KR101506727B1 - 나노-ｐｃｒ: 핵산 증폭 및 검출을 위한 방법 및 장치 - Google Patents

나노-ｐｃｒ: 핵산 증폭 및 검출을 위한 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

온도 순환에 대한 의존 없이 핵산 서열들의 증폭을 제공하여 통상적인 벤치탑 온도 순환 장치들로부터 핵산 서열의 증폭방법을 자유롭게 하는 방법, 장치, 및 조성물이 기재된다. 이중 가닥 핵산의 변성, 프라이머 어닐링, 및 중합효소에 의한 프라이머 연장의 정밀한 제어가 핵산에 응력을 적용하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 이 방법들은 통상적인 PCR 방법에 비해: PCR 과정에 대한 정밀한 제어; 전반적으로 개선된 충실도; GC-고함량 영역 또는 연속 반복 영역과 같은 문제성 있는 서열들에 대한 개선된 정확성; 증가된 서열 길이; 증가된 반응 수율; 감소된 실험 시간; 보다 큰 효율성; 보다 낮은 비용; 보다 높은 이동성; 및 온도, pH, 및 이온 강도와 같은 다양한 환경적 파라미터들에 대한 견고도;를 포함하는 하나 이상의 잇점을 제공할 수 있다.
중합효소 연쇄 반응, DNA 중합효소, 어닐링, 프라이머, 핵산 증폭, 병원균 검출, 장력, 미세유체 장치, 미세유체 채널.

Description

나노-ＰＣＲ: 핵산 증폭 및 검출을 위한 방법 및 장치{Nano-PCR: Methods and devices for nucleic acid amplification and detection}
본 발명은 핵산의 증폭 및 검출에 관한 것이다. 특정한 구체예에서, 본 발명은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)을 수행하는 개선된 방법, 장치 및 재료를 제공한다.
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 특정 DNA 서열 또는 RNA 서열을 증폭하기 위해 이용되는 통상적인 기법이 되었다. 1987년 7월 28일에 Mullis에게 허여된 미국특허 제4,683,202호 및 1987년 7월 28일에 Mullis 등에게 허여된 미국특허 제4,683,195호는 기본적인 PCR 기법을 개시한다. PCR 방법의 최초 공개 이후, PCR 방법은 생물공학 및 생물 의학의 실시에 심오한 영향을 끼치고 있다. 그 이후에 허여된 천 여건의 미국 특허는 상기 두 특허들 중 하나 또는 양자 모두의 개시내용을 원용한다.
통상적으로, DNA 서열의 증폭은 먼저 표적 DNA 서열의 양 말단에 상보적인 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 선택하고 수득하는 단계에 의해 수행된다. 프라이머, 중합효소, 4종류의 공통된 뉴클레오시드 트리포스페이트의 혼합물, 다양한 염류 및 완충용액을 표적 DNA와 혼합하고, DNA를 변성시키기 위해 이를 약 90℃까지 가열하여 표적 이중-가닥 DNA를 단일-가닥 DNA 주형으로 분리시킨다. 프라이 머의 DNA 주형 말단으로의 어닐링(즉, 서열-특이적 혼성화 또는 결합)은 약 60℃ 미만까지 반응 혼합물을 서서히 냉각시키는 것에 의해 수행된다. 그 후, 복제, 즉, 프라이머 연장(primer extension)으로도 알려진 과정 동안 온도를 약 70℃ 이상까지 증가시킨다. 중합효소는 각 DNA 주형 가닥을 3'에서 5' 방향으로 해독하고, 프라이머의 말단으로부터 상보적인 서열을 5'에서 3' 방향으로 합성한다. 이는 DNA 증폭의 1 사이클을 완성하고, 새로운 사이클을 위한 개시 물질을 생성한다. 각각의 완전한 사이클은 변성(denaturation), 프라이머 어닐링(primer annealing), 및 프라이머 연장(primer extension)으로 구성되며, 그 과정은 지수적으로 증가하는 수(2n)의 원래 표적 DNA 서열의 카피를 생성한다. 새로운 사이클을 개시하기 위해, 반응 혼합물은 다시 90℃ 이상까지 가열되어, 이중-가닥 생성물을 단일-가닥 DNA 주형으로 변성시킨다. 그 후, 프라이머 어닐링 및 연장 단계들이 반복된다.
이와 같은 기본적인 PCR 증폭 체계(scheme)는 다양한 확장 및 변형과 함께, 핵산의 조작 및 검출을 위한 다수의 상이한 방법들, 예를 들면, 진단 분석 및 법의학적 분석을 포함하는 방법들을 가능하게 하며, 이 방법들은 소량의 초기 시료로부터 역치 량(threshold amount)의 DNA를 생성하는 것을 필요로 한다. PCR 기술은 예를 들면, 전염성 질환 및 유전성 질환의 모니터링, DNA 및 RNA의 서열결정, 유전자 발현 연구, 약물 개발, 및 법의학적 핑거프린팅(forensic fingerprinting)에서 이용된다. 이는 바이러스성 병원균 및 세균성 병원균의 검출, 동정 및 정량을 위한 표준 기술이 되었다. 여러 가지 PCR-기반 진단 테스트들이 예를 들면, AIDS를 유발 하는 HIV-I; 간암을 유발할 수 있는 B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스; 경부암을 유발할 수 있는 인간 유두종 바이러스(human papillomavirus); 유아에서 폐렴 및 기관지염의 주요한 원인인 RSV; 여성에서 골반 염증성 질환 및 불임을 유발할 수 있는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및 네이세리아 고노로이애(Neisseria gonorrhoeae); 이식 환자 및 기타 면역 약화자(immuno-compromised)들에서 생명을 위협하는 질환을 유발할 수 있는 사이토메칼로바이러스(cytomegalovirus); 및 활성 상태에서 기침 및 피곤을 유발하고 감염된 기관을 회복불가능하게(irreversibly) 손상시킬 수 있는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis);를 포함한 병원균의 검출 및/또는 정량을 위해 이용가능하다. 그러나, 다수의 분야들에서 필요성을 충족시키고 있음에도 불구하고, 현재의 PCR 및 PCR-기반 기술들은 여전히 여러 근본적인 한계점들을 갖는다.
통상적인 PCR 및 PCR-기반 기술들의 한계점
충실도(Fidelity): 정상적인 서열에 대한 정확성이 통상적인 PCR을 제한한다. 예를 들면, DNA 증폭을 위해 통상적으로 이용되는 내열성(thermostable) 중합효소인 Taq은 PCR 동안 약 1 x 10-4개의 오류/염기쌍의 오류율을 보인다. 이는 400개의 염기쌍으로 구성된 DNA 서열의 PCR 증폭은 20회의 사이클 수행 동안 PCR 생성물의 모든 분자들 중에 약 40,000개의 오류를 임의적으로 도입할 것이라는 것을 의미한다.
어려운 표적 서열(예를 들면, GC 함량이 높은(GC rich) 서열 또는 반복 서열)에 대한 정확성은 통상적인 PCR 및 PCR-기반 기술들의 훨씬 중요한 한계점이다. Taq과 같은 통상적인 중합효소 반응의 오류율은 표적 뉴클레오티드 서열에 크게 의존한다. 예를 들면, 서열이 G+C 함량이 높은 경우(예를 들면, 닭의 아비딘 유전자의 5' 조절 영역에서 보는 바와 같은 서열), Taq에 의한 PCR은 종종 실행 가능한 방법이 아니다. 마찬가지로, 트리뉴클레오티드 반복 서열(AGC)n 또는 연속 반복 서열(tandem repeats) (A)n과 같은 단순한 반복 서열들은 Tag의 오류율을 반복 서열당 1.5 x 10-2개의 오류까지 증가시킬 수 있다. Shinde et al., Nucleic Acids Research, 31:974를 참조한다. 이 이유 때문에, 보다 높은 충실도(즉, 보다 낮은 오류율)를 갖도록 유전공학적으로 개발된(genetically engineered) 중합효소들에 대해 여러 특허들이 허여되었다. 이들은 Hi-Fidelity 및 Phusion 중합효소를 포함한다.
길이 제한: 증폭되는 표적 서열의 길이도 또한 현재의 PCR 기술을 제한한다. 일부 보고들은 10 내지 20 킬로베이스까지의 서열의 증폭을 주장하나, 이는 통상적인 실시에서는 매우 드물고 상당히 어렵다. 또한, 긴 표적 주형의 PCR 증폭은 한정된 세트의 적절한(well-behaved) DNA 서열들 상에서만 가능하다. 적절한 서열들 상에서 상당히 일상적이고 비용-효율적인 DNA 증폭을 위한 현실적인 상한은 약 300 내지 400개의 염기들로 구성된 길이이며 일반적으로 G-C 함량이 높은 서열들에 대해서는 그 상한이 낮아진다.
제한된 증폭: 현재의 PCR 기법들은 또한 하나의 반응 혼합물에서 수행될 수 있는 증폭 사이클의 수에서도 제한된다. 반복적인 가열 및 냉각 사이클은 점진적인 효소 분해(열화)를 초래하고, 이는 개시 물질이 증폭될 수 있는 증폭 계수(factor)를 제한한다. 통상적인 PCR 증폭이 30-35회의 사이클을 초과하는 경우는 매우 드물다.
견고도(Robustness): 통상적인 PCR은 일반적으로 상당한 용량의 시약, 부피가 큰 장치(예를 들면, 온도 순환기(thermal cycler)), 상당한 인간 노동력(예를 들면, 지루한 최적화), 및 최소량의 개시 물질을 필요로 하며, 각각은 통상적인 PCR을 비싸고 상당한 시간을 소요하는 방법으로 만드는데 기여한다. 현재의 PCR 기법들은 통상적으로 정상적인 서열들에 대해서는 수 시간 소요하나 어려운 서열들 또는 긴 주형들에 대해서는 수일 내지 수주를 소요한다. 통상적인 PCR 기법들은 반응 혼합물의 온도를 순환시키고 평형화시키기 위해 상당한 양의 시간을 필요로 한다. 또한, 이상적이지 않은 상태의 표적을 확실하게 증폭시키기 위해서는 시간이 소요되는 최적화가 요구된다.
통상적인 PCR 기법들의 수행을 위해서는 세밀하게 제어된 조건들(예를 들면, 온도, pH 및 완충용액 구성성분)이 요구된다. 또한, 다양한 오염물들이 표적 DNA 또는 RNA를 카피하기 위해 이용되는 중합효소를 직접적으로 억제하거나 방해하여 PCR 증폭을 방해할 수 있다. 이는 증폭을 위해 이용될 수 있는 개시 물질의 품질을 더 제한하고 증폭 단계들이 확실하게 수행될 수 있기 전에 DNA 또는 RNA 추출 기법에 의해 수득되어야 하는 순도의 수준에 추가적인 요건을 부과한다. 통상적인 PCR 의 수행 환경은 일반적으로 실험실로 한정되며, 원거리 장소, 의사의 진료실, 환자의 침상, 또는 야외에서는 거의 수행가능하지 않다.
진단의 민감도 및 특이성: PCR-기반 진단 및 법의학용 키트 및 분석법의 민감도는 PCR 반응에서 달성가능한 전체 수율, 정확도, 견고도, 및 표적 길이에 의존적이다. 현재의 PCR의 성능 파라미터들에 대한 전술된 한계점들은 PCR 증폭을 확실하게 수행하기 위해 필요한 개시 DNA 또는 RNA의 최소량에 한계를 설정한다. 이는 다시, 통상적인 PCR 또는 PCR-기반 기술에 의존하는 병원균 검출 시스템, 진단 또는 법의학용 키트 또는 분석법의 민감도를 제한한다. PCR-기반 진단, 법의학, 또는 병원균 검출 시스템의 특이성은 DNA가 증폭되고 해독되는 정확성 및 확실하게 증폭되고 확인될 수 있는 표적 DNA 또는 RNA의 길이에 중요하게(critically) 의존적이다.
이와 같은 이유들 및 기타 이유들 때문에, 현 세대의 PCR-기반 기술 및 검출 시스템은 전체 속도, 효율성, 비용-효율성, 및 용도의 범위 측면에서 일반적으로 제한된다. 통상적인 PCR 방법 및 장치들에 대한 점진적인 개선이 전술된 분리된 성능 파라미터들 중 일부에 대해 제안되었다. 예를 들면, Tso 등은 2003년 9월 2일에 허여된 미국특허 제6,613,560호에서 시료 유체의 미량(microquantities)을 이용하여 DNA를 증폭하는 PCR 마이크로반응기를 개시한다. 고온에서의 DNA 변성에 대한 대안이 또한 제안되었다. 예를 들면, Purvis는 2001년 9월 18일에 허여된 미국특허 제6,291,185호에서 이중-가닥 핵산의 전기화학적(electrochemical) 변성 방법을 개시했다. Stanley는 2001년 3월 6일에 허여된 미국특허 제6,197,508호에서 또 다른 핵산의 전기화학적 변성 방법을 개시한다. Dattagupta 등은 2001년 4월 10일에 허여된 미국특허 제6,214,587호에서 주형으로부터 DNA 가닥을 치환하기 위해 프라이머를 사용하는 방법을 개시했다. 또한, Mullis는 앞서(supra) DNA 가닥들을 분리하기 위해 헬리카제(helicase) 효소의 이용을 제안했다.
통상적인 PCR의 한계점들을 고려할 때, 다양한 점진적 개선에 대한 제안에도 불구하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 핵산의 증폭, 조작(manipulation), 서열결정(sequencing), 및 검출을 위한 개선된 방법, 장치 및 조성물에 대한 필요성이 존재한다.
본 명세서에 기재된 방법 및 장치는 PCR을 수행하는 혁신(breakthrough) 기술을 제공한다. 본 명세서에 기재된 기술은 PCR이 온도 순환(thermal cycling)에 대한 의존 없이 수행될 수 있게 한다. 본 기술은 광범위한 주위 온도에서 또는 제어된 온도들에서 적용될 수 있다. 복제 및 증폭 동안 필요한 경우 정확한 제어를 수행하는 것이 가능하고, 이에 의해, 다수의 성능 파라미터들에서의 실질적인 개선을 가능하게 한다. "나노-PCR(Nano-PCR)™"이라 불리는 이 기술은 핵산의 PCR-기반 검출 및 증폭에 새로운 패러다임을 도입한다.
본 발명의 구체예의 상세한 설명
정의
"핵산(nucleic acid)," "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)," 및 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"라는 용어는 본 명세서에서 리보뉴클레오티드(ribonucleotide) 또는 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 포함하기 위해 사용된다. 이 용어들 간에 길이에 대해 의도된 구분은 없다. 또한, 이 용어들은 해당 분자의 일차 구조만을 의미한다. 따라서, 특정 구체예들에서, 이 용어들은 삼중-가닥(triple-stranded), 이중-가닥 및 단일-가닥 DNA 및 삼중-가닥, 이중-가닥 및 단일-가닥 RNA를 포함할 수 있다. 그들은 또한 메틸화 및/또는 캡핑(capping)에 의한 것과 같은 폴리뉴클레오티드의 변형된 형태 및 변형되지 않은 형태들을 포함한다. 보다 상세하게는, "핵산," "폴리뉴클레오티드," 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어들은 (2-데옥시-D-리보오스를 포함하는) 폴리데옥시리보뉴클레오티드, (D-리보오스를 포함하는) 폴리리보뉴클레오티드, 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 기타 종류의 폴리뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드계 백본(nonnucleotidic backbone), 예를 들면, 폴리아미드를 포함하는 기타 중합체류(예를 들면, 펩티드 핵산(PNA)) 및 폴리모르폴리노(Anti-Virals, Inc. Corvallis, Oreg.로부터 Neugene으로 구입 가능함) 중합체, 및 중합체가 DNA 및 RNA에서 발견되는 바와 같은 염기 쌍 형성(base pairing) 또는 염기 스태킹(base stacking)을 가능하게 하는 배열로 핵염기(nucleobase)를 포함하는 경우, 합성 서열-특이적 핵산 중합체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "프라이머(primer)"는 적합한 온도 및 적합한 완충 용액에 담긴 적합한 조건들(즉, 4 종류의 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA 중합효소 또는 RNA 중합효소 또는 역전사 효소와 같은 중합(polymerizaiton) 작용제의 존재) 하에서 주형-유도(template-directed) DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 프라이머의 의도된 용도에 의존적이나 일반적으로 7개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이이며, 보다 일반적으로는 10개 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된 길이이다. 다른 프라이머들은 30 내지 50개의 뉴클레오티드로 구성된 길이와 같이 길이가 다소 더 길 수 있다. PCR 프라이머는 통상적으로 약 20-30개의 염기쌍으로 구성되는 길이이며 표적 서열의 상류에 위치한(즉, 5'에서 3' 방향) 한쪽 가닥 및 그 서열의 하류에 위치한(즉, 3'에서 5' 방향) 그 반대쪽 가닥에 상보적이게 선택된다. 프라이머의 5' 말단들은 증폭된 PCR 생성물의 말단들을 정의한다. 프라이머는 AT 함량과 거의 동일한 GC 함량을 포함할 수 있고 하나의 염기로 구성된 긴 부위(stretch)는 포함할 수 없다. 또한, 프라이머들은 상호 간에 실질적으로 상보적인 구조들을 포함해서는 안 된다. 이는 "프라이머 이량체(primer dimer)" 또는 다른 이차 구조가 형성되지 않는 것을 보장한다. 짧은 프라이머 분자들은 일반적으로 주형과 충분히 안정적인 하이브리드 복합체를 형성하기 위해 보다 낮은 온도들을 요구한다. 프라이머가 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없으나 주형과 혼성화되기에 충분한 정도로 상보적이어야 한다. "프라이머 부위(primer site)" 또는 "프라이머 결합 부위(primer binding site)"라는 용어는 프라이머가 혼성화되는 표적 DNA의 세그먼트를 의미한다. "프라이머 쌍(primer pair)"이라는 용어는 증폭되는 DNA 서열의 5' 말단의 상보체(complement)와 혼성화하는 5' "상류 프라이머(upstream primer)" 및 증폭되는 서열의 3' 말단과 혼성화하는 3' "하류 프라이머(downstream primer)"을 포함하는 일 세트의 프라이머를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "상보적(complementary)"이라는 용어는 하나의 핵산이 또 다른 핵산 분자와 일치(identical)하거나 또는 그에 선택적으로 혼성화된다는 것을 의미한다. 혼성화의 선택성은 특이성(specificity)의 완전한 부재보다 더 선택적인 혼성화가 일어나는 경우 존재한다. 통상적으로, 선택적인 혼성화는 14-25개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 부위에 대해 약 55% 이상의 일치성(identity), 대안적으로 65% 이상, 75% 이상, 또는 90% 이상의 일치성이 있는 경우 일어날 것이다. 대안적인 일 구체예에서, 하나의 핵산은 다른 핵산에 특이적으로 혼성화된다. M. Kanehisa, Nucleic Acids Res. 12:203 (1984)를 참조한다.
"완벽하게 상보적인(perfectly complementary)" 프라이머는 프라이머의 전체 길이에 걸쳐 완전히 상보적인 서열을 가지며 불일치(mismatch)를 포함하지 않는다. 프라이머는 통상적으로 표적 서열의 일부(서브서열)에 완벽하게 상보적이다. "불일치(mismatch)"는 프라이머의 뉴클레오티드와 그와 정렬된 표적 핵산의 뉴클레오티드가 상보적이지 않은 부위를 의미한다. 프라이머와 관련하여 사용되는 경우, "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"이라는 용어는 프라이머가 그의 표적 서열에 완벽하게 상보적이지 않고; 대신에, 프라이머가 원하는 프라이머-결합 부위에서 그의 각각의 가닥에 선택적으로 혼성화되기에 충분한 정도로만 상보적이라는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "프로브(probe)"는 하나 이상의 종류의 화학 결합, 통상적으로는 상보적 염기 쌍 형성을 통해, 통상적으로는 수소 결합 형성을 통해 상보적 서열의 표적 핵산에 결합하고, 이에 의해 이중가닥 구조(duplex structure)를 형성할 수 있는 핵산이다. 프로브는 "프로브 결합 부위(probe binding site)"에 결합하거나 또는 혼성화된다. 프로브는 특히 일단 프로브가 그의 상보적인 표적에 혼성화된 후, 프로브의 용이한 검출을 허용하기 위해 검출가능한 표지(label)로 표지로 표지될 수 있다. 프로브에 부착된 표지는 예를 들면, 화학 또는 물리적 수단에 의해 검출될 수 있는, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 다양한 표지들을 포함할 수 있다. 프로브에 부착될 수 있는 표지들은 방사성 동위원소, 형광발광단(fluorophores), 발색단(chromophores), 금 입자들, 양자점(quantum dots), 질량 표지(mass labels), 전자 밀집 입자(electron dense particles), 자성 입자(magnetic particles), 스핀 표지, 화학발광을 방출하는 분자, 전기화학적으로 활성인 분자, 효소, 보조인자(cofactor) 및 효소 기질들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 프로브는 크기가 상당히 다양할 수 있다. 일부 프로브는 비교적 짧다. 일반적으로, 프로브는 7개 내지 15개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이이다. 다른 프로브들은 20개, 30개, 또는 40개이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이이다. 또 다른 프로브들은 길이가 더 길고, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이이다. 그러나, 다른 프로브들은 길이가 보다 더 길고, 100개, 150개, 200개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 구성된 길이이다. 프로브들은 전술된 범위들 내에 속하는 임의의 특정 길이일 수 있다.
"호열성 DNA 중합효소(thermophilic DNA polymerase)"는 40℃를 넘는, 기능을 발휘하는 최적 온도를 갖는 내열성(thermostable) DNA 중합효소이다. 종종, 호열성 DNA 중합효소의 기능을 위한 최적 온도는 50℃ 내지 80℃, 또는 60℃ 내지 80℃의 범위이다. 이와 같은 내열성 효소들은 통상적인 PCR 동안 효소의 가열 및 냉각의 반복된 사이클에 대해 보다 견고도를 제공하기 위해 도입되었다.
"어려운 서열(difficult sequence)"은 중합효소가 그 위에서 미끄러지거나, 실책을 하거나 또는 작용을 중단하는 경향을 보이는 서열을 의미한다. 어려운 서열의 예들은 GC-고함량 서열(GC-rick sequence)이라 불리는 약 50%보다 높은 비율의 G와 C의 염기쌍을 갖는 일부 잔기들의 서열들(예를 들면, 6개, 9개, 12개, 15개, 또는 30개의 염기쌍 또는 그 이상의 길이의 세그먼트), 연속적인 반복 세그먼트를 포함하는 서열, 폴리-A 서열과 같은 폴리반복(polyrepeat) 서열, 헌팅턴 병과 같은 특정 질환과 관련된 서열에서 발견되는 트리뉴클레오티드 반복 영역, 및 기타 그와 같은 문제성(problematic) 서열을 포함한다.
통상적인 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 개요
호열성(즉, 내열성) DNA 중합효소를 이용한 표준 온도 순환식(thermal cycling) 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위해, 통상적으로 하기의 단계들을 실행한다: 1) 튜브에 PCR용 완충용액, dNTP 혼합물, 프라이머 쌍, DNA 중합효소, 및 이중-탈이온수(doubly dedionized water)를 포함하는 칵테일을 준비하는 단계; 2) 상기 튜브에 증폭될 DNA를 첨가하는 단계; 3) 상기 튜브를 온도 순환기(thermal cycler)(예를 들면, Perkin-Elmer™ 9600 또는 9700 PCR Thermal Cycler)의 온도 블럭에 배치하는 단계; 4) 약 25회 내지 30회의 사이클 동안 반복될 특정한 반응 조건(예를 들면, 약 1 내지 2분간 약 90℃ 이상까지 가열하여 이중-가닥 DNA의 열 변성을 수행하는 기간, 2분간 서서히 약 50 내지 65℃까지 냉각하여 어닐링하는 기간, 및 수분간 약 70 내지 75℃까지 가열하여, 프라이머 연장이라고도 불리는 중합을 수행하는 기간)으로 온도 순환기를 프로그래밍하는 단계. 상기 방법을 실행하면, 개시 물질의 약 2n배 증폭을 생성하고, 상기에서 n은 수행되는 증폭 사이클의 총 수이다. 통상적인 PCR의 일부 한계점들은 통상적인 기법이 일반적으로 수행되는 방법으로부터 유발되는 반면, 성능(performance) 파라미터에 있어서의 여러 한계점들은 직접 또는 간접적으로 온도 순환에 대한 의존으로부터 유발된다. 전체 반응 수율, 증폭 효율성, 민감도, 견고도, 및 이동성(portability)은 각각 예를 들면, 온도 순환에 의해 제한된다. Nano-PCR™ 방법은 온도 순환에 의한 한계점들뿐 아니라 통상적인 PCR의 일반적인 수행에 내재된 한계점들을 극복한다.
Nano-PCR™
Nano-PCR™ 방법 및 장치는 통상적인 방법들에 의해 부과되는 여러 한계점들을 타계하는 것에 의해 중합효소 연쇄 반응의 검출 및 증폭 능력을 비약적으로 확장시킬 수 있다. 표 1은 현재의 PCR의 일반적인 성능 파라미터들을 Nano-PCR™과 비교한다.
표 1: 현재의 PCR 대비 나노-PCR™의 성능 파라미터
성능 파라미터 현 세대 PCR Nano-PCR™ 방법 및 장치
정확도-정상적인 서열 약 1x10-4개의 오류/염기쌍의 전형적인 오류율 약 1x10-7개의 오류/염기쌍 미만의 오류율 또는 보다 개선이 가능함
문제성 있는 서열(GC-고함량 또는 반복 서열)의 복제시 정확도 약 1.5x10-2개의 오류/반복 서열의 전형적인 오류율 복제 과정의 정확성 제어를 통해 약 1.0x10-3개의 오류/반복 서열 미만의 오류율이 달성될 수 있음
증폭된 서열의 길이 통상적으로 약 300-400개의 염기쌍으로 한정됨 20,000개의 염기쌍까지의 연장된 서열을 증폭할 수 있음
전체 반응 수율 시약 및 중합효소 분해가 일반적으로 약 30-35회 사이클로 증폭을 제한함 시약은 DNA 증폭의 100회 이상의 사이클을 견딜 수 있음
비용 온도 순환기는 일반적으로 약 $4,000 이상 소요됨 Nano-PCR™을 수행하기 위해, 소형이고 비교적 값싼 장치가 제조될 수 있음
전체 PCR 반응 시간 수시간 내지 수일이 소요됨 1시간 미만으로 수행될 수 있음
이동성 실험실 환경에 한정된 벤치 탑(bench top) 장치에서 수행됨 휴대용 장치에서 수행될 수 있음
견고도 세밀하게 제어되는 운영 조건들,
즉, 온도, pH가 요구됨. 고도의 순수한 개시 물질이 필요함		 온도 및 pH 변이가 가능함. 보다 광범위한 개시 물질로 작업이 가능함. 가능한 오염물에 대해 보다 내성이 있고 개시 물질의 준비를 위해 보다 덜 정교한 추출 방법이 적용가능함
민감도 통상적으로 1000개 이상의 폴리뉴클레오티드/ml 분석물이 요구됨 10개 미만의 폴리뉴클레오티드/ml 분석물이 요구됨
특이성 진단용 키트에서 위 양성율(false positive)이 15%를 초과할 수 있음 진단용 키트에서 위 양성율이 12.5%보다 훨씬 낮을 수 있음. 개선된 특이성은 표적 DNA 또는 RNA의 서열을 확인하기 위해 이용되는 고비용의 사후-처리 및 생물정보학 단계들에 대한 필요성을 감소시킴
현재까지 실행되고 있는 PCR 및 PCR-기반 기술들의 공통 요소는 순차적으로 DNA를 변성하고, 프라이머를 어닐링하며, 중합효소를 통해 프라이머를 연장하는 온도 순환의 이용이었다. Nano-PCR™로 불리는, 본 명세서에 기재된 방법들 및 그 방법들을 수행하기 위한 장치는 DNA 또는 RNA 증폭을 수행하기 위한 온도 순환에 대한 새로운 대안을 제공하기 위해 핵산 분자에 제어된 양의 힘 또는 응력을 적용하는 것을 이용한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 핵산에 응력(stress)을 적용하는 것은 핵산을 신장(stretch) 또는 연장하는 경향이 있는 힘의 핵산에 대한 직접적 및 간접적 적용을 포함한다. 예로서, 응력은 핵산 분자 자체 및/또는 핵산에 결합된 표면, 기판(substrate), 또는 입자들 상에 작용하는지 여부에 관계없이, 기계적 장력(tension)의 직접 적용, 유체 흐름에서 수력학적 응력(hydrodynamic stresses) 또는 전자기장에 의해 핵산에 적용될 수 있다. 다수의 응용에서, Nano-PCR™은 전통적으로 통상적인 PCR의 성능 및 범위를 제한하고 있는 하나 또는 그 이상의 한계점들을 극복할 수 있다.
기계적 장력의 순환(Cycling of Mechanical Tension)
핵산에 대한 제어된 장력의 적용은 이중-가닥 DNA(ds DNA)의 열 변성에 대한 대안뿐 아니라 PCR 과정의 각 단계를 정확하게 제어할 수 있는 독특한 능력을 제공한다. Nano-PCR™은 DNA/RNA 분자 및/또는 중합 효소에 대한 기계적 응력, 수력학적 응력, 또는 전자기적 응력과 같은 정확하게 제어되는 힘의 효과를 이용하여 DNA 또는 RNA를 증폭하는 새로운 접근방법을 도입한다.
DNA 분자를 포함하는 용액의 온도를 증가시키는 것과 DNA 분자에 대한 응력을 증가시키는 것은 유사한 결과들을 생성한다. 따라서, 중합효소 반응 사이클은 DNA를 변성시키기 위해 DNA 주형에 적용되는 장력을 약 65 pN 이상까지 증가시키는 것에 의해 개시될 수 있다. 프라이머의 어닐링에 해당하는 단계는 프라이머가 주형에 어닐링될 수 있도록 DNA 주형에 대한 장력을 서서히 약 50 pN 미만까지 감소시키는 것에 의해 수행될 수 있다. 그 후, DNA 주형에서의 장력은 복제의 진행, 속도 및/또는 정확도를 제어하기 위해 효소에 의한 중합을 통한 프라이머의 연장 동안 약 0 내지 약 30 pN 내에서 조절될 수 있다. 통상적인 PCR의 온도 순환에서와 같이, Nano-PCR™ 방법에서는 응력의 순환이 사전에 프로그래밍된 사이클로 반복될 수 있다.
하기의 실시예들에서, 이 방법들이 실행될 수 있는 다양한 양식들이 기재된다. 기계적 장력과 같이, 핵산 분자에 적용된 수력학적 응력 및/또는 전기장이 온도 순환에 대한 의존 없이 Nano-PCR™을 수행하기 위해 순환될 수 있다. 물론, Nano-PCR™ 방법은 어떠한 온도 순환 없이도 수행될 수 있으나, 이는 이하에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이 온도의 제어가 일부 구체예들에서 유리하지 않을 것이라는 것을 의미하는 것은 아니다. 도 1a 및 도 1b는 Nano-PCR™ 방법의 대표적인 흐름도를 도시한다. 기본적인 프로토콜에 대한 변형 및 추가가 서열결정, 클로닝, 돌연변이생성(mutagenesis), 돌연변이 선별(mutant screening), 및 병원균 검출 등과 같은 특정 과제를 위해 적합하게 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다.
실온 및 표준 완충용액 조건들에서, 이중-가닥 DNA에 약 65 pN 이상의 장력을 적용하면 단일-가닥 DNA(ss DNA)로의 변성(즉, 융해)을 유발할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실온(room temperature)"은 편안한 실험실 온도의 정상적인 범위내의 온도, 일반적으로 약 20-22℃로 이해된다. 실온에서 DNA의 힘-유도 융해에 대한 이론적 모델이 Ioulia Rouzina 및 Victor A. Bloomfield에 의해 설명되었다("Force-Induced Melting of the DNA Double Helix 1. Thermodynamic Analysis" Biophys J., 80:882-93, 2001; 및, "Force-Induced Melting of the DNA Double Helix. 2. Effect of Solution Conditions" Biophys J., 80:894-900, 2001). 본 명세서에 기재된 바와 같은 Rouzina 및 Bloomfielding의 식을 이용하여, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 통상적인 융점 온도(melting point temperature) 계산과 유사한 방식으로 프라이머를 융해할 장력의 정확한 수준을 결정하는 것이 가능하다.
프라이머 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 적용된 장력을 약 65 pN 미만으로 서서히 감소시키면 온도 순환기에서 변성된 DNA를 프라이머의 융점 온도 미만으로 서서히 감소시키는 것와 유사한 방식으로 프라이머가 선택적으로 주형 DNA에 결합할 수 있게 한다. 따라서, 프라이머 어닐링 단계 동안, 핵산 주형 가닥에 적용된 장력은 ds DNA의 융해를 유발하는 양으로부터 프라이머 어닐링을 가능하게 하는 양까지 서서히 감소될 수 있다. 또한, 비-특이적 결합 및 비-특이적 프라이머 연장을 최소화하기 위해 결합되지 않은 프라이머가 반응 챔버로부터 제거(flush)될 때까지, DNA 가닥에 대한 장력을 중합효소 작용을 실질적으로 방해하는 수준에서, 예를 들면, 약 30 pN 또는 그 이상이나 약 50 pN 미만에서 유지하는 것이 바람직할 수 있다.
약 0 내지 약 30 또는 35 pN의 범위에 있는 장력을 핵산 주형에 적용하는 것이 중합효소 활성의 속도를 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 효소의 정확한 속도는 중합효소 및/또는 뉴클레오시드 트리포스페이트 기질의 주위(ambient) 온도 또는 주위 농도를 포함한, 다양한 인자들에 의존한다. 실온에서 약 35-45 pN보다 큰 장력은 중합효소의 자연적인 교정(proofreading) 엑소뉴클레아제 활성을 촉진한다.
Nano-PCR™ 방법의 대표적인 구체예는: (a) 표적 서열을 포함하는 이중-가닥 DNA(dsDNA)의 시료, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 예를 들면, 표적 서열의 3' 말단 및 그의 상보체(complement)에 상보적인 프라이머 쌍; 4 종류 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트(즉, ATP, CTP, GTP, TTP); 및 DNA 중합효소를 제공하는 단계; (b) 비-온도-구동 과정(non-thermally-driven process), 예를 들면, dsDNA를 ssDNA로 융해시키기에 충분한 장력(예를 들면, 약 65 pN을 초과하는 장력)의 적용을 이용하여 상기 dsDNA를 단일-가닥 DNA(ssDNA) 주형 가닥으로 변성시키는 단계; (c) 상기 비-온도 구동 과정을 제어하여, 프라이머의 상보적인 주형 가닥으로의 혼성화를 촉진하는 단계, 예를 들면, dsDNA를 변성시키기 위해 장력을 이용한 경우, ssDNA에 적용되는 장력을 감소시키는 경우; (d) 상기 DNAp(DNA polymerase)가 dsDNA를 형성하기 위해 프라이머를 연장하게 하는 단계; 및 (e) 원하는 양의 DNA 서열 증폭을 수득할 때까지 단계 (b-d)를 반복하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에서 "비-온도 구동 과정(non-thermally driven process)"의 이용은 예를 들면, dsDNA의 변성이 dsDNA의 융점 온도 이상까지 온도를 증가시키는 것을 통해서만 달성되는 것이 아니라, 온도에 의존하지 않는 물리적 또는 기계적 힘이 핵산에 적용된다는 것을 의미한다. 비-온도 구동 과정은 DNA 가닥에 장력을 적용하는 단계, 예를 들면, 기계적 힘의 직접 적용에 의해, 유체 흐름에 의해, 전기장의 적용에 의해, 및/또는 하나 이상의 변성제의 작용에 의해 장력을 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 그와 같은 힘의 효과는 온도에 의해 영향을 받을 수 있으므로, 주어진 상황에서 상기 방법의 하나 이상의 단계 동안 온도를 제어하고 선택적으로 조정하는 것이 바람직할 수 있다.
증폭될 표적 서열은 단리된 DNA 또는 핵산 혼합물에 포함될 수 있고 동일한 또는 동일하지 않은 길이의 상보적 가닥들 상에 포함될 수 있다. 방법은 또한 RNA를 포함하는 조성물로 개시하는 단계 및 역전사 효소 또는 유사한 방법을 이용하여 DNA 주형을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 표적 서열은 대안적으로 단일 가닥 핵산 상에 제공될 수 있고, 이는 제1 순환에서 단계 (b)가 불필요하게 한다. 단계 (a)의 반응 성분들은 절차의 개시시에 조합되거나 또는 필요에 따라 별도로 도입될 수 있다. 선택적으로, 반응 성분들은 또한 특정 단계들 동안 반응 챔버로부터 제거될 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오시드 트리포스페이트(NTPs)는 단계 (d) 동안, 또는 그 전에 도입될 수 있고 프라이머는 단계 (c) 동안, 또는 그 전에 도입될 수 있으며 결합되지 않는 프라이머는 프라이머 연장(복제) 단계 전에 챔버로부터 제거(flush)될 수 있다. 또한, 본 발명의 다양한 구체예들에서, 약 0-45 pN, 약 0-35 pN, 또는 약 0 내지 20 pN의 범위에 있는 장력이 단계 (d) 동안 주형 DNA 가닥에 적용될 수 있다. 그와 같은 구체예들에서, 단계 (d) 동안 주형 가닥에 적용되는 장력의 양은 선택적으로 시간에 따라 변할 수 있다. 단계 (d)에서 주형 가닥에 적용되는 장력의 양은 G-C 고함량 세그먼트(예를 들면, 약 50% 이상의 G-C 염기쌍 또는 70% 이상의 G-C 염기쌍을 포함하는 세그먼트)와 같은 어렵거나 또는 오류 발생이 잦은(error prone) 서브서열의 위치 또는 반복 서열을 포함하는 세그먼트의 위치를 기준으로 중합효소의 알려진 또는 추정된 진행에 따라 변할 수 있다.
정상 서열 및 "어려운(Difficult)" 서열에 대한 Nano-PCR™의 정확도
프라이머 연장 단계 동안 주형 DNA에 장력이 적용되는 경우, 중합효소는 "역 방향(reverse direction)"으로 유도되고 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성이 우세할 수 있다. 원자 수준 및 단일 중합효소/엑소뉴클레아제 단계의 순서에 대해 경시적으로, 그 과정은 확률적(stochastic)인 것으로 이해될 것이다. 그러나, 여러 단계들의 시간 규모에 대한 평균으로부터 고려하면, 중합효소는 적용되는 장력이 주어진 온도 및 용액 조건에서 이론적으로 예측될 수 있는 역치(threshold)보다 클 때, 지속적인(sustained) 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 것으로 보인다.
중합효소의 엑소뉴클레아제 활성이 우세해지는 역치 미만의 양으로 조정된 양의 장력, 예를 들면, 실온 및 정상적인 PCR 용액 조건들 하에서 약 35 내지 45 pN 미만, 보다 바람직하게는 약 10 내지 30 pN의 범위에 있는 양의 장력을 주형 DNA에 적용하는 것에 의해, Nano-PCR™은 통상적인 PCR에 비해 실질적으로 증가된 정확성의 DNA 복제를 제공할 수 있다. 또한, 이 효과는 통상적인 PCR 방법을 이용하기 어려운 서브-서열들에 대해 달성될 수 있다. 다소 문제성 있는(problematic) 세그먼트의 혼합을 포함하는 주형에 대한 프라이머 연장 동안 시간의 경과에 따라 주형 DNA 가닥에 적용되는 장력의 양은 0 내지 45 pN, 약 0 내지 35 pN, 또는 약 0 내지 20 pN의 범위에서 조절될 수 있다. 예를 들면, 서열의 맵에 따르면, 장력은 어려운 영역에 대해 증가된 정확성을 도모하기 위해 약 35 pN 미만의 수준까지 필요에 따라 증가시키고 그 후, 덜 문제성 있는 세그먼트 상에서의 보다 빠른 진행을 허용하기 위해 주의하여 감소시킬 수 있다. 주형 가닥의 길이는 프라이머 연장 동안 변한다. 방법들의 일부 변형들에서, 주형 가닥의 길이 변화에 대한 직접적인 대응으로 주형에 대한 장력을 조절하여 중합 반응의 진행 및 "어려운" 서브서열의 특정 위치에 따라 정확하게 적용되는 장력을 조정하는 것이 가능하다. 중합효소의 진행을 직접적으로 모니터링하는 것이 현실적이지 않은 구체예들에서, 중합효소의 위치는 적용된 장력의 양에서 중합효소의 공지된 복제 속도에 소요된 시간을 곱하는 것에 의해 추정될 수 있다.
따라서, Nano-PCR™은 통상적인 PCR 에 비해 실질적으로 증가된 정확도로 정상적인 표적 주형뿐 아니라 어려운 서열(예를 들면, GC-고함량 DNA, 연속 반복서열, 마이크로새털라이트(microsatellite) 또는 트리뉴클레오티드 반복 DNA)이 복제되고 증폭되는 정확한 복제를 가능하게 한다. 현재 이용가능한 가장 높은 충실도의 중합효소 중 하나(예를 들면, Phusion Enzyme)가 통상적인 온도-구동 PCR에서 이용되는 일 실시예에서, 유리한 경우들, 즉, 적절한 서열들 상에서 약 4.0 x 10-7개의 오류/염기쌍의 오류율이 관찰된다. 이와 대조적으로, 본 명세서에 기재된 Nano-PCR™ 방법들은 약 1.0 x 10-7개 미만의 오류/염기쌍의 오류율, 5.0 x 10-8개 미만의 오류/염기쌍의 오류율, 1.0 x 10-8개의 오류/염기쌍, 5.0 x 10-9개의 오류/염기쌍, 1.0 x 10-9개의 오류/염기쌍, 5.0 x 10-10개의 오류/염기쌍 또는 심지어 1.0 x 10-10개의 오류/염기쌍의 오류율을 가져올 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 방법들은 50 퍼센트, 60 퍼센트, 70 퍼센트, 75 퍼센트, 또는 심지어 80 퍼센트 또는 85 퍼센트보다 높은 GC 함량을 갖는 올리고뉴클레오티드 단편의 효율적인 증폭을 가능하게 할 수 있다.
특정 경우들에서, 올리고뉴클레오티드 단편은 8개 이상의 염기쌍으로 구성된 반복적인 염기쌍 단위들의 섹션(예를 들면, AAAAAAAA, GCGCGCGC)을 포함한다. 통상적인 PCR의 오류율은 그와 같은 경우들에서 증가되어, 통상적으로 1.0 x 10-2개의 오류/염기쌍에 접근한다. 본 발명의 Nano-PCR™ 방법은 약 1.0 x 10-3개 미만의 오류/염기쌍 미만의 오류율로 반복적인 염기쌍 단위들의 증폭을 제공한다. 특정 조건들 하에서, 1.0 x 10-4개 미만의 오류/염기쌍의 오류율, 1.0 x 10-5개의 오류/염기쌍, 1.0 x 10-6개의 오류/염기쌍, 또는 1.0 x 10-7개의 오류/염기쌍의 오류율이 달성될 수 있다. 이와 같은 낮은 오류율은 또한 반복되는 염기쌍 단위가 10개 이상의 염기쌍으로 구성된 길이, 15개 이상의 염기쌍으로 구성된 길이, 또는 20개 이상의 염기쌍으로 구성된 길이인 경우 수득될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법들에서, 그와 같은 결과들은 또한 통상적인 PCR 방법을 이용하는 경우 어려운 서열들인 마이크로새털라이트 영역, 중합효소 미끄러짐(slippage) 영역, 및 기타 연속 반복 영역에 대해 수득될 수 있다.
증폭 효율성
증폭 효율성이 식 N1 = N2(l+Y)n에 의해 정의되고, N1은 생성물 카피의 수이고, N2는 주형 올리고뉴클레오티드 카피의 수이며, n은 사이클의 수, Y는 효율성인 경우, 80 퍼센트보다 높은 효율성이 달성된다. 특정 조건들 하에서, 85 퍼센트, 90 퍼센트, 95 퍼센트, 96 퍼센트, 97 퍼센트, 98 퍼센트, 또는 심지어 99% 보다 높은 증폭 효율이 달성될 수 있다. 그와 같은 증폭 효율성은 또한 올리고뉴클레오티드의 GC 함량이 55 퍼센트, 60 퍼센트, 65 퍼센트, 70 퍼센트, 또는 심지어 75 퍼센트보다 높은 경우들에서도 수득될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 단편의 GC 함량이 50 퍼센트, 55 퍼센트, 60 퍼센트, 65 퍼센트 또는 70 퍼센트보다 높은 경우에서 50 퍼센트보다 높은 증폭 효율성이 달성될 수 있다. 60 퍼센트, 70 퍼센트, 80 퍼센트, 90 퍼센트, 95 퍼센트, 97 퍼센트, 또는 심지어 99 퍼센트보다 높은 효율성이 수득될 수 있다. 통상적인 PCR에서, 이와 같은 GC-고함량 영역들은 소디움 히드록시드, TMA 클로라이드, TMA 옥살레이트, TMA 아세테이트, TMA 히드로겐 술페이트, 암모늄 클로라이드, 벤질디메틸헥사데실암모늄 클로라이드, HTA 브로미드, HTA 옥살레이트, 베타인 모노하이드레이트, DMSO, 및 포름아미드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 변성제의 첨가와 함께 증폭되고 그 서열이 결정된다. Nano-PCR™의 특정 구체예들에서는 그와 같은 중합효소 연쇄 반응 첨가제의 부재 하에 본 명세서에 기재된 방법들을 이용한 효율적인 증폭이 관찰된다.
견고도 및 적응성(Adaptability)
통상적인 PCR 방법들은 일반적으로 온도의 정확한 제어 및 순환(cycling)에 의존한다. 또한, 통상적인 PCR 방법들은 다양한 변성제 및 지루한 최적화와 같은 추가적인 인자들을 필요로 할 것이다. 그러나, 본 명세서에 기재된 바와 같이 증폭을 추진하기 위한 장력 순환의 이용은 PCR 과정에 대해 온도 순환 단독에 의해 허용되는 것보다 훨씬 높은 정도의 정확도 및 제어를 가능하게 한다. 또한, 본 명세서에 기재된 방법들은 선택된 중합효소가 작용할 수 있는 온도 범위 및 주어진 장력에서 프라이머/주형 결합의 융점 온도와 같은 인자들에 의해서만 한정되고, 광범위한 온도 조건 하에서 작용할 수 있다.
물론, 온도가 장력 하에서 중합효소의 속도 및 정확도 및 DNA의 융해에 영향을 미칠 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일반적으로, dsDNA를 융해시키기 위해 요구되는 장력의 양은 온도 증가에 따라 감소된다. 개략적인 가이드로서, dsDNA를 융해시키기 위해 약 0 내지 20℃, 약 75 pN까지의 장력이 요구될 수 있다. 약 60℃에서, dsDNA를 변성시키기 위해 요구되는 장력의 양은 약 45 pN일 수 있다. 융해 장력(melting tension)은 유리 DNA 융점 바로 아래에서 약 7 pN까지 감소된다.
일반적으로는 필요하지 않으나, 개별적인 적용의 요건들에 따라 본 방법의 하나 이상의 단계들 동안 온도를 제어하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 반응 혼합물의 온도는 선택된 DNA 중합효소의 정확도, 중합 속도, 및/또는 장력 반응을 최적화하고, DNA 융해를 달성하기 위해 요구되는 장력의 양을 증가 또는 감소시키거나, 또는 개별적인 장치 또는 작업 환경 때문에 유리할 온도에서 유지될 수 있다. 달리 원하지 않는다면, 온도는 일반적으로 일정할 수 있고, 전체 과정은 정상적인 실온 또는 그 부근에서 수행될 수 있다. 달리 표시되지 않으면, 본 명세서의 실시예들은 실온에서 적합할 양의 장력을 이용하여 기재된다. 당업자는 보다 높거나 낮은 온도에 대해 DNA 주형에 적용되는 장력을 용이하게 조절할 수 있을 것이다.
소량의 장력의 적용을 통해서도, 열 순환 온도는 PCR 반응이 수행되어야 하는 온도에 더 이상 제한을 가하지 않는다. 약 7 내지 45 pN의 장력을 적용하는 것에 의해, 예를 들면, 이중-가닥 DNA가 변성되는 온도를 약 30℃까지 낮출 수 있다. DNA에 적용되는 장력의 양을 조정하여 통상적인 PCR에서 변성을 위해 요구되는 양보다 훨씬 낮은 온도에서 PCR의 수행을 가능하게 한다. 이 효과는 낮은 진폭(amplitude)의 온도 순환을 이용한 PCR을 가능하게 한다. 예를 들면, 방법은 약 65 pN 미만의 힘이 용액의 온도의 약 90℃ 미만까지, 대안적으로 약 80℃ 미만까지의 상승과 함께 조화되어 적용되는 변성 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 장치는 90℃ 미만의 온도에서 수행되거나 작동될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 변성 단계들은 80℃, 70℃, 60℃, 50℃, 40℃, 30℃, 또는 심지어 25℃ 미만에서 수행될 수 있다. 어닐링 단계들은 50℃, 45℃, 40℃, 35℃, 30℃, 또는 심지어 25℃ 미만에서 수행될 수 있다. 또한, 중합 단계들은 70℃, 60℃, 50℃, 40℃, 30℃, 또는 심지어 25℃ 미만에서 수행될 수 있다.
마찬가지로, DNA가 함침되는 용액의 pH 및 이온 강도가 DNA의 장력-유도 융해 곡선에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본 방법들에서 DNA에 적용되는 힘의 수준을 조절하는 것에 의해, Nano-PCR™은 통상적인 PCR에 비해 PCR 과정을 수행하기 위해 보다 광범위한 용액의 pH 및 이온 강도 조건을 이용할 수 있게 한다. 마찬가지로, 모든 이와 같은 파라미터들 및 추가적인 파라미터들은 프라이머 연장의 장력 제어에 영향을 미칠 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법들은 이 효과들을 위해 조절될 수 있고 심지어 이 효과들을 이용할 수 있다. 따라서, Nano-PCR™ 방법은 일반적으로 보다 광범위한 온도, 이온 강도, pH 및 완충용액 조건들에 대해 보다 견고(robust)할 수 있고, 이는 Nano-PCR™이 보다 광범위한 상황들에서 개시 DNA 또는 RNA의 보다 덜 엄격한 추출 및 정체를 요하며 수행될 수 있고, 통상적인 PCR의 범위를 일반적으로 제한하는 다양한 오염물질 및 효소 억제제들에 대해 보다 큰 내성을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 바람직한 구현들에서, 오염시키는 물질의 존재는 Nano-PCR™ 과정의 일부로서 시료를 플러싱(flushing)하는 것에 의해 제거될 수 있다. 예를 들면, 오염물질을 포함하는 정제되지 않은 DNA 시료가 Nano-PCR™ 장치로 도입될 수 있고, 그 DNA는 예를 들면, 장력의 제어된 적용을 위해 DNA를 유지시키는, 본 명세서에 기재된 수단에 의해, 반응 챔버 내에 유지된다. 오염물질은 반응 챔버로서 플러싱되어 제거되고 시약들은 챔버 내로 플러싱되어 공급된다. 이는 Nano-PCR™ 과정에 실질적인 견고도를 제공하여, 통상적인 PCR에 적합하지 않은 환경에서 신속하고 정확한 증폭을 가능하게 한다.
기계적 힘의 직접 적용을 이용한 Nano-PCR™
Nano-PCR™ 방법들은 DNA 변성 및/또는 DNA 중합효소 활성의 정확한 제어를 제공할 수 있는 비-온도-구동 과정으로서 DNA 가닥에 기계적 장력을 직접 적용하는 다양한 방법들을 이용하여 수행될 수 있다. 이중-가닥 올리고뉴클레오티드에 장력을 적용하는 여러 상이한 방법들이 있다. 예를 들면, DNA 가닥들은 이동가능한 요소, 개별적으로 제어가능한 요소, 또는 조작될 수 있는 입자들에 어레이(array)로 고정될 수 있다.
대향하는 코팅된 표면(opposed coated surface) 이용:
일 예로서, 도 2a-도 2c에 도시된 바와 같이, 대향하는 코팅된 표면들에 고정된 핵산을 이용하는 방법이 수행될 수 있다: 코팅된 표면들은 각 표면에 대해 동일하거나 또는 상이할 수 있는 제1 복합체화 분자(complexing molecule)(예를 들면, 스트렙타비딘)(201, 207)을 두 개의 기판 표면들(203, 209)에 부착시키는 것에 의해 제조된다. 코팅된 기판 표면들은 적합한 거리 만큼 떨어져서 상호 간에 반대로 배열된다. 한 가닥의 양 말단이 제1 복합체화 분자를 인식하고 결합할 수 있는 제1 복합체화 분자(예를 들면, 비오틴)에 상보적인 복합체화 분자를 포함하는 것인 이중-가닥 핵산(205) 이 코팅된 표면에 고정된다. 코팅된 표면들 간의 거리를 증가시키거나 또는 표면들 중 하나 또는 양자 모두를 측면 이동(lateral translation)시키는 것에 의해 고정된 핵산의 말단들에 힘이 적용될 수 있다. 예를 들면, 기판들 중 하나 또는 양자 모두는 압전 소자(piezoelectic element)와 같은 이동가능한 요소이거나 또는 이동가능한 요소를 포함할 수 있다. dsDNA가 융해되도록 유발하기에 충분한 장력(예를 들면, 실온에서 65 pN 초과)이 핵산에 적용되어, 고정된 가닥 및 유리된 가닥을 생성할 수 있다. 고정된 가닥 및 유리된 가닥은 모두 적합한 프라이머 및 중합효소를 이용하여 복제될 수 있다. 바람직하게는, 고정된 가닥만이 복제될 수 있도록 유리된 가닥들은 플러싱되어 제거되고 선택적으로 회수될 수 있다. 대향하는 표면들의 위치는 고정된 주형 가닥에 적용되는 장력의 양을 조정하기 위해 복제 동안 제어될 수 있다. 사이클은 원하는 만큼 반복될 수 있다.
대향하는 코팅된 표면들(215, 217)을 이용하는 방법을 수행하는 장치의 변형들에서, 하나의 표면 또는 두 표면들 모두는 또한 개별적으로 이동가능한 요소(219)의 어레이를 형성하기 위해 배열되고, 각각은 도 2c에 도시된 바와 같이 프로그래밍 가능한 프로세서에 의해 구동되는 제어 회로(control circuit)에 의해 개별적으로 처리(address)될 수 있다. 그와 같은 제어 회로는 프로세서에 힘 및/또는 변위 파라미터를 보고하는 피드백 채널을 포함할 수 있다. 프린팅 또는 리소그라피 기법들이 표면 상에 분자를 고정하는 부위를 패턴화하기 위해 이용될 수 있다. 상기 방법을 수행하는 장치는 또한 챔버로 시약을 도입하는 채널, 또는 상기 코팅된 표면을 포함하는 채널 및 시약을 개별적으로 또는 조합하여 전달(및 선택적으로 저장)하는 기구(apparatus) 및 반응 생성물을 회수하는 기구를 포함할 수 있다. 공유 결합, 항원-항체, 및 스트렙타비딘-비오틴을 포함하나 이에 한정되지 않는, 핵산을 표면에 고정하는 광범위하게 다양한 적합한 방법들이 알려져 있다.
유체 흐름의 배열이 대향하는 표면들 사이에서 DNA 가닥들을 배향하고 연장시키기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 도 2b에 도시되는 바와 같이, DNA는 일 단부에서 고정 위치들(anchoring locations) 사이에 분포된 유체 흐름을 위한 통로를 갖는 표면(213)에 고정될 수 있다. 이 통로들을 통해 유체를 흐르게 하는 것은 DNA 가닥을 원하는 방향, 예를 들면, 대향하는 표면(211) 또는 상기 유체 흐름을 수용하기 위해 고정 표면들 사이에 분포된 통로를 가질 수 있는, 이동가능한 요소들의 어레이를 향해 다소 균일하게 배향하고 연장시키기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 방법은 DNA 가닥을 제1 표면에 고정하는 단계, 유체를 제1 표면에 있는 개구부(opening)를 통해 상기 제1 표면에 대향하는 제2 표면에 있는 개구부를 향해 흐르고 통과하게 하는 단계, 및 상기 유체 흐름에서 배향된 DNA 가닥을 상기 제2 표면에 고정하는 단계를 포함할 수 있다.
각 사이클의 진행에 따라 고정되는 가닥의 수를 증가시키기 위해, 활성화가능한(activabable) 프라이머들이 결합된 가닥들을 복제하기 위해 이용될 수 있다. "활성화가능한 프라이머(activatable primer)"는 화학 또는 물리적 방법에 의해 활성화될 수 있는 화학 모이어티를 포함한다. 이와 같은 "활성화가능한 기(activatable group)"는 예를 들면, 적합한 파장의 레이저를 이용한 광활성화에 의해 활성화되기 전에는 불활성이다. 기능적인 복합체화 기(functional complexing group)로 전환되거나 또는 기능적인 복합체화 기의 차단을 해제할 수 있는(unblocking) 다수의 활성화가능한 화학적 작용기들이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있다. 본 방법의 변형에서, 활성화가능한 프라이머는 고정된 단일-가닥 핵산에 어닐링될 수 있다. 프라이머 연장 및 단편 복제가 수행된다. 결과물인 이중-가닥 핵산은 주형 가닥에 대한 장력의 적용을 통해 변성된다. 이때, 유리 상태의 카피 가닥들은 프라이머의 활성화가능한 기들을 포함할 것이다. 활성화는 카피 가닥들이 대향하는 코팅 표면들 상에 고정될 수 있게 한다. 이 사이클은 원하는 수준의 증폭이 수득될 때까지 반복될 수 있다. 원하는 경우, 고정된 핵산은 예를 들면, 핵산의 고정된 말단에 인접한 서열 또는 프라이머에 의해 카피된 핵산의 말단으로 도입된 서열을 인식하는 제한효소의 사용에 의해 방출될 수 있다.
광학적 트랩 또는 자기적 트랩(optical or magnetic traps) 이용:
DNA에 장력을 직접적으로 적용하는 또 다른 방법은 DNA가 고정된 입자들을 조작하기 위해 광학적 트위저(tweezer) 또는 자기적 트위저 또는 기타 트랩(trap)을 이용할 수 있다. 광학적 트위저는 광학 강도 구배(optical intensity gradient)에 의해 생성되는 힘으로 입자들을 잡는다. 광의 전기장에 의해 양극화된 유전체 입자들은 구배를 통해 가장 밝은 지점으로 끌린다. 이와 대조적으로, 반사하고, 흡수하는, 저-유전체 입자들은 복사압(radiation pressure)에 의해 가장 어두운 지점으로 밀린다. 삼차원 트랩을 형성할 정도로 충분히 강한 선택적으로 생성된 힘이 적합한 형상의 파면을 갖는 레이저 빔을 높은 개구수치의 렌즈(high numerical aperture lens)에 의한 엄격한 포커스(tight focus)로 가져오는 것에 의해 수득될 수 있다. 도 3a는 레이저 빔(303)의 포커스에 트랩된 비드들(301) 사이에 연장된 DNA 가닥을 도시한다. 도 3b에 도시된 바와 같이 광학적 트위저의 어레이(307)를 이용하여 다수의 입자들을 조작하는 것이 가능하다. 구매 가능한 광학적 트위저 어레이는 Arryx, Inc.에 의해 생산되는 어레이들을 함한다. 광학적 트위저의 어레이의 또다른 구현은 E. R. Dufresne and D. G. Grier, Rev. Sci. Instr. 69:1974 (1998); 및, 미국특허 제6,055,106호(2000)를 참조한다. 광학적 트위저 어레이는 약 103, 104, 105, 106, 또는 그 이상의 쌍의 광학적 트위저 또는 자기적 트위저를 포함할 수 있다.
광학적 트위저 또는 자기적 트위저를 이용한 증폭은 일반적으로 다음과 같이 수행될 수 있다: 핵산이 유체 매질에서 적합한 입자들에 각 말단에서 고정된다. 입자들은 광학적 트랩 또는 자기적 트랩을 이용하여 조작되도록 개조될 수 있다. dsDNA를 변성화시키기에 충분한 장력, 예를 들면, 약 65 pN보다 큰 장력이 입자들에 대한 힘(예를 들면, 광학적 힘 또는 자기력)의 적용을 통해 올리고뉴클레오티드에 적용되어, 핵산의 변성을 가져온다. 장력은 프라이머와 핵산이 어닐링될수 있게 하기 위해 프라이머의 존재 하에 감소될 수 있다. DNA 중합효소에 의한 중합은 장력을 더 이완시키는 것에 의해 개시될 수 있다. 사이클을 반복하기 위해, 결과물인 이중-가닥 핵산이 변성될 수 있도록 장력이 증가될 수 있다. 변형에서, 핵산은 일 말단에서 유체 흐름에 예를 들면, 자기장에 의해 트랩된 비드에 고정될 수 있다. 핵산에 대한 장력을 제어하기 위해 유체의 유속이 이용될 수 있다.
단일 표적 분자로부터 개시하여 순차적으로 카피 가닥들로 어레이를 채우는 것이 가능하다. 카피 가닥들은 활성화가능한 프라이머를 이용하여 새로운 비드들에 고정될 수 있다. 새로운 비드들은 카피된 가닥들에 인접하게 위치될 수 있다. 대안적으로, 사전에 고정된 프라이머들을 갖는 비드들이 변성화 단계와 연계되어 카피된 가닥들에 인접하게 위치될 수 있다. 이와 같은 방식에 의한 비드들의 조작은 선택적으로, 프로그래밍 가능한(programmable) 프로세서에 의해 자동으로 제어될 수 있다.
수력학적 응력을 이용한 Nano-PCR™
Nano-PCR™ 방법은 제어된 유체 흐름에서 수력학적 응력에 의해 장력을 DNA에 적용하는 것을 이용하여 수행될 수 있다. 이 방식을 이용하는 방법들은 벤치탑 장치일 수 있거나 또는 대안적으로 휴대용 장치에 포함될 수 있는 것과 같은 이동가능한 크기로 축소될 수 있는 미세유체 장치(microfluidic device)에서 수행될 수 있다. 제어된 유체 흐름에서 수력학적 응력에 의해 DNA에 장력을 적용하는 것을 이용하는 Nano-PCR™ 방법은 제어된 유체 흐름 속도를 제공하는 임의의 배열(arrangement)을 이용하여 수행될 수 있다.
고정된 DNA 중합효소 이용: 장치에서 표면에 고정된 중합효소를 이용하는 Nano-PCR™방법을 수행하는 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다. 중합효소는 유체가 제어되는 속도로 그 표면상에서 흐를 수 있도록 배열된 표면상에 고정된다. 예를 들면, 제1 복합체화 모이어티로 코팅된 채널 또는 챔버 내의 표면이 제2 복합체화 모이어티를 포함하기 위해 변형된 DNA 중합효소를 고정하기 위해 이용될 수 있다. 대표적인 복합체화 모이어티들은 항원-항체, 히스티딘-Ni-NTA, 또는 비오틴-스트렙타비딘 쌍을 포함한다. 표적 dsDNA는 프라이머의 존재 하에 변성되고, 예를 들면, dsDNA와 프라이머는 dsDNA를 융해시키기에 충분한 힘(예를 들면, 약 65 pN보다 큰 힘)이 상기 dsDNA에 적용되도록 유속을 겪게 할 수 있다. 유속을 감소시키는 것에 의해 중합효소/뉴클레오티드/프라이머 복합체가 형성되게 할 수 있다. 프라이머 연장 및 단편 복제는 유속의 추가적인 감소에 의해 촉진될 수 있다. 주형 및 카피 가닥들을 포함하는 이중-가닥 핵산 생성물은 증가된 유속의 적용을 통해 변성될 수 있고, 원하는 수준의 증폭이 수득될 때까지 사이클이 반복될 수 있다. 그와 같은 방법에서, 중합효소는 미세채널(microchannel), 예를 들면, 미세유체 "랩 온 어 칩(lab on a chip)" 형 장치의 미세채널에 고정될 수 있다.
하나 이상의 코팅된 표면들 상에 고정된 중합효소를 이용하는 방법을 실행하기 위한 장치의 변형에서, 그와 같은 장치는 또한 시약을 상기 코팅된 표면을 포함하는 반응 챔버 또는 채널에 도입하는 채널 및 개별적으로 또는 조합하여 시약들을 전달하고, 선택적으로 저장하는 기구 및 반응 생성물을 회수하는 기구를 포함할 수 있다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 프린팅 또는 리소그라피 기법들이 분자를 고정시킬 위치를 패턴화하기 위해 이용될 수 있다. 그와 같은 장치는 반응 챔버 또는 채널에서 유체 흐름을 생성하고 제어하는 기구를 포함한다. 전기역학적 방법, 펌프 및 주사기 기구(syringe apparatus)를 포함하는 유체 흐름을 생성하고 제어하는 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다. 시약 용액들은 선택적으로 반응 챔버를 통해 재순환될 수 있다.
도 4는 중합효소(401)가 기판(407)에, 예를 들면, 스트렙타비딘 결합 등에 의해 고정되는 방식을 예시한다. DNA 가닥들(403)은 고정된 중합효소에 결합할 수 있게 된다. 기판(407) 상을 흐르는 제어된 유체 흐름(409)은 수력학적 응력의 형태로 DNA 가닥들에 대해 신장력(stretching force)의 적용을 유발한다. 전술된 바와 같이 도 1에 도시된 일반적 체계(scheme)에 따라 그와 같은 힘의 적용을 이용하여 Nano-PCR이 수행될 수 있다.
제어된 유체 흐름에서 고정된 DNA 가닥 이용; 핵산에 장력을 적용하는 또 다른 방법은 제어된 유체 흐름에 고정된 핵산을 포함한다. 본 방법은 일반적으로 다음과 같이 수행될 수 있다: 일 말단에 표면에 코팅된 제2 복합체화 모이어티를 인식하고 이에 결합할 수 있는 제1 복합체화 모이어티를 포함하는 핵산이 코팅된 표면에 고정되게 한다. 유체는 dsDNA가 융해되게 하기에 충분한 힘(예를 들면, 약 65 pN보다 큰 힘)이 고정된 이중-가닥 핵산에 적용되어, 가닥 분리를 가져올 수 있도록 표면 상을 흐른다. DNA 중합효소 및 프라이머, 선택적으로 활성화가능한 기들을 포함하는 프라이머가 감소된 유속으로 표면상으로 플러싱된다. 감소된 또는 중단된 유속은 중합효소/올리고뉴클레오티드/프라이머 복합체의 형성을 가능하게 한다. 프라이머 연장 및 단편 복제는 유속의 추가적인 감소 또는 흐름의 중단을 통해 NTP의 존재 하에 촉진될 수 있다. 복제 후에, 유속은 증가되어 dsDNA가 변성되도록 결과물인 dsDNA가 장력의 적용을 받게 된다. 활성화가능한 프라이머가 이용되는 경우, 연장된 프라이머가 활성화될 수 있다. 이와 같은 활성화되고, 연장된 프라이머들은 코팅된 표면에 결합할 수 있게 되고, 원하는 정도의 증폭이 수득될 때까지 사이클이 반복될 수 있다. 그와 같은 방법에서, 중합효소는 미세채널, 예를 들면, 미세유체 "랩 온 어 칩" 형 장치의 미세채널에 고정될 수 있다.
도 5는 DNA 가닥(503)이 고정용(anchoring) 분자(501)를 통해 기판(507)에 고정된 경우에서 수력학적 응력에 의한 유체 흐름 내 DNA의 신장(stretching)을 도시한다. 방향(509)으로 흐르는 유체는 유체 흐름 속도의 함수로서 제어된 방식으로 DNA를 연장하고 신장한다. 도 5b는 유체가 제어된 속도로 구조물들 사이에서 흐를 수 있도록 DNA 가닥(503)이 복수의 기판 구조들(505)에 결합 분자들(binding molecules)(501)에 의해 고정된 변형을 도시한다. 유사한 결과를 달성하기 위해 이용될 수 있는 다수의 다른 변형들이 있는 것으로 이해될 것이다.
하나 이상의 코팅된 표면상에 고정된 핵산을 이용하는 방법을 수행하는 장치의 변형에서, 그와 같은 장치는 또한 시약을 상기 코팅된 표면을 포함하는 반응 챔버 또는 채널에 도입하는 채널 및 개별적으로 또는 조합하여 시약들을 전달하고, 선택적으로 저장하는 기구 및 반응 생성물을 회수하는 기구를 포함할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 프린팅 또는 리소그라피 기법들이 분자를 고정시킬 위치를 패턴화하기 위해 이용될 수 있다. 그와 같은 장치는 반응 챔버 또는 채널에서 유체 흐름을 생성하고 제어하는 기구를 포함할 수 있다. 유체 흐름을 생성하고 제어하는 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 흐름은 펌프에 의해 제공될 수 있고 또는 정전기적으로 구동될 수 있다. 시약 용액은 선택적으로 반응 챔버를 통해 재순환될 수 있다.
속도 구배에서 DNA의 신장(stretching) 및 수력학적 포커싱(hydrodynamic focusing) 이용: 유체 흐름을 이용하여 장력을 적용하는 대안적인 방식이 상기 방법들과 조합되어 이용될 수 있거나, 또는 개별적인 방법의 기초를 형성할 수 있다. DNA는 속도 구배를 갖는 유체에서 신장될 수 있다. 수력학적 포커싱 및 역 전파성 신장 흐름(counter propagating elongational flow)에 대한 다양한 대표적 배열들이 도 6a-도6c에 도시된다.
예를 들면, Wong 등은 여러 그와 같은 기법들의 기초를 검토하고 수력학적 포커싱 방법을 설명했다(Wong et al., "Deformation of DNA molecules by hydrodynamic focusing." J. Fluid Mech. 497:55-65, 2003). 도 6a에 도시된 바와 같이, 수력학적 포커싱에서, 비교적 고속으로 흐르는 완충용액(607)의 두 분류(stream)가 저속으로 도입되는 중앙 분류(central stream)를 갖는 미세채널(605)에서 수렴한다. 수렴하는 분류들은 실질적인 혼합 없이 중앙 분류를 가속시킨다. 그 결과는 흐름 방향으로 강한 속도 구배를 갖는 흐름의 영역이다. 이 구배에 있는 DNA(601)가 연장된 상태까지 신장된다. 수렴하는 분류의 유속을 훨씬 더 증가시키면, dsDNA를 변성시켜 상기 미세채널로부터 ssDNA가 나오게 하는 것이 가능할 것이다. 이는 ssDNA를 반응 챔버로, 예를 들면, 중합효소가 고정되어 있는 챔버로 전달할 수 있게 한다.
어떠한 고정의 필요 없이 핵산을 트랩하고 핵산에 장력을 제공하기 위해 정체성 흐름(stagnation flow)이 이용될 수 있다. Perkins 등은 평면형 신장 흐름 기구(planar elongation flow apparatus)에서 DNA의 신장을 기술했다("Single Polymer Dynamics in an Elongation Flow" Science, 276:2016-21, 1997). Perkins의 기구에서, 도 6c에 도시된 바와 같이 유체(623)는 반대 방향으로부터 T자형 접합부(T-shaped junction)(625)로 흐른다. 상기 접합부의 중앙에, 정체점(629)이 정립된다. 이 점의 외부에, 유체 속도 구배가 정립된다. DNA(601)는 속도 구배에 의해 반대 방향들로 동일하게 당겨져, 정체점에 트랩될 수 있다. 도 6b에 도시된 채널(615)과 같은 대안적인 배열들은 채널(615)로 유입되는 유체 또는 핵산이 위치하는 슬롯을 가로질러 반대 방향들로 흐르는 완충용액의 오프셋 제트(617)를 포함할 수 있다.
적용되는 전기장의 순환을 이용한 Nano-PCR™방법
Nano-PCR™ 방법에서 전기장 및 자기장의 이용을 통해 DNA 가닥에 힘을 적용하는 것이 가능하다. 이것이 달성될 수 있는 다양한 방식들이 있다. 예를 들면, 전기장은 미세유체 장치에서 유체 흐름을 구동시키는 것에 의해 DNA에 간접적으로 힘을 적용하기 위해 이용될 수 있다. 전술된 바와 같이, 유체 흐름은 DNA, 예를 들면, 표면 및/또는 입자에 고정된 DNA, 또는 표면에 고정된 DNA 중합효소에 결합된 DNA에 수력학적 응력을 적용하기 위해 이용될 수 있다. 전기영동적 힘(electrophoretic force)가 직접 DNA 가닥에 힘을 적용할 수 있다.
전기장은 또한 전도성 입자에 결합된 DNA 가닥들을 조작하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 변성, 어닐링, 및/또는 프라이머 연장 단계들이 비-온도-구동 과정에 의해 제어되며 상기에서 DNA 가닥의 한쪽 말단 또는 양 말단이 상기 DNA 가닥에 장력을 제공하기 위해 전기장에 의해 조작될 수 있는 전도성 입자, 예를 들면, 금 나노입자 등에 결합되는 것인 Nano-PCR™ 방법이 수행될 수 있다. DNA 분자의 한쪽 말단이 전도성 입자에 부착되는 경우, 나머지 말단은 장치 내의 반응 챔버 내에서 표면에 고정될 수 있다. 그와 같은 방법들은 각 사이클에서 생성되는 DNA 가닥들을 고정하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 활성화가능한 프라이머를 이용할 수 있다.
Nano-PCR™방법의 대표적 적용
Nano-PCR™ 방법은 병원균 및 생물학적 무기(bioweapon) 검출용 키트 및 시스템에 채용될 수 있다. 그와 같은 병원균의 예들은 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 아데노-관련 바이러스(Adeno-Associated Virus: AAV), 아데노바이러스(Adenovirus), 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus: CMV), 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus), 엔테로바이러스(Enterovirus), A형 간염 바이러스(Hepatitis A Virus: HAV), B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus: HBV), C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus: HCV), 인간 헤르페스 바이러스 타입 6(Human Herpes Virus Type 6: HHV-6), 인간 면역결핍증 바이러스 타입 1(Human Immunodeficiency Virus Type 1: HIV-1), 인간 면역결핍증 바이러스 타입 2(Human Immunodeficiency Virus Type 2: HIV-2), 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 1 및 타입 2(Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2: HSV-1 and HSV-2), 인간 T-세포 림프영양성 바이러스 타입 I 및 타입 II(Human T- CeIl Lymphotropic Virus Type I and Type II: HTLV-I and HTLV-II), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 파르보바이러스 B-19(Parvovirus B- 19), 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Synctitial Virus: RSV) 및 돼지 내인성 레트로바이러스(Porcine Endogenous Retrovirus: PERV). Nano-PCR™ 방법들은 이 방법들이 제공할 수 있는 민감도, 정확도 및 견고성의 강화 때문에 모든 환경에서 모든 병원균의 검출을 위해 이용될 수 있다.
통상적인 PCR-기반 진단법을 이용한 특정 병원균의 검출 및 확인은 일반적으로 병원성 개체 또는 그의 폴리뉴클레오티드가 특정 역치 농도로 생물학적 유체(예를 들면, 혈액, 타액 등)에 존재할 것을 요구한다. 예를 들면, 마이코박테리움 투베르쿨로시스의 검출 하한은 7.5 x 103개의 개체/ml로 보고되었다. HCV RNA는 100 내지 1000개의 RNA 분자/ml 범위에서 검출가능하다. Shim은 중합효소 연쇄 반응은 입증된 마이코박테리움 투베르큘로시스-함유 노듈(nodule)의 약 87.5 퍼센트를 검출하는 것으로 보고했다. 그 수치는 12.5 퍼센트의 검출에 대한 위-음성율(false-negative rate)에 해당한다. 바람직한 구체예들에서, Nano-PCR™ 방법들은 전술된 바와 같은 병원균을 일반적으로 12.5 퍼센트 미만, 10 퍼센트, 5 퍼센트, 2.5 퍼센트, 1 퍼센트, 0.5 퍼센트, 0.25 퍼센트, 또는 0.1 퍼센트의 위-음성율로 검출하기 위해 이용될 수 있다.
또한, 통상적인 PCR은 일반적으로 약 30-35회의 사이클로 한정되나, Nano-PCR™은 그에 한정되지 않도록 수행될 수 있다. 이는 DNA 융점 온도 이상으로 가열하는 반복적인 사이클 후 중합효소의 분해 때문이다. 이와 대조적으로, Nano-PCR™ 방법들은 선택적으로 40회, 50회, 60회, 70회, 100회, 또는 그 이상의 사이클을 포함할 수 있다. Nano-PCR™은 등온(isothermal) 방식으로 또는 낮은 진폭의 온도 변조로 수행될 수 있으므로, Nano-PCR™은 다수의 사이클을 위해 반복될 수 있고, (예를 들면, 실온에서) 효소의 수명에 의해서만 한정된다.
따라서, Nano-PCR™방법들은 통상적인 PCR에 의해 요구되는 양보다 실질적으로 적은 양의 개시 물질(개체 또는 그의 DNA 또는 RNA)을 증폭하기 위해 이용될 수 있다. Nano-PCR™방법들은 한 분자의 DNA 또는 RNA만큼의 소량도 검출하고 확실하게 증폭하며, 위-음성율을 크게 감소시키며 100%까지의 증가된 민감도를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 전술된 바와 같은 병원균들에 대해, 개체 또는 폴리뉴클레오티드는 1000개 미만의 개체 또는 폴리뉴클레오티드/ml, 100개의 개체 또는 폴리뉴클레오티드/ml, 25개의 개체 또는 폴리뉴클레오티드/ml, 10개의 개체 또는 폴리뉴클레오티드/ml, 5개의 개체 또는 폴리뉴클레오티드/ml, 또는 심지어 1개의 개체 또는 폴리뉴클레오티드/ml의 농도에서 검출될 수 있다.
본 방법의 대표적인 변형은 시료에서 하나 이상의 특정한 DNA 서열의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 두 개의 상이한 DNA 서열들을 구분하기 위해 이용될 수 있다. 그와 같은 변형에서, 표적 DNA는 전술된 바와 같이 증폭될 수 있다. 본 방법은 또한: 증폭된 DNA를 프로브 또는 프로브들(예를 들면, 검출될 서열에 상보적이고 형광 표지와 같은 검출가능한 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드)과 접촉시키는 단계; 및, 상기 증폭된 DNA에 결합된 프로브의 존재 또는 부재를 관찰하는 것에 의해 시료 내에 특정 DNA 서열의 존재 여부를 검출하거나, 또는 복수의 프로브들 중 어느 프로브가 상기 증폭된 DNA에 결합되었는지를 검출하여 두 개의 상이한 서열들 간을 구별하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 방법의 또 다른 변형은 RNA 상에 코딩된 서열의 증폭 및/또는 검출을 위해 이용될 수 있다. 표적 서열은 단리된 RNA 또는 핵산 혼합물 내의 RNA 상에 코딩될 수 있다. 본 방법은: 시료(예를 들면, 조직 또는 체액)로부터 RNA를 단리하는 단계; 역 전사를 수행하여 그에 의해 해당하는 cDNA를 수득하는 단계; 및, 상기 표적 서열을 전술된 바와 같이 증폭하는 단계;를 포함할 수 있다. 그와 같은 방법들은 전술된 바와 같이 시료 내에 특정 서열의 존재를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 변형은 DNA의 서열결정을 위해 이용될 수 있다. 그와 같은 방법은 선택적으로 전술된 바와 같이 DNA를 증폭하는 단계 및 상기 DNA의 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 DNA의 서열결정은 (a) 표적 서열을 포함하는 dsDNA의 시료로서, 상기 시료는 4개의 병행적인 반응들(parallel reactions)로 분리되는 것인 시료, 상기 표적 서열의 3' 말단에 상보적인 프라이머; 4 종류 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트(즉, ATP, CTP, GTP, TTP)를 제공하는 단계; 병행적인 반응 각각에 형광 모이어티와 같은 검출가능한 화학적 모이어티로 선택적으로 표지된 ddATP, ddCTP, ddGTP, 및 ddTTP로부터 선택된 상이한 디데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트(ddNTP), 및 DNA 중합효소를 제공하는 단계; (b) 비-온도-구동 과정, 예를 들면, dsDNA를 ssDNA로 융해시키기에 충분한 장력(예를 들면, 약 65 pN보다 큰 힘)의 적용에 의해 dsDNA를 ssDNA 주형 가닥으로 변성시키는 단계; (c) 프라이머가 상보적인 주형 가닥들로 혼성화되도록, 예를 들면, dsDNA를 변성시키기 위해 장력을 이용한 경우, ssDNA에 적용되는 장력을 감소시키는 것에 의해 비-온도 구동 과정을 제어하는 단계; (d) dsDNA를 형성하기 위해 DNAp가 프라이머를 연장하게 하는 단계; (e) 원하는 양의 DNA 서열 증폭이 수득될 때까지 상기 단계(b-d)를 선택적으로 반복하는 단계, 및 다양한 단일 분자 서열결정 체계에서와 같이, 상기 반응에서 생성되는 각 뉴클레오티드의 길이를 검출하는 것에 의해 또는 염기-특이적 형광 모이어티 또는 일부 다른 염기-특이적 신호를 검출하는 것에 의해 서열을 결정하는 단계;를 포함할 수 있다.
Nano-PCR™ 장치
본 명세서에 기재된 바와 같은 비-온도-구동 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위해 이용할 수 있는 다수의 상이한 장치 종류 및 구성(configuration)이 있다. 그와 같은 장치 중 하나는 장치상에 있는 미세유체 채널 내의 유속이 제어가능하고 가변적인 것인 미세유체 장치(microfluidic device)이다. 바람직한 구체예들에서, 장치는 반응 챔버를 가질 것이고, 상기 반응 챔버는 채널, 채널들의 배열, 또는 밀폐된 공간(enclosed space)일 수 있다. 반응 챔버는 일반적으로 핵산을 유지하는 수단 및 그 안에 유지된 상기 핵산에 응력 또는 장력을 적용하는 수단을 포함할 것이다. 따라서, 본 명세에 기재된 방법들 중 하나를 수행하도록 설계된 배열은 그 내부에 핵산에 결합할 수 있는 입자들 또는 그들의 상보적인 복합체화 분자들을 획득(secure)할 수 있는 복합체화 분자, 복합체화 분자들을 갖는 표면, 이동가능한 요소, 유체 흐름을 배향하고 유체 속도 구배를 형성하는 채널, 펌프, 밸브, 막, 등을 갖는 채널 및 밀폐된 공간의 조합을 포함할 것으로 예상할 수 있다. 챔버는 예를 들어 광학적 미세조작기(optical micromanipulator)가 이용되는 경우, 광학적으로 투명한 창을 포함할 수 있다. 장치들은 휴대용 유닛들에 포함될 수 있는 미세유체 장치로서 제조될 수 있다. 원하는 경우, Nano-PCR™은 1 마이크로리터 미만, 예를 들면, 약 50-1000 nL, 바람직하게는 약 100-500 nL의 용액 용량에서 수행될 수 있다.
일 실시예로서, 도 7a는 시약이 유입구(inlet)(701, 707 및 715)을 통해 도입될 수 있는 장치의 가능한 구성을 도시한다. 하나 이상의 저장 챔버(705, 711)가 준비된 완충용액, 디데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트, 중합효소, 등을 담기 위해 제공될 수 있다. 밸브(703, 709, 717 및 718)는 채널들 간의 접합부에서 유체 흐름을 제어하기 위해 배열된 하나 이상의 유체 게이트를 포함할 수 있다. 반응 챔버(715)는 예를 들면, 도 2-도 6에 도시된 바와 같이, 그 내부에 담긴 핵산 분자들에 대해 장력의 제어된 적용이 가능하도록 배열될 수 있다. 채널(721) 및 펌프(723)는 챔버(715)를 통한 시약의 재순환 및 제어된 흐름이 가능하도록 하기 위해 선택적으로 제공된다. 펌프(723)는 본 발명이 속한 기술 분야에서 인정되는 임의의 적합한 메카니즘, 예를 들면, 연동식 펌핑(peristaltic pumping), 하나 이상의 벨로우(bellow) 또는 피스톤의 사용에 의한 펌핑, 전동력에 의한 펌핑, 및 그와 같은 장치 등의 변형 또는 조합에 의해 작동될 수 있다. 재순환이 바람직하지 않은 경우, 흐름은 챔버(715) 내에서, 또는 외부적으로, 예를 들면, 유입구 및/또는 유출구(outlet)(701 및 719)에 부착된 주사기에 의해 제어될 수 있다. 원형, 또는 개략적으로 원형인 채널 구성을 이용하는 미세유체 장치의 예는 도 7b에 의해 도시된다. 유입구(751)는 채널 급송 반응 채널(channel feeding reaction channel)(763)에 직접 또는 추후의 사용을 위해 하나 이상의 저장 챔버(753, 754)로의 시약의 도입을 가능하게 한다. 밸브들(755, 757, 및 759)은 반응 채널로의 유입 및 유출을 제어한다. 펌프들(761)은 연동식 작용, 예를 들면, 연속적으로 제어되는 방식으로 하나 이상의 밸브 게이트의 채널(763)로의 구부러짐(deflection), 전동력, 또는 미세유체학 부문에서 인정되는 임의의 다른 수단에 의해 채널(763)에서 유체 속도를 제어하기 위해 작동할 수 있다. 예를 들면, 국제공개특허 WO/02081729에 기재된 바와 같이, 흐름을 제어하기 위해 제어되는 순서로 장치의 채널로 구부러질 수 있는 탄성 중합체 물질로 제조된 구조들을 포함하는 연동식 펌핑 배열 및 밸브를 이용하여 장치가 구축될 수 있다.
도 7b에 도시된 장치의 작동은 비-온도-구동 중합효소 연쇄 반응 동안 그의 작동에 대한 설명을 통해 더 이해될 수 있다. 핵산 증폭 반응의 구체적인 예에서, 표적 핵산을 포함하거나 또는 잠재적으로 포함하는 시료가 유입구(751)를 통해 루프(763)로 도입된다. 일부 실시예들에서, 루프(763)의 하나 이상의 벽들은 도 4-도 5에 도시된 바와 같이 중합효소 또는 뉴클레오티드를 고정하기 위해 제조되었다. 대안적으로, 루프는 도 6에 도시된 바와 같이 추가적인 유입구를 이용하거나 또는 표면을 회전시키는 것에 의해 유체 속도 구배, 역 전파성 유체 흐름(counter propagating fluid flow), 등을 생성하기 위해 배열될 수 있다. 증폭 반응을 수행하기 위해 필요한 다른 시약들은 마찬가지로 유입구를 통해 도입된다. 전형적인 시약들은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 프라이머 또는 프라이머들(예를 들면, 정방향(forward) 프라이머 및 역방향(reverse) 프라이머), 4종류의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(즉, dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP), 중합효소, 완충용액 및 중합효소에 의해 요구되는 다양한 보조인자들(예를 들면, 금속 이온)을 포함한다.
시료 및 필요한 증폭 시약들의 루프(763)로의 도입 후, 결과물인 용액은 펌프(761)의 작용에 의해 순환된다. 펌프 작용의 속도를 변화시켜서, 용액 순환/흐름 속도를 조절할 수 있다. 표적 핵산에 대한 약 65 pN의 힘의 적용을 초래하는 유속은 핵산을 변성시키는 것으로 정립되어 있다. 유속은 표적 핵산에 적용되는 힘이 약 30 pN 내지 60 pN의 범위에 속하도록 감소된다. 이는 중합효소/핵산/프라이머 복합체의 형성을 가능하게 한다. 프라이머 연장은 유속을 30 pN 미만의 적용되는 힘에 해당하는 값으로 더 감소시키는 것에 의해 개시된다. 프라이머 연장의 종료시, 유속은 다시 결과물인 이중-가닥 핵산을 변성시키기 위해 증가된다. 상기 단계들은 원하는 양의 표적 핵산이 수득될 때까지 반복된다. 밸브(759)를 개방하여 유출구(765)를 통해 용액을 흘려보내는 것(flush)에 의해 증폭된 표적 핵산에 접근할 수 있다.
Nano-PCR™ 방법들을 수행하는 기구는 개별적으로 반응 장치의 요소들을 다루고 제어할 수 있는 프로그래밍이 가능한 제어 장치를 포함할 수 있고 또한 센서 및 피드백 회로를 포함하여 제어 장치가 적용된 응력 및 주형 연장과 같은 반응 파라미터들을 모니터링하고 분석할 수 있으며, 원하는 경우, 그들을 조절할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 온도 순환에 의존하지 않는 PCR 방법의 대표적인 흐름도를 도시한다.
도 2a-도 2c는 대향하는 표면들 사이에 고정된 DNA 가닥에 장력을 적용하기 위한 대표적 방법 및 이를 위한 반응 챔버의 요소들의 배열을 도시한다.
도 3a 및 도 3b는 광학적 트랩 또는 자기적 트랩을 이용하여 DNA 가닥에 장력을 적용하는 방법 및 이를 위한 반응 챔버의 요소들의 배열을 도시한다.
도 4는 유체 흐름 내에서 기판에 고정된 중합효소에 결합된 DNA 가닥에 장력을 적용하는 대표적인 방법 및 이를 위한 반응 챔버의 요소들의 배열을 도시한다.
도 5a 및 도 5b는 유체 흐름에서 한쪽 말단에 고정된 DNA 가닥에 장력을 적용하는 대표적인 방법 및 이를 위한 반응 챔버의 요소들의 배열을 도시한다.
도 6a-도 6c는 유체 속도 구배에 매달려있는 DNA 가닥에 장력을 적용하기 위한 대표적인 방법 및 이를 위한 반응 챔버의 요소들의 배열을 도시한다.
도 7a 및 도 7b는 온도 순환 또는 열에 의한 변성에 의존하지 않는 PCR 방법을 수행하기 위한 대표적인 장치의 개략도를 도시한다.
실시예 1: 대향하는 코팅된 표면들을 이용한 방법 및 장치
표준 방법에 따라 한 쌍의 스트렙타비딘-코팅된 표면을 제조하였다( Sabanayagam, Smith, and Cantor. "Oligonucleotide immobilization on micropatterned streptavidin surfaces." Nucleic Acids Res. 2000, Vol. 28, No. 8 pp. i-iv). 비오티닐화된(biotinylated) dsDNA(한 가닥의 양 말단에서 비오티닐화됨)를 상기 표면들에 첨가하여, 표면들 사이에 상기 dsDNA를 고정화시켰다(Jeffrey M.Rothenberg and Meir Wilchek. p-Diazobenzoyl-biocytin: a new biotinylating reagent for DNA Nucleic Acids Research Volume 16 Number 14 1988). 표면에 적용되는 주형의 농도를 조정하여, DNA 분자들의 표면 밀도는 조절될 수 있다. 실온에서, 코팅된 표면들 간의 거리를 증가시켜 약 65 pN보다 큰 장력을 dsDNA에 적용하였다. 이는 dsDNA를 변성시켜, 증폭을 위한 표적 ssDNA만 남게 했다. 결합된 DNA를 속박된(caged) 비오틴 기들을 포함하는 프라이머들과 접촉시키고, 표면들 간의 거리를 감소시켜 30 pN 내지 60 pN의 힘이 고정된 ssDNA에 적용되게 하였다. 프라이머들이 표적 DNA에 어닐링되게 하고 DNA 중합효소 및 뉴클레오티드를 결과물인 복합체에 첨가하였다. 프라이머 연장은 적용되는 장력을 30 pN 미만까지 더 감소시키는 것에 의해 개시되었다. 프라이머 연장이 완료되면, 표면들 간의 거리를 증가시켜 결과물인 이중-가닥(duplex)에 65 pN보다 큰 힘을 적용시켰다. 이 힘의 적용은 복제 뉴클레오티드 가닥을 그 주형으로부터 분리(변성)시켰다. 속박된 비오틴 모이어티를 포함하는 복제 가닥들을 광활성화시키고 스트렙타비딘-코팅된 대향하는 표면들에 결합되게 하였다. 표적 뉴클레오티드에 대한 원하는 정도의 증폭을 수득할 때까지 상기 단계들을 반복했다.
속박된 비오틴 시약들은 Molecular Probes 또는 Pierce와 같은 상업적 공급업체로부터 구매하였다. 예를 들면, 광활성화가능한 니트로벤질기를 갖는 비오틴 유도체(MeNPOC-biotin)가 생물 분자들 및 표면들로의 용이한 결합(easy linkage)에 적합한 형태로 존재한다 (Pirrung MC, Huang CY. A general method for the spatially defined immobilization of biomolecules on glass surfaces using "caged" biotin. Bioconjug Chem. 1996 May- Jun;7(3):317-21).
실시예 2: 고정된 중합효소를 이용한 방법 및 장치
표준 방법에 따라 스트렙타비딘-코팅된 미세채널 표면을 제조했다(Sabanayagam, Smith, and Cantor. "Oligonucleotide immobilization on micropatterned streptavidin surfaces." Nucleic Acids Res. 2000, Vol. 28, No. 8 pp. i-iv). 비오티닐화된 DNA 중합효소를 상기 미세채널로 흘려보내고(flush) 표면 포화를 위해 방치했다. 효소의 비오티닐화를 위한 상업용 키트들이 예를 들면, Pierce Labs로부터 이용가능하다. 결합되지 않은 효소는 미세채널로부터 흘려보내고 표적 뉴클레오티드(예를 들면, ssDNA, RNA) 및 프라이머를 60 pN 보다 큰 힘을 상기 뉴클레오티드에 적용하는 챔버 유속으로 유입시켰다. 30 pN 내지 60 pN의 힘이 상기 뉴클레오티드에 적용되도록 유속을 감소시켜 중합효소/뉴클레오티드/프라이머 중합체를 형성시켰다. 챔버 유속을 30 pN 미만으로 더 감소시켜서 프라이머 연장이 수행되게 하였다. 프라이머 연장이 완료되면, 유속을 증가시켜 65 pN보다 큰 힘을 결과물인 이중 가닥(duplex)에 적용하였다. 이와 같은 힘의 적용은 복제된 뉴클레오티드 가닥을 그 주형으로부터 (변성)분리시켰다. 분리된 가닥들을 중합효소 결합이 이루어질 때까지 미세유체 챔버를 통해 순환시키고, 상기 단계들은 표적 뉴클레오티드에 대해 원하는 정도의 증폭이 수득될 때까지 반복했다.
실시예 3: DNA 고정화를 이용한 방법 및 장치
표준 방법에 따라 스트렙타비딘-코팅된 미세채널 표면을 제조하였다(Sabanayagam, Smith, and Cantor. "Oligonucleotide immobilization on micropatterned streptavidin surfaces." Nucleic Acids Res. 2000, Vol. 28, No. 8 pp. i-iv). 비오티닐화된 dsDNA(한 가닥의 양 말단에서 비오티닐화됨)를 상기 미세채널로 흘려보내고, 표면 결합을 위해 방치하였다(Jeffrey M.Rothenberg and Meir Wilchek. p-Diazobenzoyl-biocytin: a new biotinylating reagent for DNA Nucleic Acids Research Volume 16 Number 14 1988). 결합된 dsDNA에 65 pN보다 큰 힘을 적용하는 챔버 유속은 정립되어 있다. 이는 dsDNA를 변성시켜, 증폭을 위한 표적 ssDNA만 남게 했다. DNA 중합효소, 뉴클레오티드, 및 속박된 비오티닐화 프라이머들(caged biotinylated primers)을 상기 미세채널로 흘려보냈다. 속박된 비오틴 시약들은 Molecular Probes 또는 Pierce와 같은 상업적 공급업체들로부터 구매 가능하다. 예를 들면, 광활성화가능한 니트로벤질기를 갖는 비오틴 유도체(MeNPOC-biotin)가 생물 분자들 및 표면들로의 용이한 결합에 적합한 형태로 존재한다 (Pirrung MC, Huang CY. A general method for the spatially defined immobilization of biomolecules on glass surfaces using "caged" biotin. Bioconjug Chem. 1996 May- Jun;7(3):317-21). 30 pN 내지 60 pN의 힘이 결합된 ssDNA에 적용되도록 유속을 감소시켰다. 프라이머들이 표적 DNA에 어닐링되게 하고, 결과물인 화합물들이 DNA 중합효소와 복합체를 형성하게 하였다. 챔버 유속을 30 pN 미만으로 더 감소시켜서 프라이머 연장이 수행되게 하였다. 프라이머 연장이 완료되면, 유속을 증가시켜 65 pN보다 큰 힘을 결과물인 이중 가닥(duplex)에 적용하였다. 이와 같은 힘의 적용은 복제된 뉴클레오티드 가닥을 그 주형으로부터 (변성)분리시켰다. 속박된 비오틴 모이어티를 포함하는 복제 가닥들을 광활성화시키고 스트렙타비딘-코팅된 미세채널 표면에 결합되게 하였다. 표적 뉴클레오티드에 대한 원하는 정도의 증폭을 수득할 때까지 상기 단계들을 반복했다.
실시예 4: 광학적 트위저를 이용한 방법 및 장치
이중-가닥 DNA 복합체를 주위 온도에서 적합한 매질에 담긴 폴리스티렌 비드들 사이에 고정화시켰다("Overstretching B-DNA: the Elastic Response of Individual Double Stranded and Single Stranded DNA Molecules" by Steven B. Smith, Yujia Cui, and Carlos Bustamante Science (1996) vol. 271, pp. 795-799). 약 65 pN의 신장력(stretching force)을 광학적 트위저의 이용을 통해 DNA에 적용하였다(Rouzina, L, and V. A. Bloomfield. 2001b. Force-induced melting of the DNA double helix 2. Effect of solution conditions. Biophys. J. 80:894-900). 그 힘은 DNA 변성을 초래했다. 프라이머를 매질에 첨가하고, 신장력을 60 pN 미만으로 감소시켰다. 이는 프라이머들이 변성된, 단일-가닥 DNA에 어닐링되게 하였다. DNA 중합효소 및 뉴클레오티드를 매질에 첨가하고 신장력을 0 내지 30 pN로 감소시켜서 고도로 정확한 복제를 개시시켰다. 복제가 완료되면, 약 65 pN의 신장력을 각각의 이중-가닥 DNA 분자들에 적용하여, 단일-가닥 DNA 분자들이 방출되게 하였다. 이는 조작기들의 어레이를 이용하는 것에 의해 그 규모가 확장될 수 있다. 예를 들면, Arryx, Inc.에 의해 제조된 광학적 트랩 어레이와 같은 어레이가 이용될 수 있다.
본 발명은 그 특정한 구체예들을 참조하여 상세하게 기재되었으나, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서, 다양한 변경들이 이루어질 수 있고 그 동등물이 채용될 수 있다는 것이 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 명확할 것이다.

Claims (116)

  1. 핵산을 증폭하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 하나 이상의 단일-가닥 핵산의 주형 가닥들을 상기 하나 이상의 주형 가닥들의 일부에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머들과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 하나 이상의 프라이머 중 하나 이상을 상기 프라이머와 상보적인 하나 이상의 주형 가닥들의 부분에 어닐링(annealing)시키는 단계;
    (c) 상기 하나 이상의 주형 가닥들을 핵산 중합효소 및 4 종류 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트와 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 하나 이상의 어닐링된 프라이머를 상기 핵산 중합효소에 의해 연장시켜 이에 의해 상기 하나 이상의 주형 가닥들에 결합된 하나 이상의 연장 생성물(extension product)을 형성하는 단계;
    (e) 상기 하나 이상의 연장 생성물을 상기 하나 이상의 주형 가닥들로부터 분리시키는 단계; 및
    상기 단계 (a), (b), (c), (d) 및 (e)를 반복하여 상기 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하며,
    상기 단계 (e)에서 상기 하나 이상의 연장 생성물 중 하나 이상은 단계 (a) 내지 (e)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되고,
    상기에서, 마지막 사이클에 있어서 단계 (e)는 선택적이며,
    상기에서, 하나 이상의, 단계 (a) 내지 (e)의 사이클은 상기 하나 이상의 주형 가닥에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력(tension)을 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (e)는 상기 하나 이상의 주형 가닥에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법,
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 주형 가닥들에 제어된 양의 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계는 기계적 장력, 수력학적 응력(hydrodynamic stress), 또는 전기장 에너지를 상기 하나 이상의 주형 가닥들에 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 주형 가닥들은 유체 흐름에 노출된 표면에 고정되거나, 상기 하나 이상의 주형 가닥들은 유체 흐름에 노출된 표면에 고정된 DNA 중합효소에 결합되거나, 또는 상기 하나 이상의 주형 가닥들은 역-전파성 유체 흐름(counter-propagating fluid flows)에 의해 유지되고 연장되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 0 내지 65 pN, 10 내지 65 pN, 및 0 pN 보다 큰 값 내지 45 pN까지인 범위들로부터 선택되는 범위 내에서 상기 하나 이상의 주형 가닥들에 장력을 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 (d)는 상기 하나 이상의 주형 가닥에 장력을 적용하는 단계 및 핵산 상의 어려운 서열이 복제되는 시기에 해당하는 시점에 상기 적용되는 장력을 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 어려운 서열은 GC-고함량 서열, 연속 반복 서열(tandem repeat sequence), 폴리반복(polyrepeat) 서열, 트리뉴클레오티드 반복 영역, 마이크로새털라이트 영역, 및 중합효소 미끄러짐(polymerase slippage) 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계들 (a), (b), (c), (d) 및 (e)는 65 ℃ 미만의 온도에서 수행되거나; 또는
    상기 단계들 (a), (b), (c), (d) 및 (e)는 50회 이상 반복되거나; 또는
    1000개의 염기보다 많은 염기들로 구성된 주형 가닥이 증폭되거나; 또는
    상기 단계들은 1 마이크로리터 미만의 용량을 갖는 반응 챔버에서 수행되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 단계 (a)의 제1 수행(first instance) 전에:
    RNA 시료를 수득하는 단계,
    상보적인 DNA 가닥을 생성할 수 있게 하기에 충분한 조성물의 존재 하에 상기 RNA를 역전사효소와 접촉시키는 단계, 및
    상기 DNA를 상기 RNA로부터 분리하여 단일 가닥 핵산을 형성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단계 (a)의 제1 수행 전에:
    DNA 시료를 수득하는 단계,
    상기 DNA를 변성시키는 단계,
    상기 변성된 DNA를 반응 챔버 내에서 기판에 결합시키는 단계, 및
    상기 반응 챔버를 플러싱하여 상기 시료로부터 오염물들을 제거하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 단계 (a)의 제1 수행에서, 상기 하나 이상의 주형 가닥은 하나의 핵산 분자로부터 수득되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 주형 가닥들을 기판에 결합된 분자와 결합할 수 있는 복합체화 기들(complexing groups)을 포함하는 프라이머와 접촉시킴으로써 상기 주형 가닥들을 상기 기판에 결합시키는 단계를 포함하며;
    상기 복합체화 기들은 활성화가능하거나(activatable); 또는
    상기 복합체화 기들 및 상기 기판에 결합된 분자들은 각각 비오틴과 스트렙타비딘이거나; 또는
    상기 하나 이상의 복합체화 기들은 광활성화가능한 속박된 비오틴(photoactivatable caged biotin)을 포함하는 것인 방법.
  12. 병원균을 검출하는 방법으로서, 제1항의 핵산을 증폭하는 방법을 포함하고, 상기 병원균과 특이적으로 관련된 뉴클레오티드 서열의 존재 여부에 대해 증폭된 핵산을 탐색하는(probing) 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  13. 핵산을 증폭하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 이중-가닥 핵산 분자를 두 개의 단일-가닥 핵산 분자들로 분리시키기 위해 장력을 상기 이중-가닥 핵산 분자의 하나 또는 두 개의 가닥에 적용함으로써 이중-가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계로, 상기에서 장력이 적용된 하나 또는 두 개의 단일-가닥 핵산 분자는 주형 가닥이 되는 것인 단계;
    (b) 상기 하나 또는 두 개의 주형 가닥을 상기 주형 가닥들의 일부에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머들, 핵산 중합효소 및 4 종류 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트와 접촉시키는 단계;
    (c) 단계 a)에서 상기 하나 또는 두 개의 주형 가닥에 적용된 장력을 감소시켜, 상기 하나 이상의 프라이머들을 이들과 상보적인 주형 가닥들의 해당하는 부분에 어닐링시키는 단계;
    (d) 상기 하나 또는 두 개의 주형 가닥에 적용되는 장력을 제어하여 상기 핵산 중합효소에 의해 상기 하나 이상의 프라이머가 연장되게 하고, 이에 의해 하나 이상의 연장 생성물이 상기 하나 이상의 주형 가닥에 결합된 하나 이상의 이중-가닥 핵산 분자들을 형성하는 단계; 및
    (e) 단계 (a), (b), (c), 및 (d)를 반복하여 상기 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하며,
    단계 (d)에서 형성된 하나 이상의 연장 생성물이 단계 (a)-(d)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되고,
    상기 핵산 분자에 적용되는 장력은 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하고, 감소시키고, 제어하는 단계들 중 하나 이상은 장력이 적용된 핵산 분자들을 기판 또는 하나 이상의 입자 또는 상기 두가지 모두에 결합시키는 단계 및 상기 기판 또는 하나 이상의 입자 또는 상기 두가지 모두의 운동을 제어하는 단계를 포함하거나; 또는
    핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하고, 감소시키고, 제어하는 단계들 중 하나 이상은 장력이 적용된 상기 핵산 분자들을 하나 이상의 입자들에 결합시키는 단계 및 상기 하나 이상의 입자들의 운동을 광학적 조작 또는 자기적 조작(magnetic manipulation)에 의해 제어하는 단계를 포함하거나; 또는
    핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하고, 감소시키고, 제어하는 단계들 중 하나 이상은 장력이 적용된 상기 핵산 분자들에 대한 유체 흐름을 조절하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 핵산 분자들 중 하나 이상은 기판에 결합된 중합 효소에 의해 결합되며, 유체는 상기 기판 위를 흐르도록 된 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 핵산 분자들 중 하나 이상은 기판에 결합되는 것인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 핵산 분자들 중 하나 이상은 유체 흐름 속도 구배에서 또는 역 전파성 유체 흐름에 의해 신장되는 것인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 단계 (d)는 상기 하나 이상의 주형 가닥 상의 어려운 서열이 복제되는 시기에 해당하는 시점에 상기 장력을 증가시키는 단계를 포함하고, 상기 어려운 서열은 GC-고함량 서열, 연속 반복 서열(tandem repeat sequence), 폴리반복(polyrepeat) 서열, 트리뉴클레오티드 반복 영역, 마이크로새털라이트 영역, 및 중합효소 미끄러짐(polymerase slippage) 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 방법은 실온에서 수행되고, 상기 단계 b)에서 장력은 65 pN보다 크며, 상기 단계 c)에서 장력은 0 pN 내지 60 pN으로 감소되고, 상기 단계 d)에서 장력은 0 pN 내지 45 pN로 조정되는 것인 방법.
  20. 중합효소 연쇄 반응에 의해 핵산 증폭을 수행하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 이중-가닥 핵산을 변성시켜 단일-가닥 주형 가닥들을 생성시키는 단계;
    (b) 프라이머를 상기 주형 가닥들에 어닐링시키는 단계; 및
    (c) 주형-가닥-구동 중합효소(template-strand-driven polymerase)에 의해 상기 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성시킴으로써 이중-가닥 핵산 분자들을 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (a)-(c)를 반복하여 이중-가닥 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하며,
    단계 (c)에서 형성되는 하나 이상의 연장 생성물은 단계 (a)-(c)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 이용되고,
    하나 이상의, 단계 (a)-(c)의 사이클은 상기 핵산에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 장력을 적용하는 단계는 기계적 장력, 수력학적 응력, 또는 전자기력, 또는 이들의 조합을 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 단계 (a) 내지 (d)는 80 ℃ 미만의 온도, 30 ℃ 미만의 온도, 또는 주위 온도(ambient temperature)에서 수행되는 것인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 단계 (a)에서 적용되는 장력이 65 pN 이상이거나, 또는 단계 (b)에서 적용되는 장력이 (ⅰ) 50 pN 이하, (ⅱ) 30 pN 이상 50pN 이하, 및 (ⅲ) 35 pN 이상 45 pN 이하의 범위로부터 선택되거나; 또는 단계 (c)에서 적용되는 장력이 45 pN 이하인 것인 방법.
  24. 핵산 증폭을 수행하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 이중-가닥 핵산을 변성시켜 단일-가닥 주형 가닥을 생성시키는 단계;
    (b) 프라이머를 상기 주형 가닥에 어닐링시키는 단계;
    (c) 상기 프라이머를 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 연장시킴으로써 연장 생성물을 생성시키고 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자를 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (a)-(c)를 반복하여 상기 이중-가닥 핵산을 증폭시키는 단계로서, 상기 단계 (a)는 등온에서 이루어지며 상기 핵산에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 기계적 또는 수력학적 장력을 적용하는 단계를 포함하는 것인 단계를 포함하며;
    상기 단계 (a)-(c) 사이클 중 단계 (c)에서 생성되는 이중-가닥 핵산 분자들 중 하나 이상은, 단계 (a)-(c)의 후속 사이클 중의 단계 (a)에서 변성되어, 단계 (c)에서 형성되는 하나 이상의 연장 생성물이 단계 (a)-(c)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 이용되는 것인 방법.
  25. 핵산 증폭을 수행하는 방법으로서:
    (a) 이중-가닥 핵산을 변성시켜 단일-가닥 주형 가닥들을 생성시키는 단계;
    (b) 상기 주형 가닥들에 프라이머를 어닐링시키는 단계;
    (c) 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 상기 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자들을 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (a)-(c)를 반복하여 상기 이중-가닥 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하며,
    단계 (c)에서의 하나 이상의 상기 연장 생성물은 단계 (a)-(c)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 이용되고,
    상기 단계 (c)는 상기 핵산에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는, 조절가능한 장력을 적용하는 단계를 포함하며, 상기 조절가능한 장력은 핵산 중합효소의 교정(proofreading) 엑소뉴클레아제 활성을 조절하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 이용되는 프라이머는 단계 (c)에서 수득된 연장 생성물을 고정시키기 위한 복합체화기들을 포함하는 활성화가능한 프라이머인 것인 방법.
  27. 핵산 증폭을 수행하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 이중-가닥 핵산을 변성시켜 단일-가닥 주형 가닥들을 생성하는 단계;
    (b) 상기 주형 가닥들에 프라이머를 어닐링시키는 단계; 및
    (c) 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 상기 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자들을 형성하는 단계; 및
    (d) 단계 (a)-(c)를 반복하여 상기 이중-가닥 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하며,
    하나 이상의, 단계 (a) 내지 (c)의 사이클은 상기 핵산에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하며,
    상기 단계 (a)-(c) 사이클 중의 단계 (c)에서 생성되는 이중-가닥 핵산 분자 중 하나 이상은, 단계 (a)-(c)의 후속 사이클 중의 단계 (a)에서 변성되어, 단계 (c)에서 형성된 하나 이상의 연장 생성물이 단계 (a)-(d)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 이용되거나, 또는
    단계 (a) 내지 (c)의 사이클이 n회 반복된 후, 상기 주형 가닥의 카피의 수는 n차로 지수적으로 증가하며, 상기에서 n은 1보다 큰 정수인 것인 방법.
  28. 제20항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 핵산에 장력을 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  29. 핵산 가닥에 대한 프라이머의 어닐링의 엄격도(stringency)를 제어하는 방법으로서, 상기 방법은:
    복수의 핵산 증폭 사이클에서,
    핵산 가닥에 프라이머를 어닐링시키는 단계로서, 상기 핵산 가닥 또는 상기 프라이머에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 적용되어 상기 핵산 가닥에의 상기 프라이머의 어닐링의 엄격도를 제어하도록 하는 단계를 포함하며,
    상기에서 핵산 중합효소에 의해 상기 프라이머를 연장시킴으로써 형성된 연장 생성물은 핵산 증폭의 후속 사이클에서 핵산 주형 가닥으로서 이용되는 것인 방법.
  30. 핵산 중합효소에 의한 프라이머 연장의 오류율을 낮추는 방법으로서, 상기 방법은:
    복수의 핵산 증폭 사이클에서,
    핵산 중합효소에 의해 핵산 주형에 어닐링된 프라이머를 연장시켜 이중-가닥 핵산 분자를 생성하는 단계로서, 상기 핵산 주형 또는 상기 프라이머에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 적용되어 상기 핵산 중합효소에 의한 상기 프라이머 연장의 오류율을 낮추는 단계를 포함하며,
    상기 핵산 중합효소에 의해 상기 프라이머를 연장시킴으로써 형성되는 연장 생성물은 핵산 증폭의 후속 사이클에서 핵산 주형 가닥으로서 이용되는 것인 방법.
  31. 핵산 중합효소에 의한, GC 함량이 높은 주형(GC-rich template) 상의 프라이머 연장의 오류율을 낮추는 방법으로서, 상기 방법은:
    복수의 핵산 증폭 사이클에서,
    핵산 중합효소에 의해 GC 함량이 높은 핵산 주형에 어닐링된 프라이머를 연장시켜 이중-가닥 핵산 분자를 생성하는 단계로서, 상기 핵산 주형 또는 상기 프라이머에 조절가능하게 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 적용되어 상기 GC 함량이 높은 주형 상의 상기 프라이머의 연장의 오류율을 낮추는 것인 단계를 포함하며,
    핵산 중합효소에 의해 상기 프라이머를 연장시킴으로써 형성되는 연장 생성물은 핵산 증폭의 후속 사이클에서 핵산 주형 가닥으로 이용되며,
    상기 GC 함량이 높은 핵산 주형은 50%보다 높은 GC 함량을 갖는 것인 방법.
  32. 핵산 증폭의 충실도(fidelity)를 개선시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 이중-가닥 핵산을 변성시켜 단일-가닥 주형 가닥들을 생성하는 단계;
    (b) 상기 주형 가닥에 프라이머를 어닐링시키는 단계;
    (c) 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 상기 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자를 형성하는 단계; 및
    (d) 단계 (a)-(c)의 사이클을 1회 이상 반복함으로써 상기 이중-가닥 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하며,
    상기 단계 (c)에서 형성된 하나 이상의 연장 생성물은 단계 (a)-(c)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로서 이용되고,
    1회 이상의, 단계 (a) 내지 (c)의 사이클은, 핵산 증폭의 충실도를 개선시키기 위해 상기 핵산에 조절가능하게 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  33. 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 4개의 시료를 제공하는 단계로서, 각 시료는 하기를 포함하는 것인 단계:
    단일-가닥 또는 이중-가닥의 핵산 표적 서열,
    핵산 중합효소;
    상기 표적 서열에 상보적인 프라이머;
    4종류 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트; 및
    ddATP, ddCTP, ddGTP 및 ddTTP로부터 선택되는 각각의 디데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트;
    (b) 상기 이중-가닥 핵산 표적 서열을 단일-가닥 핵산 표적 서열로 변성시키는 단계;
    (c) 상기 프라이머를 그의 상보적인 단일-가닥 핵산 표적 서열에 혼성화시키는 단계;
    (d) 상기 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 형성하는 단계;
    (e) 단계 (b) 내지 (d)를 반복하여 추가적인 연장 생성물을 형성하는 단계; 및
    (f) 상기 핵산 표적 서열의 서열을 결정하는 단계를 포함하며,
    상기에서 하나 이상의, 단계 (b) 내지 (d)의 사이클은 핵산 표적 서열의 하나 이상의 가닥에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하고,
    상기 연장 생성물은 단계 (b) 내지 (d)의 후속 사이클에서 핵산 주형 가닥으로 이용되는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 단계 (f)는 상기 연장 생성물의 길이를 검출하는 것에 의해 수행되는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 디데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트는 검출가능한 화학적 모이어티로 표지된 것인 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 디데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트는 염기-특이적 형광 모이어티로 표지되고, 상기 단계 (f)는 염기-특이적 형광 모이어티를 검출하는 것에 의해 수행되는 것인 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 핵산 표적 서열은 단계 (a) 내지 (f)를 수행하기 전에 증폭되는 것인 방법.
  38. 삭제
  39. 핵산 복제의 충실도를 개선시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    복수의 핵산 증폭 사이클에서,
    주형-가닥-구동 중합효소에 의해 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하여, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자를 형성하고, 동시에 조절가능하게 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하여 교정 엑소뉴클레아제 활성을 유도하며, 이에 의해 복제의 충실도를 개선시키는 단계를 포함하고,
    상기에서 1.0 x 10-7 개의 오류/염기쌍 미만의 오류율이 달성되며,
    상기에서 핵산 중합효소에 의해 상기 프라이머를 연장시킴으로써 형성되는 연장 생성물은 핵산 증폭의 후속 사이클에서 핵산 주형 가닥으로 이용되는 것인 방법.
  40. 핵산 서열 결정의 충실도를 개선시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 4개의 시료를 제공하는 단계로서, 각 시료는 하기를 포함하는 것인 단계:
    단일-가닥 또는 이중-가닥의 핵산 표적 서열,
    핵산 중합효소;
    상기 표적 서열에 상보적인 프라이머;
    4 종류 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트; 및
    ddATP, ddCTP, ddGTP 및 ddTTP로부터 선택되는 개별적인 디데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트;
    (b) 상기 이중-가닥 핵산 표적 서열을 단일-가닥 핵산 표적 서열로 변성시키는 단계;
    (c) 상기 프라이머를 그의 상보적인 단일-가닥 핵산 표적 서열에 혼성화시키는 단계;
    (d) 상기 프라이머를 연장시켜 이중-가닥 핵산 연장 생성물을 형성하고, 동시에 상기 핵산 표적 서열에 조절가능하게 장력을 적용하여 교정 엑소뉴클레아제 활성을 유도하여, 이에 의해 충실도 또는 프라이머 연장을 개선시키는 단계;
    (e) 단계 (b) 내지 (d)를 반복하여 추가적인 연장 생성물을 형성하는 단계; 및
    (f) 상기 핵산 표적 서열의 서열을 결정하는 단계를 포함하며,
    상기에서 하나 이상의, 단계 (b) 내지 (d)의 사이클은 핵산 표적 서열의 하나 이상의 가닥에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하고,
    상기 연장 생성물은 단계 (b) 내지 (d)의 후속 사이클에서 핵산 주형 가닥으로서 사용되는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 장력은 핵산 복제 또는 서열 결정의 충실도를 개선시키기 위해 상기 핵산에 조절 가능하게 적용되는 것인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 오류율은 5.0 x 10-8 개의 오류/염기쌍 미만인 것인 방법.
  43. 삭제
  44. 핵산 증폭의 충실도를 개선시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 이중-가닥 핵산을 변성시켜 단일-가닥 주형 가닥들을 생성하는 단계;
    (b) 상기 주형 가닥들에 프라이머를 어닐링시키는 단계;
    (c) 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 상기 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자를 형성하며, 동시에 상기 주형 가닥에 조절가능하게 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하여 교정 엑소뉴클레아제 활성을 유도하고, 이에 의해 프라이머 연장의 충실도를 개선시키는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (a)-(c)를 반복하여 이중-가닥 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하며,
    상기 단계 (c)에서 형성되는 하나 이상의 연장 생성물은 단계 (a)-(c)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 이용되고,
    1.0 x 10-7 개의 오류/염기쌍 미만의 오류율이 달성되는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 단계 (a) 내지 (b) 중 하나 이상의 단계는 상기 핵산에 조절가능하게 장력을 적용하여 핵산 증폭의 충실도를 개선시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 오류율은 5.0 x 10-8 개의 오류/염기쌍 미만인 것인 방법.
  47. 삭제
  48. 생물학적 시료에서 병원균의 존재여부를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 핵산 증폭을 수행하는 단계로서,
    (ⅰ) 이중-가닥 핵산을 변성시켜 단일-가닥 주형 가닥들을 생성하는 단계;
    (ⅱ) 상기 주형 가닥들에 하나 이상의 프라이머를 어닐링시키는 단계;
    (ⅲ) 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 상기 하나 이상의 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자들을 형성하는 단계; 및
    (ⅳ) 단계 (ⅰ)-(ⅲ)를 반복하여 상기 이중-가닥 핵산을 증폭시키는 단계로, 하나 이상의, 상기 단계 (ⅰ)-(ⅲ)의 사이클은 상기 핵산에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하는 것인 단계를 포함하고,
    상기에서, 단계 (ⅲ)에서 상기 하나 이상의 연장 생성물 중 하나 이상은 단계 (ⅰ)-(ⅲ)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되는 것인 단계;
    (b) 상기 병원균과 특이적으로 관련된 뉴클레오티드 서열의 존재 여부에 대해 상기 증폭된 핵산을 탐색하는 단계를 포함하며,
    상기 병원균 또는 뉴클레오티드 서열은 1000 개의 개체 또는 폴리뉴클레오티드/ml 미만의 농도에서 검출되는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 적용되는 장력은 기계적 장력, 수력학적 장력, 또는 전자기적 장력, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 병원균 또는 폴리뉴클레오티드는 각각 100 개의 개체 또는 폴리뉴클레오티드/ml 미만의 농도에서 검출되는 것인 방법.
  51. 제48항에 있어서, 병원균 또는 뉴클레오티드 서열은 1 개의 개체 또는 폴리뉴클레오티드/ml 미만의 농도에서 검출되는 것인 방법.
  52. 핵산 증폭을 수행하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 이중-가닥 핵산을 변성시켜 단일-가닥 주형 가닥들을 생성하는 단계;
    (b) 상기 주형 가닥들에 하나 이상의 프라이머를 어닐링시키는 단계;
    (c) 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 상기 하나 이상의 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자를 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (a)-(c)를 반복하여 이중-가닥 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하며,
    상기 단계 (c)에서 형성되는 하나 이상의 연장 생성물은 단계 (a)-(c)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되고,
    하나 이상의, 단계 (a)-(c)의 사이클은 상기 주형 가닥에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하고, 및
    상기 장력은 주형 가닥 상의 중합효소의 위치에 따라 조절되는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 주형 가닥 상의 중합효소의 위치는 모니터링 되거나, 계산되거나 또는 어려운 서열의 위치에 일치되고, 상기 어려운 서열은 GC-고함량 서열, 연속 반복 서열(tandem repeat sequence), 폴리반복(polyrepeat) 서열, 트리뉴클레오티드 반복 영역, 마이크로새털라이트 영역, 및 중합효소 미끄러짐(polymerase slippage) 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 삭제
  55. 시료에서 하나 이상의 특이적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 핵산 증폭을 수행하는 단계로서,
    (ⅰ) 이중-가닥 핵산을 변성시켜 단일-가닥 주형 가닥들을 생성하는 단계;
    (ⅱ) 상기 주형 가닥들에 하나 이상의 프라이머를 어닐링시키는 단계;
    (ⅲ) 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 상기 하나 이상의 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자를 형성하는 단계; 및
    (ⅳ) 상기 단계 (ⅰ)-(ⅲ)를 반복하여 이중-가닥 핵산을 증폭시키고, 이에 의해 증폭된 핵산을 생성하는 단계를 포함하고,
    상기에서 단계 (ⅰ)-(ⅲ) 중 하나 이상은 상기 핵산에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하며,
    단계 (ⅲ)에서 상기 하나 이상의 연장 생성물 중 하나 이상은 단계 (ⅰ)-(ⅲ)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되는 것인 단계;
    (b) 상기 증폭된 핵산을 하나 이상의 프로브와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 증폭된 핵산에 결합된 프로브의 존재 또는 부재를 관찰함으로써 상기 특이적 핵산 서열(nucleic sequence)이 시료에 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  56. 시료에서 2개 이상의 특이적 핵산 서열을 구별하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 핵산 증폭을 수행하는 단계로서,
    (ⅰ) 이중-가닥 핵산을 변성시켜 단일-가닥 주형 가닥들을 생성하는 단계;
    (ⅱ) 상기 주형 가닥들에 하나 이상의 프라이머를 어닐링시키는 단계;
    (ⅲ) 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 상기 하나 이상의 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자를 형성하는 단계; 및
    (ⅳ) 상기 단계 (ⅰ)-(ⅲ)를 반복하여 이중-가닥 핵산을 증폭시키고, 이에 의해 증폭된 핵산을 생성하는 단계를 포함하고,
    상기에서 단계 (ⅰ)-(ⅲ) 중 하나 이상은 상기 핵산에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하며,
    단계 (ⅲ)에서 상기 하나 이상의 연장 생성물 중 하나 이상은 단계 (ⅰ)-(ⅲ)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되는 것인 단계;
    (b) 상기 증폭된 핵산을 복수의 프로브들과 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 복수의 프로브들 중 어느 것이 상기 증폭된 핵산에 결합되는지를 검출하고, 이에 의해 2개 이상의 특이적 핵산 서열을 구별하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  57. RNA에 코딩된 서열의 증폭 또는 검출 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 역전사를 수행하고 이에 의해 상응하는 cDNA 주형을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 상응하는 cDNA를:
    (i) 하나 이상의 cDNA 주형 가닥에 하나 이상의 프라이머를 어닐링시키는 단계;
    (ii) 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 상기 하나 이상의 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자를 형성하는 단계; 및
    (iii) 상기 단계 (ⅰ)-(ii)를 반복하여 이중-가닥 핵산을 증폭시키고, 이에 의해 RNA에 코딩된 서열을 증폭 또는 검출하는 단계를 포함하고,
    상기에서 하나 이상의, 단계 (ⅰ)-(ii)의 사이클은 상기 핵산에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하며,
    단계 (ii)에서 상기 연장 생성물 중 하나 이상은 단계 (ⅰ)-(ii)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되는 것인 방법에 의해 증폭시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  58. 이중 가닥 핵산의 변성을 제어하는 방법으로서, 상기 방법은:
    복수의 핵산 증폭 사이클에서,
    상기 핵산 가닥에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 수력학적 장력을 조절가능하게 적용하여 상기 이중 가닥 핵산의 변성을 제어하는 단계를 포함하며,
    상기에서, 핵산 중합효소에 의해 프라이머를 연장시킴으로써 형성되는 하나 이상의 연장 생성물은 핵산 증폭의 후속 사이클에서 핵산 주형 가닥으로 사용되는 것인 방법.
  59. 삭제
  60. 핵산을 증폭시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 하나 이상의 단일-가닥 핵산의 하나 이상의 주형 가닥들을 상기 하나 이상의 주형 가닥들의 일부에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머들과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 하나 이상의 프라이머들 중 하나 이상의 프라이머를, 상기 프라이머와 상보적인 하나 이상의 주형 가닥들의 일부에 어닐링시키는 단계;
    (c) 상기 하나 이상의 주형 가닥들을 핵산 중합효소 및 4 종류 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트와 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 하나 이상의 어닐링된 프라이머를 핵산 중합효소에 의해 연장시키고, 이에 의해 상기 하나 이상의 주형 가닥에 결합된 하나 이상의 연장 생성물을 형성하는 단계;
    (e) 상기 하나 이상의 연장 생성물을 상기 하나 이상의 주형 가닥들로부터 분리하는 단계; 및
    (f) 상기 단계 (a), (b), (c), (d) 및 (e)를 반복하여 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하며,
    상기 단계 (e)에서 형성되는 하나 이상의 연장 생성물들은 단계 (a)-(e)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되고,
    마지막 사이클에서 단계 (e)는 선택적이며, 하나 이상의, 단계 (a)-(e)의 사이클 중에 핵산 분자를 잡아늘이는 경향이 있는 장력이 적용되는 것인 방법.
  61. 핵산 증폭의 충실도를 개선시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 하나 이상의 단일-가닥 핵산의 주형 가닥을 상기 하나 이상의 주형 가닥의 일부에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 하나 이상의 프라이머들 중 하나 이상의 프라이머를, 상기 프라이머와 상보적인 하나 이상의 주형 가닥의 부분에 어닐링시키는 단계;
    (c) 상기 하나 이상의 주형 가닥을 핵산 중합효소 및 4 종류 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트와 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 하나 이상의 어닐링된 프라이머를 핵산 중합효소에 의해 연장시키고, 이에 의해 상기 하나 이상의 주형 가닥에 결합된 하나 이상의 연장 생성물을 형성하는 단계;
    (e) 상기 하나 이상의 연장 생성물을 상기 하나 이상의 주형 가닥으로부터 분리하는 단계; 및
    (f) 상기 단계 (a) 내지 (e)를 반복하여 핵산을 증폭시키는 단계로서,
    단계 (e)에서 하나 이상의 연장 생성물들 중 하나 이상은 단계 (a)-(e)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되고, 마지막 사이클에서 단계 (e)는 선택적인 것인 단계를 포함하고, 및
    하나 이상의, 단계 (a)-(e)의 사이클 동안에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 적용되어, 이에 의해 증폭의 충실도를 개선시키는 것인 방법.
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 하기를 포함하는 시료를 제공하는 단계:
    핵산 표적 서열;
    핵산 중합효소;
    상기 핵산 표적 서열에 상보적인 프라이머; 및
    하나 이상의 뉴클레오티드;
    (b) 상기 프라이머를 그의 상보적인 핵산 표적 서열에 어닐링시키는 단계;
    (c) 상기 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 형성하는 단계;
    (d) 단계 (b) 내지 (c)를 반복하여 연장 생성물을 추가적으로 형성하는 단계; 및
    (e) 상기 핵산 표적 서열의 서열을 결정하는 단계를 포함하며,
    상기에서 하나 이상의, 단계 (b) 내지 (d)의 사이클은 상기 핵산 표적 서열 및 상기 프라이머 연장 생성물 중 하나 이상에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하고,
    단계 (c)에서 형성된 하나 이상의 연장 생성물 중 하나 이상은 단계 (a)-(d)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 핵산 표적 서열은 RNA, 이중-가닥 DNA 또는 단일-가닥 DNA이거나; 또는
    상기 핵산 표적 서열의 서열을 결정하는 단계는 상기 연장 생성물의 길이를 검출하는 것에 의해 수행되거나; 또는
    상기 하나 이상의 뉴클레오티드는 하나 이상의 검출가능한 화학적 모이어티로 표지되거나; 또는
    상기 하나 이상의 뉴클레오티드는 하나 이상의 염기-특이적 형광 모이어티로 표지되고, 상기 핵산 표적 서열의 서열을 결정하는 단계는 상기 하나 이상의 염기-특이적 형광 모이어티를 검출하는 것에 의해 수행되거나; 또는
    상기 핵산 표적 서열은 단계 (a) 내지 (e)를 수행하기 전에 증폭되는 것인 방법.
  66. 삭제
  67. 제64항에 있어서, 단계 (a)의 제1 수행 전에 하기를 더 포함하는 것인 방법:
    RNA를 수득하는 단계,
    상기 RNA를 상보적인 DNA 가닥을 합성하도록 하기에 충분한 조성물의 존재 하에서 역전사효소와 접촉시키는 단계, 및
    상기 상보적인 DNA 가닥을 상기 RNA로부터 분리하여 단일-가닥 핵산을 형성하는 단계.
  68. 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 이중-가닥 핵산 표적 서열;
    핵산 중합효소;
    상기 핵산 표적 서열에 상보적인 프라이머;
    하나 이상의 뉴클레오티드; 및
    하나 이상의 디데옥시 뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    (b) 상기 이중-가닥 핵산 표적 서열을 변성시키는 단계;
    (c) 상기 프라이머를 그의 상보적인 핵산 표적 서열에 어닐링시키는 단계;
    (d) 상기 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 형성하는 단계;
    (e) 단계 (b) 내지 (d)를 반복하여 연장 생성물을 더 형성하는 단계; 및
    (f) 상기 핵산 표적 서열의 서열을 결정하는 단계를 포함하며,
    하나 이상의, 단계 (b) 내지 (e)의 사이클 동안 상기 핵산 표적 서열 또는 상기 프라이머 중 하나 이상에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 적용되고,
    상기 단계 (d)에서 형성되는 하나 이상의 연장 생성물들 중 하나 이상은 단계 (a)-(d)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 단계 (f)는 상기 연장 생성물의 길이를 검출하는 것에 의해 수행되는 것인 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오티드는 하나 이상의 검출가능한 화학적 모이어티에 의해 표지되는 것인 방법.
  71. 제68항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오티드는 하나 이상의 염기-특이적 형광 모이어티에 의해 표지되고, 상기 단계 (f)는 하나 이상의 염기-특이적 형광 모이어티를 검출하는 것에 의해 수행되는 것인 방법.
  72. 제68항에 있어서, 상기 핵산 표적 서열은 단계 (a) 내지 (f)를 수행하기 전에 증폭되는 것인 방법.
  73. 핵산 서열 결정의 충실도를 개선시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 하기를 포함하는 시료를 제공하는 단계:
    단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 표적 서열;
    핵산 중합효소;
    상기 표적 서열에 상보적인 프라이머;
    하나 이상의 뉴클레오티드; 및
    하나 이상의 디데옥시 뉴클레오티드;
    (b) 상기 시료가 이중-가닥 핵산 표적 서열을 포함하는 경우, 상기 이중-가닥 핵산 표적 서열을 단일-가닥 핵산 표적 서열로 변성시키는 단계;
    (c) 상기 프라이머를 그의 상보적인 핵산 표적 서열에 혼성화시키는 단계;
    (d) 상기 프라이머를 연장시켜 이중-가닥 핵산 연장 생성물을 형성하는 단계;
    (e) 단계 (b) 내지 (d)를 반복하여 연장 생성물을 더 형성하는 단계; 및
    (f) 상기 핵산 표적 서열의 서열을 결정하는 단계를 포함하며,
    상기 단계 (d)에서 하나 이상의 연장 생성물들 중 하나 이상은 단계 (a)-(d)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되며;
    상기에서 하나 이상의, 단계 (a) 내지 (f)의 사이클 동안 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 적용되고 이에 의해 핵산 서열 결정의 충실도가 개선되거나, 또는
    핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 상기 핵산 표적 서열 및 상기 프라이머 중 하나 이상에 적용되어 교정 엑소뉴클레아제 활성을 유도하고, 이에 의해 프라이머 연장의 충실도를 개선시키고, 및 이에 의해, 핵산 서열 결정의 충실도를 개선시키는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 단계 (b) 및 (c) 중 하나 이상은 상기 핵산 표적 서열 및 상기 프라이머 중 하나 이상에 장력을 적용하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  75. 프라이머 및 핵산 주형의 혼성화를 제어하는 방법으로서, 상기 방법은:
    복수의 핵산 증폭의 사이클에서,
    하나 이상의 프라이머를 하나 이상의 핵산 주형에 어닐링시키는 단계로, 상기 핵산 주형 또는 상기 프라이머에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 적용되며, 상기 프라이머 또는 핵산 주형 또는 상기 두가지 모두는 어레이(array)로 배열되고,
    이에 의해 상기 프라이머와 상기 핵산 주형의 혼성화를 조절하는 것인 단계를 포함하고,
    핵산 중합효소에 의해 상기 프라이머를 연장시킴으로써 형성되는 연장 생성물은 핵산 증폭의 후속 사이클에서 핵산 주형 가닥으로 사용되는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 어닐링의 엄격도를 제어하기 위해 장력이 적용되는 것인 방법.
  77. 어려운 서열 주형 가닥으로의 프라이머의 어닐링의 엄격도를 제어하는 방법으로서, 상기 방법은:
    복수의 핵산 증폭 사이클에서,
    프라이머를 어려운 서열 주형 가닥에 어닐링시키는 단계로서, 상기 어려운 서열 주형 가닥 또는 상기 프라이머에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 적용되어 상기 프라이머의 상기 어려운 서열 주형 가닥으로의 어닐링의 엄격도를 제어하는 것인 단계를 포함하고;
    상기에서 핵산 중합효소에 의해 형성되는 연장 생성물은 하나 이상의 핵산 증폭의 후속 사이클에서 핵산 주형으로 사용되며,
    상기 어려운 서열은 GC-고함량 서열, 연속 반복 서열(tandem repeat sequence), 폴리반복(polyrepeat) 서열, 트리뉴클레오티드 반복 영역, 마이크로새털라이트 영역, 및 중합효소 미끄러짐(polymerase slippage) 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  78. 하나 이상의 핵산 중합효소에 의해 하나 이상의 어려운 서열 주형 가닥들 상에서 복수의 프라이머를 연장시키는 단계의 오류율을 낮추는 방법으로서, 상기 방법은:
    복수의 핵산 증폭 사이클에서,
    하나 이상의 핵산 중합효소에 의해 하나 이상의 어려운 서열 주형 가닥에 어닐링된 복수의 프라이머를 연장시켜 이중-가닥 핵산 분자들을 포함하는 연장 생성물을 생성하고, 상기 어려운 서열은 GC-고함량 서열, 연속 반복 서열(tandem repeat sequence), 폴리반복(polyrepeat) 서열, 트리뉴클레오티드 반복 영역, 마이크로새털라이트 영역, 및 중합효소 미끄러짐(polymerase slippage) 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단계를 포함하고,
    상기 하나 이상의 어려운 서열 주형 가닥 또는 상기 복수의 프라이머에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 적용되어 상기 하나 이상의 어려운 서열 주형 가닥 상의 복수의 프라이머의 연장 단계의 오류율을 낮추며,
    상기에서 핵산 중합효소에 의해 형성되는 연장 생성물은 하나 이상의 후속 핵산 증폭 사이클에서 핵산 주형 가닥으로 사용되는 것인 방법.
  79. 핵산을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 하나 이상의 핵산 주형을 하나 이상의 프라이머와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 하나 이상의 프라이머를 하나 이상의 핵산 주형에 어닐링시키는 단계;
    (c) 상기 하나 이상의 핵산 주형을 핵산 중합효소 및 하나 이상의 뉴클레오티드와 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 하나 이상의 어닐링된 프라이머를 핵산 중합효소에 의해 연장시키고, 이에 의해 하나 이상의 연장 생성물을 형성하는 단계;
    (e) 상기 하나 이상의 연장 생성물을 상기 하나 이상의 핵산 주형으로부터 분리하는 단계; 및
    (f) 단계 (a) 내지 (e)를 반복하는 단계를 포함하며,
    상기에서 하나 이상의, 단계 (a)-(e)의 사이클 동안 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 적용되고, 이에 의해 핵산을 제조하며,
    마지막 사이클에서 단계 (e)는 선택적이며,
    상기 단계 (d)에서 형성되는 연장 생성물들 중 하나 이상은 하나 이상의, 단계 (a)-(e)의 후속 사이클에서 주형으로 사용되는 것인 방법.
  80. RNA의 서열을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 역전사를 수행하여 이에 의해 cDNA 주형을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 cDNA 주형을:
    (ⅰ) 이중-가닥 핵산 주형을 변성시켜 단일-가닥 핵산 주형 가닥을 생성하는 단계;
    (ⅱ) 상기 핵산 주형 가닥에 하나 이상의 프라이머를 어닐링시키는 단계;
    (ⅲ) 핵산 중합효소에 의해 상기 하나 이상의 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자를 형성하는 단계; 및
    (ⅳ) 상기 단계 (ⅰ)-(ⅲ)를 반복하여 이중-가닥 핵산을 증폭시키는 단계;를 포함하는 방법에 의해 증폭시키는 단계를 포함하고,
    상기 단계 (ⅲ)에서 상기 연장 생성물들 중 하나 이상은 단계 (ⅰ)-(ⅳ)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되며,
    하나 이상의 단계 (ⅰ)-(ⅲ)의 사이클에서 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 적용되는 것인 방법.
  81. 제28항에 있어서, 상기 장력은 조절가능하게 적용되는 것인 방법.
  82. 제29항에 있어서, 상기 장력은 조절가능하게 적용되는 것인 방법.
  83. 핵산 서열에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하기 위한 장치로서, 상기 장치는:
    하나 이상의 유체 채널;
    핵산 분자를 상기 하나 이상의 유체 채널 내에 유지하기 위한 수단;
    주형-기반 프라이머 신장, 복제, 또는 하나 이상의 증폭 사이클 동안, 내부에 유지된 상기 핵산 분자들에 프라이머 가변적이고 제어된 양의 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하기 위한 수단; 및
    핵산 증폭, 복제, 또는 주형-기반 프라이머 신장을 위해 구성되고, 시약들을 반응시키거나, 저장하거나 또는 도입하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하며, 상기 시약들은 핵산 프라이머, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 및 중합효소를 포함하는 것인 장치.
  84. 삭제
  85. 제83항에 있어서, 상기 장치 내에 유지된 핵산 분자에 장력을 적용하기 위한 수단은 핵산 분자들을 그 위에 고정시키기 위한 수단을 포함하는 제1 및 제2 표면을 포함하며, 또한 상기 제1 및 제2 표면은 상호 간에 이동될 수 있도록 구성되는 것인 장치.
  86. 제83항에 있어서, 상기 핵산 분자에 장력을 적용하기 위한 수단은 핵산 분자를 그 위에 고정시키기 위한 수단을 포함하는 하나 이상의 표면을 포함하고, 상기 장치는 상기 핵산 분자 상에 제어되고 가변적인 유체 흐름을 제공하기 위한 수단을 더 포함하는 것인 장치.
  87. 제86항에 있어서, 핵산 분자를 그 위에 고정시키기 위한 수단을 갖는 하나 이상의 표면은, 상기 핵산 분자들을 고정시키기 위한 수단들 간에 분배되는 유체 흐름을 위한 통로를 더 포함하는 것인 장치.
  88. 제83항에 있어서, 상기 핵산 분자들 상에 제어되고 가변적인 유체 흐름을 제공하기 위한 수단은 층류(laminar fluid flow)에서 속도 구배를 형성하도록 구성되는 것인 장치.
  89. 제83항에 있어서, 상기 장치에 유지된 상기 핵산 분자들에 장력을 제공하기 위한 수단은 층류에서 속도 구배, 유체 흐름 내의 정체점(stagnation point), 역 전파성 유체 흐름, 또는 이들의 조합을 제공하도록 구성된 유체 흐름 채널들을 포함하는 것인 장치.
  90. 제83항에 있어서, 상기 장치 내에 유지된 상기 핵산 분자들에 장력을 제공하기 위한 수단은 핵산 분자들에 결합된 입자들을 조작할 수 있도록 구성된 광학적, 전기적, 또는 자기적 조작기(manipulator)들의 어레이를 포함하는 것인 장치.
  91. 핵산 분자들에 장력을 제공하기 위한 미세유체 장치로서, 상기 장치는:
    a) 기판;
    b) 상기 기판 내에 위치한 흐름 채널;
    c) 핵산 분자들의 시료가 상기 흐름 채널 내로 도입될 수 있게 하는 상기 흐름 채널과 유체 소통(fluid communication) 관계에 있는 유입구,
    d) 주형-기반 프라이머 신장, 복제, 또는 하나 이상의 증폭 사이클 동안, 상기 핵산 분자에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하기 위한 수단,
    e) 상기 장치 내에 핵산 분자들을 유지시키기 위한 수단, 및
    f) 핵산 증폭, 복제, 또는 주형-기반 프라이머 신장을 위해 구성되고, 시약들을 반응시키거나, 저장하거나 또는 도입하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하며, 상기 시약들은 핵산 프라이머, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 및 중합효소를 포함하는 것인 장치.
  92. 제91항에 있어서, 상기 핵산 분자들에 장력을 적용하기 위한 수단은 부착된 핵산 중합효소를 갖는 하나 이상의 표면을 포함하며, 상기 장치는 상기 핵산 분자들 상에 제어되고 가변적인 유체 흐름을 제공하기 위한 수단을 더 포함하는 것인 장치.
  93. 제91항에 있어서:
    그 위에 복수의 지지 구조(support structure)를 가지며, 상기 지지 구조는 핵산 분자들을 고정시키기 위한 수단을 갖는 것인 하나 이상의 표면; 및
    상기 핵산 분자들 상에 제어되고 가변적인 유체 흐름을 제공하기 위한 수단을 더 포함하고,
    상기 지지 구조는 유체가 제어된 속도로 상기 구조들 사이로 흐를 수 있도록 구성되는 것인 장치.
  94. 제91항에 있어서, 상기 장치 내에 유지된 핵산 분자들에 장력을 적용하기 위한 수단은 속도 구배를 형성하도록 구성되는 유체 채널을 포함하는 것인 장치.
  95. 제94항에 있어서, 상기 유체 채널은 수력학적 포커싱(hydrodynamic focusing)을 제공하도록 구성되는 것인 장치.
  96. 제94항에 있어서, 상기 유체 채널은 역 전파성 흐름을 제공하도록 구성되는 것인 장치.
  97. 삭제
  98. 삭제
  99. 삭제
  100. 삭제
  101. 삭제
  102. 핵산 분자들을 가공하기 위한 미세유체 장치로서:
    a) 기판;
    b) 상기 기판 내에 위치한 흐름 채널;
    c) 핵산 분자들의 시료가 흐름 채널 내로 도입될 수 있게 하는 상기 흐름 채널과 유체 소통 관계에 있는 유입구,
    d) 주형-기반 프라이머 신장, 복제, 또는 하나 이상의 증폭 사이클 동안, 상기 핵산 분자에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하기 위한 수단,
    e) 상기 장치 내에 핵산 분자들을 유지시키기 위한 수단으로서, 상기 장치는 핵산 분자들의 변성을 위해 장력을 제공하도록 구성되는 것인 수단, 및
    f) 핵산 증폭, 복제, 또는 주형-기반 프라이머 신장을 위해 구성되고, 시약들을 반응시키거나, 저장하거나 또는 도입하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하며, 상기 시약들은 핵산 프라이머, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 및 중합효소를 포함하는 것인 장치.
  103. 삭제
  104. DNA 분자의 서열 결정을 위한 장치로서:
    하나 이상의 유체 채널;
    상기 유체 채널 내에 위치하며, 상기 장치 내에 핵산 분자들을 유지하기 위한 수단; 및
    주형-기반 프라이머 신장, 복제, 또는 하나 이상의 증폭 사이클 동안 그 내부에 유지된 핵산 분자들에 가변적이고 제어된 양의 장력을 적용하기 위한 수단,
    시약들을 반응시키거나, 저장하거나 또는 도입하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하며, 상기 챔버는 4개의 시료를 포함하고, 각 시료는:
    단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 표적 서열,
    DNA 중합효소;
    상기 표적 서열에 상보적인 프라이머;
    4 종류 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트; 및
    ddATP, ddCTP, ddGTP 및 ddTTP로부터 선택되는 개별적인 디데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함하고;
    상기에서 서열 결정은:
    (b) 이중-가닥 DNA 표적 서열을 단일-가닥 DNA 표적 서열로 변성시키는 단계;
    (c) 상기 프라이머를 그와 상보적인 단일-가닥 DNA 표적 서열에 혼성화시키는 단계;
    (d) 상기 프라이머를 연장시켜 연장 생성물들을 형성하는 단계;
    (e) 단계 (b) 내지 (d)를 반복하여 추가적인 연장 생성물을 형성하는 단계; 및
    (f) 상기 DNA 표적 서열의 서열을 결정하는 단계를 포함하며,
    상기에서 단계 (b) 내지 (d)의 각 사이클 동안 DNA 표적 서열의 하나 이상의 가닥에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력이 적용되는 것인 장치.
  105. 핵산 증폭을 수행하기 위한 장치로서:
    하나 이상의 유체 채널;
    상기 유체 채널 내에 위치하며, 상기 장치 내에 핵산 분자들을 유지하기 위한 수단; 및
    주형-기반 프라이머 신장, 복제, 또는 하나 이상의 증폭 사이클 동안, 그 내부에 유지된 핵산 분자들에 가변적이고 제어된 양의 장력을 적용하기 위한 수단,
    시약들을 반응시키거나, 저장하거나 또는 도입하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하고,
    상기에서 증폭은:
    (a) 이중-가닥 핵산을 변성시켜 단일-가닥 주형 사슬들을 생성시키는 단계;
    (b) 하나 이상의 프라이머를 상기 주형 가닥들에 어닐링시키는 단계;
    (c) 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 상기 하나 이상의 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자들을 형성하는 단계; 및
    (d) 단계 (a)-(c)를 반복하여 상기 이중-가닥 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하며,
    상기에서, 단계 (a)-(c)의 사이클 중 단계 (c)에서 생성되는 하나 이상의 이중-가닥 핵산 분자는 단계 (a)-(c)의 후속 사이클 중의 단계 (a)에서 변성되어, 단계 (c)에서 형성되는 하나 이상의 연장 생성물이 단계 (a)-(d)의 후속 사이클에서 주형 가닥으로 사용되고,
    하나 이상의, 단계 (a)-(c)의 사이클은 상기 주형 가닥에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하며,
    상기 장력은 상기 주형 가닥 상의 중합 효소의 위치에 따라 조절되는 것인 장치.
  106. 시료에서 하나 이상의 특이적 핵산 서열의 존재를 검출하기 위한 장치로서:
    하나 이상의 유체 채널;
    상기 유체 채널 내에 위치하며, 상기 장치 내에 핵산 분자들을 유지하기 위한 수단; 및
    주형-기반 프라이머 신장, 복제, 또는 하나 이상의 증폭 사이클 동안, 그 내부에 유지된 핵산 분자들에 가변적이고 제어된 양의 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하기 위한 수단,
    시약들을 반응시키거나, 저장하거나 또는 도입하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하고,
    상기에서 증폭은:
    (a) 핵산 증폭을 수행하는 단계로서,
    (i) 하나 이상의 프라이머를 단일-가닥 주형 가닥들에 어닐링시키는 단계;
    (ii) 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 상기 하나 이상의 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자들을 형성하는 단계; 및
    (iii) 단계 (ⅰ)-(ii)를 반복하여 상기 이중-가닥 핵산을 증폭시키고 이에 의해 증폭된 핵산을 생성하는 단계를 포함하며,
    상기에서 하나 이상의, 단계 (ⅰ)-(ii)의 사이클은 상기 핵산에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하는 것인 단계;
    (b) 상기 증폭된 핵산을 하나 이상의 프로브와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 증폭된 핵산에 결합된 프로브의 존재 또는 부재를 관찰함으로써 상기 특이적 핵산 서열이 상기 시료에 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 것인 장치.
  107. RNA에 코딩된 서열의 증폭 또는 검출을 위한 장치로서:
    하나 이상의 유체 채널;
    상기 유체 채널 내에 위치하며, 상기 장치 내에 핵산 분자들을 유지하기 위한 수단; 및
    주형-기반 프라이머 신장, 복제, 또는 하나 이상의 증폭 사이클 동안, 그 내부에 유지된 핵산 분자들에 가변적이고 제어된 양의 장력을 적용하기 위한 수단,
    시약들을 반응시키거나, 저장하거나 또는 도입하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하고,
    상기에서 증폭은:
    (a) 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 역전사를 수행하고 이에 의해 상응하는 cDNA 주형을 수득하는 단계;
    (c) 상기 상응하는 cDNA 주형을:
    (i) 하나 이상의 프라이머를 하나 이상의 단일-가닥 cDNA 주형 가닥에 어닐링시키는 단계;
    (ii) 주형-가닥-구동 중합효소에 의해 상기 하나 이상의 프라이머를 연장시켜 연장 생성물을 생성하고, 이에 의해 이중-가닥 핵산 분자들을 형성하는 단계; 및
    (iii) 단계 (ⅰ)-(ii)를 반복하여 상기 이중-가닥 핵산을 증폭시키고 이에 의해 RNA에 코딩된 서열을 증폭 또는 검출하는 단계를 포함하며,
    하나 이상의, 단계 (ⅰ)-(ii)의 사이클은 상기 핵산에 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법에 의해 증폭시키는 단계를 포함하는 것인 장치.
  108. 삭제
  109. 제1항에 있어서, 장력이 단계 (b) 및 (d) 동안 적용되는 것인 방법.
  110. 제57항에 있어서, 상기 이중-가닥 핵산은 하나 이상의 단일-가닥 cDNA 주형 가닥을 생성하기 위해 어닐링 단계 전에 변성되는 것인 방법.
  111. 제110항에 있어서, 상기 이중-가닥 핵산은 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 것에 의해 변성되는 것인 방법.
  112. 제60항에 있어서, 하나 이상의, 단계 (a) 내지 (e)의 사이클은 등온과정인 것인 방법.
  113. 제107항에 있어서, 상기 이중-가닥 핵산은 하나 이상의 단일-가닥 cDNA 주형 가닥을 생성하기 위해 어닐링 단계 전에 변성되는 것인 장치.
  114. 제113항에 있어서, 상기 이중-가닥 핵산은 핵산 분자를 신장시키는 경향이 있는 장력을 적용하는 것에 의해 변성되는 것인 장치.
  115. 제1항에 있어서, 단계 (d)는 상기 하나 이상의 주형 가닥에 장력을 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  116. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 상기 하나 이상의 주형 가닥에 장력을 적용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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