CN104531902A

CN104531902A - 一种试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN104531902A
Application number: CN201410848119.4A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 李春歌
Original assignee: Luoyang Pu Laikewantai Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co., Ltd.; Luoyang Zhongke gene detection and Diagnosis Center Co., Ltd.
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2034-12-31
Also published as: CN104531902B

Abstract

本发明提供了一种试剂盒，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒检测试剂盒。该试剂盒能够对样品中的猪流行性腹泻病毒进行通检，且简化现有方法中的繁琐的鉴别检测程序，避免通过基因序列测定进行鉴别检测的繁琐和耗时长的缺点。

Description

一种试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhoea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病，该病于1971年首次报道于荷兰，我国于1976年发现本病。PEDV破坏感染猪空肠和回肠上皮细胞和肠绒毛，导致腹泻，引起仔猪死亡，从而造成养猪业严重的经济损失。特别是2010年以来，PEDV在亚洲主要养猪国家和美国呈现大规模爆发。

PEDV基因组是单股正链的RNA，全长27000-33000个核苷酸(nt)，基因组序列包含6个ORF，从5`→3`依次为编码复制酶多聚蛋白、纤突蛋白(S)、ORF3蛋白、次要嵌膜蛋白(E)、主要嵌膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)的基因。

研究人员针对PEDV临床流行毒株设计了PCR扩增引物和相关的检测方法，包括：(1)针对PEDV的N蛋白的保守区设计的引物而进行PEDV的通用检测方法，但不能区分PEDV经典株和近年来流行的变异株(郭容利,何孔旺,倪艳秀等.PEDV、TGEV、PARV多重RT-PCR检测方法的建立及其应用[J].江苏农业学报,2013,29(5):1065-1069)；(2)通过PCR扩增样品中PEDV的高变异区域而后通过测序鉴定是否是PEDV经典株或变异株，耗时长且费力，操作繁琐。

专利申请CN103060474A公开了通过设计特异性引物对猪流行性腹泻病毒变异株的S基因进行扩增，通过扩增片段的分子量大小，判断是否存在猪流行性腹泻病毒变异株。然而该方法不能满足临床针对猪流行性腹泻病毒经典株和变异株的通检，只能扩增变异株猪流行性腹泻病毒，临床应用需要利用其他的检测方法检测猪流行性腹泻病毒经典株，程序繁琐。

专利申请CN103805712A公开了通过针对猪流行性腹泻病毒基因组保守区设计一对特异性引物，可以对猪流行性腹泻病毒基因组模板进行特异性扩增，以此检测猪流行性腹泻病毒的存在。然而该发明不能够区分近年来临床上流行的变异的猪流行性腹泻病毒和经典的猪流行性腹泻病毒，不利于在分子生物学水平上快速检测区分临床样品中猪流行性腹泻病毒。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种快速检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，不仅满足了区分猪流行性腹泻病毒经典株和变异株的现实需求，能简单、快捷、有效地针对猪流行性腹泻病毒进行毒株差异鉴定，同时还实现了不漏检临床样品中的猪流行性腹泻病毒的目的，同时简化了猪流行性腹泻病毒经典株和变异株的鉴定时间和程序。

本发明的第一方面在于提供一种试剂盒，所述试剂盒包括能扩增PEDV S1蛋白基因中包含5`端启动子前第28位核苷酸至启动子后第532位核苷酸的核苷酸序列的上、下游引物，以及Pst I限制性内切酶。

术语“PEDV S1蛋白”即为“猪流行性腹泻病毒S1蛋白”，位于猪流行性腹泻病毒S蛋白的功能区之一，由789个氨基酸组成(参见猪流行性腹泻病毒S1蛋白截短表达及多抗制备，任晓峰，贾文龙，东北农业大学学报,2013,44(9):46-50)。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述上游引物为SEQ ID NO.2编码的核苷酸序列，下游引物为SEQ ID NO.3编码的核苷酸序列。

上述引物设计参考CV777毒株全基因组序列，CV777毒株GenBank登录号为AF353511。

优选地，所述试剂盒中PCR反应液包括序列为SEQ ID NO.2的上游引物，序列为SEQ ID NO.3的下游引物，或包含所述引物序列扩增相同基因序列的核苷酸引物序列；更优选地，所述试剂盒中PCR反应液中的上游引物、下游引物各50μl。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒进一步包含PCR反应体系和限制性酶切反应体系；其中，所述PCR反应体系包括dNTPs、DNA聚合酶、Mg²⁺、反转录酶、RNA酶抑制剂、稳定剂；以及所述限制性酶切反应体系包括Pst I酶切缓冲液、双蒸水。

所述稳定剂用于稳定DNA聚合酶的活性，主要成分包括甘油、山梨醇、甘露醇、肌醇、PEG等。

优选地，所述试剂盒中PCR反应液还包括：2×RT-PCR Master Mix，双蒸水；所述2×RT-PCR Master Mix液包含dNTPs、DNA聚合酶、Mg²⁺、反转录酶、RNA酶抑制剂、稳定剂等。

在本发明的一个具体实施方式中，所述试剂盒中PCR反应液包括：2×RT-PCR Master Mix 500μl，双蒸水500μl。

在本发明的一个具体实施方式中，所述试剂盒中限制性酶切反应体系还包括10×酶切反应液、双蒸水。

在本发明的一个优选实施方式中，所述检测试剂盒中限制性酶切反应体系包括：10×酶切缓冲液40μl，限制性内切酶PstⅠ酶20μl，双蒸水500μl。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包含阴性对照和阳性对照；其中，所述阴性对照为磷酸盐缓冲液；以及所述阳性对照包括猪流行性腹泻病毒经典株的培养物、猪流行性腹泻病毒变异株的培养物。

优选地，所述阴性对照为pH7.2的磷酸盐缓冲液。

术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约pH4至约pH10的范围，优选约pH5至pH9的范围，更有选约pH6至约pH8的范围，最优选约pH7.2。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。

术语“猪流行性腹泻病毒经典株”为临床使用的PEDV活疫苗毒株或与疫苗毒株相似的临床流行多年的PEDV毒株，如：CV777株(保藏号为CCTCC-V200608，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2006年11月16日，该毒株已在中国专利CN101117627A中公开)；ZJ08株(保藏号为CGMCC No.7806，该毒株已在中国专利CN103725651A中公开)；韩国DR13株、CPF1074株、PFF513株、KPD-9F株、SM98株；比利时Brl/87株和日本JMe2株、P-5V株(韩国DR13株、CPF1074株、PFF513株公开于猪流行性腹泻病毒FJ-11A株的分离与ORF3基因序列分析，陈如敬，吴学敏，车勇良等，福建农业学报，2011,26(6):947-951；韩国KPD-9F株、比利时Brl/87株和日本JMe2株公开于专利申请抗猪流行性腹泻病毒高免血清及其制备方法，CN103705918A；SM98株公开于2010-2012年中国猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析，王晓梦等，第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集；P-5V株公开于2014年流行性腹泻最新防控，浙江诺倍威生物技术有限公司技术期刊，2014,3)等。

术语“猪流行性腹泻病毒变异株”是又称高致病性猪流行性腹泻病毒，包括但不限于其S1蛋白具有与SEQ ID No.1基本相同的核苷酸序列的PEDV。优选地，猪流行性腹泻病毒变异株其S1蛋白具有与SEQ ID No.1基本相同的核苷酸序列的PEDV。与SEQ ID No.1基本相同是指，PEDV的核苷酸序列优选包含与SEQ ID No.1有85％-100％相同的序列，优选在猪流行性腹泻病毒变异株并非本文所述PEDV的条件下，例如与作为参考病毒分离物的CH/FJND-3/2011相比，S1蛋白的核苷酸同源性低于91％，优选低于92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。猪流行性腹泻病毒变异株核苷酸序列优选有超过80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，与SEQ ID No.1相同，同样优选在猪流行性腹泻病毒变异株并非本文所述PEDV的条件下，例如与作为参考病毒分离物的CH/FJND-3/2011相比，S1蛋白的核苷酸同源性低于91％，优选低于92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地，所述猪流行性腹泻病毒变异株为HN1301株(猪流行性腹泻病毒HN1301株(Porcine epidemic diarrhea virus,strain HN1301)，其保藏号为CCTCC NO：V201341，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市·武汉大学，保藏日期为2013年9月16日)、AH2012株、BJ-2011-1株、GDYG株(AH2012株、BJ-2011-1株、GDYG株公开于猪流行性腹泻病毒变异株N基因的克隆及原核表达，孙冰等，畜牧与兽医，2014,46(5):72-76)。

术语“同源性”是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标氨基酸(或核苷酸)序列与参比氨基酸(或核苷酸)序列进行序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸(或核苷酸)序列之间相同氨基酸(或核苷酸)的百分比。氨基酸(或核苷酸)序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心NCBI的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，Altschul S.F.et al，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.et al，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例如，Higgins D.G.et al，Methods in Enzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.et al，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot O.et al，Nucleic Acids Res.，31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.etal，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻病毒经典株的培养物为CV777株、ZJ08株、DR-13株、CPF1074株、PFF513株、KPD-9F株、SM98株、Brl/87株、JMe2株和P-5V株的培养物；以及所述猪流行性腹泻病毒变异株的培养物为变异株S1蛋白具有与SEQ ID No.1实质上相同的核苷酸序列的PEDV的培养物。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述猪流行性腹泻病毒变异株的培养物包括猪流行性腹泻病毒HN1301株、AH2012株、BJ-2011-1株、GDYG株。

本发明“实质上相同的核苷酸序列”意指编码与SEQ ID NO.1编码的蛋白相同或功能相同的蛋白对应的核苷酸序列。

作为本发明的一种实施方式，本发明的试剂盒中，所述试剂盒还包含猪流行性腹泻病毒基因组提取体系。

本发明的另一方面在于提供所述试剂盒的制备方法，其中，所述方法包括：(1)合成所述能扩增PEDV S1蛋白基因中包含5`端启动子前第28位核苷酸至启动子后第532位核苷酸的核苷酸序列的上、下游引物；以及(2)将所述引物与Pst I限制性内切酶、PCR反应体系和Pst I限制性酶切反应体系、阴性对照、阳性对照组装成试剂盒。

优选地，所述步骤(1)中所述引物为序列为SEQ ID NO.2的上游引物，序列为SEQ ID NO.3的下游引物；所述PCR反应液还包括2×RT-PCR Master Mix 500μl，双蒸水500μl。

优选地，所述步骤(2)中酶切反应液包括：10×酶切缓冲液40μl，限制性内切酶PstⅠ酶20μl，双蒸水500μl。

优选地，所述步骤(3)中阴性对照为pH7.2的磷酸盐缓冲液，阳性对照为猪流行性腹泻病毒经典株的培养物、猪流行性腹泻病毒变异株的培养物。

本发明的另一方面在于提供所述试剂盒的使用方法，其中，所述方法包括：(1)提取样品中病毒基因组；(2)使用引物对所述步骤(1)提取的病毒基因组进行RT-PCR扩增；(3)对所述步骤(2)扩增的PCR产物进行Pst I酶切鉴定；以及(4)根据所述Pst I酶切结果进行判定。

本发明的试剂盒的使用方法可以用于死体动物的检测，也可用于流行病学分析。

作为本发明的一种实施方式，所述检测试剂盒的使用方法包括：(1)样品中病毒基因组核酸的制备；(2)使用引物进行RT-PCR扩增；(3)PCR产物进行Pst I酶切鉴定；(4)根据判定标准对鉴定结果进行分析，判定样品中是否存在PEDV毒株及其种类，阳性对照和阴性对照的PCR扩增条带的有无决定了检测过程是否有效，若两个阳性对照均出现扩增条带，阴性对照不出现条带，说明RT-PCR检测过程有效，样品中若出现扩增条带，则说明样品中存在PEDV毒株；当PCR产物进行Pst I酶切鉴定后，若阳性对照1经酶切消化后的产物仍为1条条带，而阳性对照2经酶切消化后的产物产生两条大小分别约为377bp和163bp的条带，则说明酶切检测过程有效，样品酶切结果经电泳分离后仅出现一条带，则说明样品中含猪流行性腹泻病毒经典株，酶切结果经电泳分离后出现两条带，则说明样品中含猪流行性腹泻病毒变异株。

作为本发明的一种优选实施方式，所述检测试剂盒的使用方法包括：(1)样品中病毒基因组核酸的制备；(2)使用SEQ ID NO.2编码的上游引物，SEQ ID NO.3编码的下游引物进行RT-PCR扩增；(3)PCR产物进行Pst I酶切鉴定；(4)根据判定标准对鉴定结果进行分析，判定样品中是否存在PEDV毒株及其种类，阳性对照和阴性对照的PCR扩增条带的有无决定了检测过程是否有效，若两个阳性对照均出现约540bp的条带，阴性对照不出现条带，说明RT-PCR检测过程有效，样品中若出现约540bp的条带，则说明样品中存在PEDV毒株；PCR产物进一步通过PstI酶切，若阳性对照1经酶切消化后的产物仍为1条540bp的条带，而阳性对照2经酶切消化后的产物产生两条大小分别约为377bp和163bp的条带，则说明酶切检测过程有效，样品中若出现上述大小的两条带，则可判定样品中含有PEDV变异株，若样品中的PCR产物不被酶切消化，则可判定样品中含有PEDV经典株。

本发明的优势在于：

该检测试剂盒能够区分猪流行性腹泻病毒经典株和变异株，同时不漏检临床样品中的猪流行性腹泻病毒；简化猪流行性腹泻病毒经典株和变异株的鉴定时间和程序。

附图说明

图1为PCR扩增猪流行性腹泻病毒S1基因540bp基因片段电泳图，图中，泳道1：DNA Marker，由上至下依次为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp；泳道2：猪流行性腹泻病毒经典株；泳道3：近年流行的猪流行性腹泻病毒变异株；泳道4：PCR阴性对照。

图2为猪流行性腹泻病毒PCR扩增产物酶切结果电泳图，图中，泳道1：DNA Marker，由上至下依次为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp；泳道2：猪流行性腹泻病毒经典株；泳道3：近年流行的猪流行性腹泻病毒变异株；泳道4：PCR阴性对照。

序列表中：

序列1为猪流行性腹泻病毒变异株S1蛋白基因序列；

序列2为本发明试剂盒中PCR扩增上游引物序列；

序列3为本发明试剂盒中PCR扩增下游引物序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用阴性对照即磷酸盐缓冲液为pH7.2、0.01M的PBS，但该实施方式无论在任何情况均不构成本发明的限定。本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

本发明实施例中所用阳性毒株1为猪流行性腹泻病毒经典株CV777株，保藏号为CCTCC-V200608，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2006年11月16日，该毒株已在中国专利CN101117627A中公开；所用阳性毒株2为猪流行性腹泻病毒变异株HN1301株(即Porcine epidemic diarrhea virus,strainHN1301)，其保藏号为CCTCC NO.V201341，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2013年9月16日。

本发明实施例以猪流行性腹泻病毒经典株CV777株、猪流行性腹泻病毒变异株HN1301株说明本发明。

本发明中检测试剂盒的判定标准为：阳性对照和阴性对照的PCR扩增条带的有无决定了检测过程是否有效，若两个阳性对照均出现约540bp的条带，阴性对照不出现条带，说明RT-PCR检测过程有效，样品中若出现约540bp的条带，则说明样品中存在PEDV毒株；PCR产物进一步通过PstI酶切，若阳性对照1经酶切消化后的产物仍为1条540bp的条带，而阳性对照2经酶切消化后的产物产生两条大小分别约为377bp和163bp的条带，则说明酶切检测过程有效，样品中若出现上述大小的两条带，则可判定样品中含有PEDV变异株，若样品中的PCR产物不被酶切消化，则可判定样品中含有PEDV经典株。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1.检测试剂盒的制备

1.1引物合成

通过对猪流行性腹泻病毒经典株和近年来流行的猪流行性腹泻病毒变异株的S1基因进行比对分析，设计一对猪流行性腹泻病毒特异性引物来扩增S1基因5`端大小约为540bp的片段，通过PCR反应可鉴别猪流行性腹泻病毒与其它病原。引物对和序列如下：

通过上述设计，获得一对猪流行性腹泻病毒的特异引物，分别用无菌双蒸水溶解，-20℃保存。

1.2配制PCR反应液(20份)

PCR反应液主要包括：上游引物PSF 40μl(浓度10μmoL/L)、下游引物PSR 40μl(浓度10μmoL/L)、2×PCR Master Mix 500μl、双蒸水328μl，进行分装，每个反应管分装。其中，引物的配制时，1nmol引物干粉中加入100μl双蒸水即得到浓度为10μmoL/L的引物。

1.3配置酶切反应液(20份)

主要包括：10×酶切缓冲液40μl、双蒸水340μl、限制性内切酶PstI酶20μl。

1.4配制试剂盒阴性对照、阳性对照

配制pH7.2的磷酸盐缓冲液作为阴性对照。

分别使用猪流行性腹泻病毒经典株CV777株和临床分离的猪流行性腹泻病毒变异株HN1301株在Vero细胞上的培养物做为阳性对照，通过细胞间接免疫荧光法测定病毒毒价，稀释至毒价为10^5.0TCID₅₀/ml，按0.5ml分装。

将上述制备好的PCR反应液、酶切反应液、阴性对照、阳性对照置于同一包装盒中，组成试剂盒，封装。

实施例2.检测试剂盒的使用

2.1样品中病毒基因组模板的制备

按照天根生化科技有限公司的病毒基因组RNA提取试剂盒说明书进行病毒基因组模板的提取和保存。

2.2PCR扩增

按照实施例1中1.2部分中所准备的试剂进行配制一步法PCR反应体系，反应体系为50μL体系，其中每个反应体系中包括25μl的2×PCR MasterMix、2μl的上游引物和2μl的下游引物、19μl的双蒸水和2μl的病毒基因组模板。配制完成后，将反应体系放置于PCR扩增仪中，设定反应程序为42℃45min，95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，进行35～40个循环，72℃保温5min，得扩增产物，取5μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪中观察记录结果。

依据判定标准，对结果(见图1)进行分析，分析结果表明：猪流行性腹泻病毒经典株和变异株均能够被扩增出大小约为540bp的特异性条带。

2.3酶切鉴定PCR产物

按照实施例1中1.3部分所准备的试剂进行配制酶切体系，酶切反应体系为20μl，其中每个反应体系中包括2μl的10×酶切缓冲液、1μl的PstI内切酶、5-10μl的PCR扩增产物，然后用双蒸水补齐体系至20μl，37℃水浴30min后进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪中观察结果。

依据判定标准，对结果(见图2)进行分析，分析结果表明：猪流行性腹泻病毒变异株PCR扩增产物出现两条预期的条带，而猪流行性腹泻病毒经典株则仍然只有一条条带，说明猪流行性腹泻病毒变异株能够被PstI酶切，该检测方法可区分猪流行性腹泻病毒经典株和变异株。

实施例3.检测试剂盒检测鉴定、区分现有猪流行性腹泻病毒

3.1检测鉴定所用毒株

利用实施例1所制备的检测试剂盒对多株猪流行性腹泻病毒经典株和变异株的S1蛋白基因序列进行检测鉴定，所选用的猪流行性腹泻病毒经典株与变异株代表性毒株的S1基因序列信息如下：

毒株名称	来源	登录号	株型
				CV777	比利时，1993	AF353511	经典株
Br1/87	英国，1987	Z25483	经典株
				DR-13	韩国，2007	JQ023161	经典株
SM98	韩国	GU937797	经典株

BP-5	日本	AB548618	经典株
				SD-M	中国	JX560761	经典株
NK	日本	AB548623	变异株
				Chinju99	韩国	AY167585	变异株
Kawahira	日本	AB548622	变异株
				KNU-0905	韩国	GU180148	变异株
BJ-2012-1	中国	JX435299	变异株
				CH/CG/11	中国	JQ627654	变异株

3.2鉴定结果

按照实施例2中检测试剂盒的使用方法，对上述猪流行性腹泻病毒经典株与变异株代表性毒株进行检测鉴定，结果显示，猪流行性腹泻病毒变异株PCR扩增产物出现两条预期的条带，而猪流行性腹泻病毒经典株则仍然只有一条预期条带，且阴性对照无条带，证明该检测方法可靠，并可有效区分现有猪流行性腹泻病毒经典株和变异株。

本发明与现有猪流行性腹泻病毒经典株和变异株鉴别检测方法相比具有以下优点：(1)可以对样品中的猪流行性腹泻病毒进行通检，避免使用现有方法可能造成的漏检；(2)可以简化现有方法中的繁琐的鉴别检测程序，避免通过基因序列测定进行经典株和变异株的鉴别检测的繁琐和耗时长的缺点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括能扩增PEDV S1蛋白基因中包含5`端启动子前第28位核苷酸至启动子后第532位核苷酸的核苷酸序列的上、下游引物，以及Pst I限制性内切酶。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，上游引物为SEQ ID NO.2编码的核苷酸序列，下游引物为SEQ ID NO.3编码的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含PCR反应体系和限制性酶切反应体系；

其中，所述PCR反应体系包括dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、反转录酶、RNA酶抑制剂、稳定剂；以及

所述限制性酶切反应体系包括Pst I酶切缓冲液、双蒸水。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含阴性对照和阳性对照；

其中，所述阴性对照为磷酸盐缓冲液；以及

所述阳性对照包括猪流行性腹泻病毒经典株的培养物、猪流行性腹泻病毒变异株的培养物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述猪流行性腹泻病毒经典株的培养物为CV777株、ZJ08株、DR-13株、CPF1074株、PFF513株、KPD-9F株、SM98株、Brl/87株、JMe2株和P-5V株的培养物；以及

所述猪流行性腹泻病毒变异株的培养物为变异株S1蛋白具有与SEQ ID No.1实质上相同的核苷酸序列的PEDV的培养物；优选地，所所述猪流行性腹泻病毒变异株的培养物包括猪流行性腹泻病毒HN1301株、AH2012株、BJ-2011-1株、GDYG株。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含病毒基因组提取体系。

7.一种制备权利要求1～6所述试剂盒的方法，其中，所述方法包括：

(1)合成所述能扩增PEDV S1蛋白基因中包含5`端启动子前第28位核苷酸至启动子后第532位核苷酸的核苷酸序列的上、下游引物；

(2)将所述引物与Pst I限制性内切酶、PCR反应体系和Pst I限制性酶切反应体系、阴性对照、阳性对照组装成试剂盒。

8.根据权利要求1～6所述试剂盒的使用方法，其中，所述方法包括：

(1)提取样品中病毒基因组；

(2)使用引物对所述步骤(1)提取的病毒基因组进行RT-PCR扩增；

(3)对所述步骤(2)扩增的PCR产物进行Pst I酶切鉴定；以及

(4)根据所述Pst I酶切结果进行判定。