CN109439796A - 一种快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组及试剂盒 - Google Patents

一种快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT‑PCR检测引物组及试剂盒，属于动物病毒学和分子生物学技术领域。该试剂盒包括SEQ ID1~6所示的引物序列，还包括PrimeSTAR HR缓冲液、cDNA模板和灭菌水。本发明提供的PEDV、TGEV和PReoV的多重RT‑PCR检测试剂盒采用多重RT‑PCR扩增，三种病变相似且同为RNA病毒的病毒一次检测，检测总时间控制在2小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。

Description

一种快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组及 试剂盒
技术领域
本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域，具体为针对PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR的检测引物组、检测试剂盒及应用。
背景技术
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的急性、高度接触性肠道疾病，主要以急性水样腹泻、呕吐和迅速脱水死亡为基本特征。各种年龄段的猪都能够感染发病，尤其以1-2周龄内哺乳仔猪为主要发病群体，感染发病率和死亡率甚至可高达 100%。英国和比利时在20世纪70年代，各自率先报道了该病的发生，随后该病在全球多个主要养猪国家相继暴发和流行。2013年4月，美国出现PED疫情并很快蔓延至整个国家，截止2014年底，至少造成800万头新生仔猪死亡，经济损失高达18亿美元。随后不久，加拿大、墨西哥、多米尼克等与美国相邻的北美国家和欧洲的德国等地也暴发了PED疫情。中国自 2010 年十月份也暴发了PED疫情，造成超过百万头哺乳仔猪的死亡，损失极其惨重。
猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis，TGEV) 属冠状病毒科冠状病毒属成员。引起以发热、呕吐、脱水、严重腹泻、仔猪致死率高为主要临床特征的一种急性、高度接触性胃肠道疾病，猪传染性胃肠炎。各种年龄的猪均可感染发病，而10日龄以内的仔猪死亡率高达100%。5周龄以上的猪感染后虽然死亡率很低，但是这些猪通常成为僵猪，饲料报酬低，给养猪业带来严重损失。美国于1946年首次报道该病，随后多个国家和地区相继报道有本病的发生与流行。20世纪50年代末，我国报道有本病的发生，到目前为止我国大部分的省（市）都有该病的发生与流行，且该病尚无有效的治疗药物，给养猪业造成了极大的困扰。
20世纪50年代呼肠孤病毒的首次发现，证实了dsRNA病毒可以作为稳定的生命形式存在于自然界中。呼肠孤病毒(Reovirus)系呼肠孤病毒科(Reoviridea)正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)成员主要感染人和哺乳动物，如猪、牛、犬、猫、鼠等以及禽的呼吸道或消化道，对动物具有广泛的致病性。
猪呼肠孤病毒（Porcine reovirus，PReoV）属呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属成员，是哺乳动物呼肠孤病毒（Mammalian Reovirus，MRV）的一种，为分节段的双链 RNA 病毒，无囊膜，具有特征性的 20 面体对称双层衣壳结构，完整的病毒粒子直径为 76 nm 左右，病毒经口感染或经呼吸道感染。目前报道的PReoV共有 3 个血清型，其中 1 型由 Kasza 和McFerran 于1970年分别分离报道；3 型由 Robl 于1971年分离报道；2 型由 Fukutomi于1996年在日本首次分离报道；所有的猪几乎都可检测到3 种血清型的抗体。我国曾志勇2006年在国内首次从猪体内分离到了 3 型哺MRV， SC-A 株；随后，Zhang 等2007年也分离到了一株 3 型MRV，MRV-HLJ/2007 株；Kwon 等2011年从南韩地区 78 个猪场 237 份腹泻样品中检出了 45 份 3 型MRV阳性（检出率达 19%），并且从阳性病料中分离到了 10 株 3型MRV；Narayanappa等2015年用美国分离到的PReoV感染新生仔猪，发现仔猪出现严重腹泻，并且死亡率高达100%。从患有呼吸道疾病或胃肠道疾病的猪、临床健康的猪、流产胎儿等都可分离到呼肠孤病毒。另外，健康猪群体内也会存在猪呼肠孤病毒。利用PReoV感染未吃初乳初生仔猪会引起猪的体温升高以及腹泻等症状。上述报道说明，PReoV在猪群中流行广泛，且对猪具有一定程度的致病作用。
2010年以来，顽固性仔猪腹泻的发生与流行呈持续上升趋势，已成为猪场损失最为重要的原因之一，其中尤其以病毒性腹泻的危害最为严重。而PEDV、TGEV和PReoV都是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原。临床上仅出现猪腹泻症状，而无其它表现时，难以区分是由PEDV、TGEV还是PReoV引起猪的腹泻，或者是由PEDV、TGEV和PReoV混合感染引起猪的腹泻，因此有必要建立PEDV、TGEV和PReoV多重RT-PCR检测方法，为临床上及时准确地对猪腹泻病因进行调查和监测提供技术支持，从而有效地防控猪腹泻病的发生与流行。
发明内容
本发明的目的是解决上述技术问题，提供一种快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组及试剂盒，该试剂盒能够快速区分PEDV、TGEV和PReoV，灵敏感高、特异性强，从而为有效防控PEDV、TGEV和PReoV病毒病的发生和流行提供技术支持。为实现本发明目的所使用的技术方案为：
一种快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组，所述多重RT-PCR检测引物组由PEDV RT-PCR检测引物、TGEV RT-PCR检测引物和PReoV RT-PCR检测引物组成；
所述PEDV RT-PCR检测引物由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成；
所述TGEV RT-PCR检测引物由具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQID NO:4 所示核苷酸序列的下游引物组成；
所述PReoV RT-PCR检测引物由具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:6 所示核苷酸序列的下游引物组成。
优选地，所述PEDV RT-PCR检测引物是依据PEDV的N基因进行设计，扩增目的片段大小为458 bp；所述TGEV RT-PCR检测引物是依据TGEV的全基因进行设计，扩增目的片段大小为277bp； 所述PReoV RT-PCR检测引物是PReoV的S2基因进行设计，扩增目的片段大小为974 bp。
优选地，所述多重RT-PCR检测引物组在制备猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪呼肠孤病毒鉴别检测试剂盒的应用。
本发明还提供一种如以上所述快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒，所述多重RT-PCR检测试剂盒包括具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的下游引物。
优选地，所述的多重RT-PCR检测试剂盒中，包括RT反应体系和PCR反应体系；所述RT反应体系为：采用20 µL体系，RNA 模板14 µL，5×PrimeScript TM缓冲液4 µL，RTEnzyme Mix 1.0 µL，反转录引物Oligo18T 1.0 µL；所述PCR反应体系为：采用25 µL体系，灭菌水6.5 µL，PrimeSTAR HR 12.5 µL，25 µmol/L PEDV、TGEV和PReoV上下游引物各0.5 µL，模板3.0 µL。
优选地，所述的多重RT-PCR检测试剂盒中RT反应条件为：37℃ 20 min，85℃ 30s，12℃保存；PCR反应条件为：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，56.8℃复性5 s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10 min。
优选地，所述多重RT-PCR检测试剂盒的最佳退火温度为56.8℃。
优选地，所述RT-PCR检测试剂盒的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO: 6所示引物使用浓度为25 μmol/L。
本发明的有益效果为：
本发明提供的PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒采用多重RT-PCR扩增，三种病变相似且同为RNA病毒的病毒一次检测，检测总时间控制在2小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本发明能彻底解决PEDV、TGEV和PReoV引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场快速检测，亦适用于流行病学调查。
本发明提供了三对针对PEDV、TGEV和PReoV的特异性引物，PEDV-P1/ PEDV-P2为PEDV特异性扩增引物组，TGEV-P1/ TGEV-P2为TGEV 特异性扩增引物组，PReoV-P1/ PReoV-P2为PReoV特异性扩增引物组，利用其制成的三重RT-PCR检测试剂盒能快速、特异的检测出PEDV、TGEV和PReoV中的单一病毒以及三者的混合病毒，PEDV出现458bp一个条带，TGEV出现277bp一个条带，PReoV出现974bp一个条带，PEDV、TGEV和PReoV三种病毒混合样品出现458bp、277bp、974bp三个条带。
本发明的PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒对PEDV的检测极限为100.74TCID50/mL，对TGEV的检测极限为102.38TCID50/mL，对PReoV的检测极限为103.96TCID50/mL ，表明本发明的PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒在检测PEDV、TGEV和PReoV时具有较高的灵敏度。本发明的PEDV、TGEV和PReoV RT-PCR鉴别检测试剂盒既能缩短诊断时间、节约诊断试剂，又能降低使用成本。
本发明提供的PEDV、TGEV和PReoV RT-PCR鉴别检测试剂盒在6个月内检测结果一致，表明本发明PEDV、TGEV和PReoV RT-PCR鉴别检测试剂盒具有很高的稳定性。田间试验证明本发明所得的PEDV、TGEV和PReoV RT-PCR鉴别检测试剂盒实用性和适用性良好。
附图说明
图1是实施例目的基因的RT-PCR扩增结果，其中M：DNA分子质量标准DL2000；1：PReoV阳性组织样本； 2：PEDV阳性组织样本； 3：TGEV阳性组织样本； 4： PEDV/TGEV /PReoV三阳性组织样本。
图2是实施例多重RT-PCR检测试剂盒不同退火温度结果，其中M：DNA分子质量标准DL2000；1：50.0℃；2：50.3℃；3：51.0℃；4：52.0℃；5：53.2℃；6：54.4；7：55.6℃；8：56.8℃；9：58.0℃；10：59.0℃；11：60℃。
图3是本发明多重RT-PCR检测试剂盒特异性试验结果，其中M：DNA分子质量标准DL2000；1： PEDV/TGEV /PReoV三阳性组织样本；2：PDCoV；3：CSFV；4：PRRSV；5：JEV；6：PBoV；7：PPV；8：PRV；9：PCV2；10：TTV； 11：阴性对照。
图4是本发明多重RT-PCR检测试剂盒敏感性试验结果，其中M：DNA分子质量标准DL2000； 1-7：PEDV的TCID50分别为105.74TCID50/mL、104.74TCID50/mL、103.74TCID50/mL、102.74TCID50/mL、101.74TCID50/mL、100.74TCID50/mL、10-0.26TCID50/mL；
1-7：TGEV的TCID50分别为105.38TCID50/mL、104.38TCID50/mL、103.38TCID50/mL、102.38TCID50/mL、101.38TCID50/mL、100.38TCID50/mL、10-0.62TCID50/mL；
1-7：PReoV的TCID50分别为106.96TCID50/mL、105.96TCID50/mL、104.96TCID50/mL、103.96TCID50/mL、102.96TCID50/mL、101.96TCID50/mL、100.96TCID50/mL；
8：阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例
1 材料与方法
1.1 病毒及临床样品
猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪呼肠孤病毒（PReoV）、猪丁型冠状病毒（PDCoV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪博卡病毒（PBoV）、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）及猪细环病毒（TTV）均由本实验室保存提供。临床样品采自广西各地养猪场猪腹泻粪便及拉稀仔猪肠道样品，剪取组织样品约 0.5 g-1.0 g，置于灭菌研钵中，充分研磨成匀浆，加入灭菌的 1 mol/L PBS 溶液配成 1：5 乳悬液，反复冻融 3 次。10 000 r/min 离心5 min，收集上清液，转入 1.5 mL 离心管中编号供 RNA 抽提或者 -20 ℃ 保存备用。
1.2 主要试剂
反转录试剂盒（PrimeScript RT reagent Kit）、PrimeSTAR HR（Premix）、DL2000 DNAMarker均为大连宝生物工程有限公司产品；病毒基因组RNA/DNA快速抽提试剂盒为Axygen生物科技有限公司产品。
1.3 引物的设计与合成
根据GenBank上登录的PEDV N基因、TGEV全基因组序列和PReoV S2基因序列，利用MegAlign(DNA Star)，Primer Premier 7.0 软件针对PEDV N基因、TGEV全基因组序列和PReoVS2基因的保守区域分别设计一对特异性引物PEDV-P1/ PEDV-P2、TGEV-P1/ TGEV-P2和PReoV-P1/ PReoV-P2。PEDV上游引物PEDV-P1： 5’- AGAACAGAGGAGGCAATAATAA -3’ ，PEDV下游引物PEDV-P2：5’- AACAGCCACATTACCACCAA -3’，PCR扩增目的片段大小为458bp。TGEV上游引物TGEV-P1： 5’- TCCCGT GGT CGG AAG ART AAT A -3’ ，TGEV下游引物TGEV-P2：5’- CCCAGACAACTCCATCTAATTT -3’，PCR扩增目的片段大小为277bp。PReoV上游引物PReoV-P1：5’- TGCGTTCCTATTCAAGACTGTTGG -3’，PReoV下游引物PReoV-P2：5’-CATGTAACTGATTACCAGCTCTGC -3’，PCR扩增目的片段大小为974bp。引物由大连宝生物工程有限公司合成。
1.4病毒RNA/DNA的提取
猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪呼肠孤病毒（PReoV）、猪丁型冠状病毒（PDCoV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪博卡病毒（PBoV）、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）及猪细环病毒（TTV）及处理好的组织病料，按照AxyPrep Body Fluid Viral RNA/DNA Miniprep Kit使用说明书进行RNA/DNA提取，所获得的RNA/DNA 用于下一步的RT-PCR或PCR反应或置于-20℃保存。
1.5反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
反转录合成cDNA：按照RT（反转录）试剂盒说明，采用20 µL体系：RNA 模板14 µL，5×PrimeScript TM缓冲液4 µL，RT Enzyme Mix 1.0 µL，反转录引物Oligo18T 1.0 µL，按以下程序进行反转录反应：37℃ 20 min，85℃ 30 s，12℃保存。
PCR反应体系25 µL，灭菌水6.5 µL，PrimeSTAR HR（Premix） 12.5 µL，25 µmol/LPEDV、 TGEV和PReoV上下游引物各0.5 µL，模板3.0 µL。按照下列条件进行扩增：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，56.8℃复性5 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min，PCR总反应时间约为77分钟。取扩增产物10 µL于10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，并观察结果。
1.6 多重RT-PCR检测方法特异性试验
以制备好的猪丁型冠状病毒（PDCoV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪博卡病毒（PBoV）、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）及猪细环病毒（TTV）cDNA、DNA以及PEDV、TGEV、PReoV和PEDV/TGEV/PReoV三阳性材料cDNA为模板，用所建立的方法进行扩增，以验证该方法的特异性。
1.7 多重RT-PCR检测方法敏感性试验
1.7.1 PEDV、 TGEV、PReoV阳性模板的制备
将PEDV（107.22 TCID50/mL）病毒液、TGEV（106.86 TCID50/mL）病毒液和PReoV（108.44TCID50/mL）病毒液1：1：1混合，然后10倍系列稀释至10-7（PEDV稀释到10-0.26 TCID50/mL、TGEV稀释到10-0.62 TCID50/mL、PReoV稀释到100.96 TCID50/mL），各稀释后的不同浓度的病毒液按照AxyPrep Body Fluid Viral RNA/DNA Miniprep Kit使用说明书进行RNA提取，所获得的RNA 用于下一步的RT-PCR反应。
1.7.2 多重RT-PCR检测方法敏感性试验
将上述所得的RNA作为RT-PCR反应模板，用所建立的多重RT-PCR检测方法进行反应，测定所建立的多重 RT-PCR检测方法的敏感性。
1.8 多重RT-PCR重复性试验
以建立的多重RT-PCR检测方法，对PEDV、TGEV、PReoV三阳性样品重复检测3次，以验证结果的可靠性。
2 结果
2.1 多重RT-PCR扩增
以PEDV阳性RNA、TGEV阳性RNA、PReoV阳性RNA、PEDV/TGEV/PReoV三阳性混合RNA为模板，按照1.5中的反应体系和反应程序进行多重RT-PCR反应。电泳结果显示（见图1），所建立的多重RT-PCR方法能够检测出PReoV阳性、PEDV阳性、TGEV阳性及PEDV/TGEV/PReoV三阳性材料，扩增出PEDV目的基因约458 bp均，扩增出TGEV目的基因约277 bp，扩增出PReoV目的基因约974 bp，与预期目的片段大小相符。将扩增出的PEDV、TGEV和PReoV PCR产物送上海生物工程有限公司进行测序，将测序结果放在NCBI上进行Blast确定为PEDV、TGEV和PReoV特异性片段。
2.2 多重RT-PCR检测方法最佳退火温度
为获得该反应最佳扩增效果，在50-60℃的温度范围内设11个温度梯度进行多重RT-PCR扩增，发现56.8℃时三个条带均最明显，确定了最佳退火温度为56.8℃（见图2）。
2.3 多重RT-PCR检测方法特异性试验结果
试验结果显示（见图3），本研究建立的多重RT-PCR鉴别检测方法能特异地检测出PEDV、TGEV和PReoV，而对猪丁型冠状病毒（PDCoV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪博卡病毒（PBoV）、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）及猪细环病毒（TTV）的检测结果均无条带，表明所建立的方法具有较好的特异性。
2.4 多重RT-PCR检测方法敏感性试验
结果显示，该多重RT-PCR检测方法对PEDV、TGEV和PReoV的检测极限分别为100.74TCID50/mL、102.38TCID50/mL和103.96TCID50/mL（见图4）。
2.5多重RT-PCR检测方法重复性试验结果
以建立的多重RT-PCR检测方法，对PEDV/TGEV/ PReoV三阳性样品进行检测，重复3次，结果在458bp、277bp和974 bp处，均得到了清晰可见的目的条带，说明建立的多重RT-PCR检测方法具有很好的稳定性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 一种快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组及试剂盒
<141> 2018-08-07
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 1
agaacagagg aggcaataat aa 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 2
aacagccaca ttaccaccaa 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 3
tcccgtggtc ggaagartaa ta 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 4
cccagacaac tccatctaat tt 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 5
tgcgttccta ttcaagactg ttgg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 6
catgtaactg attaccagct ctgc 24

Claims (8)

1. 一种快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于，所述多重RT-PCR检测引物组由PEDV RT-PCR检测引物、TGEV RT-PCR检测引物和PReoV RT-PCR检测引物组成；
所述PEDV RT-PCR检测引物由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成；
所述TGEV RT-PCR检测引物由具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQID NO:4 所示核苷酸序列的下游引物组成；
所述PReoV RT-PCR检测引物由具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:6 所示核苷酸序列的下游引物组成。
2.根据权利要求1所述快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于，所述PEDV RT-PCR检测引物是依据PEDV的N基因进行设计，扩增目的片段大小为458bp；所述TGEV RT-PCR检测引物是依据TGEV的全基因进行设计，扩增目的片段大小为277bp；所述PReoV RT-PCR检测引物是PReoV的S2基因进行设计，扩增目的片段大小为974 bp。
3.根据权利要求1所述快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于，所述多重RT-PCR检测引物组在制备猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪呼肠孤病毒鉴别检测试剂盒的应用。
4.一种如权利要求1所述快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重RT-PCR检测试剂盒包括具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的下游引物。
5.根据权利要求4所述快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重RT-PCR检测试剂盒中，包括RT反应体系和PCR反应体系；所述RT反应体系为：采用20 µL体系，RNA 模板14 µL，5×PrimeScript TM缓冲液4 µL，RT Enzyme Mix 1.0µL，反转录引物Oligo18T 1.0 µL；所述PCR反应体系为：采用25 µL体系，灭菌水6.5 µL，PrimeSTAR HR 12.5 µL，25 µmol/L PEDV、TGEV和PReoV上下游引物各0.5 µL，模板3.0 µL。
6.根据权利要求5所述快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重RT-PCR检测试剂盒中RT反应条件为：37℃ 20 min，85℃ 30 s，12℃保存；PCR反应条件为：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，56.8℃复性5 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。
7.根据权利要求5所述快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重RT-PCR检测试剂盒的最佳退火温度为56.8℃。
8.根据权利要求4或5所述快速区分PEDV、TGEV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR检测试剂盒的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO: 6所示引物使用浓度为25 μmol/L。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110257557A (zh) * 2019-06-10 2019-09-20 华南农业大学 一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组
CN111270015A (zh) * 2020-03-26 2020-06-12 广西壮族自治区兽医研究所 一种检测csfv和prrsv的引物组合物、试剂盒及方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277454A (zh) * 2011-08-22 2011-12-14 浙江省农业科学院 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒
CN103320537A (zh) * 2013-07-01 2013-09-25 青岛农业大学 一种pedv和tgev双重rt-pcr检测方法及寡核苷酸引物对
CN105154589A (zh) * 2015-09-18 2015-12-16 广东省实验动物监测所 一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法
CN105483291A (zh) * 2015-12-31 2016-04-13 河南农业大学 猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物
CN108060269A (zh) * 2018-01-19 2018-05-22 东北农业大学 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277454A (zh) * 2011-08-22 2011-12-14 浙江省农业科学院 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒
CN103320537A (zh) * 2013-07-01 2013-09-25 青岛农业大学 一种pedv和tgev双重rt-pcr检测方法及寡核苷酸引物对
CN105154589A (zh) * 2015-09-18 2015-12-16 广东省实验动物监测所 一种快速区分PEDV、TGEV、PoRV的多重荧光免疫分析方法
CN105483291A (zh) * 2015-12-31 2016-04-13 河南农业大学 猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物
CN108060269A (zh) * 2018-01-19 2018-05-22 东北农业大学 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
戴益民等: "猪呼肠孤病毒巢式RT-PCR法的建立及初步应用", 《第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集》 *
田小艳等: "3 种致猪腹泻病毒的多重RT-PCR 检测", 《动物医学进展》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110257557A (zh) * 2019-06-10 2019-09-20 华南农业大学 一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组
CN110257557B (zh) * 2019-06-10 2023-10-13 华南农业大学 一种TGEV、PEDV、SADS-CoV和PDCoV的多重RT-PCR检测引物组
CN111270015A (zh) * 2020-03-26 2020-06-12 广西壮族自治区兽医研究所 一种检测csfv和prrsv的引物组合物、试剂盒及方法

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