CN116064745A - 一种5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种等温扩增方法，利用Taq酶的5’瓣状核酸内切酶的特性，释放出互补配对的适配子；适配子之间互补扩增补齐缺口；全长适配子解链后的单链可识别体系中环装质粒目的区域，在等温扩增酶的作用下进行等温扩增；本方法包括引物组、适配子序列、探针序列、外源环状质粒；所用酶包括taq酶、Bst酶等，本发明优点在于：减少引物对，降低设计难度；2.特异性高，假阳性率低；3.设计简单，可规模化检测；方便拓展应用范畴。

Description

一种5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法
技术领域
本发明涉及核酸等温扩增领域，具体涉及利用Taq酶的5’瓣状核酸内切酶等温扩增领域。
背景技术
近年来分子生物学技术有了迅猛的发展，为了适应不同环境、不同样本及不同目的的检测需求，多种等温扩增方法应运而生。其中，环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)和交叉引物等温扩增技术(Crossing PrimingAmplification，CPA)是其中应用最广的两种方案。LAMP扩增流程如图1所示；CAP具体扩增流程如图2所示。
目前等温扩增技术存在两个问题：1.引物设计难：上述方法需要设计至少3对引物才能完成扩增，考虑到引物的特异性、长度、Tm值等因素，对上述等温扩增方法引物的设计就变得比较难。另外由于DNA重复序列、GC含量高区域等因素的存在，不是所有的位点都可以采用上述两种方案进行扩增。2.假阳性高：由于等温扩增极强的敏感性，反应环境中若是存在污染或引物有非特异的扩增，极易产生假阳性结果，对检测造成误判。
发明内容
发明目的：提供一种设计简单、特异性灵敏度高、假阳性低的等温扩增方法，以解决现有技术引物设计复杂、假阳性率高的问题。
技术方案：一种等温扩增方法，利用Taq酶的5’瓣状核酸内切酶(FEN1，flapendonuclease1)的特性，释放出互补配对的适配子。适配子之间互补扩增补齐缺口。全长适配子解链后的单链可识别体系中环装质粒目的区域，在等温扩增酶的作用下进行等温扩增。
本方法包括引物组、适配子序列、探针序列、外源环状质粒；所用酶包括taq酶、Bst酶等。
整个方法步骤如下：
步骤A设计引物集合
针对目的基因设计引物，引物包含两对，分别为A/B和C/D。
A/B为外侧双向引物，引物长度为10-60nt，最佳为18-24nt，用于锚定目的基因。扩增子长度不限，以100bp-1Kb为佳。A/B结构可以无特殊修饰，也可以增加部分修饰以达到提高特异性、稳定引物结构的目的，例如硫代修饰等。A/B引物序列与外源质粒无识别区域。
C/D为内侧双向引物，一方面对目的基因进行进一步锚定以提高特异性，另一方面，C/D引物5’端分别为探针PC/PD序列，用于后续释放探针识别外源质粒；3’端为目的基因锚定引物C’和D’，用于对目的基因的识别和退火。C/D引物在实际反应中可以是一对，也可以是多对。C/D结构图示如图3所示。
C’/D’识别区域位于A/B引物对的扩增范围内，引物长度为10-60nt，最佳为18-24nt；
C’/D’引物序列与外源质粒无识别区域，特别是3’端无识别区域；
C’/D’可以无特殊修饰，也可以增加部分修饰以达到提高特异性、稳定引物结构的目的，例如硫代修饰等；
C’/D’可以3’端1-5个碱基与目的基因不同，达到阻断延伸的作用，最佳为2-3个；
C’/D’可以3’端加入双脱氧胞嘧啶修饰，达到阻断延伸的作用；
探针PC包括两部分序列，外源质粒识别序列C1和适配子序列1；
探针PD包括两部分序列，外源质粒识别序列D1和适配子序列2；
C1和D1为外源质粒识别序列，识别外源质粒特异性序列，根据外源质粒的不同序列有所不同，外源质粒识别序列长度为10-60nt，更佳为16-40nt，最佳为18-24nt；
适配子序列1和适配子序列2为反向互补序列，其序列在目的基因及外源质粒上没有识别区域，适配子序列长度为10-60nt，更佳为16-40nt，最佳为18-24nt。
外源质粒选择：选择适合的环状质粒作为外源质粒，用于等温扩增。
步骤B目的基因识别及探针置换、延伸，形成外源质粒识别结构
获得需要检测的样本DNA/RNA(后简称目的基因)，DNA可直接用于后续检测，RNA需通过常见的反转录步骤获得对应cDNA后用于后续检测。本领域技术人员对此步骤非常熟悉，在此不做约束。
A/B引物对识别目的基因位点，并结合在目的基因上，在taq酶的作用下开始扩增。此处的酶可以是taq酶，也可以是其他具有5’瓣状核酸内切酶活性的其他DNA聚合酶。
C/D引物对的3’端C’、D’序列分别识别目的基因位点，由于5’瓣状核酸内切酶活性，C/D引物的PC/PD序列分别被切割并释放出来。
PC/PD序列3’端互补，在taq酶作用下延伸补平，形成双链DNA结构PCPD。此处的酶可以是taq酶，也可以是其他具有DNA聚合酶活性的其他酶。
步骤C探针识别及等温扩增
双链DNA结构PCPD双链变性恢复单链PC/PD。此处变性可以采用高温后冷却的方式，也可以使用变性试剂，例如氢氧化钠缓冲液等。
PC/PD分别退火识别并结合外源环状质粒特异性位点，此处识别位点可以为一个，也可以为多个。
开始环状等温扩增，此处的酶可以是Bst DNA Polymerase，也可以是其他具有链置换酶活性的DNA聚合酶。
鉴定扩增结果，可以通过荧光、浊度仪、qPCR仪、电泳等方式进行鉴定。
有益效果：本发明通过5’瓣状核酸内切酶的内切酶作用，探针引物上设计的外源DNA序列以及外源质粒，实现由目的检测片段至环装扩增的转换，达到指数级扩增的检测要求。同时，由于外源DNA和外源质粒的存在，只需对目的基因设计两对巢式引物，即可达到特异性、灵敏度高的检测需求，无需设计繁琐的多引物对扩增。另外通过对外源DNA的结构设计，减少其非特异性扩增，达到降低假阳性的目的。具体效果描述如下：
1、减少引物对，降低设计难度：LAMP方案在设计引物时需要设计3对引物，还要考虑3对引物之间的位置、Tm值以及与茎环结构的适配性，流程比较复杂，对设计经验要求较高。本发明则无需设计多对引物，只要针对目的基因上下游分别设计两对或两对以上类似巢式扩增引物组即可。引物组的目的不是像LAMP或CPA的引物一样完成置换及形成哑铃状结构，基本等同于常规的扩增引物。只需达到以下2点要求即可：(1)特异性结合目的基因序列；(2)序列和外源质粒DNA序列无错配，不能形成稳定的扩增结构，特别是3’端的几个碱基。本发明中的引物组，主要起到对目的基因定位以及携带探针的作用。引物组中，外侧双向引物针对目的基因上下游特异性位点进行锚定，在DNA聚合酶作用下开始扩增。而内侧引物分别锚定双链DNA的两条链，分别位于A、B引物的3’下游。内侧引物3’端与目的基因特异性结合，5’端携带探针序列。后续扩增中，只有引物组都与目的基因结合，探针序列才会被释放出来；因此特异性较常规qPCR会更高。另外由于内侧引物引入探针序列，为后续内源信号-外源信号的环化提供介质。
2、特异性高，假阳性率低：通过taq酶的5’瓣状核酸内切酶作用，将内引物对的探针部分与目的基因结合部分解离，释放的探针部分可特异性结合外源质粒，达到信号的转换。另外，由于探针部分的特殊设计，酶切后游离的单链探针未经过扩增延长，不能与外源质粒结合。只有两个不同的单链探针部分互补结合并延伸后，才能获得与外源质粒识别的序列。这一设计，避免了单链探针对外源质粒的非特异性识别，保证了反应的特异性，减少假阳性的概率。
3、设计简单，可规模化检测：本发明通过外源质粒的引入，减少了扩增引物设计的难度及复杂性。针对不同的检测位点，只要针对性设计一对扩增引物、一对识别引物，即可完成内源信号-外源信号的转化，达到位点检测的目的。设计简便，可形成固定系统流程，方便规模化处理。
4.方便拓展应用范畴：基于5’瓣状核酸内切酶介导的外源质粒识别等温扩增方案，可根据分析目的的不同设计针对性引物，满足不同的定性、定量检测需求。
附图说明
图1 LAMP方法扩增流程图；
图2 CAP方法扩增流程图
图3 C/D结构示意图
图4本发明方案流程图
图5白色念珠菌扩增电泳图
图6 SNP扩增电泳图
图7甲型流感病毒扩增荧光信号图
具体实施方式
实施例1一种白色念珠菌的检测方法
1.针对白色念珠菌特异性区域，设计外侧引物对，引物序列为：
白色念珠菌OF GATGAAGAACGCAGCGAAAT
白色念珠菌OR TAAGTTCAGCGGGTAGTCCT
设计内侧引物对，内侧引物对可以设为1对，也可以根据位点特异性设置多对，本方案设计1对，引物序列为：
Figure BDA0003741365920000041
其中，IF和IR的下划线部分反向互补。IF5’斜体下划线标记序列与IR5’斜体下划线标记序列为识别探针。IF和IR的3’端序列为目的基因的结合序列，其中3’端两个碱基与目的序列不互补，以阻止序列扩增。
2.样本抽提：
对4个待测样本A/B/C/D，按照常规方法对样本DNA进行抽提，可以使用试剂盒，也可以采用经典抽提法，方法不限，以获得样本DNA为目的。
3.扩增：
①按下表配制taq酶反应体系：
试剂 终浓度/体积
10X PCR Buffer(with Mg2+) 1x
dNTP(2.5mM each) 0.2mM each
Taq DNA Polymerase(5U/μl) 1.25U
无核酸水 Add to 20μl
引物混合物(10μM each) 0.8μM
模板DNA 10pg-1μg
总体积 20μl
65℃10-30min。
②加入外源质粒，95℃5min，60℃5min
③加入以下试剂
试剂 终浓度/体积μl
步骤②产物 20μl
Bst 2.0DNA Polymerase(10U/μl) 1μl
10×Bst Buffer 5μl
100mM MgSO4 3μl
dNTP Mixture(10mM each) 6μl
ddH2O 补齐至50μl
65℃ 30～60min；85℃ 5min失活。
4.鉴定：
琼脂糖电泳检测：
其中，NC代表阴性对照，M代表DNA ladder，A/B/C/D代表四个样本
根据检测结果，如图5所示，判定A样本为弱阳性，B、C、D为强阳性，与qPCR检测方法结果一致。
实施例2一种SNP的检测方法
1.针对rs1801133位点区域，设计外侧和内侧引物对，内侧引物对可以设为1对，也可以
根据位点特异性设置多对，本方案设计1对，引物序列为：
Figure BDA0003741365920000051
Figure BDA0003741365920000061
其中，IF和IR的下划线部分反向互补。IF5’斜体下划线标记序列及IR5’斜体下划线标记序列为识别探针。IF和IR的3’端序列为目的基因的结合序列。
2.样本抽提：
按照常规方法对样本DNA进行抽提，可以使用试剂盒，也可以采用经典抽提法，方法不限，以获得样本DNA为目的。
样本如下：
编号 rs1801133一代测序突变信息
A AA
B GA
C GG
3.扩增：
①按下表配制taq酶反应体系：
试剂 终浓度/体积
10X PCR Buffer(with Mg2+) 1x
dNTP(2.5mM each) 0.2mM each
Taq DNA Polymerase(5U/μl) 1.25U
无核酸水 Add to 20μl
引物混合物(10μM each) 0.8μM
模板DNA 10pg-1μg
总体积 20μl
②65℃10-30min。
③加入外源质粒，95℃5min，60℃5min
④加入以下试剂
Figure BDA0003741365920000062
Figure BDA0003741365920000071
⑤65℃ 30～60min；85℃ 5min失活。
4.鉴定：
琼脂糖电泳检测如图6所示；从结果看，A为突变纯合子AA，B为杂合子GA，C为野生纯合子GG，与一代测序结果一致。
实施例3一种甲型流感病毒的检测方法
1.针对甲型流感病毒(以下简称甲流)区域，设计外侧和内侧引物对，内侧引物对可以设为1对，也可以根据位点特异性设置多对，本方案设计1对，引物序列为：
Figure BDA0003741365920000072
其中，IF和IR的下划线部分反向互补。IF5’斜体下划线标记序列及IR5’斜体下划线标记序列为识别探针。IF和IR的3’端序列为目的基因的结合序列，其中3’端两个碱基与目的序列不互补，以阻止序列扩增。
2.样本抽提：
Sample1-4共4个样本，按照常规方法对样本RNA进行抽提，可以使用试剂盒，也可以采用经典抽提法，方法不限，以获得样本RNA为目的。
同时送测mNGS作为对照。
3.扩增：
①反转录
Figure BDA0003741365920000073
Figure BDA0003741365920000081
50℃ 30min，94℃2min，置于冰上。
②按下表配制taq酶反应体系：
试剂 终浓度/体积
10X PCR Buffer(with Mg2+) 1x
dNTP(2.5mM each) 0.2mM each
Taq DNA Polymerase(5U/μl) 1.25U
无核酸水 Add to 20μl
引物混合物(10μM each) 0.8μM
步骤①产物 10μl
总体积 20μl
65℃ 10-30min。
③加入外源质粒，95℃ 5min，60℃ 5min④加入以下试剂
试剂 终浓度/体积μl
步骤②产物 20μl
Bst 2.0 DNA Polymerase(10U/μl) 1μl
10×Bst Buffer 5μl
100mM MgSO4 3μl
dNTP Mixture(10mM each) 6μl
SYBR Green I 6μl
ddH2O 补齐至50μl
置于qPCR仪中，设置反应条件如下：65℃ 30min；85℃ 5min失活。
全程收集荧光信号。
4.鉴定：
查看结果如图7所示，从结果看，sample 4和1中检出甲型流感病毒，sample 2和3未检出，和mNGS结果一致。

Claims (14)

1.一种5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，利用Taq酶的5’瓣状核酸内切酶的特性，释放出互补配对的适配子；适配子之间互补扩增补齐缺口；全长适配子解链后的单链可识别体系中环装质粒目的区域，在等温扩增酶的作用下进行等温扩增；具体步骤如下：
步骤A：设计引物集合：
a.针对目的基因设计引物，引物包含两对，分别为A/B和C/D；
b.所述的A/B为外侧双向引物，引物长度为10-60nt，A/B引物序列与外源质粒无识别区域；扩增子长度无限定；
c.所述的C/D为内侧双向引物，C/D引物5’端分别为探针PC/PD序列；3’端为目的基因锚定引物C’和D’；C/D引物为大于等于1对；
所述的探针PC包括两部分序列，外源质粒识别序列C1和适配子序列1；
所述的探针PD包括两部分序列，外源质粒识别序列D1和适配子序列2；
所述的C1和D1为外源质粒识别序列，识别外源质粒特异性序列，外源质粒识别序列长度为10-60nt；
适配子序列1和适配子序列2为反向互补序列，其序列在目的基因及外源质粒上没有识别区域，序列长度为10-60nt；
d.外源质粒选择：选择适合的环状质粒作为外源质粒，用于等温扩增
步骤B目的基因识别及探针置换、延伸，形成外源质粒识别结构
a.获得需要检测的样本DNA/RNA用于后续检测；
b.A/B引物对识别目的基因位点，并结合在目的基因上，在taq酶的作用下开始扩增，所述的taq酶为具有5’瓣状核酸内切酶活性的DNA聚合酶。
c.C/D引物对的3’端C’、D’序列分别识别目的基因位点，C/D引物的PC/PD序列分别被切割并释放出来。
d.PC/PD序列3’端互补，在taq酶作用下延伸补平，形成双链DNA结构PCPD；
步骤C探针识别及等温扩增
a.双链DNA结构PCPD双链变性恢复单链PC/PD；
b.PC/PD分别退火识别并结合外源环状质粒特异性位点；
c.环状等温扩增；
d.鉴定扩增结果。
2.根据权利要求1所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的A/B引物长度为18-24nt，所述的扩增子长度为100bp-1Kb。
3.根据权利要求1所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的A/B结构增加硫代修饰。
4.根据权利要求1所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的C’/D’识别区域位于A/B引物对的扩增范围内，引物长度为10-60nt。
5.根据权利要求4所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的C’/D引物长度为为18-24nt。
6.根据权利要求1所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的C’/D’引物序列与外源质粒无识别区域。
7.根据权利要求1所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的C’/D’增加硫代修饰以达到提高特异性、稳定引物结构的目的。
8.根据权利要求1所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的C’/D’3’端1-5个碱基与目的基因不同，达到阻断延伸的作用。
9.根据权利要求8所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的C’/D’可以3’端2-3个碱基与目的基因不同。
10.根据权利要求1所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的C’/D’3’端加入双脱氧胞嘧啶修饰。
11.根据权利要求1所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的外源质粒识别序列长度为16-40nt。
12.根据权利要求11所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的外源质粒识别序列长度为18-24nt。
13.根据权利要求1所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的适配子序列1和适配子序列2序列长度为16-40nt。
14.根据权利要求13所述的5’瓣状核酸酶介导的等温扩增方法，其特征在于，所述的适配子序列1和适配子序列2序列长度为18-24nt。
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