CN107841575B - 一种区分四种血清型禽腺病毒i群的纳米多重pcr方法 - Google Patents
一种区分四种血清型禽腺病毒i群的纳米多重pcr方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法,根据GenBank公布的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群六邻体基因序列,设计合成各型特异性引物;提取基因后进行纳米多重PCR扩增,PCR反应条件为95℃预变性5min,94℃30s,53℃退火1min,72℃1min49s,30个循环;72℃延伸10min;纳米多重PCR扩增反应结束后,取PCR产物,以DL2000为Maker,1%琼脂糖凝胶电泳,观察扩增片段大小,确定病毒的血清型。本发明方法明显缩短检测时间;加入纳米颗粒,在同时检测到四种血清型病毒的情况下,敏感性较普通多重PCR至少提高10倍;特异性强、敏感性高、稳定性好,能快速、敏感、准确地对我国主要流行血清型的禽腺病毒I群进行分型。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米多重PCR方法,特别是涉及一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法,属于动物病毒检测技术领域。
背景技术
禽腺病毒(Fowl adenovirus ,FAdV)I群主要包括12个血清型,Changjing Li 等(2016)对我国2006年-2016年来临床禽腺病毒I群的分离毒株Hexon基因进行了测序分析,表明我国主要流行的血清型有4、8a、8b和11型,禽腺病毒I群对肉鸡的高感染率和高死亡率给养鸡业造成了严重的经济损失。这四种血清型禽腺病毒均引起肉鸡出现严重的肝脏炎症反应,引起的临床症状极为相似,这为临床不同血清型禽腺病毒I群感染的检测带来困难。此外,不同血清型禽腺病毒Ⅰ群之间不能形成交叉保护,故建立临床禽腺病毒Ⅰ群感染的检测方法并对感染病毒进行分型,对禽腺病毒Ⅰ群感染的预防与控制具有十分重要的意义。
血清学检测方法是禽腺病毒I群分型的常规方法,但缺乏标准抗血清,使得本方法应用受限。目前主要通过分子生物学方法进行分型,主要包括:PCR结合测序,通过比较分析基因序列对毒株进行基因分型;根据病毒基因组限制性酶切图谱分析分为不同的基因型;高分辨熔解曲线的基因进行分型。这三种方法中,其中第一种为目前最常用的分型方法,但这三种方法都需要通过PCR对基因进行扩增后,进行测序、酶切和荧光等相关分析,故由于费时、需要特殊仪器及价格昂贵等原因,不适合于临床大量样品中禽腺病毒I群的分型鉴定。
建立简便、快速的临床禽腺病毒I群感染的分型检测方法,关键在于缩短检测时间、去除繁琐的后续分析、且能一次性准确确定感染病毒的血清型。目前,有关禽腺病毒I群的通用检测方法已有报道,但现有方法中中尚未见有对我国主要流行的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群的快速简便的分型检测方法的公开。
多重PCR分型方法可通过一次PCR扩增即可确定血清型,是一种快速、准确的分型方法。为提高普通多重PCR检测的敏感性,加入纳米颗粒,建立纳米多重PCR分型方法,可用于临床禽腺病毒I群的分型确定。
发明内容
本发明的目的在于克服现有禽腺病毒I群分型方法中的繁琐、需特殊仪器、敏感性差等方面存在的缺陷,寻求提供一种快速、简便、准确的区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法。鉴于目前我国禽腺病毒I群主要流行的为4、8a、8b和11型,建立针对这四种血清型的多重PCR区分方法可以快速简便进行分型,为进一步提高分型方法的敏感性,将多重PCR分型方法中加入纳米颗粒,建立纳米多重PCR的分型方法,以提高检测的敏感性。
为了实现上述目的,本发明的一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法按照以下步骤操作:
一、纳米多重PCR引物设计:
根据 GenBank 公布的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群六邻体基因序列,设计合成各型特异性引物;4型禽腺病毒I群引物(F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’ R:5’-AAGAGGCCCGGGCAATGC-3’);8a型禽腺病毒I群引物(F:5’- CAARTTCAGRCAGACGGT -3’ R:5’-AATGTTTGACGAGCTGATGGG -3’);8b型禽腺病毒I群引物(F: 5’- CAARTTCAGRCAGACGGT -3’R: 5’- ATGCTGCAGCTGTTGCCGTAG -3’);11型禽腺病毒I群引物(F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’ R:5’- ACTGCCGTCGTCTCGTCTAAG -3’);
二、基因的提取:
取4、8a、8b和11型禽腺病毒I群标准毒株(购自中国兽药监察所)细胞研磨液400μL于1.5mLEP管中,加入400μL氯仿、600μL裂解液,混匀后4℃沉淀10min,之后12000r/min离心,取上清600μL,加入异丙醇800μL,4℃沉淀30min后12000r/min离心,弃上清后干燥,用20μL去离子水溶解;所述裂解液的组成为:硫氰酸胍9.456g,硫氰酸胺3.044g,醋酸钠13.60g,甘油5ml,苯酚38ml,水57ml;
三、纳米多重PCR扩增:
1、PCR反应体系:2×Nano-QPCRmix6μL(上海户实医药科技有限公司),Taq enzyme0.2μL(大连宝生物工程有限公司),上、下游混合引物各1μL,模板(制备的DNA溶液)0.5μL,去离子水3.3μL;所述上、下游混合引物同第一步;
2、PCR反应条件:95℃预变性5min,94℃30s,53℃退火1min,72℃ 1min49s,30个循环;72℃延伸10min;
四、琼脂糖凝胶电泳:
纳米多重PCR扩增反应结束后,取PCR产物8μL,以DL2000为Maker,质量百分比为1%的琼脂糖凝胶电泳,观察扩增片段大小,确定病毒的血清型;扩增片段为2193bp为4型禽腺病毒I群,扩增片段为1045bp为8a型禽腺病毒I群,扩增片段为371bp为8b型禽腺病毒I群,扩增片段为453bp为11型禽腺病毒I群。
纳米多重PCR特异性试验:应用上述建立的纳米多重PCR方法分别对传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋综合症病毒(EDSV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)和新城疫(NDV)的cDNA进行检测,验证该方法的特异性。试验结果均未扩增出条带,仅扩增出4、8a、8b和11型四种血清型禽腺病毒I群的特异性条带,说明引物特异性良好。
敏感性试验:应用4、8a、8b和11型禽腺病毒I群标准毒株六邻体全基因建立的阳性质粒为模板,进行10倍系列稀释,进行纳米多重PCR和普通多重PCR最小检测浓度测定。在四种血清型病毒都同时检出的情况下,纳米多重PCR的敏感性比普通多重PCR至少提高10倍。
临床样品检测:取实验室分离保存的、并进行测序确定血清型的禽腺病毒I群临床毒株,进行纳米多重PCR分型检测。检测结果显示,纳米多重PCR分型结果与测序结果相一致,表明本研究建立的纳米多重PCR方法能够用于临床大量样本的检测。
本发明与现有技术相比,采用简便的多重PCR分型方法,无需对PCR产物进行繁琐的特殊处理和特殊仪器分析,明显缩短检测时间;加入纳米颗粒,在同时检测到四种血清型病毒的情况下,敏感性较普通多重PCR至少提高10倍;且不能扩增传染性支气管炎病毒、减蛋综合症病毒、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒等临床感染鸡的主要病毒。纳米多重PCR方法特异性强、敏感性高、稳定性好,能快速、敏感和特异性地对我国主要流行血清型的禽腺病毒I群进行分型。
附图说明
图1为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的单一纳米PCR预设条件确定图;
图2为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR反应条件优化图;
图3为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR的特异性检测图;
图4为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的多重PCR的敏感性检测图;
图5为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR的敏感性检测图;
图6为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR的稳定性检测图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例对本发明方法作进一步阐述。
实施例1、
一、纳米多重PCR引物合成:
根据表1中设计的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群分型检测引物序列,合成各型特异性引物;4型禽腺病毒I群引物(F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’ R:5’-AAGAGGCCCGGGCAATGC-3’);8a型禽腺病毒I群引物(F:5’- CAARTTCAGRCAGACGGT -3’ R:5’-AATGTTTGACGAGCTGATGGG -3’);8b型禽腺病毒I群引物(F: 5’- CAARTTCAGRCAGACGGT -3’R: 5’- ATGCTGCAGCTGTTGCCGTAG -3’);11型禽腺病毒I群引物(F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’ R:5’- ACTGCCGTCGTCTCGTCTAAG -3’);
二、基因的提取:
取4、8a、8b和11型禽腺病毒I群标准毒株(购自中国兽药监察所)细胞研磨液400μL于1.5mLEP管中,加入400μL氯仿、600μL裂解液,混匀后4℃沉淀10min;之后12000r/min离心10min,取上清600μL,加入异丙醇800μL,4℃沉淀30min后12000r/min离心10min;弃上清后干燥,用20μL去离子水溶解;所述裂解液的组成为:硫氰酸胍9.456g,硫氰酸胺3.044g,醋酸钠13.60g,甘油5ml,苯酚38ml,水57ml;
三、纳米多重PCR扩增:
1、PCR反应体系:2×Nano-QPCRmix6μL(上海户实医药科技有限公司),Taq enzyme0.2μL(大连宝生物工程有限公司),上、下游混合引物各1μL,模板(制备的DNA溶液)0.5μL,去离子水3.3μL;所述上、下游混合引物同第一步;
2、PCR反应条件:95℃预变性5min,94℃30s,53℃退火1min,72℃ 1min49s,30个循环;72℃延伸10min;
4、8a、8b和11型禽腺病毒I群单一纳米PCR预设条件扩增结果如图1所示,M:DNAmaker2000;1: FAdV-8a;2:FAdV-4; 3:FAdV-11; 4:FAdV-8b;
纳米多重PCR反应条件优化如图2所示,M:2000 maker;1-4:50℃;5-8:53℃;9-12:54℃;13-16:54℃;17-20:56℃;
四、琼脂糖凝胶电泳:
纳米多重PCR扩增反应结束后,取PCR产物8μL,以DL2000为Maker,质量百分比为1%的琼脂糖凝胶电泳,观察扩增片段大小,确定病毒的血清型;扩增片段为2193bp为4型禽腺病毒I群,扩增片段为1045bp为8a型禽腺病毒I群,扩增片段为371bp为8b型禽腺病毒I群,扩增片段为453bp为11型型禽腺病毒I群。
表1. 4、 8a 、8b和 11型禽腺病毒Ⅰ群分型纳米多重PCR引物
实施例2、纳米多重PCR特异性试验:
应用上述建立的纳米多重PCR方法分别对传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋综合症病毒(EDSV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)和新城疫(NDV)的cDNA进行检测,验证该方法的特异性。
如图3所示,M: 2000 maker,1: 四种血清型禽腺病毒I群阳性样品混合物,2:IBV,3:EDSV,4:AIV-H9,5: NDV。
试验结果均未扩增出条带,仅扩增出四种血清型禽腺病毒-I群的特异性条带,说明引物特异性良好。
实施例3、敏感性试验:
应用4、8a、8b和11型禽腺病毒I群标准毒株六邻体全基因建立的阳性质粒为模板,进行10倍系列稀释,进行纳米多重PCR和普通多重PCR最小检测浓度测定 。
如图4所示,多重PCR浓度梯度:M:2000maker ,1:原浓度质粒 ,2:10×101倍稀释质粒, 3:10×102倍稀释质粒, 4:10×103倍稀释质粒, 5:10×104倍稀释质粒, 6:10×105倍稀释质粒, 7:10×106倍稀释质粒 ,8:10×107倍稀释质粒。普通多重PCR检测最小浓度分别为:FAdV-4为 5.14×107拷贝·μL-1、FAdV-8a为2.87×107拷贝·μL-1、FAdV-8b为1.71×106拷贝·μL-1、FAdV-11为4.35×107拷贝·μL-1。
如图5所示,纳米多重PCR浓度梯度:M:2000maker, 1:原浓度质粒, 2:10×101倍稀释质粒 ,3:10×102倍稀释质粒, 4:10×103倍稀释质粒, 5:10×104倍稀释质粒, 6:10×105倍稀释质粒, 7:10×106倍稀释质粒, 8:10×107倍稀释质粒, 9:10×108倍稀释质粒,10:10×109倍稀释质粒。纳米多重PCR检测最小浓度分别为:FAdV-4为 5.14×106拷贝·μL-1、FAdV-8a为2.87×104拷贝·μL-1、FAdV-8b为1.71×104拷贝·μL-1、FAdV-11为4.35×105拷贝·μL-1。
结果显示,在四种血清型病毒都同时检出的情况下,纳米多重PCR的敏感性比普通多重PCR至少提高10倍。
实施例4、临床样品检测:
取实验室分离保存的、并进行测序确定血清型的禽腺病毒I群临床毒株,进行纳米多重PCR分型检测。
如图6所示,M:2000maker;1: 四种血清型禽腺病毒I群阳性样品混合物;2: 空白对照;3、4:8a型禽腺病毒I群;5、8:11型禽腺病毒I群;6、7、9、10、12、13:4型禽腺病毒I群;11:8b型禽腺病毒I群。
检测结果显示,纳米多重PCR分型结果与测序结果相一致,表明本研究建立的纳米多重PCR方法能够用于临床大量样本的检测。
Claims (1)
1.一种非诊断目的的区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法,其特征在于:按照以下步骤操作:
第一步,纳米多重PCR引物设计:根据 GenBank 公布的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群六邻体基因序列,设计合成各型特异性引物;4型禽腺病毒I群引物F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’,4型禽腺病毒I群引物R:5’-AAGAGGCCCGGGCAATGC-3’;8a型禽腺病毒I群引物F:5’- CAARTTCAGRCAGACGGT -3’,8a型禽腺病毒I群引物R:5’-AATGTTTGACGAGCTGATGGG -3’;8b型禽腺病毒I群引物F:5’- CAARTTCAGRCAGACGGT -3’,8b型禽腺病毒I群引物R:5’- ATGCTGCAGCTGTTGCCGTAG -3’;11型禽腺病毒I群引物F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’,11型禽腺病毒I群引物R:5’- ACTGCCGTCGTCTCGTCTAAG -3’;
第二步,基因的提取:取4、8a、8b和11型禽腺病毒I群标准毒株细胞研磨液400μL于1.5mL EP管中,加入400μL氯仿、600μL裂解液,混匀后4℃沉淀10min,之后12000r/min离心,取上清600μL,加入异丙醇800μL,4℃沉淀30min后12000r/min离心,弃上清后干燥,用20μL去离子水溶解;所述裂解液的组成为:硫氰酸胍9.456g,硫氰酸胺3.044g,醋酸钠13.60g,甘油5ml,苯酚38ml,水57ml;
第三步,纳米多重PCR扩增:PCR反应体系:2×Nano-QPCRmix6μL,Taq酶 0.2μL,第一步中设计的4种引物F的混合物1μL,第一步中设计的4种引物R的混合物1μL,模板0.5μL,去离子水3.3μL;PCR反应条件:95℃预变性5min,94℃30s,53℃退火1min,72℃ 109 s,30个循环;72℃延伸10min;
第四步,琼脂糖凝胶电泳:纳米多重PCR扩增反应结束后,取PCR产物8μL,以DL2000为Maker,质量百分比为1%的琼脂糖凝胶电泳,观察扩增片段大小,确定病毒的血清型;扩增片段为2193bp为4型禽腺病毒I群,扩增片段为1045bp为8a型禽腺病毒I群,扩增片段为371bp为8b型禽腺病毒I群,扩增片段为453bp为11型禽腺病毒I群。
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PCR-RFLP 技术对Ⅰ群禽腺病毒12个血清型;唐熠 等;《中国兽医科学》;20091030;第39卷(第10期);摘要,第887-889页的材料方法和结果 * |
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CN107841575A (zh) | 2018-03-27 |
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