CN108060269B - 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的DPO引物组及其应用。本发明针对TGEV‑N基因、PEDV‑N基因和PRoV‑VP7基因分别设计了一对DPO引物，建立了猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的多重DPO real‑time RT‑PCR检测方法。结果显示，该方法的检测限为5.3×100copies/μL，在40℃‑65℃退火温度范围内均可高效扩增靶基因片段，表明该方法退火温度范围宽，同时DPO引物特异性强，PCR反应过程中未产生非特异性扩增。本发明多重DPO real‑time RT‑PCR检测方法设计简单、特异性强、灵敏度高，为TGEV、PEDV和PRoV三种致猪病毒性腹泻病病原的快速准确检测提供了新的技术手段。

Description

用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病 毒检测的DPO引物组及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的引物组，特别涉及一种用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒进行定性、定量检测的双启动寡核苷酸(DPO)引物组、还涉及含有该引物组的试剂盒及其应用。本发明属于生物检测技术领域。
背景技术
猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻 (Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirusvirus,PRoV) 通常以混合感染的形式存在。三种病原均可引起猪只发生以呕吐、严重腹泻和脱水为特征的传染病，危害严重，目前临床上很难区分这三种病毒病，是危害养猪业发展的主要病毒性传染病。
由于这三种病毒病的临床症状和病理变化非常相似，仅靠临床诊断很难区分病原，需要借助实验室方法检测。虽然分离鉴定、免疫相关检测手段已经应用于病毒的诊断，但是由于检测条件、周期、准确性等因素的限制，使得现有相关技术不能用于高效快捷的病原确诊。常规RT-PCR方法只能做对病原进行定性检测，难以精确定量。
目前国内临床诊断的方法包括病理学检查、血清学检测和RT-PCR检测等，如田小艳等发表了3种致猪腹泻病毒的多重RT-PCR检测方法，但常规PCR引物设计过程复杂，需要对引物参数进行反复优化，而且特异性较差，有时即使优化反应条件也避免不了非特异性扩增的出现。为解决此问题，本发明利用双启动寡核苷酸引物(Dual PrimingOligonucleotide)，即DPO引物，通过对猪传染性胃肠炎病毒特异性N基因序列、猪流行性腹泻病毒N基因序列、猪轮状病毒VP7序列进行 DNAMAN比对，选取其高特异性序列进行DPO引物设计，建立了基于DPO引物精确检测猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的多重Real-time RT-PCR检测方法。DPO引物特异性高，退火温度范围宽，避免了传统方法中反复优化反应的繁琐操作。本发明检测方法特异强、敏感高，显著提高了病原的检测效率及敏感性，为三种致猪腹泻病毒的检测提供了重要的技术支持。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够特异的、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重DPO-real time RT-PCR检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
为建立特异、快速的检测猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的多重DPO real-time RT-PCR检测方法，本发明通过对猪传染性胃肠炎病毒特异性N基因序列、猪流行性腹泻病毒N基因序列、猪轮状病毒VP7序列进行DNAMAN 比对，选取其高特异性序列分别设计了一对双启动寡核苷酸(DPO)引物，建立了猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的多重DPO real-time RT-PCR 检测方法。结果显示，该方法的检测限为5.3×100copies/μL，在40℃-65℃退火温度范围内均可高效扩增靶基因片段，表明该方法退火温度范围宽，同时DPO引物特异性强，PCR反应过程中未产生非特异性扩增。利用该多重检测方法对采集的131 份疑似临床样品进行检测，共计检出43份TGEV阳性样品、61份PEDV阳性样品、 21份PRoV阳性样品，其中部分临床样本出现混合感染。经单重DPO real-time RT-PCR检测方法复验，两者检测结果一致。
因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒同时检测的DPO引物组，其由分别用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的三对DPO引物对组成；
其中，用于猪流行性腹泻病毒检测的DPO引物对如下所示：
TGEV-DPO-F：CTGTTCTTGCCGCACTTAAAAIIIIIGGTGTTGAC
TGEV-DPO-R：TAGCTCCATAAAATCTTGTCACATCIIIIITACCTGCAG
其中，用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO引物对如下所示：
PEDV-DPO-F：GGTATTGGAGAAAATCCTGACAGGIIIIIGCAACAGCA
PEDV-DPO-R：GACGCATCAACACCTTTTTCGIIIIITTCCGCATC
其中，用于猪轮状病毒检测的DPO引物对如下所示：
PRoV-DPO-F：TGTTTTTAACAAAAGGATIIIIIACAGGGTCA
PRoV-DPO-R：CTGTAGTCGAACATCCTAIIIIIAGAGTCTGC
其中，I表示次黄嘌呤核苷。
进一步的，本发明还提出了所述的DPO引物组在制备同时检测或诊断猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的试剂中的用途。
更进一步的，本发明还提出了一种用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重DPO-real time RT-PCR试剂盒，其含有本发明所述的引物组。
其中，优选的，所述的多重DPO-real time RT-PCR试剂盒种还包括荧光染料、反应缓冲液、dNTP、RNasin、随机引物、反转录酶、阳性标准品、阴性对照以及无 RNA酶水。
其中，优选的，所述的反转录酶为M-MLV，所述的阳性标准品为分别含有TGEV N基因的第32-212位序列、PEDV N基因的第776-992位序列以及PRoV VP7基因的第25-311位序列的质粒。
使用本发明所述的试剂盒检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒时，按照以下步骤进行：
(1)提取待测样本的总RNA
(2)反转录
对步骤(1)提取得到的总RNA进行反转录得到cDNA模板；
(3)荧光定量PCR检测
利用阳性标准品作为对照，以步骤(2)得到的cDNA为模板，使用本发明所述的引物组进行荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR体系为：
Figure BDA0001553443030000031
荧光定量PCR程序为：95℃10min，95℃15s，60℃1min，共进行35～40 个循环。
(4)标准曲线的制作
利用一系列不同浓度梯度的阳性标准品为模板，按照步骤(3)进行荧光定量 PCR扩增，以标准品拷贝数的对数做为X轴，Ct值做为Y轴自动绘制标准曲线；
(5)样本中病毒含量的计算
根据建立的标准曲线分别计算样本中病毒的拷贝数。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明采用DPO引物结合实时荧光定量PCR方法，Real-time PCR方法具有检测范围广、检测速度快、通量高、封闭检测无污染、灵敏度高等诸多优点，在临床检测中得到广泛应用。此外，DPO引物具有退火温度范围宽，特异性好，设计简单，无须优化反应条件等优点，适于多重PCR检测方法的建立。
基于上述问题的考虑，本发明选取猪传染性胃肠炎病毒N基因、猪流行性腹泻病毒N基因和猪轮状病毒VP7基因的高度保守序列，设计了检测PEDV、TGEV和 PRoV的3组DPO引物对，建立了用于检测PEDV、TGEV和PRoV的多重DPO-real time RT-PCR方法。本发明从基因水平去构建标准质粒，进行标准曲线的建立，基于DPO引物建立实时荧光定量PCR检测方法，能够实现现有检测技术所无法完成的定量、快速、特异、敏感的结果判定。
基于传统PCR引物建立多重RT-PCR方法时，往往要反复优化引物的特异性、退火温度以及避免引物二聚体、错配等问题。本发明采用的DPO引物特异性好、退火温度范围宽，无需优化反应体系，尤其在多重反应当中优势更为突出，很好地解决了上述问题。另外，通过添加荧光基团实时监测扩增反应过程，还可以通过制作标准曲线得到定量检测结果。本发明检测方法和检测试剂盒具有使用方便、效率高、灵敏度高、特异性强等优势。
本发明多重DPO real-time RT-PCR检测方法设计简单、特异性强、灵敏度高，为TGEV、PEDV和PRoV三种致猪病毒性腹泻病病原的快速准确检测提供了新方法。
附图说明
图1为多重real-time PCR检测方法的建立；
1：TGEV；2：PEDV；3：PRoV；4：阴性对照；
图2为TGEV多重real-time PCR标准曲线；
图3为PEDV多重real-time PCR标准曲线；
图4为PRoV多重real-time PCR标准曲线；
图5为Real-time PCR灵敏度分析；
1：5.3×104copies/μL；2：5.3×103copies/μL；3：5.3×102copies/μL；4：5.3×101copies/μL；5：5.3×100copies/μL；6：阴性对照
图6为Real-time PCR特异性；
1：猪传染性胃肠炎病毒；2：猪流行性腹泻病毒；3：猪轮状病毒；4～11：鸡传染性支气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、鸡传染性法氏囊病毒、牛细小病毒、传染性造血器官坏死病病毒、猫传染性腹膜炎病毒和阴性对照；
图7为Real-time PCR常规引物与DPO引物特异性比对结果；
图7A中，1：TGEV-N3基因/TGEV-CG引物；2：TGEV-N3基因/TGEV-DPO 引物；图7B中，1：TGEV-N5基因/TGEV-CG引物；2：TGEV-N5基因/TGEV-DPO 引物；图7C中，1：TGEV-SN3基因/TGEV-CG引物；2：TGEV-SN3基因/TGEV-DPO 引物；图7D中，1：TGEV-SN5基因/TGEV-CG引物；2：TGEV-SN5基因/TGEV-DPO 引物；
图8为TGEV-DPO引物与已发表引物特异性对比结果；
A)TGEV-P引物；B)TGEV-DPO引物；
图9为多重与单重real-time PCR对比。
1：多重方法扩增结果；2：单重方法扩增；3：阴性对照。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步的说明验证，所有实施例仅用于例证本发明，不限制本发明的保护范围。本领域技术人员知晓对于本发明权利要求内所做的更改或等效变更，均落入本发明的保护范围之内。
实施例1用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒同时检测的DPO引物组的设计与合成
通过对PEDV、TGEV和PRoV基因组的生物信息分析，本发明确定了TGEV-N 基因(SEQID NO.1所示)、PEDV-N基因(SEQ ID NO.6所示)、PRoV -VP7基因 (SEQ ID NO.7所示)作为检测靶基因。根据GenBank中登录的基因序列，使用 DNAMAN筛选出高度保守区。具体为：TGEV N基因的第32-212位序列、PEDV N 基因的第776-992位序列、PRoV VP7基因的第25-311位序列。针对上述保守序列分别设计并合成了一对DPO引物对，如下表1所示。
表1 DPO引物序列
Figure BDA0001553443030000061
其中，“I”表示次黄嘌呤核苷。
实施例2用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒同时检测的多重DPO-real time RT-PCR方法的建立
1、猪传染性胃肠炎病毒检测方法的建立
(1)提取待测样本的总RNA
取约100mg待测样本组织、阴性样本组织或已知阳性PEDV、TGEV和PRoV 病毒细胞培养物于冰浴匀浆器中，加入1ml Trizol(Invitrogen,USA)，迅速研磨成匀浆液，加入200μl氯仿，震荡30S，冰上放置5min。4℃，12000rpm，离心10min，取上层水相转移至另一1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置2h。然后4℃，12000rpm，离心20min，弃上清，加入1ml 75％乙醇，轻轻混匀， 4℃，12000rpm，离心10min，吸净上清液，于室温下晾干，加入20μl DEPC处理的去离子水溶解沉淀，-80℃保存备用。
(2)反转录
使用试剂盒(Promega，USA)对所述总RNA分别进行反转录得到cDNA模板。反转录反应液组成如下表2所示：
表2反转录体系
Figure BDA0001553443030000062
Figure BDA0001553443030000071
42℃反转录50min，95℃5min灭活反转录酶。
(3)荧光定量PCR检测
以PEDV、TGEV和PRoV基因组RNA反转录产物cDNA为模板，根据表3 和表4的反应体系与反应程序，进行real-time PCR检测。结果见图1所示，阳性样本出现典型的扩增曲线，阴性样本未出现扩增曲线。从溶解曲线分析可知，可依据 Tm值的不同区分PEDV、TGEV和PRoV，且无非特异性峰出现。
表3 Real-Time PCR反应体系
试剂名称 用量
FastStart Universal SYBR Green Master 12.5μL
TGEV-DPO-F(10uM) 0.5μL
TGEV-DPO-R(10uM) 0.5μL
PEDV-DPO-F(10uM) 0.5μL
PEDV-DPO-R(10uM) 0.5μL
PRoV-DPO-F(10uM) 0.5μL
PRoV-DPO-R(10uM) 0.5μL
cDNA模板 5.0μL
ddH2O 4.5μL
表4 Real-Time PCR反应程序
Figure BDA0001553443030000072
2、标准曲线的制作
(1)PEDV、TGEV和PRoV质粒标准品的构建
提取PEDV、TGEV和PRoV基因组RNA，并进行RT-PCR扩增靶基因片段，靶基因序列分别为TGEV N基因的第32-212位序列、PEDV N基因的第776-992位序列、PRoV VP7基因的第25-311位序列，将扩增得到的靶基因PCR产物回收纯化并克隆入pMD19-T载体，作为检测方法的标准品质粒，构建的质粒分别命名为 pMD-TGEV-N、pMD-PEDV-N和pMD-PRoV。
(2)标准曲线的制作
本发明采用混合质粒标准品为模板，3对高特异性DPO引物分别实施real-timePCR检测。检测后，生成动力学曲线图，并以标准品拷贝数的对数为X轴，Ct值为Y轴绘制标准曲线。结果如下：三种多重RT-PCR结果相关系数R2均可达0.99，均具有良好的线性关系，如图2-4所示。
TGEV：斜率M＝-3.31，Tm＝72.3，采用5.3×106copies/μL～5.3×102copies/μL质粒标准品的5个浓度梯度。标准曲线方程为：Y＝-3.31X+35.28(见图2)。
PEDV：斜率M＝-3.509，Tm＝75.2，采用5.3×106copies/μL～5.3×102copies/μL质粒标准品的5个浓度梯度。标准曲线方程为：Y＝-3.509X+34.73(见图3)。
PRoV：斜率M＝-3.37，Tm＝79.5，采用5.3×108copies/μL～5.3×101copies/μL质粒标准品的8个浓度梯度。标准曲线方程为：Y＝-3.37X+37.62(见图4)。
3、灵敏度检测
将质粒拷贝数为5.3×104copies/μL的标准品混合，进行10倍梯度稀释，采用建立的方法进行检测，检测结果见图5所示，本发明检测方法的检测限为 5.3×100copies/μL。
4、特异性检测
利用本发明建立的方法检测猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、鸡传染性支气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、鸡传染性法氏囊病毒、传染性造血器官坏死病病毒、牛细小病毒、猫传染性腹膜炎病毒，检测结果见图6所示，只有猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒为阳性结果，显示了良好的特异性。
实施例3对比试验1
1、猪传染性胃肠炎Real-time PCR DPO引物与常规引物设计与比较
以TGEV-N基因为例进行碱基点突变，对比分析DPO引物与常规PCR引物的特异性。碱基突变设计为：①3’端突变三个位点(命名为TGEV-N3，SEQ ID NO.2 所示)；②5’端突变三个位点(命名为TGEV-N5，SEQ ID NO.3所示)；③3’端突变五个位点(命名为TGEV-SN3，SEQID NO.4所示)；④5’端突变五个位点(命名为TGEV-SN5，SEQ ID NO.5所示)；⑤未突变N基因(命名为TGEV-N，SEQ ID NO.1所示)。分别比较常规引物TGEV-CG以及已公开引物(王劭等发表)与本发明设计的DPO引物的特异性，引物序列见表5。
表5引物序列
Figure BDA0001553443030000091
注：“I”表示次黄嘌呤核苷。
以上述突变基因为模板，按照各自的反应体系以及反应条件进行RT-PCR比较实验，结果如图7，从图7结果可以看出，DPO引物扩增明显受到了抑制，其特异性优于常规引物，说明DPO引物特异性良好。
2、猪传染性胃肠炎Real-time PCR DPO引物与已发表文献(王劭等发表)所用引物特异性比较
使用6种病毒的细胞培养物cDNA(猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、传染性造血器官坏死病病毒)使用王劭等(猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立，王劭等，动物医学进展，2007，28(11)：12-16)公开的引物以及本发明的DPO引物进行特异性比较，引物序列如表1所示，结果如图8所示，使用DPO引物只有TGEV有扩增曲线，其余无扩增信号(图8B)；使用TGEV-P引物有假阳性出现(图8A)，证明DPO引物有较强的特异性。
3、本发明多重检测方法与单重检测方法比较
以TGEV为例，使用本发明方法对含TGEV的混合样品进行检测，并与单重检测方法对比。结果见图9所示，两者检测结果相同，且靶基因的扩增效率基本一致。
实施例4用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO-real time RT-PCR试剂盒组成
该DPO-real time RT-PCR试剂盒包括：反转录PCR反应液、dNTP
Figure BDA0001553443030000101
RNasin
Figure BDA0001553443030000102
随机引物
Figure BDA0001553443030000103
M-MLV
Figure BDA0001553443030000104
FastStart Universal SYBRGreen Master、三对DPO引物对(10uM，实施例1)、三种阳性标准品 (pMD-TGEV-N、pMD-PEDV-N和pMD-PRoV质粒)、阴性对照以及无RNA酶水。
序列表
<110>东北农业大学
<120>用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的DPO引物组及其应用
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<212> DNA
<213> TGEV-N3
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<212> DNA
<213> TGEV-N5
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<212> DNA
<213> TGEV- SN3
<400> 4
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gaaggtgatg tgacaagatt ttatggagct agaagcagtt cagccaattt 230
<210> 5
<211> 230
<212> DNA
<213> TGEV- SN5
<400> 5
aataacaaga aggatgacag tgtagaacaa gctgttcatg cagctcctaa agagttaggt 60
gttgacacag aaaaacaaca gcaacgctct cgttctaaat ctaaagaacg tagtaactct 120
aagacaagag atactacacc taagaatgaa aacaaacaca cctggaagag aactgcaggt 180
aaaggtaatt tgagaagatt atatgaagct agaagcagtt cagccaattt 230
<210> 6
<211> 1501
<212> DNA
<213> PEDV -N
<400> 6
tccgccaaaa cagccaagct tggtaccgca tgcctcgaga ctgcaggctc tagattcgaa 60
agcggccgcg actagtgagc tcgtcgacga ttacattgtt taatttcctg tatcgaagat 120
ctcgttgata atttcaacgg ccgtatcacc accatcaaca gctgtgtccc attccagatt 180
ggcatgggtc acatcagatg gcgcacccac atcatcgtag atggcctctt tatgctgctg 240
cagcgtggtt tcacgcttgt tcttcttttc cttctttctc tggagttttg cattcccagt 300
tttaaatgca tccacctgtg aaacaagaag ctcaacattt ggatctgact ttggcacagt 360
cattttatag ttgtatgtaa tctcgtaaga gtccgctagc tcacgaacag ccacattacc 420
accaaagagc aatgctgcaa catttggtgc taaactggcg atctgagcat agcctgacgc 480
atcaacacct ttttcgacaa attccgcatc tccaaagttt ttgaagcccc ctctgggtcc 540
gaagcaagct gctacgctat tttcgccctt gggaattctc ctccactctg ggatgtcttt 600
gaggtcacgt tccttcgaag tggccctgga tttgttcttc ttaggtgtat ttttgccgct 660
gttgtcagac ttttcctgct taggcttctg ctgttgctta tgcctgtcag gattttctcc 720
aatacccaaa gatttaagtg catccttgac agcagccacc agatcatcgc gtgatgttac 780
accaccacgg tcatttgact ggttcctgtt attggactgg ttacgagact tgttattgtt 840
attattattg cctcctctgt tctgagaagc tccacgaccc tggttatttc cacgattctg 900
tgaattacca cgggactggt tattgcctct gttgttactt ggagatctag acctattgtt 960
gccattgcca cgactcctgc tacgcgaatt tgcacgtgaa gcaggaggtg tgttaggttc 1020
aacaatctca actacaccgg ggagctgttg agagaatttt ggaatgattg gcttttcaga 1080
cgcctttctg acacccaaat tagtgggttc agtctttgcg ccttctttag caacccagaa 1140
aacaccctca gtacgagtcc tataacggag gtcgccgtga ggtcctgttc cgaggtagta 1200
gaaatgccaa ttggaaggtt gttcaattcg ctcaccacgg cgcatgcgcc agcgaatttg 1260
ctcattccag tacccaattt gctggtcctt attccccttg ttagtgggta cagcgttgtt 1320
tgcaagtacc ttagaaaggg gcttgtcatt agtaacccta agaggggcat agagagataa 1380
tggcacccgt ttgcggccac gatcctgaaa gctgacagaa gccataaaat ctctagagga 1440
tcccatggcg ccctgaaaat acaggttttc ggtcgttggg atatcgtaat cgtgatggtg 1500
a 1501
<210> 7
<211> 433
<212> DNA
<213> PRoV -VP7
<400> 7
aatggacaga aacattgtcg cagttgtttt taacaaaagg atggccaaca gggtcagttt 60
attttaaagg atatgcagat attgcgtcat tttctgtaga accgcagtta tactgcgact 120
ataatattgt actaatgaaa tatgatggaa atttacagtt agacatgtct gaattggctg 180
atttaatatt gaatgaatgg ctatgtaatc caatggatat aatgctatat tattatcagc 240
aaacagatga agctaataaa tggatatcaa tgggtacatc atgtacgatt aaagtatgtc 300
ctctaaatac gcagactctc gggataggat gttcgactac agacataaat tcatttgaaa 360
cagtggccaa tgcagagaaa ttagctataa ctgatgttgt cgatggagtc aatcataaat 420
tagacgtaac aac 433

Claims (5)

1.用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒同时检测的DPO引物组，其特征在于由分别用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的三对DPO引物对组成；
其中，用于猪流行性腹泻病毒检测的DPO引物对如下所示：
PEDV-DPO-F：GGTATTGGAGAAAATCCTGACAGGIIIIIGCAACAGCA
PEDV-DPO-R：GACGCATCAACACCTTTTTCGIIIIITTCCGCATC
其中，用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO引物对如下所示：
TGEV-DPO-F：CTGTTCTTGCCGCACTTAAAAIIIIIGGTGTTGAC
TGEV-DPO-R：TAGCTCCATAAAATCTTGTCACATCIIIIITACCTGCAG
其中，用于猪轮状病毒检测的DPO引物对如下所示：
PRoV-DPO-F：TGTTTTTAACAAAAGGATIIIIIACAGGGTCA
PRoV-DPO-R：CTGTAGTCGAACATCCTAIIIIIAGAGTCTGC
其中，I表示次黄嘌呤核苷。
2.权利要求1所述的DPO引物组在制备同时检测或诊断猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的试剂中的用途。
3.一种用于同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒的多重DPO-real time RT-PCR试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的引物组。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光染料、反应缓冲液、dNTP、RNasin、随机引物、反转录酶、阳性标准品、阴性对照以及无RNA酶水。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的反转录酶为M-MLV，所述的阳性标准品为分别含有TGEV N基因的第32-212位序列、PEDV N基因的第776-992位序列以及PRoVVP7基因的第25-311位序列的质粒，其中TGEV N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、PEDV N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、PRoV VP7 基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
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