。５'−３'エキソヌクレオリティック活性を欠いているバシラス・ステアロ サーモフィラス（Ｂacillus stearothermopilus）由来のＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｂst ＤＮＡポリメラーゼＩ）の大きなフラグメントは、好ましいＤＮＡポリ メラーゼである。他の好適なＤＮＡポリメラーゼとしては、クレノウポリメラー ゼおよびバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ヌクレオ リティック分解しにくい５'ブロックしたプライマーの使用は、５'−３'エキソ ヌクレオリティック活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用せしめるべきである 。 相補的プライマーは、核酸鋳型に相補的な領域を有するように選択される。該 プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映することを必要としないが、鋳型鎖 とハイブリダイズする能力を有しなければならない。非相補的塩基は、伸長反応 を生じることができるようにプライマー配列が核酸鋳型における対応する配列と ハイブリダイズするのに充分な相補性を有することを条件として、プライマー中 に散在され得る。新しく形成された伸長産生物は、置換すると、別の核酸合成の ための鋳型として作用することができる。 好ましくは、該プライマーは、非相補的５'領域を含有する。かくして、好ま しいプライマーは、核酸鋳型にハイブリダイズするのを可能にする相補的領域、 および非相補的領域を含有する。非相補的領域の存在により、鎖置換を増強する ことが見いだされた。 該プライマー配列は、デオキシリボヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣまたはＧのう ちの１個以上；および／または、リボヌクレオチド塩基Ａ、Ｕ、ＣまたはＧのう ちの１個以上および／または修飾がプライマーの核酸へのハイブリダイゼーショ ン、またはプライマーの伸長、または鎖置換を防止しない修飾ヌクレオチド（デ オキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）１個以上を含むことができる 。 プライマーは、化学的基を用いて、それらの行動を増強するか、または、増幅 産生物の特徴付けを促進するように修飾されてもよい。例えば、ある種のポリメ ラーゼのヌクレオリティック活性に対して耐性であるホスホロチオエートまたは メチルホスホナートなどの骨格修飾オリゴヌクレオチドは、かかる酵素を使用せ しめる。修飾の他の例は、プライマーの伸長を妨害しない非ヌクレオチドリンカ ー［例えば、アーノルド（Ａrnold）ら、ＥＰＡ ８８ ３０８ ７６６−０］を用 いることを含む。所望の修飾および天然ヌクレオチドの混合物を含有するオリゴ ヌクレオチドがよく用いられる。 プライマーは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位またはＲＮＡポリメラーゼに ついてのプロモーター部位などの酵素についての反応性部位を含有してもよい。 かかる部位の使用の例としては、増幅後の増幅産生物のクローニングおよび増幅 産生物の転写が挙げられる。かかる部位は、増幅に必要ではないが、増幅した核 酸の次の操作に役に立つ。 本発明のプライマーは、当該技術分野において知られている方法によって製造 することができる。好ましくは、該プライマーは、化学的方法によって合成され る。例えば、カルサーズ（Caruthers）ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー( ＭethodsＩn Ｅnzymology)、第１５４巻、第２８７頁（１９８７）には、ホスホ ジエステル結合によってヌクレオチドを連結するための標準的なホスホルアミダ イト固相化学法を用いることが開示されている。本発明の譲受人であるジェン− プローブ・インコーポレイテッドに譲渡された１９８９年６月３日に出願された 「有機リン化合物の硫化のための方法および試薬」（Ｍethod and reagent for sulfurization of organophosphorous compounds）と題されるバート（Ｂhatt） のＵ.Ｓ.出願第０７／３１９,５７０号には、モノチオリン酸エステル結合を含 有するオリゴヌクレオチドを合成するための方法が開示されている。「オリゴマ ーの合成についての改良されたプロセス」（Ｉmproved process for the synthe sis of oligomers）と題されるクレム（Ｋlem）らのＰＣＴ ＷＯ９２／０７８６ ４には、メチルホスホナート結合を含む種々の結合を有するオリゴヌクレオチド の合成が開示されている。(これらの文献は、出典明示により本明細書の一部と する)。 自動合成器は、オリゴヌクレオチド合成によく適している。自動合成器におい て、５'−保護した固定化（３'−ヒドロキシルを介して）ヌクレオシド残基を用 いて開始する。５'−脱保護後、亜リン酸エステル結合は、３'−ホスホルアミダ イト、５'−保護ヌクレオシド残基との反応によって導入される。次いで、亜燐 酸結合を酸化して安定な結合とし、該プロセスを、合成した配列中に導入される 所望のヌクレオチド残基を用いて循環させる。酸化方法は、典型的なリン酸エス テルまたはモノチオリン酸エステルを生じ得る［アーノルド（Ａrnold）ら、前 掲、ＥＰＡ８８ ３０８ ７６６−０］。非ヌクレオチドホスホルアミダイト誘導 体の導入は、自動合成の間に行うことができる。また、合成されたオリゴヌクレ オチドは、［例えば、Ｕ.Ｓ.特許第４,８１８,６８１号において開示されている ような］合成方法によってさらに修飾され得る。 プライマーの５'末端は、核酸ポリメラーゼ中に存在する５'−エキソヌクレア ーゼ活性に対して耐性であるように修飾することができる。かかる修飾は、「ヌ クレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合剤」(Ｎon-nucleotide Ｌinkin g Ｒeagents for Ｎucleotide Ｐrobe)と題されるアーノルド（Ａrnold）らのＵ .Ｓ.出願第０７／３１９,４２２号およびlabel-ＯＮ^TM試薬の使用を開示するＣ ＬＯＮＴＥＣＨ製品カタログ（出典明示により本明細書の一部とする）によって 開示されたような技術を用いて、非ヌクレオチド基をプライマーの末端５'ヌク レオチドに付加することによって行うことができる。 試験試料 一般に、精製形態または非精製形態の核酸の供給源は、標的核酸配列を含有す るかまたは含有すると推測されることを条件とする出発核酸として利用すること ができる。核酸の供給源および純度に依存して、出発核酸は、増幅前に精製する ことを必要としてもよい。出発核酸の精製は、好ましくは、核酸が増幅を阻害す る物質を含有する場合に行われる。核酸精製は、標準的な方法を用いて行うこと ができる。 標的配列は、一本鎖化または二本鎖化されてもよいＤＮＡまたＲＮＡ中に存在 してもよい。これらの核酸の混合物または前増幅からの核酸を用いることもでき る。核酸または核酸混合物は、同一または異なってもよい１個よりも多くの標的 核酸配列を含有してもよい。したがって、本発明は、同一または異なる標的核酸 鎖上に位置する１種類以上の標的核酸配列を同時に増幅するのに有用である。 所定の標的核酸を含有すると推測されるかまたは含有することが知られている 試料は、種々の供給源から得られてもよい。かかる供給源としては、生物試料； 食物または農業試料；環境試料；尿、血液、乳汁、脳脊髄液、痰、唾液、便、肺 吸引液などの体液または浸出液；および咽喉または生殖器綿棒が挙げられる。 増幅に適している核酸を得るために試験試料を処理するのが望ましい。例えば 、ある種の環境では、増幅前に、標的核酸を放出、抽出または変性するように試 験 試料を処理するのが望ましい。かかる処理は、増幅を阻害する不純物を除去し、 二次構造を最小限にするように核酸を変性させることかできる(すなわち、二本 鎖ＤＮＡおよびヘアピンループ)。これらの処理は、当該技術分野でよく知られ ている手段によって行うことができる。 プライマーは、標的核酸の特定の領域にハイブリダイズするように設計される 。好ましくは、２組のプライマーを用いる。１組のプライマー、相補的プライマ ーは、標的配列に対して３'の鋳型核酸上に存在する核酸配列にハイブリダイズ するように設計される。ハイブリダイゼーションは、相補的ヌクレオチド間の水 素結合に基づいて生じる。他の組のプライマー、センスプライマーは、標的配列 に対して５'の鋳型核酸上に存在する領域と類似であるように設計される。各プ ライマーセットのメンバーは、図面において概略的に示すように共直線的に配置 される。 両方の組のプライマーは、鋳型中に存在し、鋳型に相補的な標的配列が増幅さ れるように配置される。ＤＮＡポリメラーゼは、５'→３'方向で核酸合成を触媒 する(鋳型ヌクレオチドに関して３'鋳型領域から５'鋳型領域まで付加される)。 相補鎖は、相補的プライマーを用いて開始鋳型から生じる。相補鎖は、鋳型依存 性核酸合成についての鋳型として作用することができる。 センスプライマーが標的配列に対して５'の核酸鋳型上での領域と類似である 場合、相補鎖上での標的配列に対して３'の領域に相補的であろう。センスプラ イマーは、相補鎖に関する相補的プライマーとして作用することができる。鋳型 依存性核酸合成は、次いで、相補鎖上で生じることができ、これにより、多くの 標的配列を産生する。 異なる数の相補的およびセンスプライマーを用いて、標的配列を増幅させても よい。プライマーの数が増加するにつれて、増幅も増加することは、明白である 。かくして、相補的プライマーおよびセンスプライマーの合計数は、５を超える のが好ましい。好ましい具体例では、少なくとも４個のセンスプライマーおよび ４個の相補的プライマーを用いる；少なくとも７個のセンスプライマーおよび７ 個の相補的プライマーを用いる；ならびに、少なくとも１０個のセンスプライマ ー および１０個の相補的プライマーを用いる。相補的プイマーの数は、センスプラ イマーの数と等しい必要はない。例えば、２個のセンスプライマーおよび３個の 相補的プイマーの組合せを用いてもよい。 ＤＭＳＯなどのある種の有機溶媒を増幅反応に添加し、高温を用いると、実質 的な増幅およびストリンジェンシーが見られる。高温を用いて、鎖置換を増加さ せる場合、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性核酸ポリメラーゼを用い てもよい。選択された温度は、酵素が活性である温度範囲に依存する。 プライマー、核酸ポリメラーゼ、およびヌクレオチドは、所望の増幅の程度を 支持するのに充分な量で用いなければならない。ヌクレオチド類似体は、塩基対 、ＤＮＡポリメラーゼ、および鎖置換機能が、反対に、増幅が所望の程度に進行 しないという点に影響を及ぼされないという条件で、置換または添加され得る。 「鎖置換」とは、核酸ポリメラーゼによる鋳型依存性核酸合成のために生じる ５'→３'方向で核酸鋳型からの核酸鎖の分離を意味する。新しく合成し、置換し た核酸は、実質的には、鋳型核酸配列に相補的である同一のヌクレオチド配列を 有する。 好ましくは、鎖分離剤を用いて、鎖置換を増強する。鎖分離剤としては、ヘリ カーゼなどの酵素、ヘリカーゼ活性を有する酵素ＲecＡ、および一本鎖核酸結合 タンパクが挙げられる。核酸の鎖を分離するためのヘリカーゼの使用は、コール ド・スプリング・ハーバー・シンポジア・オン・クウォンティテイティブ・バイ オロジー(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｓymposia on Ｑuantitative Ｂiology)、第 ＸＬＩＩＩ巻、「ＤＮＡ：複製および組換え」(ＤＮＡ：Ｒeplication and Ｒec ombination)［ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー( Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory)、１９７８］に開示されており、ＲecＡの 使用は、ラディング(Ｒadding)、Ａnn.Ｒev.Ｇenetics、１６：４０５（１９８ ２）に開示されている。鎖分離は、コーンバーグ,エイ (Ｋornberg,Ａ.)、ＤＮ Ａ複製（ＤＮＡ Ｒeplication）ダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・カン パニー(Ｗ.Ｈ.Ｆreeman ＆ ｃo.)、カリフォルニア州サンフランシスコ、１９８ ０によって開示されている。ザーリング（Ｚarling）ら、Ｕ.Ｓ.特 許第５,２２３,４１４号（１９９３年６月）には、核酸ハイブリダイゼーション および増幅におけるＲecＡの使用が開示されている。 前記のような増幅は、標的配列の数を増加させることを意味する。増幅の程度 は、プライミングの速度または程度、またはプライマー伸長を増加させる条件ま たは薬物を用いることによって増加させることができる。例えば、鎖分離剤は、 ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換速度を増加させ得る。 広範囲の種々の方法が、標的配列を検出するのに利用可能である。例えば、ヌ クレオチド基質またはプライマーは、新しく合成したＤＮＡに取り込まれる検出 標識を含むことができる。次いで、得られた標識増幅産生物を未使用の標識ヌク レオチドまたはプライマーと分離し、該標識を分離された産生物フラクション中 で検出する。 有用な検出可能な標識として供される物質は、当該技術分野でよく知られてお り、放射性同位元素(例えば、³²Ｐ、³Ｈ、¹²⁵Ｉおよび¹⁴Ｃ)、蛍光性化合物、化 学発光性化合物、クロモフォア、ならびに、直接検出可能ではないが、特異的な 結合相手、例えば、各々がアビジンおよび抗体の標識形態との反応によって容易 に検出することができるビオチンおよびハプテンなどのリガンドが挙げられる。 別のアプローチは、検出可能な核酸プローブとハイブリダイズし、得られたハ イブリッドを慣用方法で測定することによって増幅産生物を検出することである 。特に、該産生物は、化学発光性アクリジニウムエステル標識核酸プローブを標 的配列にハイブリダイズし、非ハイブリダイズプローブ上に存在するアクリジニ ウムエステルを選択的に加水分解し、ルミノメーターで残存するアクリジニウム エステルから得られたケミルミネセンスを測定することによってアッセイするこ とができる。［例えば、アーノルド（Ａrnold）ら、前掲、ＰＣＴ ＵＳ８８／０ ２７４６、およびネルソン（Ｎelson）ら、ノンアイソトピック・ディエヌエイ ・プローブ・テクニクス(Ｎonisotopic ＤＮＡ Ｐrobe Ｔechniques)、第２７５ 頁、アカデミック・プレス(Ａcademic Ｐress)、サンディエゴ（クリッカ（Kric ka）編、１９９２）を参照（両文献とも、出典明示により本明細書の一部とする ］。 実施例 本発明は、以下の実施例によって、さらに説明されるが、それに限定されるも のではない。 実施例１：ＲＮＡ標的の増幅 この実施例は、ＤＮＡ鋳型を調製し、プライマーアレイおよび５'−エキソ− マイナスＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鋳型を増幅することによるリボゾー ムＲＮＡ（ｒＲＮＡ）標的配列の増幅を説明する。ＤＮＡ鋳型のｒＲＮＡからの 調製、および該鋳型の増幅は、ＤＮＡ鋳型の調製および増幅に必要な試薬を含有 する同一の反応容器中で行った。 この実施例で用いたプライマーアレイは、１３個のプライマーからなっていた 。該プライマーは、標準的なホスホルアミダイト化学によって調製した。プライ マーのうち７個は、相補的プライマー（ｒＲＮＡ標的に関する）であった。これ らのプライマーは、以下の核酸配列（５'→３'に記す）を有した： プライマーのうち６個は、センスプライマー（ｒＲＮＡ標的に関する）であった 。これらのプライマーは、以下の核酸配列（５'→３'に記す）を有した： クラミジア・トラコマチス(Ｃhlamydia trachomatis)［グリシン（Ｇlisin） ら、バイオケミストリー（Ｂiochemistry）１３：２６３３(１９７４)］から標 的２３Ｓ ｒＲＮＡを得、緩衝液（５０mＭトリス−ＨＣl (pＨ８.３)、３７.５m Ｍ ＫＣl、１.５mＭ ＭgＣl₂、１０mＭ ＤＴＴ）中に希釈した。可変量のｒＲＮ Ａ標的を、緩衝液（７％ＤＭＳＯ、５０mＭトリス−ＨＣl（pＨ８.３）７５mＭ ＫＣl、３mＭ ＭgＣl₂、および２mＭ ＤＴＴ）２０μl中でプライマー（７×１ ０-¹²mol）と混合し、６０℃で３０分間インキュベートして、プライマーをプレ ハイブリダイズした。次いで、プレハイブリダイズしたプライマーを０.２mＭ ＡＴＰ、０.２mＭ ＴＴＰ、０.２mＭ ＧＴＰ、０.２mＭ ＣＴＰ、２００ユニッ トのマロネーマウス白血病ウイルス(Ｍaloney Ｍurine Ｌeukemia Ｖirus)・リ バーストランスクリプターゼ(ＭＭＬＶ−ＲＴ)、および２ユニットのＢst ＤＮ ＡポリメラーゼＩで処理した。増幅を、３７℃で６０分間、次いで、６０℃で１ ２０分間行った。 次いで、増幅産生物を変性させ、ネルソン（Ｎelson）ら［前掲］に従って、 アクリジニウムエステル標識プローブを用いてアッセイした。９５℃で５分間イ ンキュベートすることによって変性を行った。アクリジニウムエステルで標識す るプローブは、ネルソン（Ｎelson）ら［前掲］による開示に従って行った。ア クリジニウムエステル標識プローブは、配列番号２７に相当する核酸配列を有す るように合成した。ハイブリダイゼーション緩衝液（１００mＭコハク酸リチウ ム(pＨ５.２)、８％ドデシル硫酸リチウム、１.５mＭ ＥＤＴＡ、および１.５m Ｍ ＥＧＴＡ）１００μl中、６０℃で１５分間、アクリジニウムエステル標識プ ローブ（２×１０^-11mol）を増幅産生物と一緒にインキュベートした。次いで、 試薬溶液（０.１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム、pＨ７.６、および５％（ｖ／ｖ）ト リトンＸ−１００）を添加し、６０℃で１０分間インキュベートすることによっ て、非ハイブリダイズプローブ上に存在するアクリジニウムエステルを加水分解 した。残存するケミルミネッセンスをルミノメーターで測定した。第１表に示す 結果は、本発明の増幅方法における標的核酸の滴定を示す。 実施例２：臨床検体の増幅 この実施例は、臨床試料（頸のスワブ試料）中に存在するｒＲＮＡ標的配列の 増幅を説明する。この実施例で用いたオリゴヌクレオチド、増幅方法、および検 出方法は、実施例１の記載に従った。この実施例では、用いた試料のタイプおよ び試料調製物は、実施例１と異なる。 頸のスワブ試料を回収し、陰イオン界面活性剤を含有する緩衝溶液（６０mＭ リン酸緩衝液(pＨ６.８)、６％ドデシル硫酸リチウム、２mＭ ＥＤＴＡ、および ２mＭ ＥＧＴＡ）中に懸濁させた。実施例１の記載に従って、該臨床検体を２３ Ｓクラミジア・トラコマチス（Ｃhlamydia trachomatis）rＲＮＡ １０-¹⁸molで スパイクし、プライマーとハイブリダイズさせ、増幅させ、検出した。臨床試料 中での標的核酸の好結果の増幅は、クラミジアｒＲＮＡを有しない臨床試料より も５０倍大きいＲＬＵを有するクラミジアｒＲＮＡを有する臨床試料によって示 される。 実施例３：増幅の特異性 この実施例は、標的配列および非標的配列（すなわち、アンプリコン（amplic on）の外側の転写物の領域）に向けたプローブを用いることによって特異的な標 的配列の増幅を説明する。この実施例で用いた標的核酸は、Ｔ７バクテリオファ ージの遺伝子１０から誘導した。特に、Ｔ７バクテリオファージの遺伝子１０の 一部を含有するｐＧＥＭＸ１のＸmaＩおよびＢanＩ消化物をｐＵＣ１９中にサブ クローン化した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた挿入物の発現により、長さ ８６３塩基のＲＮＡ産生物を得、この転写物を用いて、ＤＮＡ鋳型を産生し、次 いで、増幅させた。 プライマーアレイを用いて、標的配列を増幅させ、以下の核酸配列（５'→３' に記す）を有する４個の相補的プライマー（ＲＮＡ転写物に関する）： および、以下の核酸配列（５'→３'に記す）を有するＲＮＡ転写物と同一のセン スを有する４個のプライマー： を作製した。 実施例１の記載に従って、ハイブリダイゼーション、増幅、および検出を行っ た。アクリジニウムエステル標識プローブ、配列番号２２および配列番号２７を 用いて、標的配列の存在を検出した。非標識アクリジニウムエステル標識プロー ブ（配列番号２３）を対照として用いて、プライマー領域（例えば、相補的プラ イマーの３'およびセンスプライマーの５'）の外側で生じる非特異的増幅を測定 した。第２表に示した結果は、増幅が特異的であることを示す。 実施例４：増強された鎖置換 この実施例は、プライマーに結合した非相補的領域の鎖置換を増強する能力を 示す。相補的プライマーの２種類の組合せを用いて、鎖置換を測定した。両方の 組合せは、５'−³²Ｐ標識プライマー（配列番号１９）および別のプライマーを 含有した。１つの組合せにおける別のプライマーは、配列番号２４に相当した。 他の組合せにおける別のプライマーは、配列番号２５に相当した。配列番号２５ プライマーは、配列番号２４プライマーに類似しているが、５個の相補的ヌクレ オチドを有しており、５'非相補的領域を含有した。増幅は、Ｔ７バクテリオフ ァージ遺伝子１０の一部に相当するオリゴデオキシヌクレオチド鋳型上で行った 。配列番号２６に相当する鋳型は、実施例１の記載に従って合成した。 緩衝液（５０mＭトリス−ＨＣl(pＨ８.３)、３７.５mＭ ＫＣl、１.５mＭ Ｍg Ｃl₂、１０mＭ ＤＴＴ）２０μl中、該プライマー（４×１０^-12mol）を鋳型（ ４×１０^-13mol）と、７０℃で５分間インキュベートすることによってプレハイ ブリダイズし、次いで、該反応を、約２時間かけて室温（約２０〜２５℃）に冷 却した。次いで、０.１mＭ ＡＴＰ、０.１mＭ ＴＴＰ、０.１mＭ ＧＴＰ、０.１ mＭ ＣＴＰ、４ユニットのＢst ＤＮＡポリメラーゼＩを添加し、５０℃でイン キュベートすることによって増幅を行った。反応物のアリコットをホルムアミド ／ＥＤＴＡ溶液（５０％ホルムアミド １０mＭトリス−ＨＣl pＨ８.０、０. １mＭ ＥＤＴＡ）に移すことによって、５、１５および３０分の時点をとった。 該試料を変性用１５％ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、ランさせた。伸長産 生物およびプライマーに相当するバンドを該ゲルから切り出し、シンチレーショ ンカウンターにおけるセレンコヴ（Ｃerenkov）カウンティングによって分析し た。 第３表に示す結果は、鎖置換が５'非相補的領域を有するプライマーを用いて 有効であることを示す。「％産生物」は、伸長産生物の量を伸長産生物およびプ ライマーの量の合計で割ったものを意味する。５'非相補的領域を有するプライ マーを用いて観察された産生物の高いパーセンテージは、増加した増幅および鎖 置換を示す。 本発明の具体例は、全ての点で説明とみなされるべきであり、限定とみなされ るべきではなく、本発明の範囲は、前記説明によるよりも添付した請求の範囲に よって示され、したがって、請求の範囲の意義および等価の範囲内になる全ての 変更は、本発明に包含される。 他の具体例は、以下の請求の範囲内である。

【手続補正書】 【提出日】１９９７年４月７日 【補正内容】 （１）明細書第９頁１３行、「から選択される」とあるを、「；」と補正する 。 （２）請求の範囲を別紙のとおり補正する。 補正した請求の範囲 １．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、核酸 標的配列を含有する核酸鎖を、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポ リメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシトシンの三リン酸塩か ら選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、少なくとも３種類の相補 的プライマーと接触させる工程からなることを特徴とする核酸標的配列の増幅方 法。 ２．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、接触 工程の伸長反応産生物に対して活性である制限エンドヌクレアーゼの不在下、核 酸標的配列を含有する核酸鎖を、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸 ポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシトシンの三リン酸塩 から選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、少なくとも２種類の相 補的プライマーと接触させる工程からなることを特徴とする核酸標的配列の増幅 方法。 ３．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、核酸 標的配列を、核酸ポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシト シンの三リン酸塩から選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、少な くとも３種類の相補的オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程からなり 、１個の相補的プライマーが該接触工程において存在する５'−エキソヌクレア ーゼによるヌクレオリティック分解に対して耐性であるように修飾されることを 特徴とする核酸標的配列の増幅方法。 ４．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、接触 工程の伸長反応産生物に対して活性である制限エンドヌクレアーゼの不在下、核 酸標的配列を、核酸ポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシ トシンの三リン酸塩から選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、少 なくとも２種類の相補的オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程からな り、少なくとも１個の相補的プライマーが該接触工程において存在する５'−エ キソヌクレアーゼによるヌクレオリティック分解に対して耐性であるように修飾 されることを特徴とする核酸標的配列の増幅方法。 ５．少なくとも４個の相補的プライマーが用いられる請求項１または２記載の 方法。 ６．相補的プライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチドの距離によって離れ ている請求項５記載の方法。 ７．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、核酸 標的配列を含有する核酸鎖を、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポ リメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシトシンの三リン酸塩か ら選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、２〜３種類の相補的オリ ゴヌクレオチドプライマーおよび２〜３種類のセンスオリゴヌクレオチドプライ マーからなる少なくとも５種類のプライマーのプライマーアレイと接触させる工 程からなることを特徴とする核酸標的配列の増幅方法。 ８．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、核酸 標的配列を含有する核酸鎖を、核酸ポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、グア ノシンおよびシトシンの三リン酸塩から選択される少なくとも１個のヌクレオチ ド三リン酸、２〜３種類の相補的オリゴヌクレオチドプライマーおよび２〜３種 類のセンスオリゴヌクレオチドプライマーからなる少なくとも５種類のプライマ ーのプライマーアレイと接触させる工程からなり、少なくとも１個のセンスプラ イマーまたは少なくとも１個の相補的プライマーが該接触工程において存在する ５'−エキソヌクレアーゼによるヌクレオリティック分解に対して耐性であるよ うに修飾されることを特徴とする核酸標的配列の増幅方法。 ９．接触工程の伸長反応産生物に対して活性である制限エンドヌクレアーゼの 不在下、実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、核 酸標的配列を含有する核酸鎖を、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸 ポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシトシンの三リン酸塩 から選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、２種類の相補的オリゴ ヌクレオチドプライマーおよび２種類のセンスオリゴヌクレオチドプライマーか らなる少なくとも４種類のプライマーと接触させる工程からなることを特徴とす る核酸標的配列の増幅方法。 １０．接触工程の伸長反応産生物に対して活性である制限エンドヌクレアーゼ の不在下、実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、 核酸標的配列を含有する核酸鎖を、核酸ポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、 グアノシンおよびシトシンの三リン酸塩から選択される少なくとも１個のヌクレ オチド三リン酸、２種類の相補的オリゴヌクレオチドプライマーおよび２種類の センスオリゴヌクレオチドプライマーからなる少なくとも４種類のプライマーと 接触させる工程からなり、少なくとも１個のセンスプライマーまたは少なくとも １個の相補的プライマーが該接触工程において存在する５'−エキソヌクレアー ゼによるヌクレオリティック分解に対して耐性であるように修飾されることを特 徴とする核酸標的配列の増幅方法。 １１．核酸標的配列が標的配列を含有する一本鎖ＤＮＡであり、核酸ポリメラ ーゼがＤＮＡポリメラーゼである請求項７〜１０のいずれか１項記載の核酸標的 配列の増幅方法。 １２．少なくとも４個のセンスプライマーおよび少なくとも４個の相補的プラ イマーが用いられる請求項１１記載の方法。 １３．少なくとも７個のセンスプライマーおよび少なくとも７個の相補的プラ イマーが用いられる請求項１１記載の方法。 １４．少なくとも１０個のセンスプライマーおよび少なくとも１０個の相補的 プライマーが用いられる請求項１１記載の方法。 １５．隣接するセンスプライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチドの距離に よって離れており、隣接する相補的プライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチ ドの距離によって離れている請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法。 １６．２個の隣接するセンスプライマーが１０ヌクレオチドまでの距離によっ て離れており、２個の隣接する相補的プライマーが１０ヌクレオチドまでの距離 によって離れている請求項１５記載の方法。 １７．条件が鎖置換薬の供給を含む請求項１１〜１６のいずれか１項記載の方 法。 １８．鎖置換薬がヘリカーゼ、ＲecＡタンパク、および一本鎖核酸結合タンパ クからなる群から選択される請求項１７記載の方法。 １９．ＤＮＡポリメラーゼがＢst ＤＮＡポリメラーゼＩまたは修飾Ｔaq ＤＮ Ａポリメラーゼである請求項１１〜１８のいずれか１項記載の方法。 ２０．条件がＤＭＳＯの供給を含む請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法 。 ２１．実質的に一定の温度が少なくとも４３℃である請求項１〜１９のいずれ か１項記載の方法。 ２２．実質的に一定の温度が６０℃〜７０℃である請求項２１記載の方法。 ２３．オリゴヌクレオチドプライマーのうち少なくとも１個がさらに５'非相 補的領域を含む請求項９記載の方法。 ２４．少なくとも１個のセンスプライマーおよび少なくとも１個の相補的プラ イマーが接触工程において存在する５'−エキソヌクレアーゼによるヌクレオリ ティック分解に対して耐性であるように修飾される請求項８または１０記載の核 酸標的配列の増幅方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スピンゴラ，マーク アメリカ合衆国87108ニューメキシコ州 アルバカーキ、チュラ・ビスタ・プレイス 207番 (72)発明者 カシアン，ダニエル・ルイス アメリカ合衆国92124カリフォルニア州 サン・ディエゴ、タンバー・ロード3911番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、核酸 標的配列を含有する核酸鎖を、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポ リメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシトシンの三リン酸塩か ら選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、少なくとも３種類の相補 的プライマーと接触させる工程からなることを特徴とする核酸標的配列の増幅方 法。 ２．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、接触 工程の伸長反応産生物に対して活性である制限エンドヌクレアーゼの不在下、核 酸標的配列を含有する核酸鎖を、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸 ポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシトシンの三リン酸塩 から選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、少なくとも２種類の相 補的プライマーと接触させる工程からなることを特徴とする核酸標的配列の増幅 方法。 ３．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、核酸 標的配列を、核酸ポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシト シンの三リン酸塩から選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、少な くとも３種類の相補的オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程からなり 、１個の相補的プライマーが該接触工程において存在する５'−エキソヌクレア ーゼによるヌクレオリティック分解に対して耐性であるように修飾されることを 特徴とする核酸標的配列の増幅方法。 ４．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、接触 工程の伸長反応産生物に対して活性である制限エンドヌクレアーゼの不在下、核 酸標的配列を、核酸ポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシ トシンの三リン酸塩から選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、少 なくとも２種類の相補的オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程からな り、少なくとも１個の相補的プライマーが該接触工程において存在する５'−エ キソヌクレアーゼによるヌクレオリティック分解に対して耐性であるように修飾 されることを特徴とする核酸標的配列の増幅方法。 ５．少なくとも４個の相補的プライマーが用いられる請求項１記載の方法。 ６．少なくとも４個の相補的プライマーが用いられる請求項２記載の方法。 ７．相補的プライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチドの距離によって離れ ている請求項５記載の方法。 ８．相補的プライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチドの距離によって離れ ている請求項６記載の方法。 ９．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、核酸 標的配列を含有する核酸鎖を、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核酸ポ リメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシトシンの三リン酸塩か ら選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、２〜３種類の相補的オリ ゴヌクレオチドプライマーおよび２〜３種類のセンスオリゴヌクレオチドプライ マーからなる少なくとも５種類のプライマーのプライマーアレイと接触させる工 程からなることを特徴とする核酸標的配列の増幅方法。 １０．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、核 酸標的配列を含有する核酸鎖を、核酸ポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、グ アノシンおよびシトシンの三リン酸塩から選択される少なくとも１個のヌクレオ チド三リン酸、２〜３種類の相補的オリゴヌクレオチドプライマーおよび２〜３ 種類のセンスオリゴヌクレオチドプライマーからなる少なくとも５種類のプライ マーのプライマーアレイと接触させる工程からなり、少なくとも１個のセンスプ ライマーまたは少なくとも１個の相補的プライマーが該接触工程において存在す る５'−エキソヌクレアーゼによるヌクレオリティック分解に対して耐性である ように修飾されることを特徴とする核酸標的配列の増幅方法。 １１．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、Ｄ ＮＡ標的配列を含有する一本鎖ＤＮＡを、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いて いるＤＮＡポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシトシンの 三リン酸塩から選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、２〜３種類 の相補的オリゴヌクレオチドプライマーおよび２〜３種類のセンスオリゴヌクレ オチドプライマーからなる少なくとも５種類のプライマーのプライマーアレイと 接触させる工程からなることを特徴とするＤＮＡ標的配列の増幅方法。 １２．実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、Ｄ ＮＡ標的配列を含有する一本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ、アデノシン、チ ミジン、グアノシンおよびシトシンの三リン酸塩から選択される少なくとも１個 のヌクレオチド三リン酸、２〜３種類の相補的オリゴヌクレオチドプライマーお よび２〜３種類のセンスオリゴヌクレオチドプライマーからなる少なくとも５種 類のプライマーのプライマーアレイと接触させる工程からなり、少なくとも１個 のセンスプライマーまたは少なくとも１個の相補的プライマーが該接触工程にお いて存在する５'−エキソヌクレアーゼによるヌクレオリティック分解に対して 耐性であるように修飾されることを特徴とするＤＮＡ標的配列の増幅方法。 １３．少なくとも４個のセンスプライマーおよび少なくとも４個の相補的プラ イマーが用いられる請求項９記載の方法。 １４．少なくとも７個のセンスプライマーおよび少なくとも７個の相補的プラ イマーが用いられる請求項９記載の方法。 １５．少なくとも１０個のセンスプライマーおよび少なくとも１０個の相補的 プライマーが用いられる請求項９記載の方法。 １６．隣接するセンスプライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチドの距離に よって離れており、隣接する相補的プライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチ ドの距離によって離れている請求項９記載の方法。 １７．隣接するセンスプライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチドの距離に よって離れており、隣接する相補的プライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチ ドによって離れている請求項１３記載の方法。 １８．隣接するセンスプライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチドの距離に よって離れており、隣接する相補的プライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチ ドによって離れている請求項１４記載の方法。 １９．隣接するセンスプライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチドの距離に よって離れており、隣接する相補的プライマーが、各々、１〜２００ヌクレオチ ドによって離れている請求項１５記載の方法。 ２０．２個の隣接するセンスプライマーが１０ヌクレオチドまでの距離によっ て離れており、２個の隣接する相補的プライマーが１０ヌクレオチドまでの距離 によって離れている請求項１６記載の方法。 ２１．接触工程の伸長反応産生物に対して活性である制限エンドヌクレアーゼ の不在下、実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、 核酸標的配列を含有する核酸鎖を、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠いている核 酸ポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシトシンの三リン酸 塩から選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、２種類の相補的オリ ゴヌクレオチドプライマーおよび２種類のセンスオリゴヌクレオチドプライマー と接触させる工程からなることを特徴とする核酸標的配列の増幅方法。 ２２．接触工程の伸長反応産生物に対して活性である制限エンドヌクレアーゼ の不在下、実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、 核酸標的配列を含有する核酸鎖を、核酸ポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、 グアノシンおよびシトシンの三リン酸塩から選択される少なくとも１個のヌクレ オチド三リン酸、２種類の相補的オリゴヌクレオチドプライマーおよび２種類の センスオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程からなり、少なくとも１ 個のセンスプライマーまたは１個の相補的プライマーが該接触工程において存在 する５'−エキソヌクレアーゼによるヌクレオリティック分解に対して耐性であ るように修飾されることを特徴とする核酸標的配列の増幅方法。 ２３．接触工程の伸長反応産生物に対して活性である制限エンドヌクレアーゼ の不在下、実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、 ＤＮＡ標的配列を含有する一本鎖ＤＮＡを、５'エキソヌクレアーゼ活性を欠い ているＤＮＡポリメラーゼ、アデノシン、チミジン、グアノシンおよびシトシン の三リン酸塩から選択される少なくとも１個のヌクレオチド三リン酸、２種類の 相補的オリゴヌクレオチドプライマーおよび２種類のセンスオリゴヌクレオチド プライマーと接触させる工程からなることを特徴とする核酸標的配列の増幅方法 。 ２４．接触工程の伸長反応産生物に対して活性である制限エンドヌクレアーゼ の不在下、実質的に一定の温度で、オリゴヌクレオチドプライマー伸長条件下、 ＤＮＡ標的配列を含有する一本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ、アデノシン、 チミジン、グアノシンおよびシトシンの三リン酸塩から選択される少なくとも１ 個のヌクレオチド三リン酸、２種類の相補的オリゴヌクレオチドプライマーおよ び２種類のセンスオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程からなり、少 なくとも１個のセンスプライマーまたは１個の相補的プライマーが該接触工程に おいて存在する５'−エキソヌクレアーゼによるヌクレオリティック分解に対し て耐性であるように修飾されることを特徴とするＤＮＡ標的配列の増幅方法。 ２５．条件がＤＭＳＯの供給を含む請求項２３記載の方法。 ２６．実質的に一定の温度が少なくとも４３℃である請求項２３記載の方法。 ２７．実質的に一定の温度が６０℃〜７０℃である請求項２６記載の方法。 ２８．条件が鎖置換薬の供給を含む請求項２３記載の方法。 ２９．鎖置換薬がヘリカーゼ、ＲecＡタンパク、および一本鎖核酸結合タンパ クからなる群から選択される請求項２８記載の方法。 ３０．ＤＮＡポリメラーゼがＢst ＤＮＡポリメラーゼＩまたは修飾Ｔaq ＤＮ Ａポリメラーゼである請求項２３記載の方法。 ３１．オリゴヌクレオチドプライマーのうち少なくとも１個がさらに５'非相 補的領域を含む請求項２３記載の方法。 ３２．少なくとも４個の相補的プライマーおよび少なくとも４個のセンスプラ イマーが用いられる請求項２３記載の方法。 ３３．少なくとも７個の相補的プライマーおよび少なくとも７個のセンスプラ イマーが用いられる請求項２３記載の方法。 ３４．少なくとも１０個のセンスプライマーおよび少なくとも１０個の相補的 プライマーが用いられる請求項２３記載の方法。 ３５．少なくとも１個のセンスプライマーおよび１個の相補的プライマーが接 触工程において存在する５'−エキソヌクレアーゼによるヌクレオリティック分 解に対して耐性であるように修飾される請求項１０記載の方法。 ３６．少なくとも１個のセンスプライマーおよび１個の相補的プライマーが接 触工程において存在する５'−エキソヌクレアーゼによるヌクレオリティック分 解に対して耐性であるように修飾される請求項１２記載の方法。 ３７．少なくとも１個のセンスプライマーおよび１個の相補的プライマーが接 触工程において存在する５'−エキソヌクレアーゼによるヌクレオリティック分 解に対して耐性であるように修飾される請求項２２記載の方法。 ３８．少なくとも１個のセンスプライマーおよび１個の相補的プライマーが接 触工程において存在する５'−エキソヌクレアーゼによるヌクレオリティック分 解に対して耐性であるように修飾される請求項２４記載の方法。