CN106222299A

CN106222299A - 一种检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量pcr试剂盒及其用途

Info

Publication number: CN106222299A
Application number: CN201610626179.0A
Authority: CN
Inventors: 黄小波; 李亚青; 曹三杰; 文心田; 伍锐; 文翼平; 张雨迪
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2016-08-02
Filing date: 2016-08-02
Publication date: 2016-12-14

Abstract

本发明提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR试剂盒，它包含SEQ ID NO:1‑2所示的引物对，扩增猪流行性腹泻病毒基因。本发明还提供了该试剂盒的用途及一种检测猪流行性腹泻病毒的方法。本发明试剂盒，可以准确、有效的检测猪流行性腹泻病毒，灵敏度高，特异性强，重复性好，检测快速，应用前景良好。

Description

一种检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR试剂盒及其用途

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR试剂盒及其用途。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。截止到2015年，PED已蔓延到大多数养猪国家，在欧洲、东南亚、美洲地区(美国、加拿大、墨西哥)、日本、韩国等地成为世界性的养猪疾病，给全球养猪业造成了巨大的经济损失，PED已成为世界范围内养猪业共同关注并急需解决的问题。

由于当前对PED的免疫防控效果不是非常理想，为了更好的预防和控制PED,在疾病初期诊断该病，及早定量病毒含量并进行处理就尤为重要。目前，对PEDV的诊断方法主要有临床诊断、ELISA、RT-PCR等。其中，RT-PCR方法操作简便、准确度较高，容易进行临床推广应用。

但现有文献中制备的RT-PCR检测试剂盒，灵敏度仍不够高，不能满足临床诊断的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR试剂盒及其用途。

本发明提供了一种检测PEDV的荧光定量PCR试剂盒，它包含SEQ ID NO:1-2所示的引物对，扩增猪流行性腹泻病毒基因。

其中，它还包含：RT-PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、荧光染料。

其中，所述荧光染料为Eva Green荧光染料。

本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的方法，它包括如下步骤：

(1)模板制备：提取待检样本中的RNA，反转录为cDNA；

(2)扩增：采用核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示的引物对，以步骤(1)的样本cDNA为模板，PCR扩增；

(3)结果检测：对扩增结果进行检测，即可。

其中，所述PCR扩增时使用了Eva Green荧光染料。

本发明还提供了上述试剂盒在制备诊断猪流行性腹泻病毒的试剂中的用途。

本发明还提供了上述试剂盒在制备区分猪流行性腹泻病毒强毒株与弱毒株的试剂中的用途。

ORF3基因是PEDV一个重要的非结构蛋白的编码基因，具有重要的生物学功能，例如与病毒的毒力存在一定的关系，且强弱毒株之间存在碱基差异现象。

本发明的荧光定量PCR试剂盒，可以准确、有效的检测猪流行性腹泻病毒，而且可以区分强毒株和弱毒株，对免疫猪群PEDV野毒感染和疫苗免疫做出快速准确的鉴别诊断，尤其是对PEDV弱毒疫苗免疫后仍爆发PEDV野毒感染的研究更有临床意义；灵敏度高，病毒的最低检测浓度分别为强毒株4.79×10⁰copies/μL；弱毒株5.17×10⁰copies/μL，特异性强，重复性好，检测快速，可用于临床诊断、弱毒疫苗病毒含量监测和病毒组织分布检测等，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为PEDV ORF3基因扩增结果图；其中，M:DL500；1：弱毒PEDV；2：强毒PEDV；3：阴性对照

图2为EG-qRT-PCR引物浓度优化熔解曲线图

图3为EG-qRT-PCR退火温度优化熔解曲线图

图4为野毒株EG-qRT-PCR扩增曲线图

图5为野毒株EG-qRT-PCR标准曲线图

图6为弱毒株EG-qRT-PCR扩增曲线图

图7为弱毒株EG-qRT-PCR标准曲线图

图8为EG-qRT-PCR熔解曲线图；蓝线：野毒株；红线：弱毒株

图9为野毒株特异性实验结果图；其中，

1-9分别为：PEDV、TGEV、PoRV、JEV、PRRSV、PCV、PPV、PRV、阴性

图10为弱毒株特异性实验结果图；其中，

1-9分别为：PEDV、TGEV、PoRV、JEV、PRRSV、PCV、PPV、PRV、阴性

图11为强毒株PEDV敏感性检测图；其中，

1-10：4.79×10⁶copies/μL～4.79×10^-3copies/μL

图12为弱毒株PEDV敏感性检测图；其中，

1-10：5.17×10⁶copies/μL～5.17×10^-3copies/μL

图13为PEDV在不同组织的含量分布图

图14为不同组织器官病变图；A：仔猪消瘦、精神不振，被毛粗乱，拉稀粪；B：肠道充血、鼓气、变透明，内部含有未消化的黄色乳糜状内容物；肠系膜淋巴结肿大充血；C：心脏表明有绒毛、粗糙、增厚；D：肝脏呈胆黄素沉积；E：脾脏肿大，形状不规则，边缘钝化卷曲；F：肺部有坏死、结节，边缘钝化；G：肾脏表面有针尖大小出血点，肾椎体和肾乳头充血。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的实验试剂与仪器如下：

1、菌株、质粒

猪腹泻病料、大肠杆菌DH5α、TGEV-PEDV二联灭活苗、TGEV-PEDV-PoRV三联灭活苗、TGEV-PEDV-PoRV三联活疫苗由本实验室保存；

2、主要试剂

MarkerⅢ、总RNA提取试剂盒、酵母提取物、胰蛋白胨、氨苄青霉素、2xTaqPCRMastermix均购自天根生化有限公司；DL500、DL2000、DL4500、pMD-19T simple Vector、T₄连接酶、PrimeScript RT reagent Kit均购自大连宝生物工程有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自OMEGA公司；2×SsoFast^TM EG Supermix购自Bio-Rad公司。

3、主要仪器设备

Legend Micro 17R centrifuge离心机、Sorvall ST 16R高速冷冻离心机、恒温振荡培养箱，美国Thermo公司；MyCyclerTM PCR仪、POWER Pac TM电泳仪及水平电泳槽、UNIVERSAL HOOD凝胶成像系统、SmartspecTM Plus核酸蛋白仪、荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；WaterPro Plus超纯水仪，美国LABCONCO公司。

实施例1 本发明荧光定量PCR试剂盒的制备

1、实验方法

1.1引物设计

根据对强毒株(AF353511)和弱毒株(EU054930)序列的分析，选取ORF3基因作为靶序列设计合成一对特异性荧光定量引物(见表1)，并且该引物扩增强毒株、弱毒株得到的片段大小不同，其中扩增强毒株得到238bp片段，扩增弱毒株得到187bp片段，因此，还可以用来鉴别诊断PEDV强弱毒株。

其中ORF3-F/ORF3-R用来构建标准质粒；F1/R1作为RT-PCR检测引物。

表1 荧光定量引物

1.2Eva Green荧光定量检测方法的建立

1.2.1标准质粒的制备

以强毒阳性样品和弱毒疫苗株为材料，取小肠组织，按照总RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA。

以提取的PEDV病毒总RNA为模板，以试剂盒中的Random 6mers为引物，进行反转录合成cDNA，反转录体系如下：

反应程序：37℃，15min；85℃，5s；12℃保存。

以反转录合成的cDNA为模板，进行PCR，PCR反应体系如下：

反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳进行分析。

扩增的PCR产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳后，按照小量胶回收试剂盒的使用说明书进行DNA回收。将胶回收的目的基因片段与pMD19-T simple vector在16℃过夜连接，反应体系如下：

将ORF3基因的连接产物转化DH_5α感受态细胞，随机挑选Amp⁺LB平扳上的白色菌落，接种于5mL LB液体培养基(含Amp⁺100μL/mL)37℃培养过夜。进行RT-PCR鉴定，反应结束后取7μL PCR产物进行2.0％的琼脂糖凝胶电泳分析，体系如下：

将鉴定为阳性的菌液接种于5mL LB液体培养基(含Amp 100μL/mL)37℃培养过夜，按照OMEGA公司的小量质粒提取试剂盒提取重组质粒，质粒经测序正确后，用核酸蛋白仪测定PEDV强弱毒质粒在0D₂₆₀和OD₂₈₀处的吸光度，计算0D₂₆₀和OD₂₈₀之间的比值，检测核酸纯度，位于1.7～1.9之间时纯度较高。在用公式拷贝数/μL＝(6.02×10²³)×(OD₂₆₀×50ng/μL×稀释倍数)/(片段长度×660)计算出PEDV强弱毒质粒DNA的浓度。

1.2.2荧光定量PCR反应条件的优化

将质粒做10倍倍比稀释，选取浓度在10³～10⁸copies/μL的质粒做3个重复，根据引物的Tm值设置温度梯度55-60℃，确定最佳退火温度，在以最佳温度优化引物浓度。根据优化好的条件，建立Eva Green实时荧光定量PCR(EG-qRT-PCR)。

反应体系见表2。

表2 荧光定量PCR反应体系

其中，cDNA模板的来源及提取方法如下：

以阳性样品小肠组织为材料，按照总RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA。

以提取的PEDV病毒总RNA为模板，以Random 6mers为引物，进行反转录合成cDNA，反转录体系如下：

反应程序：37℃，15min；85℃，5s；12℃保存。

1.2.3标准曲线和熔解曲线的建立

分别将10³～10⁸copies/μL标准质粒做3个重复，并设置阴性对照。以DNA拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标建立标准曲线，同时生成熔解曲线。

2、实验结果

2.1标准质粒的构建

经PCR产物的胶回收、目的片段与T载体连接、重组载体的转化及鉴定测序后(图1)，目的片段大小为238bp和187bp。核酸蛋白仪测定强弱毒质粒OD₂₆₀及OD₂₈₀后，其强毒OD₂₆₀/OD₂₈₀＝0.125/0.070＝1.79，弱毒OD₂₆₀/OD₂₈₀＝0.106/0.058＝1.83，比值均介于1.7～1.9之间，纯度较好。经计算后强毒和弱毒质粒DNA的浓度分别为4.79×10¹¹copies/μL，5.17×10¹¹copies/μL。

2.2荧光定量退火温度及引物浓度优化结果

经退火温度及引物浓度优化后，在0.6μL(图2)和57℃(图3)时，扩增效率最好且曲线平滑。因此选则引物浓度为0.6μL，退火温度为57℃。

3.3标准曲线和熔解曲线的制作

当浓度分别在4.79×10³～4.79×10⁸copies/μL，5.17×10³～5.17×10⁸copies/μL时，建立的标准曲线最理想，得到野毒株(即强毒株，图4-5)和疫苗株(即弱毒株，图6-7)的扩增曲线和标准曲线，扩增效率分别为114.2％、105.0％，相关系数分别为0.999和0.993。

其野毒株和弱毒疫苗株熔解温度(Tm)分别为(79.5±0.3)℃和(80.5±0.3)℃(图8)，熔解曲线中均只出现1个扩增峰。通过标准曲线得到的方程分别为y＝－3.0266x+46.981和y＝－3.2201x+45.325。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1 特异性试验

1、实验方法

分别提取猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)的总RNA，反转录成cDNA，和猪流行性腹泻病毒(PEDV)一起进行EG-qRT-PCR，同时设立阴性对照(阴性对照的模板用的是灭菌的ddH₂O)

荧光定量反应体系同表2，反应程序为：95℃30s；95℃5s，57℃10s，40个循环；最后生成熔解曲线。

评价本发明试剂盒和方法的特异性。

2、实验结果

见图9-10。

由图9-10可知，使用本发明试剂盒检测，仅PEDV结果为阳性，其它7种病毒的检测记过均为阴性。

说明本发明试剂盒和方法的特异性强，只针对猪流行性腹泻病毒，不会检出其它病毒。

实验例2 灵敏度试验

1、实验方法

以10^-3～10⁶copies/μL标准质粒为模板(强弱毒株初始质粒浓度分别为4.79×10¹¹copies/μL、5.17×10¹¹copies/μL，从初始浓度稀释到10^-3copies/μL，选取10^-3～10⁶copies/μL进行灵敏性实验)，进行EG-qRT-PCR检测，对其灵敏度进行评价。

EG-qRT-PCR反应体系如下：

反应程序：95℃30s；95℃5s，57℃10s，40个循环；最后生成熔解曲线。

2、实验结果

以浓度4.79×10^-3copies/μL～4.79×10⁶copies/μL，5.17×10^-3copies/μL～5.17×10⁶copies/μL质粒标准品为模板分别进行EG-qRT-PCR，得出强毒能检测的下限分别为4.79×10⁰copies/μL(图11)。弱毒能检测的下限分别为5.17×10⁰copies/μL(图12)。

实验结果说明，采用本发明试剂盒检测，PDEV病毒的最低检测浓度分别为强毒株4.79×10⁰copies/μL，弱毒株5.17×10⁰copies/μL，灵敏度高。

实验例3 重复性试验

1、实验方法

对同一阳性标准质粒设3个重复管，用建立的EG-qRT-PCR法进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数；将-20℃冰箱保存的阳性标准质粒每隔1周进行复检，连续4周，评价其再现性，计算其组间变异系数。

2、实验结果

将野毒(表3-4)和弱毒(表5-6)的同一批3个不同浓度的标准品(4.79×10⁶～4.79×10⁸copies/μL，5.17×10⁶～5.17×10⁸copies/μL)进行批内重复实验，再用不同批次这3个浓度的标准品(4.79×10⁶～4.79×10⁸copies/μL，5.17×10⁶～5.17×10⁸copies/μL)为模板，每隔一周进行一次检测，连续四周，为批间重复实验。实验结果表明变异系数都控制在1.05％以内。

表3 野毒批内重复实验

表4 野毒批间重复实验

表5 弱毒批内重复实验

表6 弱毒批间重复实验

实验结果表明，采用本发明试剂盒检测，强毒、弱毒株PEDV的批内和批间重复试验变异系数均控制在了1.05％以内，重复性高。

实验例4 临床检测

1.1临床病料的检测

取来自四川彭州、蒲江、安岳、茂县等地的130份仔猪腹泻病料(表7)，分别提取其总RNA，反转录成cDNA，按照实施例1的荧光定量PCR反应体系和最优反应条件，进行荧光定量PCR检测。

表7 2014-2016年临床样品

1.2疫苗病毒含量的初步检测

取分别来自A公司的TGEV-PEDV二联灭活疫苗；B公司的TGEV-PEDV二联灭活疫苗；C公司的TGEV-PEDV二联灭活疫苗和D公司的TGEV-PEDV-PoRV三联活疫苗；按照实施例1的荧光定量PCR反应体系和最优反应条件，进行荧光定量PCR检测病毒含量。

疫苗测定方法如下：

(1)随机选取7瓶活疫苗，在超净工作台中将随机选取的的7瓶活疫苗按说明书用灭菌的DMEM稀释，分装至2mL离心管中标号；

取灭活苗8mL于10mL离心管中，于-80℃冰箱反复冰冻并在室温静置融化，疫苗分层后取上清液分装至2mL离心管中标号；

(2)分别取稀释的活疫苗、灭活苗上清液提取RNA，反转录为cDNA；

(4)以反转录的cDNA为模板进行EG-qRT-PCR。

1.3临床发病猪体内PEDV的组织分布

选取四川地区位于绵阳、三台、邛崃、新津的四个代表性猪场(表8)，记录发病猪的症状和病变，选取RT-PCR检测为阳性的病猪3-6头，按照实施例1的荧光定量PCR反应体系和最优反应条件，对全身各组织的病毒定位和含量测定。

表8 病猪不同组织样本数量分布

2、实验结果

2.1临床病料的检测结果

本发明EG-qRT-PCR的阳性检出率为72.31％(表9)。EG-qRT-PCR测定的阳性样品病毒含量为5.13×10⁵copies/μL～6.31×10¹⁰copies/μL(表10)。

表9 临床样品检测结果

表10 阳性样品病毒含量

实验结果表明，本发明试剂盒可以有效检测临床样品中猪流行性腹泻病毒，而且检测结果灵敏度高。

2.2PEDV商品疫苗病毒含量的检测

将A、B、C、D公司的疫苗抽提RNA进行反转录后，用EG-qRT-PCR方法检测病毒含量，结果灭活苗的病毒含量较低，最高只有5.80×10²copies/μL，而弱毒活疫苗的病毒含量为2.17×10⁶copies/μL～2.49×10⁸copies/μL(表11)。

表11 疫苗病毒含量

实验结果表明，本发明试剂盒可以有效检测疫苗中的猪流行性腹泻病毒含量。

2.3不同组织病毒含量检测

对心、肝、脾、肺、肾、肠淋巴结及肠组织进行PEDV含量检测，根据得到的标准曲线方程计算绘图，结果显示(表12，图13，图表中的数值均是log₁₀拷贝数值的对数值)四个猪场中均是肠组织的PEDV含量最多，其次为肠淋巴结、肾、心和肝组织，脾和肺组织的PEDV含量极少，只有偶尔才可以检测到，检出率最低。不同组织心、肝、脾、肺、肾、肠淋巴结和肠组织的PEDV含量分别为3.09×10⁵～4.47×10⁸copies/μL，8.91×10⁴～1.38×10⁸copies/μL，0～6.61×10⁵copies/μL，0～3.16×10⁶copies/μL，4.79×10⁵～6.31×10⁸copies/μL，1.12×10⁷～9.12×10⁹copies/μL，3.55×10⁹～3.16×10¹²copies/μL。

不同组织中PEDV浓度分布可以从0copies/μL到3.16×10¹²copies/μL，组织中PEDV的平均浓度为2.55×10¹copies/μL～1.21×10¹²copies/μL。

对病猪观察发现精神沉郁，有拉稀症状，气味腥臭；剖检后可见肠壁变薄透明、充血，肠系膜淋巴结肿大脾脏肿胀、肾脏点状出血等症状(图14)。

表12 病猪不同组织含量分布

实验结果表明，本发明试剂盒可以有效检测病猪全身各组织的猪流行性腹泻病毒含量。

综上，本发明的荧光定量PCR试剂盒，可以准确、有效的检测猪流行性腹泻病毒，而且可以区分强毒株和弱毒株；灵敏度高，病毒的最低检测浓度分别为强毒株4.79×10⁰copies/μL；弱毒株5.17×10⁰copies/μL，特异性强，重复性好检测快速，可用于临床诊断、弱毒疫苗病毒含量监测和病毒组织分布检测等，应用前景良好。

Claims

1.一种检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，它包含SEQ ID NO:1-2所示的引物对，扩增猪流行性腹泻病毒基因。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，它还包含：RT-PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、荧光染料。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为EvaGreen荧光染料。

4.一种检测猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)模板制备：提取待检样本中的RNA，反转录为cDNA；

(3)结果检测：对扩增结果进行检测，即可。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增时使用了Eva Green荧光染料。

6.权利要求1-3任意一项所述的试剂盒在制备诊断猪流行性腹泻病毒的试剂中的用途。

7.权利要求1-3任意一项所述的试剂盒在制备区分猪流行性腹泻病毒强毒株与弱毒株的试剂中的用途。