CN110218778A - Pcr反应体系、试剂、试剂盒和pcr方法 - Google Patents

Pcr反应体系、试剂、试剂盒和pcr方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种PCR反应体系、试剂、试剂盒和PCR方法，涉及PCR技术领域。该PCR反应体系包含表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质，能够直接用于对未经核酸提取和纯化的样品进行扩增，且具有较高的扩增效率和灵敏度，缓解了现有技术中存在的缺乏一种适用于有效的对未经核酸提取纯化的样本进行扩增的PCR反应体系的问题。

Description

PCR反应体系、试剂、试剂盒和PCR方法
技术领域
本发明涉及PCR技术领域，尤其是涉及一种PCR反应体系、试剂、试剂盒和PCR方法。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Kary Banks Mulis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。这项技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的某些特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠，并被世界各国广泛应用于医学、农业、食品、生物学等各个领域的基因研究和分析,对分子生物学的发展产生了革命性的影响。
常规PCR技术的流程包括：核酸的提取与定量，PCR扩增，扩增产物鉴定。核酸提取方法如有机法(酚氯仿法)、二氧化硅膜柱法及纳米磁珠法，这些方法涉及以下技术缺陷：1)操作步骤繁琐，耗时长，在提取过程中涉及多次离心和移管操作，容易造成样本交叉污染，从而出现假阳性的结果；2)提取效率低，模板丢失的机率大，对于有些核酸载量较低的样本，经过3-4步的提取操作，模板发生丢失，容易出现假阴性结果；而基于纳米磁珠法的自动化提取操作平台虽然通量大，但硬件投入及试剂投入大，且容易出现交叉污染，全操作下来仍需耗时1-2h。
为解决上述问题，一些免提取直接扩增的方法被发明出来，其核心在于免去富集纯化步骤，但仍然保持有裂解步骤，一般的操作流程是将待检样本直接加入到裂解液中，室温或高温处理5-10min，然后取部分上清或者将全部裂解组分统统加入到扩增反应液中。与传统核酸提取方法相比，“直扩”方法节省了操作时间，极大提高了样本处理效率，将实验人员从大量冗杂重复性实验工作中解放出来了，且因其涉及的操作步骤少，极大降低了样本间交叉污染的可能性，从而提高了检测的准确度。
但此样本处理方法仍然存在缺陷：一是待检样本尤其是医学相关的临床样本来源丰富，如血液、唾液、分泌物和粪便等，其本身所带的血红蛋白、抗凝剂、IgG、腐殖酸和胆黄酸等就是PCR的强抑制剂。诸如此类的样本在常温或高温处理下若要达到裂解并释放核酸的效果，所需裂解液一般是强变性剂，如胍盐类或强碱类，源样本中就带有较多的PCR抑制剂，裂解液中所含的这些对PCR扩增抑制严重的变性剂再带入到PCR反应液中，可能会导致无法扩增或扩增效果减弱，从而对结果产生误判；二是不论是裂解后取上清加样，还是裂解后完全加样方式，裂解液也会带入一部分到反应体系中，对于原本核酸载量较低的样本，裂解液也会占用一部分样本空间，而导致样本加样量受限，这样体系中的模板量会进一步降低，从而造成检出率下降；三是此类核酸释放剂一般是封闭的，对后续的PCR反应试剂有一定的抗抑制要求，而使用市售的商品化的PCR反应液一般无法扩增或不能得到较优的扩增效果，必须使用商家配套的PCR扩增试剂，额外增加一部分试剂成本，因此其使用受限，不利于大规模的推广使用。因此一种适用于无需预先裂解或提取样本，又能保证PCR反应效率的PCR反应体系是目前需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种PCR反应体系，缓解了现有技术中存在的缺乏一种适用于有效的对未经核酸提取纯化的样本进行扩增的PCR反应体系的问题。
本发明的第二目的在于提供一种包含上述PCR反应体系的试剂或试剂盒。
本发明的第三目的在于提供一种PCR方法，该方法包括使用上述PCR反应体系进行反应，或使用上述试剂或试剂盒进行反应。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种PCR反应体系，该PCR反应体系中包含表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种包含上述PCR反应体系的试剂或试剂盒。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种PCR方法，该方法包括使用上述PCR反应体系进行反应，或使用上述试剂或试剂盒进行反应。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的PCR反应体系包含表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质。表面活性剂能够有效的裂解样本，释放其中的核酸物质；还原剂能够促进核酸物质与蛋白质分离；糖类物质和醇类物质的联合使用能够有效的结合粗样本中裂解出的血红蛋白、抗凝剂、免疫球蛋白、腐殖酸和胆黄酸等糖类和脂类物质，在高温下变性沉淀，以降低这些物质对PCR反应的干扰作用，同时还能够降低表面活性剂对PCR的抑制作用。本发明提供的PCR反应体系能够在有效的促进粗样本裂解释放核酸的同时，保证PCR反应高效灵敏的进行。并且该PCR反应体系可以与常规的用于PCR组分配合使用，对其他组分物特殊需求。基于该发明构思提供的包含上述PCR反应体系的试剂或试剂盒，也具有该PCR反应体系的所有有益效果。
本发明提供的PCR方法，该方法使用上述PCR反应体系，或使用上述试剂或试剂盒进行反应，能够实现对未经提取和纯化的核酸样本，包括但不限于血清、血浆、全血、口(鼻)腔拭子、细胞或其他体液，直接加入上述PCR反应体系，在试剂中实现核酸的原位裂解和扩增的同步进行，以达到最简化的样本处理方式和基因检测的目的。
本发明提供的PCR方法极大简化了PCR操作的全过程，省略了复杂的核酸提取或样本裂解步骤，避免了靶核酸获得过程中由于技术局限或操作步骤繁杂而导致的核酸损失、操作简单容易掌握、只需要移液器和PCR反应管等常见实验器材就能操作、方法便捷、成本低廉、扩增效率高，将核酸裂解与扩增“合二为一”，使用较少的反应试剂，较简单的操作步骤，较短的操作时间，节省大量人力物力，此方法在分子生物学研究领域尤其是快速扩增领域将得到广泛使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A为本发明实施例1提供的配方1的PCR反应体系的扩增曲线；
图1B为本发明实施例1提供的配方2的PCR反应体系的扩增曲线；
图1C为本发明实施例1提供的配方3的PCR反应体系的扩增曲线；
图1D为本发明实施例1提供的配方4的PCR反应体系的扩增曲线；
图1E为本发明实施例1提供的配方5的PCR反应体系的扩增曲线；
图1F为本发明实施例1提供的配方6的PCR反应体系的扩增曲线；
图1G为本发明实施例1提供的配方7的PCR反应体系的扩增曲线；
图1H为本发明实施例1提供的配方8的PCR反应体系的扩增曲线；
图2A为本发明实施例2中醇类物质为1％时的PCR反应体系的扩增结果；
图2B为本发明实施例2中醇类物质为2％时的PCR反应体系的扩增结果；
图2C为本发明实施例2中醇类物质为3％时的PCR反应体系的扩增结果；
图2D为本发明实施例2中醇类物质为5％时的PCR反应体系的扩增结果；
图2E为本发明实施例2中醇类物质为8％时的PCR反应体系的扩增结果；
图2F为本发明实施例2中醇类物质为10％时的PCR反应体系的扩增结果；
图3A为本发明实施例3提供的配方9的PCR反应体系的扩增曲线；
图3B为本发明实施例3提供的配方10的PCR反应体系的扩增曲线；
图3C为本发明实施例3提供的配方11的PCR反应体系的扩增曲线；
图3D为本发明实施例3提供的配方12的PCR反应体系的扩增曲线；
图3E为本发明实施例3提供的配方13的PCR反应体系的扩增曲线；
图3F为本发明实施例3提供的配方14的PCR反应体系的扩增曲线；
图4A为本发明实施例4提供的配方15的PCR反应体系的扩增曲线；
图4B为本发明实施例4提供的配方16的PCR反应体系的扩增曲线；
图4C为本发明实施例4提供的配方17的PCR反应体系的扩增曲线；
图4D为本发明实施例4提供的配方18的PCR反应体系的扩增曲线；
图4E为本发明实施例4提供的配方19的PCR反应体系的扩增曲线；
图4F为本发明实施例4提供的配方20的PCR反应体系的扩增曲线；
图5A为本发明实施例5提供的配方21的PCR反应体系的扩增曲线；
图5B为本发明实施例5提供的配方22的PCR反应体系的扩增曲线；
图5C为本发明实施例5提供的配方23的PCR反应体系的扩增曲线；
图5D为本发明实施例5提供的配方24的PCR反应体系的扩增曲线；
图5E为本发明实施例5提供的配方25的PCR反应体系的扩增曲线；
图6A为本发明实施例6提供的直接扩增HBV阳性血浆扩增结果；
图6B为本发明实施例6提供的使用裂解液裂解HBV血浆后在扩增的实验结果；
图7为本发明实施例7提供的HCV血浆加样后直接扩增的实验结果；
图8A为本发明实施例8提供的EDTA抗凝血直接加样扩增结果；
图8B为本发明实施例8提供的柠檬酸钠抗凝血直接加样扩增结果；
图8C为本发明实施例8提供的肝素抗凝血直接加样扩增结果；
图9A为本发明实施例9提供的口腔拭子直接扩增叶酸代谢基因MTHFR677位点；
图9B为本发明实施例9提供的口腔拭子直接扩增叶酸代谢基因MTHFR1298位点；
图9C为本发明实施例9提供的口腔拭子直接扩增叶酸代谢基因MTRR66位点。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种PCR反应体系，该反应体系中包含表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质。本发明所述的PCR反应体系指的是用于进行PCR反应的各种物质的混合体系，所述PCR反应包括以DNA或RNA为模板合成DNA的过程，因此所述PCR反应体系可以用于包括但不限于常规PCR反应和荧光定量PCR反应，还可以用于反转录。
本发明提供的PCR反应体系中含有表面活性剂，可以有效的使样品中的核酸物质释放至PCR反应体系中作为反应的模板。含有表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质的PCR反应体系具有原位裂解功能，对来源于血液，唾液，粪便，奶渍，拭子，细胞培养物，微生物培养物中核酸样本进行直接扩增，无需额外的提取或样本裂解液的辅助，在PCR热循环的过程中通过高低温交替循环，改变生物样本的渗透压，从而破坏生物样本的壁膜结构，并在表面活性剂的促进作用下，有效的裂解样本，释放其中的核酸物质；由于直接从粗样本中释放的核酸物质未经过提取和纯化的步骤，其中的核酸物质通常与蛋白质结合，加入还原剂能够使核酸物质与蛋白质分离，释放出更多的核酸物质作为PCR反应模板，提高扩增效率。糖类物质和醇类物质的联合使用能够有效的结合粗样本中裂解出的血红蛋白、抗凝剂、免疫球蛋白、腐殖酸和胆黄酸等糖类和脂类物质，在高温下变性沉淀，以降低这些物质对PCR反应的干扰作用。
本发明提供的PCR反应体系除去含有表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质还可以包括本领域用于PCR反应的常规组分，包括但不限于缓冲物质、引物、阳离子、酶、脱氧核糖核苷酸、抗抑制剂、核糖核酸酶抑制剂和溶剂中的至少一种，可选的包括由缓冲物质和溶剂组成的缓冲液；可选的包括酶和脱氧核糖核苷酸；可选地包括由缓冲物质、阳离子、酶、脱氧核糖核苷酸、抗抑制剂、核糖核酸酶抑制剂和溶剂组成的缓冲液；以及，所述PCR反应体系还包含用于扩增靶基因的核酸、或用于反转录的引物等寡聚核苷酸；用于荧光定量PCR荧光探针或荧光染料；用于琼脂糖凝胶电泳的荧光染色剂等，本发明对这些常规的组分不做限制。
优化PCR反应体系中各组分的组成、用量以及浓度能够进一步的优化该PCR反应体系的使用效果。例如优化表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质中具体的组分的选择或者复配方式；优化各组分的用量和浓度；优化除去表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质外其他用于PCR反应的组分的选择，以匹配合适的表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质，使这些主要物质能够更好的发挥其反应活性；优化整个PCR反应体系中的各组分之间的复配关系，均能够提高PCR反应体系的效果。
表面活性剂一些优选的组分和用量的如下：在一些优选的实施方式中，PCR反应体系中的表面活性剂的浓度为0.001％w/v～1％w/v时较佳。表面活性剂的浓度例如可以为但不限于为0.001％w/v、0.005％w/v、0.01％w/v、0.02％w/v、0.03％w/v、0.04％w/v、0.05％w/v、0.06％w/v、0.07％w/v、0.08％w/v、0.09％w/v、0.1％w/v、0.2％w/v、0.3％w/v、0.4％w/v、0.5％w/v、0.6％w/v、0.7％w/v、0.8％w/v、0.9％w/v和1.0％w/v。本发明中单位w/v指的是质量浓度g/mL。
在一些可选的实施方式中，表面活性剂包括两性离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂中的一种单独使用，或至少两种的配合使用，包括但不限于两性离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂配合使用，非离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂配合使用，或两性离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂的配合使用等。在一些优选地实施方式中，表面活性剂优选两性离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和阴离子表面活性剂三者的组合。
其中两性离子型表面活性剂包括氨基酸类表面活性剂和甜菜碱类表面活性剂中的至少一种，可选地以氨基酸类表面活性剂和甜菜碱类表面活性剂配合使用或择一使用；所述甜菜碱类表面活性剂优选包括CHAPS(3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲胺基]丙磺酸盐)；非离子型表面活性剂包括但不限于TritonX-100、Tween20、Tween80和NP40中的至少一种，可选地，以TritonX-100和Tween20配合使用，以Tween80和NP40配合使用，或TritonX-100、Tween20、Tween80和NP40中择一使用；优选使用TritonX-100；阳离子型表面活性剂包括但不限于十二烷基二甲基苄基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵和十八烷基三甲基氯化铵中的至少一种，可选地，十六烷基三甲基氯化铵和十八烷基三甲基氯化铵配合使用；十二烷基二甲基苄基氯化铵和十六烷基三甲基氯化铵配合使用；或在十二烷基二甲基苄基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵和十八烷基三甲基氯化铵中择一使用；阴离子表面活性剂包括但不限于烷基苯磺酸盐、烷基磺酸酯盐、烷基磺酸盐和烷基硫酸盐中的至少一种，可选地，以烷基苯磺酸盐和烷基磺酸酯盐配合使用，烷基磺酸盐和烷基硫酸盐配合使用，或烷基苯磺酸盐、烷基磺酸酯盐、烷基磺酸盐和烷基硫酸盐中择一使用，其中烷基硫酸盐优选十二烷基硫酸钠(SDS)。
在一些优选的实施方式中，经过实验发现，表面活性剂优选使用CHAPS、Triton X-100和SDS的组合。在一些更优选的实施方式中，在PCR反应体系中包括CHAPS 0.01％w/v～0.1％w/v，例如可以为但不限于为0.01％w/v、0.02％w/v、0.03％w/v、0.04％w/v、0.05％w/v、0.06％w/v、0.07％w/v、0.08％w/v、0.09％w/v和0.1％w/v；Triton X-1000.01％w/v～0.1％w/v，例如可以为但不限于为0.01％w/v、0.02％w/v、0.03％w/v、0.04％w/v、0.05％w/v、0.06％w/v、0.07％w/v、0.08％w/v、0.09％w/v和0.1％w/v；和SDS 0.0001％w/v～0.1％w/v，例如可以为但不限于为0.001％w/v、0.005％w/v、0.01％w/v、0.02％w/v、0.03％w/v、0.04％w/v、0.05％w/v、0.06％w/v、0.07％w/v、0.08％w/v、0.09％w/v和0.1％w/v。
还原剂一些优选的组分和用量的如下：在一些优选的实施方式中，PCR反应体系中的还原剂的浓度为0.05～5mmol/L时效果较佳，例如可以为但不限于为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L、4.0mmol/L、4.5mmol/L和5.0mmol/L，优选为0.1～1mmol/L；其中还原剂包括但不限于二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦中的至少一种；可选地，以二硫苏糖醇和β-巯基乙醇配合使用，β-巯基乙醇和三(2-羧乙基)膦配合使用，或二硫苏糖醇、β-巯基乙醇和三(2-羧乙基)膦中择一使用，优选包括二硫苏糖醇。
糖类物质一些优选的组分和用量如下：所述糖类物质包括但不限于单糖、二糖以及多糖，具体的糖类物质包括但不限于葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、海藻糖、聚蔗糖和葡聚糖中的至少一种。在一些可选的实施方式中，包括但不限于葡萄糖和蔗糖的复配使用和麦芽糖和海藻糖的复配使用；葡萄糖、果糖和葡聚糖的复配使用；优选以海藻糖和葡聚糖的复配使用。其中葡聚糖是指以葡萄糖为单糖组成的同型多糖，优选使用葡聚糖6000。
醇类物质一些优选的组分和用量如下：在一些优选的实施方式中，所述醇类物质在PCR反应体系中的浓度为0.05％w/v～10％w/v，例如可以为但不限于为0.05％w/v、0.08％w/v、0.1％w/v、0.2％w/v、0.5％w/v、1.0％w/v、1.5％w/v、2.0％w/v、3.0％w/v、4.0％w/v、5.0％w/v、6.0％w/v、7.0％w/v、8.0％w/v、9.0％w/v和10.0％w/v，更优选为1％w/v～5％w/v。其中醇类物质优选使用极性更强的多元醇，包括但不限于丙三醇、乙二醇和聚乙二醇中的至少一种，其中聚乙二醇优选平均分子量分子量为200～20000的聚乙二醇，例如可以为但不限于为PEG200、PEG400、PEG600、PEG4000、PEG600、PEG8000、PEG10000或PEG20000。在一些可选的实施方式中，包括但不限于丙三醇和PEG8000的复配；丙三醇和乙二醇的复配、丙三醇、PEG200和PEG4000的复配等，其中多元醇优选包括PEG4000。
本发明提供的PCR反应体系中，其他优选的组分和用量如下：
在一些优选的实施方式中，所述PCR反应体系还包括缓冲物质，优选地，所述PCR反应体系中含有5mmol/L～500mmol/L的缓冲物质，例如可以为但不限于为5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L或500mmol/L，优选为5mmol/L～100mmol/L；更优选为5mmol/L～30mmol/L。所述PCR反应体系的pH优选为7～10；更优选为8.5～10。
其中缓冲物质优选包括Tris(三羟甲基氨基甲烷)类缓冲物质和/或两性离子缓冲物质；所述Tris类缓冲物质优选包括Tris盐酸和/或Tris磷酸，即可以将Tris盐酸和Tris磷酸联用，也可以择一使用，优选使用Tris盐酸；两性离子缓冲物质包括但不限于Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)、Bicine(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啡啉)丙磺酸)、TAPS(三羟甲基甲胺基丙磺酸)和CAPS(3-(环己胺)-1-丙磺酸)中的至少一种。可选地，缓冲物质包括Tris盐酸和TAPS；可选地，缓冲物质包括Tris磷酸和Bicine；可选地，缓冲物质包括TAPS和MOPS；
在一些优选的实施方式中，所述PCR反应体系还包括阳离子，其中优选包括单价阳离子和二价阳离子中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，所述PCR反应体系包括单价阳离子，PCR反应体系中单价阳离子的浓度为10mmol/L～200mmol/L，例如可以为但不限于为10mmol/L、50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、150mmol/L、175mmol/L或200mmol/L；优选为30mmol/L～60mmol/L；阳离子优选包括K+和/或NH4 +。
在一些优选的实施方式中，所述PCR反应体系包括二价阳离子，PCR反应体系中二价阳离子的浓度为1.5mmol/L～6mmol/L，例如可以为但不限于为1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、3mmol/L、3.5mmol/L、4mmol/L、4.5mmol/L、5mmol/L、5.5mmol/L或6mmol/L。二价阳离子优选来源于PCR反应体系中的MgCl2和/或MgSO4；
在一些优选的实施方式中，所述PCR反应体系还包括酶，本发明所述的酶可以是从天然生物中提取出的未经基因改造的酶，也可以是经过基因工程改造，提高了抗抑制能力和扩增效率的酶，本发明对此不做限制。所述酶优选包括DNA聚合酶和/或逆转录酶；当该PCR反应体系只用于以DNA为模板的扩增反应，所述PCR反应体系中可以只包含DNA聚合酶；当该PCR反应体系只用于以粗样本中的RNA为模板进行反转录，所述PCR反应体系中可以只包含逆转录酶；当所述PCR反应体系同时以DNA和RNA为模板，例如在检测粗样本中mRNA的表达量时，通常需要先将样本中的mRNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，这时PCR反应体系中包含DNA聚合酶和逆转录酶。
所述PCR反应体系中DNA聚合酶的量优选为1.0～20U/test，例如可以为但不限于为1.0U/test、2U/test、3U/test、5U/test、7.5U/test、10U/test、12.5U/test、15U/test、18U/test和20U/test，优选为2-6U/test。单位U/test指的是以酶活性单位记每次PCR反应的用量。所述DNA聚合酶包括但不限于Taq，Tth，Tfl、TLI、Tne、Tma、ventTM、PhusionTM、Pfu和KOD中的至少一种；可选地包括Taq和Tth，可选地包括TLI和Tne，可选地包括Tma和ventTM，可选地包括Tne、Tma和Pfu，可选地在Taq，Tth，Tfl、TLI、Tne、Tma、ventTM、PhusionTM、Pfu和KOD中择一使用；更优选包括具有抑制剂耐受性质的Taq、Tth、Tfl、TLI和PhusionTM中的至少一种，可选地包括Tth和Tfl，可选地包括Tfl和TLI，可选的在Taq、Tth中择一使用。
在一些优选的实施方式中，DNA聚合酶包括经抗体、化学和配体中至少一种方法修饰的热启动聚合酶，热启动酶是经修饰封闭酶活性中心，在预设的高温下酶活性中心暴露，能避免酶在低温下优于活性不佳造成的错配，使用热启动聚合酶能够提高PCR反应的灵敏度和特异性。
所述PCR反应体系中逆转录酶的量优选为10-500U/test，例如可以为但不限于为10U/test、20U/test、50U/test、80U/test、100U/test、150U/test、200U/test、250U/test、300U/test、350U/test、400U/test、450U/test或500U/test，优选为50-100U/test。所述逆转录酶优选包括AMV逆转录酶和/或MMLV逆转录酶，即AMV逆转录酶和MMLV逆转录酶二者联用或择一使用。
在一些优选的实施方式中，所述PCR反应体系还包括脱氧核糖核苷酸(dNTP)，所述PCR反应体系中脱氧核糖核苷酸的浓度为100μmol/L～600μmol/L，例如可以为但不限于为100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L、300μmol/L、350μmol/L、400μmol/L、450μmol/L、500μmol/L、550μmol/L或600μmol/L。所述脱氧核糖核苷酸包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP中的至少一种，可选的为dATP、dGTP、dCTP和dTTP的组合，浓度优选均为200μmol/L；或dATP、dGTP、dCTP和dUTP的组合；浓度优选分别为200μmol/L、200μmol/L、200μmol/L和400μmol/L。
以未经提取核酸的粗样本作为模板，反应过程会产生对PCR具有抑制作用的血红蛋白、抗凝剂、免疫球蛋白、腐殖酸和胆黄酸等对PCR反应具有抑制作用的物质，该PCR反应体系中由于含有促进样本裂解的表面活性剂，表面活性剂也会对PCR产生一定程度的抑制作用，为了缓解上述各种因素对PCR反应带来的抑制作用，PCR反应体系中还含有抗抑制剂。所述PCR反应体系中抗抑制剂的浓度优选为0.05～10mg/ml，例如可以为但不限于为0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml或10mg/ml，优选为0.2～2mg/ml。其中所述抗抑制剂优选使用具有抗PCR抑制作用的蛋白类物质，包括但不限于BSA(牛血清白蛋白)、HSA(人血清白蛋白)、gp32蛋白(T4噬菌体基因32编码蛋白)和明胶中的至少一种，在一些可选的实施方式中，包括但不限于BSA和明胶的复配，gp32蛋白和BSA的复配，或BSA、gp32蛋白和明胶的联合使用，在一些优选的实施方式中，所述抗抑制剂包括BSA，BSA在高温下能和裂解产生的血红素，糖类，脂类形成大分子复合物沉淀下来，从而缓解此类物质对PCR的抑制作用。
当该PCR反应体系中需要以RNA为模板进行反应时，PCR反应体系中还优选包括核糖核酸酶抑制剂，以抑制RNA的降解。所述核糖核酸酶抑制剂包括但不限于焦碳酸二乙酯、异硫氰酸胍、氧钒核糖核苷复合物和RNA酶的蛋白质抑制剂中的一种或多种，优选使用RNA酶的蛋白质抑制剂，更优选使用人源和/或鼠源RNase inhibitor，即人源和鼠源RNaseinhibitor联用或择一使用。优选PCR反应体系中所述核糖核酸酶抑制剂的浓度为10～5000U/ml，例如可以为但不限于为10U/ml、50U/ml、100U/ml、200U/ml、500U/ml、1000U/ml、1500U/ml、2000U/ml、3000U/ml、4000U/ml或5000U/ml，优选为100～1000U/ml。
在一些优选的实施方式中，所述PCR反应体系中包含按照如下配比的组分时，效果更佳：所述PCR反应体系包括Tris 5mmol/L～500mmol/L、CHAPS 0.01％w/v～0.1％w/v、Triton X-100 0.01％w/v～0.1％w/v、十二烷基硫酸钠0.01％w/v～0.1％w/v、二硫苏糖醇0.05～5mmol/L、海藻糖2％w/v～5％w/v、葡聚糖6000 2％w/v～5％w/v、聚乙二醇40000.05％w/v～10％w/v、BSA 0.05～10mg/ml、K+10mmol/L～200mmol/L和Mg2+1.5mmol/L～6mmol/L。
在一些更优选的实施方式中，所述PCR反应体系包括：Tris 5mmol/L～100mmol/L、CHAPS 0.01％w/v～0.1％w/v、Triton X-100 0.01％w/v～0.1％w/v、十二烷基硫酸钠0.01％w/v～0.1％w/v、二硫苏糖醇0.1～1mmol/L、海藻糖2％w/v～5％w/v、葡聚糖60002％w/v～5％w/v、聚乙二醇4000 1％w/v～5％w/v、BSA 0.2～2mg/ml、K+30mmol/L～60mmol/L和Mg2+1.5mmol/L～6mmol/L。
进一步优选地，所述PCR反应体系包括：Tris 10mmol/L、CHAPS 0.05％w/v、TritonX-100 0.01％w/v、十二烷基硫酸钠0.005％w/v、二硫苏糖醇0.5mmol/L、海藻糖2％w/v、葡聚糖6000 1％w/v、聚乙二醇4000 2％w/v、BSA 1mg/ml、K+50mmol/L和Mg2+4mmol/L。
本发明还提供了一种包含上述PCR反应体系的试剂或试剂盒。本发明提供的试剂或试剂盒可以包含PCR反应的所有组分，也可以只包含表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质，使用时再与常规PCR缓冲液配合使用；也可以包含表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质和其他任选的组分，本发明对此不做限制。在一些可选的实施方式中，所述试剂包含有效配方量的表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质。在一些可选的实施方式中，所述试剂包含有效配方量的表面活性剂、还原剂、糖类物质、醇类物质、缓冲液、引物、阳离子、DNA聚合酶、dNTP、抗抑制剂和核糖核酸酶抑制剂。在一些可选的实施方式中，所述试剂盒包含试剂A，其中包含有效配方量的活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质；还包含试剂B，其中包含含有dNTP和阳离子的缓冲液；还包含试剂C，其中包含DNA聚合酶。在一些可选的实施方式中，所述试剂盒中还可以包含实验耗材。其中有效配方量指的是能实现上述PCR反应体系的配方量，可以理解的是，所述有效配方量可以与进行PCR时的PCR反应体系中的浓度一致，也可以成倍的增加，例如以2倍、5倍或10倍的浓度配制所述试剂或试剂盒，配制PCR反应体系时再稀释，以方便贮存、取用和商品化。
本发明还提供了一种PCR方法，该方法使用上述PCR反应体系，或使用上述试剂或试剂盒进行反应。本发明提供的PCR方法，包括但不限于反转录、普通PCR和荧光定量PCR等以DNA和/或RNA为模板的合成DNA的反应。本发明提供的PCR方法，使用上述PCR反应体系，或使用上述试剂或试剂盒进行反应，实现对粗模板，包括但不限于血清、血浆、全血、口(鼻)腔拭子、细胞或其他体液，不经任何预处理直接加样，或只需用水或缓冲液将待检物重悬后，不经过预先的核酸释放步骤或处理，即可直接将上述样本加入反应试剂，在试剂中实现核酸的原位裂解和扩增的同步进行，以达到最简化的样本处理方式和基因检测的目的。
本发明提供的PCR方法极大简化了PCR操作的全过程，省略了复杂的核酸提取或样本裂解步骤，避免了靶核酸获得过程中由于技术局限或操作步骤繁杂而导致的核酸损失、操作简单容易掌握、只需要移液器和PCR反应管等常见实验器材就能操作、方法便捷、成本低廉、扩增效率高，将核酸裂解与扩增“合二为一”，使用最少的反应试剂，最简单的操作步骤，最短的操作时间，节省大量人力物力，此方法在分子生物学研究领域尤其是快速扩增领域将得到广泛使用。
在一些优选的实施方式中，使用上述PCR反应体系，或上述试剂或试剂盒进行荧光定量PCR效果更佳，常规PCR技术的流程包括：核酸的提取与定量，PCR扩增，扩增产物鉴定。荧光定量PCR技术在扩增的同时实时监测扩增的情况，将光学信号的变化转换为数学变化从而计算出初始模板数量与种类，不必在反应终点通过检定终产物量从而推测初始模板量，因此荧光定量PCR技术的出现省减了产物鉴定这一步骤，从而简化了PCR技术。同时，由于在一些实施方式中所述PCR反应体系中还含有具有反转录功能的逆转录酶和核糖核酸酶抑制剂，因此所述PCR方法可以直接将未经提取和纯化的核酸样本作为模板，无需提取RNA的步骤，直接对其中的RNA实现反转录和荧光定量PCR，避免了分步骤操作中造成的样品的降解和人为的实验误差。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1
基础PCR反应体系：dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝0.2mmol/L：0.2mmol/L：0.2mmol/L：0.4mmol/L；Tris 10mmol/L(pH 8.8)、KCl 50mmol/L、MgCl2 4mmol/L、BSA 1mg/ml、Robustart Taq(宝锐CAT：E16)3U/test、UNG(宝锐CAT：E01)0.5U/test和TritonX-1000.01％w/v，以及引物：0.4μM HBV-S(如SEQ ID NO.1所示序列)，0.4μM HBV-A(如SEQ IDNO.2所示序列)，0.2μM HBV-P(如SEQ ID NO.3所示序列)的HBV引物探针。其他表面活性剂的组成如表1所示。
表1配方1～配方8表面活性剂的组成
组别 表面活性剂配方
配方1 0.05％CHAPS
配方2 0.1％CHAPS
配方3 0.5％CTAB
配方4 1％CTAB
配方5 0.005％SDS
配方6 0.01％SDS
配方7 0.05％CHAPS+0.5％CTAB
配方8 0.05％CHAPS+0.005％SDS
选择病毒浓度滴度为1.0+E4及1.0+E2IU/ml的HBV阳性血浆直接加入到反应孔中，每孔加入5μl的阳性血浆，即阳性血浆的加样量为10％，每孔反应体系为50μl。
配制完成后，将PCR反应管放置在宏石SLAN-48P仪器中进行扩增，扩增程序为：50℃，2min；95℃，5min；95℃，10s，55℃，30s，50cycles。实验结果如图1A-1H所示，从中可以看出0.05％CHAPS+0.005％SDS对HBV阳性血浆的扩增具有明显的改善。
实施例2
基础PCR反应体系：dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝0.2mmol/L：0.2mmol/L：0.2mmol/L：0.4mmol/L；Tris 10mmol/L(pH 8.8)、KCl 50mmol/L、MgCl2 3mmol/L、BSA 1mg/ml、Robustart Taq(宝锐CAT：E16)3U/test、UNG(宝锐CAT：E01)0.5U/test和TritonX-1000.01％w/v，以及引物0.2μmol GAPDH-S(如SEQ ID NO.4所示序列)，0.2μmol GAPDH-A(如SEQ ID NO.5所示序列)。扩增片段长度为1kb，在此反应液的基础上，加入不同种类及浓度的醇类物质，具体的如表2所示。将EDTA抗凝血上下颠倒混匀，每孔加入4ul，即全血的加样量为8％，反应体系为50μl。配制完成后，将PCR反应管放置在宏石SLAN-48P仪器中进行扩增，扩增程序为：50℃，2min；95℃，5min；95℃，10s，55℃，15s，72℃，60s；35cycles。实验结果如图2A-2F所示，可以看出2％w/v的PEG4000效果更佳。
表2几种醇类物质及其浓度
实施例3
基础PCR反应体系：dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝0.2mmol/L：0.2mmol/L：0.2mmol/L：0.4mmol/L；Tris 10mmol/L(pH 8.8)、KCl 50mmol/L、MgCl2 4mmol/L、BSA 1mg/ml(Sigma)、Robustart Taq(宝锐CAT：E16)3U/test、UNG(宝锐CAT：E01)0.5U/test和TritonX-1000.01％w/v，以及引物：0.4μM HBV-S(如SEQ ID NO.1所示序列)，0.4μM HBV-A(如SEQ IDNO.2所示序列)，0.2μM HBV-P(如SEQ ID NO.3所示序列)的HBV引物探针。在此反应液的基础上，加入不同种类及浓度的糖类物质，具体糖类物质的配方和含量如表3所示。
选择病毒浓度滴度为1.0+E4及1.0+E2IU/ml的HBV阳性血浆直接加入到反应孔中，每孔加入5μl的阳性血浆，即阳性血浆的加样量为10％，每孔反应体系为50μl。
配制完成后，将PCR反应管放置在宏石SLAN-48P仪器中进行扩增，扩增程序为：50℃，2min；95℃，5min；95℃，10s，55℃，30s，50cycles。结果如表3和图3A-3F所示，可以看出配方13即2％Trehalose与1％dextran联合使用对扩增的促进作用最为明显。
表3几种糖类物质及浓度对HBV阳性血浆扩增的结果
实施例4
基础PCR反应体系：dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝0.2mmol/L：0.2mmol/L：0.2mmol/L：0.4mmol/L；Tris 10mmol/L(pH 8.8)、KCl 50mmol/L、MgCl2 4mmol/L、BSA 1mg/ml(Sigma)、Robustart Taq(宝锐CAT：E16)3U/test、UNG(宝锐CAT：E01)0.5U/test、TritonX-1000.01％w/v、2％Trehalose和1％Dextran6000在此基础上，以及0.4μHBV-S(如SEQ ID NO.1所示序列)，0.4uM HBV-A(如SEQ ID NO.2所示序列)，0.2μM HBV-P(如SEQ ID NO.3所示序列)的HBV引物探针，加入反应终浓度为0.05mmol/L，0.1mmol/L，0.5mmol/L，1mmol/L，2.5mmol/L，5mmol/L的DTT分别扩增加样量为10％HBV阳性血浆。结果如表4和图4A-图4F所示，0.5mM DTT与1mM的DTT的加入对扩增的促进作用最为明显。
表4不同DTT浓度对HBV阳性血浆扩增的结果
实施例5
表5实施例1～实施例4对扩增具有促进作用的添加剂组合使用
以上五种配方加入HBV引物探针0.4μM HBV-S(SEQ ID NO.1)，0.4μM HBV-A(SEQID NO.2)，0.2μM HBV-P(SEQ ID NO.6)，HBV-P探针序列与前述序列一致，发光基团为VIC标记。每种分别配制25孔的反应液，每孔设定的终反应体积为50μl，将反应液分至24个反应孔中，再加入三种不同浓度的HBV阳性血浆，分别是60IU/ml，1.0+E3IU/ml及1.0+E4IU/ml，对应反应孔数分别是18孔，3孔及3孔，阳性血浆的加入体积占总反应体积的20％，即加入10μl阳性血浆，加入模板后即可直接上机扩增。
以上五种配方的反应液分别放入上海宏石SLAN-48P仪器中进行扩增，扩增程序为：50℃，2min；95℃，5min；95℃，10s，55℃，30s，50cycles。实验结果见表6及图5A-图5E所示。
表6：几种不同配方扩增HBV阳性血浆的结果
实施例6
以配方25作为PCR反应体系，引物为0.4μM HBV-S(SEQ ID NO.1)，0.4μM HBV-A(SEQ ID NO.2)和0.2μM HBV-P(SEQ ID NO.3)。配制13孔的反应液，每孔设定的终反应体积为60μl，将反应液分至12个反应孔中，再加入三种不同浓度的HBV阳性血浆，分别是60IU/ml、1.0+E3IU/ml及1.0+E4IU/ml，对应反应孔数分别是7孔，3孔及2孔，阳性血浆的加入体积占总反应体积的25％，即加入15μl阳性血浆，加入模板后即可直接上机扩增。
含有裂解液的商品化的HBV检测试剂盒的操作步骤为：在12个PCR反应孔中每孔加入5μl的核酸释放剂，再在各个反应孔中分别加入15μl的60IU/ml、1.0+E3IU/ml及1.0+E4IU/ml的HBV阳性血浆7孔，3孔及2孔，各个孔分别使用移液器吹打混匀5-8次，室温静置5min，然后各孔再加入合计40μl的反应A液和反应B液，总反应体积也保持60μl。
以上两个反应体系同时放入上海宏石SLAN-48P仪器中进行扩增，扩增程序为：50℃，2min；94℃，10min；94℃，15s，55℃，30s，45cycles。检测结果如表7和图6A和图6B所示：
表7实施例6的检测结果
从上述实验结果可以看出，1)配方25具有较高的灵敏度，能够将病毒滴度为60IU/ml的HBV阳性血浆完全检出，但对照试剂确不能全检。2)从扩增Ct值上看，配方25的Ct值较对照提前了一个梯度，体现出本试剂卓越的扩增效率和灵敏度，且配方25的荧光值也显著高于对照试剂，同等检测模板条件下，更高的反应信号更易为检测人员捕获，更容易作出阳性判读。
实施例7
一步法RT PCR反应体系：dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝0.2mmol/L：0.2mmol/L：0.2mmol/L：0.4mmol/L；Tris 10mmol/L(pH 8.8)、KCl 75mmol/L、MgCl2 4mmol/L、BSA 1mg/ml(Sigma)、Robustart Taq(宝锐CAT：E16)3U/test、Neoscript RTase(宝锐CAT：E13)50U/test、RNase inhibitor(宝锐CAT：AS05)12.5U/test、TritonX-100 0.01％w/v、Trehalose2％、Dextran6000 1％、PEG4000 2％、DTT 0.5mM、CHAPS 0.05％、SDS 0.005％。引物为0.4μM HCV-S(SEQ ID NO.7)，0.4μM HCV-A(SEQ ID NO.8)，0.2μM HCV-P(SEQ ID NO.9)。配制33孔的反应量，每孔预设的终反应体积为25μl，将反应液分至32个反应孔中，每孔20μl反应液。
取4.0+E6IU/ml浓度的HCV阳性血浆(企业标准品)，使用正常人血浆将其稀释至1.0+E5IU/ml、1.0+E3IU/ml、500IU/ml及250IU/ml，以上浓度的模板分别点样2孔，4孔，13孔及13孔，每孔点样5μl，血浆加样量占总反应体积的20％。加样完毕后，将反应管放入宏石SLAN-48P仪器中。扩增程序为：50℃15min，95℃，1min；95℃，15s，55℃，45s，50cycles。检测结果如表8和图7所示：
表8实施例7的检测结果
此配方使用HCV血浆作为模板，在大体积加样的情况下，获得的扩增曲线线型良好，在血浆浓度为250IU/ml时，根据每孔5μl的加样量，每孔中HCV理论分子数约为4copies，检出率基本达到70％，表明本发明具有卓越的抗抑制性能及扩增效率。
实施例8
以配方25作为PCR反应体系，引物为0.4μM GAPDH-S(SEQ ID NO.10)，0.4μMGAPDH-A(SEQ ID NO.11)，0.2μM GAPDH-P(SEQ ID NO.12)及0.4μMβ-actin-S(SEQ IDNO.13)，0.4μMβ-actin-A(SEQ ID NO.14)，0.2μMβ-actin-P(SEQ ID NO.15)，GAPDH及β-actin的探针上荧光标记分别为VIC与CY5，在二、四通道进行检测，反应总体积为25μl，反应液23.75μl，血液加样1.25μl。
取新鲜EDTA抗凝血，柠檬酸钠抗凝血，肝素抗凝血，取用之前先颠倒混匀，用移液器吸取1.25μl加入到反应孔中，盖上反应管盖混匀离心，将反应管移至宏石SLAN-48P中进行扩增。
扩增程序为：50℃，2min；95℃，5min；95℃，10s，55℃，30s，50cycles。
检测结果：见附图8A-图8C，从实验结果来看，本发明对三种抗凝血样本都能有较好的扩增，说明本发明不仅能较好的耐受血液中血红蛋白对PCR的干扰，且能耐受三种抗凝剂对PCR的干扰作用，在5％的全血加样量下都能获得良好的检测效果。
实施例9
以配方25作为PCR反应体系，引物为0.4μM MTHFR-677S(SEQ ID NO.16)，0.4μMMTHFR-677A(SEQ ID NO.17)，0.2μM MTHFR-677M(SEQ ID NO.18)，0.2μM MTHFR-677V(SEQID NO.19)。0.4μM MTHFR-1298S(SEQ ID NO.20)，0.4μM MTHFR-1298A(SEQ ID NO.21)，0.2μM MTHFR-1298M(SEQ ID NO.22)，0.2μM MTHFR-1298V(SEQ ID NO.23)。0.4μM MTRR-66S(SEQ ID NO.24)，0.4μM MTRR-66A(SEQ ID NO.25)，0.2μM MTRR-66M(SEQ ID NO.26)，0.2μM MTRR-66V(SEQ ID NO.27)。预设反应总体积为25μl，反应液15μl，拭子水溶液10μl。
漱口后，取棉签拭子轻刮口腔内脸颊部或咽部10次左右，将棉签浸于1ml的无菌水溶液中轻轻摆动洗涤数次，弃去棉签。2000rpm离心10min除去约800μl上清，剩余的拭子水溶液以每孔10μl的体积加入至反应孔中上机扩增，扩增仪器为宏石SLAN-48P，扩增程序为：50℃，2min；95℃，3min；95℃，15s，60℃，40s，40cycles。同时取相应被检测人的血液进行DNA提取，将提取的DNA样本送去测序，比较PCR结果与测序结果的异同。检测结果如图9A-图9C所示。
人类基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性(clinical phenotype diversity)，以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。PCR方法作为一种操作简单，快速，结果可靠性高，相对成本低廉的检测方法已广泛应用于基因多态性检测。采用口腔拭子直接作为检测模板，取样简单，无侵入性，无需复杂的操作步骤，获取结果简单快速，且结果与检验金标准(测序)一致，可靠性高。
上述各实施例中使用的引物以及引物修饰的荧光标记物如下表所示：
序列 5’-3’
SEQ ID NO.1 CCTGGTTATCGCTGGATGTGT
SEQ ID NO.2 GGACAAACGGGCAACATACCTT
SEQ ID NO.3 6FAM-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT-TAMERA
SEQ ID NO.4 tctcctacatcaccaaggac
SEQ ID NO.5 attctggaaaagacaaagtga
SEQ ID NO.6 VIC-CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT-BHQ
SEQ ID NO.7 gagtagtgttgggtcgcgaa
SEQ ID NO.8 tgcacggtctacgagacctc
SEQ ID NO.9 6FAM-Tggtactgcctgatagggtgcttgc-BHQ
SEQ ID NO.10 catcttccaggagcgaga
SEQ ID NO.11 tgttgtcatacttctcat
SEQ ID NO.12 VIC-cctcaccaccatggagaaggct-BHQ
SEQ ID NO.13 agCCTCgCCTTTgCCgA
SEQ ID NO.14 CTggTgCCTggggCg
SEQ ID NO.15 CY5-CCgCCgCCCgTCCACACCCgCCT-BHQ
SEQ ID NO.16 gaaaagctgcgtgatgatg
SEQ ID NO.17 ttgaaggagaaggtgtc
SEQ ID NO.18 CY5-Aatcggctcccgc-MGB
SEQ ID NO.19 VIC-Aatcgactcccgc-MGB
SEQ ID NO.20 aagaacgaagacttcaaa
SEQ ID NO.21 tggggggaggagctgac
SEQ ID NO.22 CY5-Acacttgcttcact-MGB
SEQ ID NO.23 VIC-Acactttcttcact-MGB
SEQ ID NO.24 aggcaaaggccatcgca
SEQ ID NO.25 atccatgtaccacagctt
SEQ ID NO.26 CY5-aagaaatatgtgag-MGB
SEQ ID NO.27 VIC-aagaaatgtgtgag-MGB
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
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<400> 4
tctcctacat caccaaggac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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attctggaaa agacaaagtg a 21
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catcctgctg ctatgcctca tcttctt 27
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gagtagtgtt gggtcgcgaa 20
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tgcacggtct acgagacctc 20
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tggtactgcc tgatagggtg cttgc 25
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catcttccag gagcgaga 18
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cctcaccacc atggagaagg ct 22
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agcctcgcct ttgccga 17
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ctggtgcctg gggcg 15
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ccgccgcccg tccacacccg cct 23
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tggggggagg agctgac 17
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aagaaatgtg tgag 14

Claims (10)

1.一种PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系中包含表面活性剂、还原剂、糖类物质和醇类物质。
2.根据权利要求1所述的PCR反应体系，其特征在于，所述表面活性剂在PCR反应体系中的浓度为0.001％w/v～1％w/v；
优选地，所述表面活性剂包括两性离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂中的至少一种；
优选地，所述表面活性剂包括两性离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和阴离子表面活性剂；
优选地，所述两性离子型表面活性剂包括氨基酸类表面活性剂和甜菜碱类表面活性剂中的至少一种；所述甜菜碱类表面活性剂优选包括CHAPS；
优选地，所述非离子型表面活性剂包括TritonX-100、Tween20、Tween80和NP40中的至少一种；优选包括TritonX-100；
优选地，所述阳离子型表面活性剂包括十二烷基二甲基苄基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵和十八烷基三甲基氯化铵中的至少一种；
优选地，所述阴离子表面活性剂包括烷基苯磺酸盐、烷基磺酸酯盐、烷基磺酸盐和烷基硫酸盐中的至少一种；所述烷基硫酸盐优选十二烷基硫酸钠；
优选地，所述PCR反应体系中包括CHAPS 0.01％w/v～0.1％w/v、Triton X-1000.01％w/v～0.1％w/v和十二烷基硫酸钠0.001％w/v～0.1％w/v。
3.根据权利要求1所述的PCR反应体系，其特征在于，所述还原剂在PCR反应体系中的浓度为0.05～5mmol/L；优选为0.1～1mmol/L；
优选地，所述还原剂包括二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦中的至少一种；优选为二硫苏糖醇。
4.根据权利要求1所述的PCR反应体系，其特征在于，所述糖类物质在PCR反应体系中的浓度为1％w/v～10％w/v；优选为2％w/v～5％w/v；
优选地，所述糖类物质包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、海藻糖、聚蔗糖和葡聚糖中的至少一种；
优选地，所述葡聚糖包括葡聚糖6000；
优选地，所述糖类物质包括海藻糖和葡聚糖6000。
5.根据权利要求1所述的PCR反应体系，其特征在于，所述醇类物质在PCR反应体系中的浓度为0.05％w/v～10％w/v；优选为1％w/v～5％w/v；
优选地，所述醇类物质包括多元醇；
优选地，所述多元醇包括丙三醇、乙二醇和聚乙二醇中的至少一种；
优选地，所述聚乙二醇的平均分子量分子量为200～20000；优选为聚乙二醇4000。
6.根据权利要求1所述的PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系还包括抗抑制剂；所述抗抑制剂优选包括BSA、HSA、gp32蛋白和明胶中的至少一种；更优选包括BSA；
优选地，PCR反应体系中所述抗抑制剂的浓度为0.05～10mg/ml；优选为0.2～2mg/ml。
7.根据权利要求1所述的PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系还包括缓冲物质、阳离子、酶、脱氧核糖核苷酸、核糖核酸酶抑制剂和溶剂中的至少一种；
优选地，所述缓冲物质包括Tris类缓冲物质和/或两性离子缓冲物质；所述Tris类缓冲物质优选包括Tris盐酸和/Tris磷酸，更优选包括Tris盐酸；所述两性离子缓冲物质优选包括Tricine、Bicine、HEPES、MOPS、TAPS和CAPS中的至少一种；
优选地，所述PCR反应体系中含有5mmol/L～500mmol/L的缓冲物质，优选为5mmol/L～100mmol/L；
优选地，所述PCR反应体系的pH为7～10；优选为8.5～10；
优选地，所述PCR反应体系还包括阳离子，所述阳离子优选包括单价阳离子和二价阳离子中的至少一种；
优选地，单价阳离子优选包括K+和/或NH4 +；浓度优选为10mmol/L～200mmol/L；优选为30mmol/L～60mmol/L；
优选地，二价阳离子优选包括Mg2+；浓度优选为1.5mmol/L～6mmol/L；
优选地，所述PCR反应体系还包括酶，所述酶优选包括DNA聚合酶和/或逆转录酶；
优选地，所述DNA聚合酶包括热启动聚合酶；
优选地，所述DNA聚合酶包括Taq，Tth，Tfl、TLI、Tne、Tma、ventTM、PhusionTM、Pfu和KOD中的至少一种；优选包括Taq、Tth、Tfl、TLI和PhusionTM中的至少一种；
优选地，PCR反应体系中DNA聚合酶的浓度为1-20U/test，优选为2-6U/test；
优选地，所述逆转录酶优选包括AMV逆转录酶和/或MMLV逆转录酶；
优选地，PCR反应体系中逆转录酶的浓度为10-500U/test，优选为50-100U/test；
优选地，所述PCR反应体系还包括脱氧核糖核苷酸，所述脱氧核糖核苷酸的浓度优选为100μmol/L～600μmol/L；
优选地，所述PCR反应体系还包括核糖核酸酶抑制剂，优选包括人源和/或鼠源RNaseinhibitor；
优选地，所述PCR反应体系中所述核糖核酸酶抑制剂的浓度为10～5000U/ml，优选为100～1000U/ml。
8.根据权利要求1-7任一项所述的PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系包括Tris 5mmol/L～500mmol/L、CHAPS 0.01％w/v～0.1％w/v、Triton X-1000.01％w/v～0.1％w/v、十二烷基硫酸钠0.01％w/v～0.1％w/v、二硫苏糖醇0.05～5mmol/L、海藻糖2％w/v～5％w/v、葡聚糖6000 2％w/v～5％w/v、聚乙二醇4000 0.05％w/v～10％w/v、BSA0.05～10mg/ml、K+10mmol/L～200mmol/L和Mg2+1.5mmol/L～6mmol/L；
优选地，所述PCR反应体系包括：Tris 5mmol/L～100mmol/L、CHAPS 0.01％w/v～0.1％w/v、Triton X-100 0.01％w/v～0.1％w/v、十二烷基硫酸钠0.01％w/v～0.1％w/v、二硫苏糖醇0.1～1mmol/L、海藻糖1％w/v～5％w/v、葡聚糖6000 1％w/v～5％w/v、聚乙二醇40001％w/v～5％w/v、BSA 0.2～2mg/ml、K+30mmol/L～60mmol/L和Mg2+1.5mmol/L～6mmol/L；
优选地，所述PCR反应体系包括：Tris 10mmol/L、CHAPS 0.05％w/v、Triton X-1000.01％w/v、十二烷基硫酸钠0.005％w/v、二硫苏糖醇0.5mmol/L、海藻糖2％w/v、葡聚糖6000 1％w/v、聚乙二醇4000 2％w/v、BSA 1mg/ml、K+50mmol/L和Mg2+4mmol/L。
9.一种包含权利要求1-8任一项所述PCR反应体系的试剂或试剂盒。
10.一种PCR方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-8任一项所述的PCR反应体系进行反应，或使用权利要求9所述的试剂或试剂盒进行反应；
优选地，所述PCR方法包括将未经裂解的样本直接加入所述PCR反应体系中，然后进行反应；
优选地，所述PCR方法包括先将未经裂解和/或未经核酸提取的样本重悬，然后将重悬的样本直接加入所述PCR反应体系中再进行反应；
优选地，所述样本包括血清、血浆、全血、拭子、细胞或体液；
优选地，所述PCR方法包括荧光定量PCR。
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