CN104498623B - 猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株鉴别诊断用引物及其检测试剂盒 - Google Patents
猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株鉴别诊断用引物及其检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株鉴别诊断用引物及其检测试剂盒，属于生物技术领域。以总RNA为模板，利用鉴别诊断猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的检测引物进行RT‑PCR扩增，反应结束后根据扩增片段的数量和分子量大小判定结果。本发明的引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，为猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的鉴别诊断提供了保证。
Description
技术领域
本发明涉及猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株鉴别诊断用引物及其检测试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是冠状病毒科冠状病毒属的成员。PEDV在临床上可以引起猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED），此病以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征。1978年，比利时和英国首次报道PED（Pensaert M B，de Bouck P．A new coronavirus—like particle associatedwith diarrhea in swine．Arch Virol，1978，58：243-247）。其基因组为单分子线状正链单股RNA，大小为28kb左右，其5’端加帽，3’端为聚A尾，具有感染性。基因组包含有5’-UTR、3’-UTR和至少7个ORF。这7个ORF中有4个编码结构蛋白：纤突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、 囊膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N），另3个编码非结构蛋白：复制酶（replicase ）1a、复制酶1b和ORF3蛋白，其顺序为：5’-replicase (1a/1b)–S-ORF3–E–M–N–3’。ORF3蛋白编码一种离子通道蛋白，可调节病毒产生，与病毒的毒力有关；强毒株的ORF3基因长675bp，而弱毒株的ORF3基因都缺少49nt或51nt（Park SJ, Moon HJ, Luo Y，et al. Cloning and further sequenceanalysis of the ORF3 gene of wild- and attenuated-type porcine epidemic
diarrhea viruses. Virus Genes. 2008，36(1)：95-104； Kai Wang, Wei Lu,Jianfei Chen，et al. PEDV ORF3 encodes an ion channel protein and regulatesvirus production. FEBS Letters，2012，586（4）：384–391）。M基因不管在弱毒株中，还是在强毒株中，都很保守。
此前，我国尚无鉴别诊断猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的二重RT-PCR方法。常规单重RT-PCR技术仅能鉴定是否是猪流行性腹泻病毒，不能区分强毒株和弱毒株。对猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的检测只能通过ORF3基因测序来确定是否缺少49 nt或51nt，操作繁杂、耗时长、成本较高。
因此，基于以上的研究和当前的需求，申请人根据猪流行性腹泻病毒弱毒株ORF3基因缺少49nt或51nt的特征，设计并合成了2对检测猪流行性腹泻病毒的引物，采用RT-PCR方法扩增M基因和ORF3基因，通过扩增片段的数量和分子量大小，判断是猪流行性腹泻病毒强毒株还是猪流行腹泻病毒弱毒株，从而特异、敏感、省时、省力、低成本地鉴别诊断猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株。目前其他RT-PCR方法不能解决该问题；基因测序技术需要时间较长，且费时、费力、成本高。因此，该技术可对猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的鉴别诊断和监测起到重要作用。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株鉴别诊断用引物及其检测试剂盒。
技术方案
本发明通过分析猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的M基因和ORF3基因的序列，在M基因的保守区设计引物和在ORF3基因发生缺失的序列处设计引物。所述的引物对有2对。第1对是PEDV-M正向引物和反向引物，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1和SEQID NO.2。第2对是PEDV-ORF3正向引物和反向引物，其核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4。
SEQ ID NO.1：5’-TATTCCCGTTGATGAGGTGATTG-3’
SEQ ID NO.2： 5’-GCTGAATAGTCGCCGTGTTTTG-3’
该对引物从感染猪流行性腹泻病毒强毒株或弱毒株的病料提取的总RNA中都可扩增出609bp DNA片段。
SEQ ID NO.3：5’-GGGTCCTAGACTTCAACCTTACG-3’
SEQ ID NO.4：5’-ATAGTTGCATCTAAAAGTGCACCAC-3’
该对引物从感染猪流行性腹泻病毒强毒株的病料提取的总RNA中可扩增出341bpDNA片段。
该引物不能从感染猪流行性腹泻病毒弱毒株的病料提取的总RNA中扩增出341 bpDNA片段。
所述强毒株为猪流行性腹泻病毒强毒株PEDV AH2012；所述弱毒株为猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV JS2008。
本发明还提供了一种用于鉴别检测猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的试剂盒，该试剂盒含有上述引物SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.3。
具体的，该试剂盒包括：
（1）阴性对照：取灭菌的DEPC水，置-20℃冰箱保存；
（2）RT反应液：
5×qRT Super Mix 4.0μL
无菌DEPC水 6.0μL
混匀后-20℃保存；
（3）PCR反应液：
2×HS PCR Mix 12.5μL
10µM SEQ ID NO.1 2.0µL
10µM SEQ ID NO.2 2.0µL
10µM SEQ ID NO.3 0.5µL
10µM SEQ ID NO.1 0.5µL
无菌DEPC水 5.5μL
混匀后-20℃保存。
所述的试剂盒，还包括：强毒株阳性对照为猪流行性腹泻病毒强毒株PEDV AH2012发生腹泻的粪便样品、弱毒株阳性对照为猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV JS2008的细胞毒。
所述试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的方法包括：
1）样品处理：采集疑似猪流行性腹泻发病猪的粪便样品，在粪便中按1：10加入DEPC水，剧烈震荡使其混和均匀，8000rpm 离心5 min，取200µL上清液，置1.5mL灭菌离心管中待用；
强毒株阳性对照样品：取强毒株阳性对照样品200μL，置1.5mL灭菌离心管中待用；
弱毒株阳性对照样品：取弱毒株阳性对照样品200μL，置1.5mL灭菌离心管中待用；
阴性对照样品：取阴性对照样品200μL，置1.5mL灭菌离心管中待用；
2）总RNA的提取：取已处理的待检样品、强毒株阳性对照样品、弱毒株阳性对照样品、阴性对照样品，加800µL Trizol，振荡混匀后，室温放置5 min，加入氯仿200 µL，剧烈振荡后，室温放置5min，4℃ 12000rpm，离心10min，取上清，加入0.5mL异丙醇，混匀，室温放置20min，4℃12000rpm离心15min，去上清，沉淀用1mL无RNA酶的75%乙醇溶液洗涤，4℃7500rpm离心5min，去上清，室温干燥RNA沉淀20min，加入DEPC水10µL，使充分溶解，-20℃冻存备用；
3）RT反应：在20µL反应体系中加入5×qRT Super Mix 4.0μL，无菌DEPC水6.0μL，总RNA 10.0µL。瞬间离心混匀，25℃反应15min，42℃孵育60 min，95℃ 5min；
4）PCR扩增：在25µL反应体系中加入2×PCR MIX 12.5µL，SEQ ID NO.1 2.0µL，SEQID NO.2 2.0µL，SEQ ID NO.3 0.5µL，SEQ ID NO.4 0.5µL，cDNA 2.0µL，DEPC水 5.5µL。PCR反应条件：95℃ 5min预变性后，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，40个循环后，72℃延伸10min；
5）判定猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株
被检样品电泳出现二条与强毒株阳性对照大小相同的扩增片段609 bp和341bp，判定为猪流行性腹泻病毒强毒株阳性；
被检样品电泳出现一条与弱毒株阳性对照大小相同的扩增片段609 bp，判定为猪流行性腹泻病毒弱毒株阳性；
被检样品电泳不出现扩增片段，判定为猪流行性腹泻病毒阴性。
有益效果
PEDV在临床上可以引起猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED），此病以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征。ORF3蛋白编码一种离子通道蛋白，可调节病毒产生，与病毒的毒力有关；强毒株的ORF3基因长675bp，而弱毒株的ORF3基因都缺少49nt或51nt。目前，我国尚无鉴别诊断猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的二重RT-PCR方法。常规单重RT-PCR技术仅能鉴定是否是猪流行性腹泻病毒，不能区分强毒株和弱毒株。对猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的检测只能通过ORF3基因测序来确定是否缺少49nt或51nt，操作繁杂、耗时长、成本较高。
本发明是根据猪流行性腹泻病毒弱毒株ORF3基因缺少49nt或51nt的特征而设计的引物，本发明的引物是经过大量PEDV的ORF3基因序列比对和筛选得到的，而且应用该引物及本发明中的检测试剂盒能够快速判断样品中是否含有猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株，为猪的腹泻病提供检测工具。
同时，进行过大量的临床检测和测序分析比对，都证实本发明的检测引物和检测试剂盒能够准确无误地检测猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株，能够达到区分强毒株和弱毒株的目的，而以往检测方法无法区分强毒株和弱毒株。本发明方法用于检测猪流行性腹泻病毒强毒株灵敏度高，最小检测量为100fg/μL样品RNA，效果非常好。本发明的引物和检测试剂盒为临床上检测猪腹泻病提供有效的工具。
经检测，华东地区58份疑似猪流行性腹泻发病猪的粪便样品有41份为猪流行性腹泻病毒强毒株阳性，其RT-PCR扩增产物与强毒株阳性对照的扩增片段数量和大小一致，有二条带，分别为609 bp和341bp。
附图说明
图1是猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的RT-PCR检测结果，其中M：DL2000 DNALadder；1. 猪流行性腹泻病毒强毒株；2. 猪流行性腹泻病毒弱毒株；3. 猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）；4. 猪轮状病毒（PRV）；5. 阴性对照
图2是本发明检测方法的灵敏度实验结果，其中M：DL2000 DNA Ladder；1-5表示反转录反应体系中加入的连续10倍稀释的RNA模板。
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1、引物的设计和合成
根据猪流行性腹泻病毒M基因的核苷酸序列，采用Primer 5.0设计引物，经过大量筛选得到如下序列的引物序列：
M基因正向引物（PEDV-MF）的序列为SEQ ID NO.1，M基因反向引物（PEDV-MR）序列为SEQ ID NO.2，具体序列的组成如下：
SEQ ID NO.1：5’-TATTCCCGTTGATGAGGTGATTG-3’
SEQ ID NO.2：5’-GCTGAATAGTCGCCGTGTTTTG-3’
根据猪流行性腹泻病毒弱毒株ORF3基因缺少49nt或51nt的特征，针对ORF3基因及其相邻的基因序列，采用Primer 5.0设计引物，经过大量筛选得到如下序列的引物序列：
ORF3基因正向引物（PEDV-ORF3F）的序列为SEQ ID NO.3，ORF3反向引物（PEDV-ORF3R）序列为SEQ ID NO.4，具体序列的组成如下：
SEQ ID NO.3：5’-GGGTCCTAGACTTCAACCTTACG-3’
SEQ ID NO.4：5’-ATAGTTGCATCTAAAAGTGCACCAC-3’。
其中SEQ ID NO.4引物是针对猪流行性腹泻病毒弱毒株缺失的51nt或49nt序列，即与下述缺失序列中画线部分互补。
缺失的51nt序列为：ATTGCCCACTTTTATATTATT GTGGTGCATTTTTAGATGCAA
CTATTATTT
缺失的49nt序列为：ATTGCCCACTTTTATATTACTGTGGTGCACTTTTAGATGCAA
CTATTAT
在针对缺失序列的引物设计过程中，既要按照一般引物设计的要求，同时又只能在缺失的51nt或49nt序列上进行设计，所以难度较大。中间设计过如下几对引物都没有获得过成功：
（1）P1：5’-GCCCACTTTTATATTACTGTGGTGC-3’ 与P2：5’-CAGCTTC TTGCCGC CCAC-3’
（2）P3：5’-GCCCACTTTTATATTACTGTGGTGC-3’与 P4：5’-AGCAGGAAAAAGAGTACGAAAAGCC-3’
（3）P5：5’- GTGGTGCACTTTTAGATGCAACTAT-3’与P6：5’-CAGCTTCTTGCCGC CCAC-3’
（4）P7：5’- GCCCACTTTTATATTACTGTGGTGC-3’与P8：5’-CAGTTCGCAACAGATGTAGGTCAG-3’
（5）P9：5’- GTGGTGCACTTTTAGATGCAACTAT-3’与P10：5’- CAGTTCGCAACAGATGTAGGTCAG-3’
根据上述核苷酸序列信息合成M基因正向引物（PEDV-MF）、M基因反向引物（PEDV-MR）、ORF3正向引物（PEDV-ORF3F）和ORF3反向引物（PEDV-ORF3R）。将上述引物各配置成浓度为10μmol/L的溶液，备用。
2、一种鉴别诊断猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的试剂盒，按下表组装：
表1 试剂盒组成
| 成分（10份/盒） | 含量 |
| 阴性对照 | 1管 |
| 强毒株阳性对照 | 1管 |
| 弱毒株阳性对照 | 1管 |
| RT反应液 | 1管 |
| PCR反应液 | 1管 |
| 使用说明书 | 1份 |
3、阴性对照样品的制备
取灭菌的DEPC水，置-20℃冰箱保存。
、强毒株阳性对照样品的制备
将本实验室保存并证明为猪流行性腹泻强毒株的PEDV AH2012（GenBank 登陆号：KC210145）的腹泻粪便样品，在粪便中按1：10加入DEPC水，剧烈震荡使其混和均匀，8000rpm，离心5min，取上清作为强毒株阳性对照样品。
、弱毒株阳性对照样品的制备
将本实验室保存并证明为猪流行性腹泻弱毒株PEDV JS2008（GenBank 登陆号：KC210146）的细胞培养物反复冻融三次后，以12000rpm，离心20min，取上清作为弱毒株阳性对照样品。
、RT反应液的制备
按下列配方制备RT反应液
5×qRT Super Mix 4μL
无菌DEPC水 6μL
混匀后-20℃保存，检验合格后分装，用于成品试剂盒。
、PCR反应液的制备
按下列配方制备PCR反应液
2×HS PCR Mix 12.5μL
10µM SEQ ID NO.1 2.0µL
10µM SEQ ID NO.2 2.0µL
10µM SEQ ID NO.3 0.5µL
10µM SEQ ID NO.4 0.5µL
无菌DEPC水 5.5μL
混匀后-20℃保存，检验合格后分装，用于成品试剂盒。
、检测猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的方法，包括：
1）样品处理：组织样品：采集华东地区58份疑似猪流行性腹泻发病猪的粪便样品，在粪便中按1：10加入DEPC水，剧烈震荡使其混和均匀，8000rpm 离心5 min，取200µL上清液，置1.5mL灭菌离心管中待用。
强毒株阳性对照样品：取强毒株阳性对照样品200μL，置1.5mL灭菌离心管中待用。
弱毒株阳性对照样品：取弱毒株阳性对照样品200μL，置1.5mL灭菌离心管中待用。
阴性对照样品：取阴性对照样品200μL，置1.5mL灭菌离心管中待用。
2）总RNA的提取：取已处理的待检样品、强毒株阳性对照样品、弱毒株阳性对照样品、阴性对照样品，加800µL Trizol，振荡混匀后，室温放置5 min，加入氯仿200 µL，剧烈振荡后，室温放置5min，4℃ 12000rpm，离心10min，取上清，加入0.5mL异丙醇，混匀，室温放置20min，4℃12000rpm离心15min，去上清，沉淀用1mL无RNA酶的75%乙醇溶液洗涤，4℃7500rpm离心5min，去上清，室温干燥RNA沉淀20min，加入DEPC水10µL，使充分溶解，-20℃冻存备用。
3）RT反应：在20µL反应体系中加入5×qRT Super Mix 4.0μL，无菌DEPC水6.0μL，总RNA 10.0µL。瞬间离心混匀，25℃反应15min，42℃孵育60 min，95℃ 5min。
4）PCR扩增：在25µL反应体系中加入2×PCR MIX 12.5µL，SEQ ID NO.1 2.0µL，SEQID NO.2 2.0µL，SEQ ID NO.3 0.5µL，SEQ ID NO.4 0.5µL，cDNA 2.0µL，DEPC水 5.5µL。PCR反应条件：95℃ 5min预变性后，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，40个循环后，72℃延伸10min。
5）判定猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的方法
被检样品电泳出现二条与强毒株阳性对照大小相同的扩增片段（609 bp和341bp），判定为猪流行性腹泻病毒强毒株阳性；
被检样品电泳出现一条与弱毒株阳性对照大小相同的扩增片段（609 bp），判定为猪流行性腹泻病毒弱毒株阳性；
被检样品电泳不出现扩增片段，判定为猪流行性腹泻病毒阴性。
6）结果
经检测，华东地区58份疑似猪流行性腹泻发病猪的粪便样品有41份为猪流行性腹泻病毒强毒株阳性，其RT-PCR扩增产物与强毒株阳性对照的扩增片段数量和大小一致，有二条带，分别为609 bp和341bp。
、特异性实验
用鉴别诊断猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株RT-PCR检测试剂盒检测其他可能引起猪腹泻的病毒（猪传染性胃肠炎病毒TGEV JS2012株，郭容利, 倪艳秀, 温立斌, 等.猪传染性胃肠炎病毒江苏株的分离与鉴定及其 S 基因序列分析. 华北农学报，2013, 28(5):74-79；猪轮状病毒PRV Nan86株，倪艳秀,林继煌,陆承平,等. 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测轮状病毒. 中国兽医学报，1998,18(8):437-440）和健康猪样品。结果显示，用本发明鉴别诊断猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株RT-PCR检测试剂盒检测的其他可能引起猪腹泻的病毒、健康猪样品均为阴性，结果见附图1。表明建立的鉴别诊断猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株强毒株和弱毒株RT-PCR检测试剂盒具有良好的特异性，可准确判定样品中是否存在猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株。
、灵敏度试验
在反转录反应体系中加入不同浓度的总RNA，进行灵敏度试验。具体地，在20μL反转录体系中，加1μL连续10倍稀释后的总RNA。按照本发明的方法，PCR反应体系中加入2μL的cDNA，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行扩增，结果如图2所示，利用本发明方法，猪流行性腹泻病毒强毒株阳性样品可以检测出609 bp和341bp DNA片段，本发明方法用于检测猪流行性腹泻病毒强毒株灵敏度高，最小检测量为100fg/μL样品RNA，效果非常好。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株鉴别诊断用引物及其检测试剂盒
<130> 0
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> PEDV-MF
<222> (1)..(23)
<223>
<400> 1
tattcccgtt gatgaggtga ttg 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> PEDV-MR
<222> (1)..(22)
<223>
<400> 2
gctgaatagt cgccgtgttt tg 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> PEDV-ORF3F
<222> (1)..(23)
<223>
<400> 3
gggtcctaga cttcaacctt acg 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> PEDV-ORF3R
<222> (1)..(25)
<223>
<400> 4
atagttgcat ctaaaagtgc accac 25
Claims (6)
1.猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株鉴别诊断用引物，包括
M基因正向引物PEDV-MF(SEQ ID NO.1)：5’-TATTCCCGTTGATGAGGTGATTG-3’和反向引物PEDV-MR(SEQ ID NO.2)：5’-GCTGAATAGTCGCCGTGTTTTG-3’
该引物从感染猪流行性腹泻病毒强毒株或弱毒株的病料提取的总RNA中都可扩增出609bp DNA片段；
ORF3基因正向引物PEDV-ORF3F(SEQ ID NO.3)：5’-GGGTCCTAGACTTCAACCTTACG-3’和反向引物PEDV-ORF3R(SEQ ID NO.4)：5’-ATAGTTGCATCTAAAAGTGCACCAC-3’
该引物从感染猪流行性腹泻病毒强毒株的病料提取的总RNA中可扩增出341bp DNA片段；
该引物不能从感染猪流行性腹泻病毒弱毒株的病料提取的总RNA中扩增出341bp DNA片段。
2.根据权利要求1所述猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株鉴别诊断用引物，其特征在于，所述强毒株为猪流行性腹泻病毒强毒株PEDV AH2012；所述弱毒株为猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV JS2008。
3.一种用于检测猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1或2所述的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，包括：
(1)阴性对照：取灭菌的DEPC水，置-20℃冰箱保存；
(2)RT反应液：
5×qRT Super Mix：4.0μL；无菌DEPC水：6.0μL；
混匀后-20℃保存；
(3)PCR反应液：
2×HS PCR Mix：12.5μL；10μM SEQ ID NO.1：2.0μL；10μM SEQ ID NO.2：2.0μL；10μMSEQ ID NO.3:0.5μL；10μM SEQ ID NO.4：0.5μL；无菌DEPC水5.5μL；
混匀后-20℃保存。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，还包括：强毒株阳性对照为猪流行性腹泻病毒强毒株PEDV AH2012发生腹泻的粪便样品和弱毒株阳性对照为猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDVJS2008的细胞毒。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株的方法包括：
1)样品处理：采集疑似猪流行性腹泻发病猪的粪便样品，在粪便中按1：10加入DEPC水，剧烈震荡使其混和均匀，8000rpm离心5min，取200μL上清液，置1.5mL灭菌离心管中待用；
强毒株阳性对照样品：取强毒株阳性对照样品200μL，置1.5mL灭菌离心管中待用；
弱毒株阳性对照样品：取弱毒株阳性对照样品200μL，置1.5mL灭菌离心管中待用；
阴性对照样品：取阴性对照样品200μL，置1.5mL灭菌离心管中待用；
2)总RNA的提取：取已处理的待检样品、强毒株阳性对照样品、弱毒株阳性对照样品、阴性对照样品，加800μL Trizol，振荡混匀后，室温放置5min，加入氯仿200μL，剧烈振荡后，室温放置5min，4℃12000rpm，离心10min，取上清，加入0.5mL异丙醇，混匀，室温放置20min，4℃12000rpm离心15min，去上清，沉淀用1mL无RNA酶的75％乙醇溶液洗涤，4℃7500rpm离心5min，去上清，室温干燥RNA沉淀20min，加入DEPC水10μL，使充分溶解，-20℃冻存备用；
3)RT反应：在20μL反应体系中加入5×qRT Super Mix 4.0μL，无菌DEPC水6.0μL，总RNA10.0μL；瞬间离心混匀，25℃反应15min，42℃孵育60min，95℃5min；
4)PCR扩增：在25μL反应体系中加入2×HS PCR MIX 12.5μL，SEQ ID NO.12.0μL，SEQID NO.2 2.0μL，SEQ ID NO.3 0.5μL，SEQ ID NO.4 0.5μL，cDNA 2.0μL，DEPC水5.5μL；PCR反应条件：95℃5min预变性后，95℃30s，55℃30s，72℃45s，40个循环后，72℃延伸10min；
5)判定猪流行性腹泻病毒强毒株和弱毒株
被检样品电泳出现二条与强毒株阳性对照大小相同的扩增片段609bp和341bp，判定为猪流行性腹泻病毒强毒株阳性；
被检样品电泳出现一条与弱毒株阳性对照大小相同的扩增片段609bp，判定为猪流行性腹泻病毒弱毒株阳性；
被检样品电泳不出现扩增片段，判定为猪流行性腹泻病毒阴性。
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