CN113308570A

CN113308570A - 一种非洲猪瘟病毒核酸免提取三重荧光定量pcr检测组合物、方法及试剂盒

Info

Publication number: CN113308570A
Application number: CN202110518311.7A
Authority: CN
Inventors: 郭振华; 邢广旭; 陈鑫鑫; 王方雨; 李睿; 乔松林; 郭军庆; 张改平
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2021-08-27

Abstract

本发明涉及一种核酸免提取的非洲猪瘟病毒B646L、MGF505‑2R和CD2v三基因荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒，属于分子检测技术领域。本发明针对非洲猪瘟病毒的B646L、MGF505‑2R和CD2v基因分别设计了三组引物和探针，同时结合核酸免提取方法，极大缩短了整个检测过程的时间，实现了非洲猪瘟病毒核酸的快速检测，可用于鉴别区分MGF505‑2R和CD2v基因双缺失或单缺失的毒株，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。临床应用显示，该方法和OIE推荐方法的检测结果符合性和相关性良好，具有重要的实际应用价值。

Description

一种非洲猪瘟病毒核酸免提取三重荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于鉴别检测非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R和CD2v三基因的核酸免提取荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒，属于分子检测技术领域。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASF virus,ASFV)引起猪的一种高度接触性传染性疾病，临床上以急性、热性、出血性、高发病率和高死亡率为主要特征。目前在非洲、亚洲和中东欧地区呈流行态势，严重威胁着世界养猪生产。自2018年8月，非洲猪瘟传入我国以来，给我国生猪产业带来了毁灭性的打击，各种因素影响下造成生猪和猪肉价格偏高，高峰时是我国往常年份正常价格的3倍左右。尽管通过生物安全的全面提升和精准剔除技术的应用，我国生猪产能得到了一定恢复，但非洲猪瘟在我国流行两年多来，已出现一些新的情况，如基因缺失毒株和变异毒株的出现流行等，使得我国非洲猪瘟的流行情况更为复杂。农业农村部在2021年3月8日发布了《关于进一步严厉打击非洲猪瘟假疫苗有关违法行为的通知》，其中要求要强化基因缺失毒株的鉴别检测。因此，急需开发出一种快速、特异和敏感的针对非洲猪瘟病毒B646L、CD2v和MGF505-2R基因的荧光定量检测方法，从而为非洲猪瘟病毒的临床鉴别检测提供技术支撑。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于快速鉴别检测非洲猪瘟病毒B646L、CD2v和MGF505-2R基因的核酸免提取三重荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于检测非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R、CD2v基因的核酸免提取三重荧光定量PCR检测组合物，由B646L基因的上游引物B646L-F、下游引物B646L-R和探针B646L-P；MGF505-2R基因的上游引物MGF505-2R-F、下游引物MGF505-2R-R和探针MGF505-2R-P；CD2v基因的上游引物CD2v-F、下游引物CD2v-R和探针CD2v-P组成；

所述引物和探针的序列如下：

上游引物B646L-F：GGGTGCATGTCATTCATCCT；

下游引物B646L-R：GTCATATCCGTTGCGAGGAA；

探针B646L-P：FAM-AGGATGCTCCGATTCAGGGCACGTCCCA-BHQ1；

上游引物MGF505-2R-F：AGCTCTTGTTACTGTGGAAGG；

下游引物MGF505-2R-R：AAAACGTTCTAAAGCGTGGC；

探针MGF505-2R-P：VIC-ACGCCGTCATAGGAGCCTTGCAGGGTGA-BHQ1。

上游引物CD2v-F：AGAAATAGAAAGTCCACCACCTGAA

下游引物CD2v-R：TCATGTATGGAAGTGGTGTCATCA

探针CD2v-P：CY5-CTAATGAAGAAGAACAATGTC-MGB。

一种包含所述检测组合物的三重荧光定量PCR检测试剂盒。

所述的三重荧光定量PCR检测试剂盒，由试剂A、试剂B、试剂C和试剂D组成；试剂A为核酸释放剂；试剂B为荧光定量PCR反应液，包含探针法荧光定量试剂Premix Ex Taq^TM、内参染料ROX Reference Dye II、权利要求1所述的B646L、MGF505-2R和CD2v基因的三组引物和探针和无菌无酶水；试剂C为阳性对照，包含标准质粒pUC57-B646L、pUC57-MGF505-2R和pUC57-CD2v；试剂D为阴性对照，为无菌无酶水。

所述标准质粒pUC57-B646L，浓度为2.6×10⁴拷贝/微升；标准质粒pUC57-MGF505-2R，浓度为2.8×10⁴拷贝/微升；标准质粒pUC57-CD2v，浓度为3.2×10⁴拷贝/微升。

所述试剂A核酸释放剂用于口腔液、鼻拭子和血液样本核酸的提取，提取具体方法为：将样品以5000rpm的速度离心3分钟；离心后，取40μL上清，加入10μL核酸释放剂，99℃作用10分钟；再以5000rpm的速度离心3分钟，所得上清即为待测样品的DNA模板。

一种用于非诊断目的的三重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA模板；

(2)采用权利要求1所述的检测组合物建立三重荧光定量PCR反应体系；

(3)进行荧光定量PCR检测；

(4)待测样品的结果分析。

所述三重荧光定量PCR反应体系为25μL，包含20μL的试剂B和5μL的模板；所述模板为待测样品的DNA、阳性对照或阴性对照。

所述20μL的试剂B包括探针法qPCR反应预混试剂Premix Ex Taq 12.5μL、内参染料ROX Reference Dye II 0.25μL、权利要求1所述的B646L、MGF505-2R和CD2v基因的每种引物和探针的反应终浓度均为0.1μM，余量为无菌无酶水。

所述反应体系的反应条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。本发明有益效果：

本发明针对非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R和CD2v三基因荧光定量PCR检测组合物的引物和探针，具有良好的兼容性；建立的三重荧光定量PCR检测方法，可同时检测B646L、MGF505-2R和CD2v三个基因，可用于MGF505-2R和CD2v双基因或者单基因缺失毒株的鉴别诊断。

本发明建立了用于鉴别检测非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R和CD2v基因的核酸免提取三重荧光定量PCR试剂盒，检测便捷。本发明的试剂盒由4种试剂构成，试剂A为核酸释放剂；试剂B为荧光定量PCR反应液，其中已经预混好qPCR反应试剂PremixEx Taq、内参染料ROX Reference Dye II及三组引物和探针；试剂C为阳性对照；试剂D为阴性对照。实际操作过程中，只需取20μL的试剂B与5μL的模板(样品核酸、阳性对照或阴性对照)混合，即可进行后续的荧光定量PCR检测。

本发明所采用的核酸免提取技术，主要是使用核酸释放剂，可以方便地对临床样品进行处理，释放核酸；由于省去传统的核酸提取过程，极大节省了整个检测过程所需的反应时间，在一些紧急情况下，可以更为快速的给出检测结果，为临床疫病防控提供参考。

本发明结合当前分子诊断中广泛使用的探针法荧光定量检测法，建立了针对非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R和CD2v基因的三重荧光定量检测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可有效区分MGF505-2R和CD2v基因双缺失或者单缺失的毒株，为非洲猪瘟病毒的临床鉴别诊断提供了很好技术支撑。临床样品的检测显示，该方法与OIE推荐的检测方法在检测ASFV B646L基因时，二者结果具有良好的一致性，数据相关性R²>0.8，具有良好的社会应用前景和价值。

附图说明

图1本发明三重荧光定量PCR检测方法的标准曲线；

A)pUC57-B646L标准曲线，模板浓度2.6×10⁷-2.6×10¹拷贝·μL^-1；

B)pUC57-MGF505-2R标准曲线，模板浓度为2.8×10⁸-2.8×10²拷贝·μL^-1；

C)pUC57-CD2v标准曲线，模板浓度为3.2×10⁸-3.2×10²拷贝·μL^-1。

图2本发明三重荧光定量PCR检测方法的特异性分析曲线；

图3本发明三重荧光定量PCR检测方法的敏感性分析曲线；

A)pUC57-B646L基因扩增敏感性分析，1-8：2.6×10⁸-2.6×10¹拷贝·μL^-1；

B)pUC57-MGF505-2R基因扩增敏感性分析，1-8：2.8×10⁸-2.8×10¹拷贝·μL^-1。

C)pUC57-CD2v基因扩增敏感性分析，1-8：3.2×10⁸-3.2×10¹拷贝·μL^-1。

图中曲线1-8分别对应的浓度按10⁸-10¹依次倍比递减。

图4核酸免提取、核酸提取和OIE推荐方法检测临床样品数据的相关性分析。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

本发明实施例中所用的实验材料：

(1)病毒核酸

猪繁殖与呼吸综合征病毒HN07-1(KX766378)、伪狂犬病毒HeNLH/2017(MT775883)、猪塞尼卡病毒HeNNY-1/2018(MK357116)、圆环病毒DF-1(JN119255)由本实验室分离保存。猪瘟弱毒疫苗、乙脑弱毒疫苗、流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒二联弱毒疫苗均购自武汉科前生物股份有限公司。上述病毒作为猪场常见的病原，在此用于本发明所建立方法的特异性分析，具体结果见图2。

(2)主要试剂及仪器

病毒核酸提取试剂盒(TaKaRa MiniBESTViral RNA/DNAExtraction KitVer.5.0)、探针法荧光定量检测试剂(Premix Ex Taq^TM)和内参染料ROX ReferenceDye II均购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa)。核酸释放剂购自珠海宝锐生物科技有限公司。荧光定量PCR仪(ABI7500)，美国ABI公司产品；核酸浓度测定仪NanoDrop One，美国ThermoFisher Scientific公司产品；

实施例1引物和探针的设计与合成

根据非洲猪瘟病毒株Pig/HLJ/2018(MK333180)的基因组序列，通过Primer3Plus(http://www.primer3plus.com)和Primer express 3.0.1软件针对CD2v基因进行引物和探针的设计。针对B646L和MGF505-2R基因的引物和探针参照我们之前的研究(Guo Z,etal.BMC Veterinary Research.2020,16.)，所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)，引物和探针用无菌水稀释到10μmol·L^-1,于-20℃保存。

表1引物和探针序列

实施例2试剂盒中阳性对照和阴性对照的选择

标准质粒pUC57-B646L、pUC57-MGF505-2R和pUC57-CD2v由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，本实验室保存，标准质粒浓度利用核酸浓度测定仪NanoDrop One测定。基因拷贝数(Y)计算公式如下：

Y(copies/μL)＝[质粒DNA的浓度(ng/μL)×10^-9/(质粒DNA长度bp×660)]×6.02×10²³。

经测定，标准质粒的基因拷贝数分别为2.6×10⁹拷贝·μL^-1(pUC57-B646L)、2.8×10⁹拷贝·μL^-1(pUC57-MGF505-2R)和3.2×10⁹拷贝·μL^-1(pUC57-CD2v)；进一步将三种标准质粒混合在一起，作为阳性对照，并用无菌无酶水进行稀释，使各质粒的浓度为2.6×10⁴拷贝·μL^-1(pUC57-B646L)、2.8×10⁴拷贝·μL^-1(pUC57-MGF505-2R)和3.2×10⁴拷贝·μL^-1(pUC57-CD2v)；同时用无菌无酶水作为阴性对照。

实施例3核酸免提取三重荧光定量PCR检测方法的建立

(1)核酸免提取三重荧光定量PCR检测试剂盒的组成

由试剂A、B、C和D组成。试剂A为核酸释放剂；试剂B为荧光定量PCR反应液，包含了探针法qPCR反应预混试剂PremixEx Taq、内参染料ROX Reference Dye II、针对B646L、MGF505-2R和CD2v基因的三组引物和探针；试剂C为阳性对照，包含标准质粒pUC57-B646L、pUC57-MGF505-2R和pUC57-CD2v；试剂D为阴性对照，为无菌无酶水。

其中核酸释放剂用于口腔液、鼻拭子和血液样本核酸的提取，包括以下步骤：

将样品以5000rpm的速度离心3分钟；离心后，取40μL上清，加入10μL核酸释放剂，99℃作用10分钟；再以5000rpm的速度离心3分钟，所得上清即为DNA模板。

(2)标准曲线的建立

经过引物和探针浓度的摸索，确定三重荧光定量PCR的反应体系为25μL，包含20μL的试剂B和5μL的模板。试剂B中各组引物和探针的反应终浓度均为0.1μM；探针法qPCR反应预混试剂PremixEx Taq 12.5μL；内参染料ROX Reference Dye II 0.25μL，余量为无菌无酶水。三种标准质粒按照1:1:1的体积进行混合，然后进行10倍倍比稀释，取5μL作为模板。

使用ABI 7500Fast Real-Time PCR System进行荧光定量PCR检测，最佳反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。

如图1所示，模板拷贝数在10¹～10⁷范围内时，所建立的三重荧光定量PCR检测方法可以获得良好的扩增动力学曲线。B646L基因对应的标准曲线为Y＝-3.214x+37.54，相关系数R²＝0.999，扩增效率为104.7％(图1A)；MGF505-2R基因对应的标准曲线为Y＝-3.314x+38.43，相关系数R²＝1，扩增效率为100.31％(图1B)；CD2v基因对应的标准曲线为Y＝-3.326x+39.82，相关系数R²＝1，扩增效率为99.85％(图1C)。

实施例4特异性分析实验

以非洲猪瘟病毒DNA和3个标准质粒(pUC57-B646L、pUC57-MGF505-2R和pUC57-CD2v)的混合物为阳性对照，以PRRSV、PEDV、TGEV、JEV、CSFV、JEV和SVA的cDNA，PCV2和PRV的DNA为模板，以无菌无酶水为阴性对照，用建立的三重荧光定量PCR检测方法进行检测，如图2所示，阳性对照组可以出现特异性的扩增曲线，而含有其它病原cDNA或者DNA的样品检测均为阴性，表明本研究建立的检测方法具有良好的特异性。

实施例5敏感性分析实验

对质粒标准品(pUC57-B646L、pUC57-MGF505-2R和pUC57-CD2v)分别做10倍倍比稀释，使标准品浓度在10⁸-10¹拷贝·μL^-1之间，用设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测(实施例3)。如图3所示，在浓度低至10¹拷贝·μL^-1时，建立的荧光定量检测方法均可以获得良好的扩增曲线。为进一步确定最低检测下限，进一步设定～10¹、～0.5×10¹和～100三个拷贝数浓度为模板(表2第二列)，用建立的三重荧光定量PCR检测方法，每个浓度做12次重复检测，以全部检测结果为阳性作为该基因片段的检测下限。结果见表2，针对B646L基因的检测下限为6.5个拷贝，针对MGF505-2R基因的检测下限为8个拷贝，针对CD2v基因的检测下限为14个拷贝。

表2最低检测限分析

注：No Ct表示无Ct值，说明该浓度下未检出。

实施例6重复性实验

以不同浓度的质粒标准品为模板进行批次内和批次间的重复性检测，结果如表3所示，当模板浓度在10⁷-10²之间时，对应CT值约在15-30之间时，组内变异系数为0.1％～1.17％；组间变异系数为0.05％～2.68％，表明建立的三重荧光定量PCR检测方法具有良好的稳定性和重复性。

表3ASFV核酸三重荧光定量PCR检测方法重复性试验结果

实施例7临床样品检测

由某养殖企业利用本发明的检测试剂盒，针对10份从拉猪车采集的ASFV核酸阳性的样品，分别在核酸提取和核酸免提取的条件下，进行三重荧光定量PCR的检测，同时用OIE推荐的荧光定量检测方法进行平行检测(Fernandez-Pinero et al.,2013)。如表4所示，本发明建立的方法在核酸提取和免提取条件下，检测数据吻合度良好；同时针对B646L基因的检测数据显示时，本发明的检测数据与OIE的检测结果符合性良好；进一步分析本发明检测数据和OIE推荐方法的数据相关性，如图4所示，分别在核酸提取(图4A)和核酸免提取(图4B)的条件下，检测数据和OIE推荐的检测方法具有高度相关性(R²>0.8)。

表4临床样品检测结果

序列表

<110> 河南省农业科学院

<120> 一种非洲猪瘟病毒核酸免提取三重荧光定量PCR检测组合物、方法及试剂盒

<130> PCR检测

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gggtgcatgt cattcatcct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gtcatatccg ttgcgaggaa 20

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

aggatgctcc gattcagggc acgtccca 28

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

agctcttgtt actgtggaag g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

aaaacgttct aaagcgtggc 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

acgccgtcat aggagccttg cagggtga 28

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

agaaatagaa agtccaccac ctgaa 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tcatgtatgg aagtggtgtc atca 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ctaatgaaga agaacaatgt c 21

Claims

1.一种用于检测非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R、CD2v基因的核酸免提取三重荧光定量PCR检测组合物，其特征在于，由B646L基因的上游引物B646L-F、下游引物B646L-R和探针B646L-P；MGF505-2R基因的上游引物MGF505-2R-F、下游引物MGF505-2R-R和探针MGF505-2R-P；CD2v基因的上游引物CD2v-F、下游引物CD2v-R和探针CD2v-P组成；

所述引物和探针的序列如下：

上游引物B646L-F：GGGTGCATGTCATTCATCCT；

下游引物B646L-R：GTCATATCCGTTGCGAGGAA；

探针B646L-P：FAM-AGGATGCTCCGATTCAGGGCACGTCCCA-BHQ1；

上游引物MGF505-2R-F：AGCTCTTGTTACTGTGGAAGG；

下游引物MGF505-2R-R：AAAACGTTCTAAAGCGTGGC；

探针MGF505-2R-P：VIC-ACGCCGTCATAGGAGCCTTGCAGGGTGA-BHQ1。

上游引物CD2v-F：AGAAATAGAAAGTCCACCACCTGAA

下游引物CD2v-R：TCATGTATGGAAGTGGTGTCATCA

探针CD2v-P：CY5-CTAATGAAGAAGAACAATGTC-MGB。

2.一种包含权利要求1所述的检测组合物的三重荧光定量PCR检测试剂盒。

3.如权利要求2所述的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，由试剂A、试剂B、试剂C和试剂D组成；试剂A为核酸释放剂；试剂B为荧光定量PCR反应液，包含探针法荧光定量试剂Premix Ex Taq^TM、内参染料ROX Reference Dye II、权利要求1所述的B646L、MGF505-2R和CD2v基因的三组引物和探针和无菌无酶水；试剂C为阳性对照，包含标准质粒pUC57-B646L、pUC57-MGF505-2R和pUC57-CD2v；试剂D为阴性对照，为无菌无酶水。

4.如权利要求3所述的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述标准质粒pUC57-B646L，浓度为2.6×10⁴拷贝/微升；标准质粒pUC57-MGF505-2R，浓度为2.8×10⁴拷贝/微升；标准质粒pUC57-CD2v，浓度为3.2×10⁴拷贝/微升。

5.如权利要求3所述的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂A核酸释放剂用于口腔液、鼻拭子和血液样本核酸的提取，提取具体方法为：将样品以5000rpm的速度离心3分钟；离心后，取40μL上清，加入10μL核酸释放剂，99℃作用10分钟；再以5000rpm的速度离心3分钟，所得上清即为待测样品的DNA模板。

6.一种用于非诊断目的的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA模板；

(3)进行荧光定量PCR检测；

(4)待测样品的结果分析。

7.如权利要求6所述的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述三重荧光定量PCR反应体系为25μL，包含20μL的试剂B和5μL的模板；所述模板为待测样品的DNA、阳性对照或阴性对照。

8.如权利要求7所述的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述20μL的试剂B包括探针法qPCR反应预混试剂Premix Ex Taq 12.5μL、内参染料ROX Reference Dye II 0.25μL、权利要求1所述的B646L、MGF505-2R和CD2v基因的每种引物和探针的反应终浓度均为0.1μM，余量为无菌无酶水。

9.如权利要求8所述的三重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述反应体系的反应条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。