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Abstract

本发明涉及一种菊花B病毒的RPA检测方法，包括如下步骤：(1)样品处理：从待测植物样品中提取总RNA，然后将其反转录成cDNA；(2)RPA扩增：以cDNA为模板，使用菊花B病毒检测的RPA特异性引物对进行RPA扩增；(3)结果判读：凝胶电泳检测RPA扩增结果，根据电泳结果判读检测的植物样品是否感染菊花B病毒。与其他核酸等温扩增技术相比，本发明的方法仅需一对引物，不需要PCR仪，简化了检测流程，缩短了检测时间，适合于病毒的快速诊断和现场检测。

Description

一种菊花B病毒的RPA检测方法
技术领域
本发明涉及园林植物分子生物学领域，特别是涉及一种菊花B病毒的RPA检测方法。
背景技术
菊花B病毒在菊科植物中普遍存在，目前其检测技术主要有血清学检测法、PCR技术、多重PCR技术、环介导等温扩增技术等。现有技术需要PCR仪器，且反应时间很长，需要付出大量精力和时间，成本也较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、反应时间短的菊花B病毒的RPA检测方法。
一种菊花B病毒检测的RPA特异性引物对，其特征在于：核苷酸序列如序列表中SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
本发明所述的菊花B病毒检测的RPA特异性引物对在检测或辅助检测菊花B病毒，或制备检测或辅助检测菊花B病毒的产品中的应用。
一种用于菊花B病毒检测的试剂盒，包括本发明所述的菊花B病毒检测的RPA特异性引物对。
本发明所述的用于菊花B病毒检测的试剂盒，还包括RPA恒温扩增试剂、植物总RNA提取试剂和反转录试剂。
本发明所述的用于菊花B病毒检测的试剂盒在检测或辅助检测菊花B病毒，或制备检测或辅助检测菊花B病毒的产品中的应用。
一种菊花B病毒的RPA检测方法，包括如下步骤：
(1)样品处理：从待测植物样品中提取总RNA，然后将其反转录成cDNA；
(2)RPA扩增：再以cDNA为模板与本发明所述的引物对进行RPA扩增；
(3)结果判读：根据RPA扩增的结果判断待测植物样品是否感染菊花B病毒；
检测标准为：
若RPA扩增得到的RPA扩增产物含有大小为158bp的片段，则检测的植物样品感染菊花B病毒，若RPA扩增产物不含有大小为158bp的片段，则检测的植物样品未感染菊花B病毒。
本发明所述的菊花B病毒的RPA检测方法，其中，所述RPA扩增的反应体系及条件如下：
向已装有冻干酶粉的PCR试管中依次加入干粉溶解缓冲液29.5μL，ddH2O 11.2μL，权利要求1中所述的引物对中的上下游引物各2.4μL，引物的浓度为10μmol/L，模板cDNA 2μL，用移液枪混匀后，加入浓度为280mmol/L的醋酸镁2.5μL，反应体系总体积50μL，离心，于40℃金属浴40min；反应结束后，加入50μL体积比为1：1的氯仿/苯酚溶液，充分混匀，12000rpm离心5min，取5μL上清液进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳。
本发明菊花B病毒的RPA检测方法与现有技术不同之处在于：
本发明建立了菊花B病毒的RPA检测方法，与PCR技术相比，该技术操作简便，灵敏度高，不需PCR仪，在水浴锅、金属浴等恒温装置内均可完成扩增，反应温度在35℃～40℃内即可扩增到清晰的目的条带。与其他核酸等温扩增技术相比，该方法仅需一对引物，不需要PCR仪，简化了检测流程，缩短了检测时间，适合于病毒的快速诊断和现场检测。
下面结合附图对本发明的菊花B病毒的RPA检测方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明RPA扩增体系获得的电泳图；
图2为本发明RPA扩增体系的反应温度优化结果图；
图3为本发明中单一PCR与RPA检测的灵敏度比较图。
具体实施方式
1、实验材料：
CVB阳性对照为经PCR鉴定为阳性的菊花叶片。
2、引物设计
根据NCBI数据库下载的CVB的CP蛋白的基因序列，利用clustal X软件进行序列多重比对，选择保守区域使用Primer 5.0软件设计多对用于RPA扩增的特异性引物序列。引物设计要求如下：引物长度30～35bp，GC含量40％～60％，尽量避免引物二聚体、发卡环等结构，扩增产物的大小为150～300bp。具体的引物序列、产物大小见下表：
3、RNA提取及反转录
取0.1g叶片使用Takara公司的Mini BEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒提取植物总RNA，取1μg的总RNA采用Promega公司的Reverse Transcription System反转录试剂盒进行反转录，最终体积为100μL。
4、RPA扩增引物的筛选
50μL的RPA扩增体系：向已装有冻干酶粉的PCR试管中依次加入干粉溶解缓冲液(rehydration buffer)29.5μL，ddH2O 11.2μL，上下游引物(10μmol/L)各2.4μL，模板cDNA2μL，用移液枪混匀后，加入醋酸镁(280mmol/L)2.5μL，离心，于40℃金属浴40min。反应结束后，加入50μL氯仿/苯酚(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心5min，取5μL上清液进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1。所设计的CVB的RPA引物扩增到与预期条带大小相符的片段。说明，所设计的引物特异性良好，最终选用CVB-R1-F/R为CVB RPA扩增的引物。
5、RPA扩增温度的优化
在引物确定的基础上，对病毒的RPA反应温度进行优化，结果如图2。在CVB的RPA反应体系中，当反应温度为25℃时，条带亮度较弱，随反应温度的升高，条带亮度逐渐增加，当反应温度达到为35℃、40℃时，条带清晰，其亮度无明显差距。说明反应温度在35℃～40℃内均可有效进行RPA扩增，选用40℃为反应温度进行后续试验。
6、RPA扩增体系
(1)根据RPA引物筛选、温度优化，最终确定CVB的RPA反应体系、反应条件如下：
向装有冻干酶粉的PCR试管中加入以下试剂(50μL)：
混匀，向PCR试管中滴加2.5μL醋酸镁MgOAc溶液(280mmol/L)，于40℃金属浴40min。待反应完成，向RPA扩增产物中加入等体积的苯酚：氯仿溶液(体积比1:1)，混匀，于12000rpm离心5min，取5μL上清液，使用2.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
7、单一PCR与RPA检测的灵敏度比较
将CVB的cDNA进行10倍梯度稀释，依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，以稀释的cDNA为模板，按上述RPA扩增条件进行灵敏度试验。为与普通PCR技术进行比较，本研究同时采用普通PCR进行灵敏度试验。20μL PCR扩增体系：2×Taq Plus Master Mix10μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，模板cDNA 1μL，ddH2O 7μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，循环35次；72℃再延伸10min。反应产物经2.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
结果如图3，当cDNA稀释倍数为105时，CVB的RPA与PCR检测方法均可检测到158bp的目的条带，当cDNA稀释倍数为106时，病毒的RPA方法仍可以检测到目的条带，但PCR方法均未能检测到目的条带。试验结果表明，CVB的RPA检测方法的灵敏度是单一PCR的10倍，更适合于微量病毒的检测。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 北京农业生物技术研究中心
<120> 一种菊花B病毒的RPA检测方法
<130> 2021-8
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gggacggtgg tgcgattatt gctgacgacg 30
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
tggatgaaaa cccatggcag accaatcaga agg 33

Claims (7)

1.一种菊花B病毒检测的RPA特异性引物对，其特征在于：核苷酸序列如序列表中SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的菊花B病毒检测的RPA特异性引物对在检测或辅助检测菊花B病毒，或制备检测或辅助检测菊花B病毒的产品中的应用。
3.一种用于菊花B病毒检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的菊花B病毒检测的RPA特异性引物对。
4.根据权利要求3所述的用于菊花B病毒检测的试剂盒，其特征在于：还包括RPA恒温扩增试剂、植物总RNA提取试剂和反转录试剂。
5.权利要求3或4所述的用于菊花B病毒检测的试剂盒在检测或辅助检测菊花B病毒，或制备检测或辅助检测菊花B病毒的产品中的应用。
6.一种菊花B病毒的RPA检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)样品处理：从待测植物样品中提取总RNA，然后将其反转录成cDNA；
(2)RPA扩增：以cDNA为模板与权利要求1所述的引物对进行RPA扩增；
(3)结果判读：RPA扩增产物进行凝胶电泳检测，根据电泳情况判读检测的植物样品是否感染菊花B病毒；
检测标准为：
若RPA扩增得到的RPA扩增产物含有大小为158bp的片段，则检测的植物样品感染菊花B病毒，若RPA扩增产物不含有大小为158bp的片段，则检测的植物样品未感染菊花B病毒。
7.根据权利要求6所述的菊花B病毒的RPA检测方法，其特征在于：所述RPA扩增的反应体系及条件如下：
向已装有冻干酶粉的PCR试管中依次加入干粉溶解缓冲液29.5μL，ddH2O11.2μL，权利要求1中所述的引物对中的上下游引物各2.4μL，引物的浓度为10μmol/L，模板cDNA 2μL，用移液枪混匀后，加入浓度为280mmol/L的醋酸镁2.5μL，反应体系总体积50μL，离心，于40℃金属浴40min；反应结束后，加入50μL体积比为1：1的氯仿/苯酚溶液，充分混匀，12000rpm离心5min，取5μL上清液进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳。
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