CN114231601A - 聚蔗糖在血液直扩pcr中的应用及其使用方法 - Google Patents
聚蔗糖在血液直扩pcr中的应用及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开聚蔗糖在血液直扩PCR中的应用及其使用方法。本发明首先公开了聚蔗糖在血液直扩PCR中的应用。本发明进一步公开了聚蔗糖在进行血液直扩PCR时的使用方法。本发明首次将聚蔗糖作为一种添加剂添加到血液稀释剂中用于血液直扩实时荧光PCR时稀释血液，通过血液的稀释有效降低了血红素对荧光信号的阻挡和血液中PCR扩增抑制物对PCR的干扰，对实时荧光PCR的Ct值和终点荧光值均有增效效果，大大提高了血液直扩实时荧光PCR的扩增效果，进一步使得在利用实时荧光PCR进行SNP分型测试时终点荧光信号聚簇效果和分型测试成功率都得到了有效的提升。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域。更具体地，涉及聚蔗糖在血液直扩PCR中的应用及其使用方法。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种增加特定DNA片段的分子生物学技术，被应用在医学和生物学的多个领域中，例如病原体检测、基因诊断、犯罪取证、基因克隆等。实时荧光PCR省去了PCR产物电泳的步骤，可在反应过程中和反应终点通过检测荧光判断扩增的情况；实时荧光PCR技术被应用于模板数量的相对定量、绝对定量、病原体核酸的检测、突变检测、SNP分型等。
通常情况下，在PCR中需要纯化的基因组DNA作为模板。直扩PCR，即不做DNA纯化、将组织样本或组织样本裂解液或粗提物直接加到PCR体系中作为模板进行PCR扩增，为实验操作提供了很大的便利并且节省了时间。但由于直扩PCR体系中存在PCR扩增抑制物，限制了直扩PCR的应用。血液直扩PCR属于直扩PCR的一种，即在PCR体系中直接加入血液作为模板DNA的一种PCR。同样地，由于PCR体系中存在PCR扩增抑制物等原因(Schrader C,Schielke A,Ellerbroek L,Johne R.PCR inhibitors-occurrence,properties andremoval.J Appl Microbiol.2012；113(5):1014–1026.doi:10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x)，影响了血液直扩PCR的扩增效果，表现为PCR产物产量低甚至没有扩增产物、重复性差等。在血液直扩实时荧光PCR中表现为扩增的重复性差、Ct值滞后严重、SNP分型测试时分型图上的终点荧光信号聚簇效果较差并影响等位基因分型结果的判读等。此外，血液中的血红素对荧光信号的强烈阻挡使扩增曲线异常(Sidstedt M,Hedman J,Romsos E L,et al.Inhibition mechanisms of hemoglobin,immunoglobulin G,andwhole blood in digital and real-time PCR[J].Analytical&BioanalyticalChemistry,2018.)。将血液稀释后作为模板用于血液直扩实时荧光PCR可有效解决血红素对荧光信号的阻挡，并且血液中的PCR扩增抑制物被稀释后可降低PCR的抑制。
因此，需要提供一种新的血液稀释剂的添加剂用于血液直扩实时荧光PCR时稀释血液，以解决上述问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供聚蔗糖作为添加剂在血液直扩PCR中的应用，将聚蔗糖添加到血液稀释剂中稀释血液后进行血液直扩实时荧光PCR，以提高PCR的扩增效果。
本发明的第二个目的在于提供一种聚蔗糖在进行血液直扩PCR时的使用方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明首先提供了聚蔗糖在血液直扩PCR中的应用。
进一步，所述血液直扩PCR具体为血液直扩实时荧光PCR。
在本发明具体的实施方式中，所述应用是在血液直扩实时荧光PCR时血液稀释中的应用和/或在利用血液直扩实时荧光PCR进行SNP分型测试时血液稀释中的应用。
进一步，所述聚蔗糖为聚蔗糖40、聚蔗糖70和聚蔗糖400中任意一种或多种的组合；其中，所述聚蔗糖40的平均分子量约为40kDa，所述聚蔗糖70的平均分子量约为70kDa，所述聚蔗糖400的平均分子量约为400kDa；优选的，所述聚蔗糖为聚蔗糖70。
本发明进一步提供了聚蔗糖在进行血液直扩PCR时的使用方法，包括如下步骤：
将所述聚蔗糖添加到血液稀释剂中得到添加聚蔗糖的血液稀释剂；
用所述添加聚蔗糖的血液稀释剂对血液进行稀释，得到稀释后的血液；
以所述稀释后的血液为模板进行血液直扩PCR。
在本发明具体的实施方式中，所述血液直扩PCR具体为血液直扩实时荧光PCR。
在本发明具体的实施方式中，上述使用方法进一步还包括利用血液直扩实时荧光PCR进行SNP分型测试。
进一步，所述聚蔗糖为聚蔗糖40、聚蔗糖70和聚蔗糖400中任意一种或多种的组合；其中，所述聚蔗糖40的平均分子量约为40kDa，所述聚蔗糖70的平均分子量约为70kDa，所述聚蔗糖400的平均分子量约为400kDa。
进一步，所述聚蔗糖在所述添加聚蔗糖的血液稀释剂的含量为20-100mg/mL。
在本发明优选的实施方式中，所述聚蔗糖为聚蔗糖70，所述聚蔗糖70在所述添加聚蔗糖70的血液稀释剂的含量为60mg/mL。
进一步，所述血液稀释剂可以为现有技术中的任意能用于血液直扩实时荧光PCR时血液稀释的血液稀释剂。在本发明具体的实施方式中，所述血液稀释剂可以为下述五种中任意一种，所述血液稀释剂由以下含量的组分组成：①20mM的Tris-Cl(pH＝8.8)、0.2mg/mL的十二烷基硫酸钠(SDS)、体积含量1％的NP40、5mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)、1mg/mL的蛋白酶K、2mM的EDTA；或②0.03M的氢氧化钾、0.2mg/mL的十二烷基硫酸钠(SDS)、体积含量1％的吐温20；或③生理盐水(0.9％氯化钠注射液)；或④去离子水；或⑤20mM的Tris-Cl(pH为8.4)、体积含量0.1％的NP40和15μg/mL的蛋白酶K。
在本发明具体的实施方式中，所述用所述添加聚蔗糖的血液稀释剂对血液进行稀释是用所述添加聚蔗糖的血液稀释剂对血液进行10-20倍稀释，即所述添加聚蔗糖的血液稀释剂与血液的体积比为9:1-19:1。
本发明试验证明利用添加本发明聚蔗糖的血液稀释剂稀释血液后作为模板进行实时荧光PCR，均可降低实时荧光PCR的Ct值和提高终点荧光值，提高了PCR的扩增效果，通过实时荧光PCR进行SNP分型测试时终点荧光信号聚簇效果和分型测试成功率都得到了有效的提升。
本发明的有益效果如下：
本发明首次将聚蔗糖作为一种添加剂添加到血液稀释剂中用于血液直扩实时荧光PCR时稀释血液，通过血液的稀释有效降低了血红素对荧光信号的阻挡和血液中PCR扩增抑制物对PCR的干扰，对实时荧光PCR的Ct值和终点荧光值均有增效效果，大大提高了血液直扩实时荧光PCR的扩增效果，进一步使得在利用实时荧光PCR进行SNP分型测试时终点荧光信号聚簇效果和分型测试成功率都得到了有效的提升。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为用添加20mg/mL聚蔗糖40、60mg/mL聚蔗糖40、100mg/mL聚蔗糖40和不添加聚蔗糖的血液稀释剂对人抗凝血全血稀释后进行实时荧光PCR后的扩增曲线图。
图2为用添加20mg/mL聚蔗糖40、60mg/mL聚蔗糖40、100mg/mL聚蔗糖40、20mg/mL聚蔗糖70、60mg/mL聚蔗糖70、100mg/mL聚蔗糖70、20mg/mL聚蔗糖400、60mg/mL聚蔗糖400、100mg/mL聚蔗糖400和不添加聚蔗糖的血液稀释剂对人抗凝血全血稀释后进行实时荧光PCR后的Ct值和终点荧光值的对比图。
图3为用添加60mg/mL聚蔗糖70和不添加聚蔗糖的血液稀释剂对人抗凝血全血进行10倍稀释后进行实时荧光PCR的扩增曲线图。
图4为用添加60mg/mL聚蔗糖70和不添加60mg/mL聚蔗糖70的不同血液稀释剂对人抗凝血全血稀释后进行实时荧光PCR后的Ct值和终点荧光值的对比图。
图5为用添加60mg/mL聚蔗糖70和不添加聚蔗糖的血液稀释剂对人抗凝血全血稀释后进行实时荧光法SNP分型的效果图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下述实施例中聚蔗糖40的平均分子量约为40kDa，聚蔗糖70的平均分子量约为70kDa，聚蔗糖400的平均分子量约为400kDa。
实施例1用添加不同浓度、不同平均分子量的聚蔗糖的血液稀释剂稀释人抗凝血全血后作模板进行实时荧光PCR扩增人基因组DNA的试验
1、添加聚蔗糖的血液稀释剂
本实施例中用到的血液稀释剂及各组分在血液稀释剂的含量为：Tris-Cl(pH为8.4，20mM)、NP40(体积含量0.1％)和蛋白酶K(15μg/mL)。在此血液稀释剂的基础上添加了聚蔗糖，得到添加聚蔗糖的血液稀释剂。
具体为：将聚蔗糖40、聚蔗糖70和聚蔗糖400分别添加到上述血液稀释剂，得到添加相应聚蔗糖的血液稀释剂，使得聚蔗糖40在添加聚蔗糖40的血液稀释剂的含量分别为20mg/mL、60mg/mL和100mg/mL(下述分别简称为添加20mg/mL聚蔗糖40、60mg/mL聚蔗糖40和100mg/mL聚蔗糖40的血液稀释剂)，聚蔗糖70在添加聚蔗糖70的血液稀释剂的含量分别为20mg/mL、60mg/mL和100mg/mL(下述分别简称为添加20mg/mL聚蔗糖70、60mg/mL聚蔗糖70和100mg/mL聚蔗糖70的血液稀释剂)，使得聚蔗糖400在添加聚蔗糖400的血液稀释剂的含量分别为20mg/mL、60mg/mL和100mg/mL(下述分别简称为添加20mg/mL聚蔗糖400、60mg/mL聚蔗糖400和100mg/mL聚蔗糖400的血液稀释剂)，并以不添加聚蔗糖作为对照。
2、血液直扩实时荧光PCR
在1.5mL EP管中加入38μL添加聚蔗糖或不添加聚蔗糖的血液稀释剂，再加入2μL人抗凝血全血进行20倍稀释，震荡混匀，得到稀释后的血液样本。取5μL稀释后的血液样本加入到实时荧光PCR体系中作为模板进行实时荧光PCR。实时荧光PCR体系中包含：5U TaqDNA聚合酶、20mM Tris-Cl(pH＝8.5)、50mM KCl、3.5mM MgCl2、0.15mM dNTPs、500nM用于检测人基因组位点的上游引物(5’-GGCTCAGCAACTTGTGAAGACCA-3’，如SEQ ID NO.1所示)、500nM下游引物(5’-GGCATTGTCCCGTGAACATCTG-3’，如SEQ ID NO.2所示)、250nM FAM标记的检测探针(5’FAM-TCCCACACTGATACTGCAGGCTGGGT-3’BHQ1，如SEQ ID NO.3所示)以及5μL稀释后的血液样本。实时荧光PCR体系的总体积为25μL。采用两步法进行PCR反应：预变性95℃5分钟；95℃15秒，60℃45秒，45个循环。最终得到添加20mg/mL聚蔗糖40、或60mg/mL聚蔗糖40、或100mg/mL聚蔗糖40、或不添加聚蔗糖的血液稀释剂对人抗凝血全血稀释后进行实时荧光PCR后的扩增曲线图。
图1给出了添加20mg/mL聚蔗糖40、或60mg/mL聚蔗糖40、或100mg/mL聚蔗糖40、或不添加聚蔗糖的血液稀释剂对人抗凝血全血稀释后进行实时荧光PCR后的扩增曲线图，结果显示与不添加聚蔗糖的对照相比，用添加不同浓度的聚蔗糖40的血液稀释剂稀释后的血液样本作模板进行实时荧光PCR的Ct值均更小、终点荧光值(所述终点荧光值为基线设定后的扩增曲线的终点荧光值)均更高。
图2给出了添加20mg/mL聚蔗糖40、60mg/mL聚蔗糖40、100mg/mL聚蔗糖40、20mg/mL聚蔗糖70、60mg/mL聚蔗糖70、100mg/mL聚蔗糖70、20mg/mL聚蔗糖400、60mg/mL聚蔗糖400、100mg/mL聚蔗糖400和不添加聚蔗糖的血液稀释剂对人抗凝血全血稀释后进行实时荧光PCR的Ct值和终点荧光值的对比统计图，结果显示添加不同浓度、不同平均分子量的聚蔗糖的血液稀释剂对血液样本稀释后进行实时荧光PCR对实时荧光PCR的Ct值和终点荧光值均有增效效果。综合Ct值和扩增曲线终点荧光值的提升效果，添加60mg/mL聚蔗糖70的血液稀释剂更优，即聚蔗糖70在添加聚蔗糖70的血液稀释剂的含量为60mg/mL时对人抗凝血全血稀释后进行实时荧光PCR后对Ct值和扩增曲线终点荧光值的提升效果更优。
在本实施例中也给出了另一个血液样本稀释比例的血液直扩实时荧光PCR结果，具体方法为：在1.5mL EP管中加入18μL添加60mg/mL聚蔗糖70或不添加聚蔗糖的血液稀释剂，再加入2μL人抗凝血全血进行10倍稀释。取5μL稀释后的血液样本加入到实时荧光PCR体系中作为模板进行实时荧光PCR。实时荧光PCR体系中包含：5U Taq DNA聚合酶、20mM Tris-Cl(pH＝8.5)、50mM KCl、3.5mM MgCl2、0.15mM dNTPs、500nM用于检测人基因组位点的上游引物(5’-GGCTCAGCAACTTGTGAAGACCA-3’，如SEQ ID NO.1所示)、500nM下游引物(5’-GGCATTGTCCCGTGAACATCTG-3’，如SEQ ID NO.2所示)、250nM FAM标记的检测探针(5’FAM-TCCCACACTGATACTGCAGGCTGGGT-3’BHQ1，如SEQ ID NO.3所示)以及5μL稀释后的血液样本。实时荧光PCR体系的总体积为25μL。采用两步法进行PCR反应：预变性95℃5分钟；95℃15秒，60℃45秒，45个循环。最终的到扩增曲线图如图3所示，结果显示，与不添加聚蔗糖的对照相比，用添加60mg/mL聚蔗糖70的血液稀释剂对人抗凝血全血进行10倍稀释后的血液样本作模板进行实时荧光PCR的Ct值更小、终点荧光值均更高。
实施例2用添加聚蔗糖70的不同血液稀释剂稀释人抗凝血全血后作模板进行实时荧光PCR扩增人基因组DNA的试验
1、添加聚蔗糖70的血液稀释剂
本实施例中用到的几组血液稀释剂的组分及各组分在血液稀释剂的含量分别为：
①Tris-Cl(pH＝8.8，20mM)、十二烷基硫酸钠(SDS，0.2mg/mL)、NP40(体积含量1％)、牛血清白蛋白(BSA，5mg/mL)、蛋白酶K(1mg/mL)、EDTA(2mM)；
②氢氧化钾(0.03M)、十二烷基硫酸钠(SDS，0.2mg/mL)、吐温20(体积含量1％)；
③生理盐水(0.9％氯化钠注射液)；
④去离子水。
在上述血液稀释剂中添加聚蔗糖70，分别得到添加聚蔗糖70的血液稀释剂①、②、③和④，其中，聚蔗糖70在添加聚蔗糖70的血液稀释剂①、②、③和④的含量均为60mg/mL(下述简称为添加60mg/mL聚蔗糖70的血液稀释剂①、②、③和④)，分别以不添加60mg/mL聚蔗糖70的血液稀释剂①、②、③和④作对照。
2、血液直扩实时荧光PCR
血液直扩实时荧光PCR的方法与实施例1中2、血液直扩实时荧光PCR的方法相同。
最终得到添加和不添加60mg/mL聚蔗糖70的不同血液稀释剂稀释人抗凝血全血后进行实时荧光PCR的扩增曲线图，并对实时荧光PCR的Ct值和终点荧光值进行统计。
图4为添加和不添加60mg/mL聚蔗糖70的血液稀释剂①、②、③和④稀释人抗凝血全血后进行实时荧光PCR的Ct值和终点荧光值的对比统计图，结果显示添加60mg/mL聚蔗糖70的血液稀释剂①、②、③和④分别相对于不添加60mg/mL聚蔗糖70的血液稀释剂①、②、③和④稀释人抗凝血全血后进行实时荧光PCR均对实时荧光PCR有降低Ct值和提高终点荧光值的效果。
实施例3添加聚蔗糖的血液稀释剂在SNP分型中的应用
从43个不同人分别抽取抗凝血全血得到43个不同人的人抗凝血全血，每个人抗凝血全血均用实施例1中添加60mg/mL聚蔗糖70的血液稀释剂(成分与实施例1中用到的血液稀释剂相同)进行稀释得到43个的稀释后的血液样本，然后将稀释后的血液样本作模板进行MTHFR 677C/T位点的SNP分型测试，以不添加聚蔗糖的血液稀释剂作为对照。
具体方法为：
在1.5mL EP管中加入38μL添加60mg/mL聚蔗糖70的血液稀释剂和不添加聚蔗糖的血液稀释剂，再加入2μL人抗凝血全血进行20倍稀释，震荡混匀，得到稀释后的血液样本。取5μL稀释后的血液样本加入到实时荧光PCR体系中作为模板进行实时荧光PCR。实时荧光PCR体系中包含：5U Taq DNA聚合酶、20mM Tris-Cl(PH＝8.5)、3.5mM MgCl2、50mM KCl、0.15mMdNTPs、500nM用于检测人基因组位点的上游引物(5’-CAAAGAAAAGCTGCGTGATGAT-3’，如SEQID NO.4所示)、500nM下游引物(5’-GACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA-3’，如SEQ ID NO.5所示)、VIC标记的检测探针250nM(5’VIC-AAATCGACTCCCGC-3’MGB，如SEQ ID NO.6所示)、250nMFAM标记的检测探针(5’FAM-AAATCGGCTCCCGCAGA-3’MGB，如SEQ ID NO.7所示)以及5μL稀释后的血液样本。实时荧光PCR体系的总体积为25μL。采用两步法进行PCR反应：预变性95℃5分钟；95℃15秒，60℃45秒，45个循环。最终得到实时荧光法SNP分型的效果图。
图5为添加60mg/mL聚蔗糖70和不添加聚蔗糖的血液稀释剂对人抗凝血全血稀释后进行实时荧光法SNP分型的效果图，结果显示不添加聚蔗糖的血液稀释剂对人抗凝血全血稀释后进行实时荧光法SNP分型的分型测试成功率为38/43，添加60mg/mL聚蔗糖70的血液稀释剂对人抗凝血全血稀释后进行实时荧光法SNP分型的分型测试成功率为43/43，并且添加60mg/mL聚蔗糖70的血液稀释剂比不添加聚蔗糖的血液稀释剂对人抗凝血全血稀释后进行实时荧光法SNP分型的荧光聚簇效果更好。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京全式金生物技术有限公司
<120> 聚蔗糖在血液直扩PCR中的应用及其使用方法
<130> JLP21I1430
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggctcagcaa cttgtgaaga cca 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcattgtcc cgtgaacatc tg 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcccacactg atactgcagg ctgggt 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caaagaaaag ctgcgtgatg at 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacctgaagc acttgaagga gaa 23
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaatcgactc ccgc 14
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaatcggctc ccgcaga 17
Claims (10)
1.聚蔗糖在血液直扩PCR中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血液直扩PCR为血液直扩实时荧光PCR。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是在血液直扩实时荧光PCR时血液稀释中的应用和/或在利用血液直扩实时荧光PCR进行SNP分型测试时血液稀释中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚蔗糖为聚蔗糖40、聚蔗糖70和聚蔗糖400中任意一种或多种的组合。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚蔗糖为聚蔗糖70。
6.聚蔗糖在进行血液直扩PCR时的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
将聚蔗糖添加到血液稀释剂中，得到添加聚蔗糖的血液稀释剂；
用所述添加聚蔗糖的血液稀释剂对血液进行稀释，得到稀释后的血液；
以所述稀释后的血液为模板进行血液直扩PCR。
7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述聚蔗糖为聚蔗糖40、聚蔗糖70和聚蔗糖400中任意一种或多种的组合；优选的，所述聚蔗糖在所述添加聚蔗糖的血液稀释剂的含量为20-100mg/mL。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述聚蔗糖为聚蔗糖70，所述聚蔗糖70在所述添加聚蔗糖70的血液稀释剂的含量为60mg/mL。
9.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述用所述添加聚蔗糖的血液稀释剂对血液进行稀释是用所述添加聚蔗糖的血液稀释剂对血液进行10-20倍稀释。
10.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述血液直扩PCR为血液直扩实时荧光PCR；
优选的，所述使用方法进一步还包括利用血液直扩实时荧光PCR进行SNP分型测试。
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2021
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