CN102586409A - 猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法 - Google Patents
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Abstract
猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法。酶联免疫法需要制备抗体，周期较长；外界影响因素对酶联免疫法诊断方法的干扰性比较大。本发明分为猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒基因引物设计与合成、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重反转录聚合酶链式反应诊断方法的建立、二联反转录聚合酶链式反应引物浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应氯化镁浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应三磷酸碱基脱氧核苷酸浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应最佳退火温度的确定、二联反转录聚合酶链式反应敏感性试验、二联反转录聚合酶链式反应特异性试验。本发明用于检测猪传染性胃肠炎
。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的猪传染性胃肠炎的检测方法，具体涉及一种猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法。
背景技术
猪传染性胃肠炎病毒TGEV与猪流行性腹泻病毒PEDV引起的疾病在临床症状上极为相似；基因组结构上，猪呼吸道冠状病毒PRCV与猪传染性胃肠炎病毒TGEV具有较高的同源性，传统诊断方法很难区别。目前，猪传染性胃肠炎TGE和猪流行性腹泻PED的诊断方法主要有病毒中和试验、免疫荧光法、免疫电镜法、酶联免疫法ELISA和反转录聚合酶链式反应法等。
酶联免疫法ELISA需要制备抗体，周期较长；外界影响因素对酶联免疫法ELISA诊断方法的干扰性比较大；酶联免疫法ELISA诊断方法不能鉴别猪传染性胃肠炎病毒TGEV和呼吸冠状病毒PRCV。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用现代分子生物学技术，通过生物学软件设计猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV引物，并通过条件优化，建立了猪传染性胃肠炎病毒TGEV的多重反转录聚合酶链式反应鉴别诊断方法。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
一种猪传染性胃肠炎多重的反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的方法有八步，分别为猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV基因引物设计与合成、猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV多重反转录聚合酶链式反应RT-PCR诊断方法的建立、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR氯化镁MgCl2浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR最佳退火温度的确定、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR敏感性试验、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR特异性试验。
所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的引物设计与合成；根据基因库GenBank上已发表的猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV的纤突蛋白S蛋白基因序列，比较分析保守序列，按反转录聚合酶链式反应RT-PCR和多重反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物设计原则，通过欧立格Oligo6.0及普来模Primer5.0软件设计猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV基因引物，各基因引物序列和扩增片断大小见表2。1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV多重反转录聚合酶链式反应RT-PCR诊断方法的建立；
所述的猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR反应体系
建立如下二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR反应体系，总体积为25μL:
超纯水（ddH20） 7.87μl
缓冲液（10×PCR Buffer） 5.0μl
三磷酸碱基脱氧核苷酸[dNTP Mixture(2.5mmol/L)] 4.0μl
P3（10μmol/L） 0.5μl
P4（10μmol/L） 0.5μl
P5（10μmol/L） 0.5μl
P6（10μmol/L） 0.5μl
猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）互补脱氧核糖核酸(cDNA) 2.0μl
猪流行性腹泻病毒（PEDV）互补脱氧核糖核酸(cDNA) 2.0μl
氯化镁[MgCl
2
(25mmol/L) ] 2.0μl
聚合酶[rTaq （5U/μl）] 0.13μl。
将二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR产物及阴性对照产物同脱氧核糖核酸分子量标记物DL2000于1%琼脂糖凝胶电泳，经紫外检测仪检测并拍照;可以看出阴性对照无电泳带；PEDV和TGEV混合cDNA中在500bp上下有两条电泳带，大小分别约为584bp和426bp，分别为PEDV和TGEV的特异片段电泳带；TGEVcDNA中有一条大小约为426bp电泳带，为TGEV的特异片段电泳带；PEDVcDNA中有一条大小约为584bp电泳带，为PEDV的特异片段电泳带。
所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物浓度优化；
试验确定的猪传染性胃肠炎病毒TGEV模板稀释度，加入猪流行性腹泻病毒PEDV滴定的引物浓度最佳量及不同浓度的猪传染性胃肠炎病毒TGEV引物进行二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物优化; 引物浓度从8μmo1/L~10μmo1/L电泳带均较亮，相比之下引物浓度在8μmo1/L时，目的片段条带最为清晰，且完整性好，说明其扩增效好。
所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR氯化镁MgCl2浓度优化;
将氯化镁MgCl2反应终浓度分别定为0μmo1/L、2μmo1/L、4μmol/L、6μmo1/L、7μmo1/L、8μmo1/L和9μmo1/L，同时与猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV病毒cDNA模板进行滴定; 二联RT-PCR MgCl2最佳浓度为9μmol/L，其扩增的特异性电泳带最亮。
所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP浓度优化;
将三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP反应终浓度分别定为0μmo1/L、2μmo1/L、4μmo1/L、6μmo1/L、8μmo1/L、10μmo1/L、12μmo1/L、14μmo1/L、16μmo1/L和18μmo1/L，同时与猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV病毒cDNA模板进行滴定; 从8μmo1/L开始电泳条带都比较清晰而且较明亮，相比较，从14μmo1/L开始电泳条带的亮度无明显的变化，故dNTP最佳浓度为14μmo1/L。
所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR最佳退火温度的确定;
根据猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV单项PCR最佳退火温度，将二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR退火温度分别定为44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、和58℃; 二联RT-PCR引物随温度变化电泳条带变化不是很大，且在42~58℃范围内退火温度均出现电泳带。但是最为清晰整齐的是54℃，即最佳退火温度为54℃。
所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，其特征是:所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR敏感性试验;
将猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV病毒cDNA模板分别做100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9稀释，加入两种引物进行二联反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）反应; 二联RT-PCR可检测出10-7稀释的TGEV和10-5稀释的PEDV cDNA模板。据此计算出可检出TGEV 7.3TCID50和PEDV 9.6TCID50。
所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR特异性试验;
分别取猪传染性胃肠炎病毒TGEV cDNA模板、猪流行性腹泻病毒PEDV cDNA模板、猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV cDNA模板及对照病毒反转录产物进行二联反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）反应。只有猪传染性胃肠炎病毒TGEV ,cDNA模板和猪流行性腹泻病毒PEDV,cDNA模板在500bp上、下各有一条清晰的电泳条带，分别为PEDV和TGEV特异性扩增条带， TGEV和PEDV阳性对照有特异性条带，相应的HCV、PRV、PPV和PRRSV模板对照均无特异性条带，说明本试验建立的TGEV和PEDV PCR引物只能扩增自身核酸，而对HCV、PRV、PPV、和PRRSV核酸的扩增结果均为阴性。
有益效果：
1.本发明根据分子生物学技术的不断发展，反转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）以其敏感性高、特异性强越来越受到人们的重视。
本发明所建立的多重反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法，由于所设计的引物具有特异性故能够鉴别诊断猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和PRCV，并且在检测时间以及检测的灵敏性等诸多方面优于传统的检测方法。
本发明与传统的ELISA方法相比较，避免了制备抗体，节省了大量的时间。
本发明与传统的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）相比较，具有省时、省力、降低成本、减少产物污染等优点；在信息捕获、基因复杂性分析、应用范围等方面均优于传统反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），并且能够达到鉴别诊断的目的。
本发明根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因组自身特点，针对猪呼吸冠状病毒（PRCV）缺失的672bp C抗原位点设计引物，成功建立了检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的多重反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法。经扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV） S基因PCR产物分别为426bp和583bp，电泳可见，在500bp指示带上、下各有一条电泳带，达到了区分和鉴别的目的。通过对反应条件的优化，确立最佳反应体系为：引物浓度为8μmo1/L、氯化镁（MgCl
2
）浓度为9μmol/L、三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTP）浓度为14μmol/L、退火温度为54℃。该方法具有省时、省力、降低成本、减少产物污染等优点；在信息捕获、基因复杂性分析、应用范围等方面均优于传统反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。
多重反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法在病原检出时间、检测敏感性上明显优于间接ELISA，并且能够达到鉴别检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪呼吸冠状病毒（PRCV）的目的。
附图说明：
附图1是说明书中的表2-1，是引物序列及其扩增片断。
具体实施方式：
实施例1：
一种猪传染性胃肠炎多重的反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的方法有八步，分别为猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV基因引物设计与合成、猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV多重反转录聚合酶链式反应RT-PCR诊断方法的建立、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR氯化镁MgCl2浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR最佳退火温度的确定、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR敏感性试验、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR特异性试验。
实施例2：
实施例1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的引物设计与合成；根据基因库GenBank上已发表的猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV的纤突蛋白S蛋白基因序列，比较分析保守序列，按反转录聚合酶链式反应RT-PCR和多重反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物设计原则，通过欧立格Oligo6.0及普来模Primer5.0软件设计猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV基因引物，各基因引物序列和扩增片断大小见表2-1。
实施例3：
实施例1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV多重反转录聚合酶链式反应RT-PCR诊断方法的建立；
所述的猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR反应体系
建立如下二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR反应体系，总体积为25μL:
超纯水（ddH20） 7.87μl
缓冲液（10×PCR Buffer） 5.0μl
三磷酸碱基脱氧核苷酸[dNTP Mixture(2.5mmol/L)] 4.0μl
P3（10μmol/L） 0.5μl
P4（10μmol/L） 0.5μl
P5（10μmol/L） 0.5μl
P6（10μmol/L） 0.5μl
猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）互补脱氧核糖核酸(cDNA) 2.0μl
猪流行性腹泻病毒（PEDV）互补脱氧核糖核酸(cDNA) 2.0μl
氯化镁[MgCl
2
(25mmol/L) ] 2.0μl
聚合酶[rTaq （5U/μl）] 0.13μl
将二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR产物及阴性对照产物同脱氧核糖核酸分子量标记物DL2000于1%琼脂糖凝胶电泳，经紫外检测仪检测并拍照;可以看出阴性对照无电泳带；PEDV和TGEV混合cDNA中在500bp上下有两条电泳带，大小分别约为584bp和426bp，分别为PEDV和TGEV的特异片段电泳带；TGEVcDNA中有一条大小约为426bp电泳带，为TGEV的特异片段电泳带；PEDVcDNA中有一条大小约为584bp电泳带，为PEDV的特异片段电泳带。
实施例4：
实施例1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物浓度优化；
试验确定的猪传染性胃肠炎病毒TGEV模板稀释度，加入猪流行性腹泻病毒PEDV滴定的引物浓度最佳量及不同浓度的猪传染性胃肠炎病毒TGEV引物进行二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物优化; 引物浓度从8μmo1/L~10μmo1/L电泳带均较亮，相比之下引物浓度在8μmo1/L时，目的片段条带最为清晰，且完整性好，说明其扩增效好。
实施例5：
实施例1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR氯化镁MgCl2浓度优化;
将氯化镁MgCl2反应终浓度分别定为0μmo1/L、2μmo1/L、4μmol/L、6μmo1/L、7μmo1/L、8μmo1/L和9μmo1/L，同时与猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV病毒cDNA模板进行滴定; 二联RT-PCR MgCl2最佳浓度为9μmol/L，其扩增的特异性电泳带最亮。
实施例6：
实施例1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP浓度优化;
将三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP反应终浓度分别定为0μmo1/L、2μmo1/L、4μmo1/L、6μmo1/L、8μmo1/L、10μmo1/L、12μmo1/L、14μmo1/L、16μmo1/L和18μmo1/L，同时与猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV病毒cDNA模板进行滴定; 从8μmo1/L开始电泳条带都比较清晰而且较明亮，相比较，从14μmo1/L开始电泳条带的亮度无明显的变化，故dNTP最佳浓度为14μmo1/L。
实施例7：
实施例1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR最佳退火温度的确定;
根据猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV单项PCR最佳退火温度，将二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR退火温度分别定为44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、和58℃; 二联RT-PCR引物随温度变化电泳条带变化不是很大，且在42~58℃范围内退火温度均出现电泳带。但是最为清晰整齐的是54℃，即最佳退火温度为54℃。
实施例8：
实施例1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，其特征是:所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR敏感性试验;
将猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV病毒cDNA模板分别做100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9稀释，加入两种引物进行二联反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）反应; 二联RT-PCR可检测出10-7稀释的TGEV和10-5稀释的PEDV cDNA模板。据此计算出可检出TGEV 7.3TCID50和PEDV 9.6TCID50。
实施例9：
实施例1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR特异性试验;
分别取猪传染性胃肠炎病毒TGEV cDNA模板、猪流行性腹泻病毒PEDV cDNA模板、猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV cDNA模板及对照病毒反转录产物进行二联反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）反应。只有猪传染性胃肠炎病毒TGEV ,cDNA模板和猪流行性腹泻病毒PEDV,cDNA模板在500bp上、下各有一条清晰的电泳条带，分别为PEDV和TGEV特异性扩增条带， TGEV和PEDV阳性对照有特异性条带，相应的HCV、PRV、PPV和PRRSV模板对照均无特异性条带，说明本试验建立的TGEV和PEDV PCR引物只能扩增自身核酸，而对HCV、PRV、PPV、和PRRSV核酸的扩增结果均为阴性。
Claims (9)
1.一种猪传染性胃肠炎多重的反转录聚合酶链式反应检测方法，其特征是:所述的方法有八步，分别为猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV基因引物设计与合成、猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV多重反转录聚合酶链式反应RT-PCR诊断方法的建立、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR氯化镁MgCl2浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR最佳退火温度的确定、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR敏感性试验、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR特异性试验。
2.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，其特征是:所述的引物设计与合成；根据基因库GenBank上已发表的猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV的纤突蛋白S蛋白基因序列，比较分析保守序列，按反转录聚合酶链式反应RT-PCR和多重反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物设计原则，通过欧立格Oligo6.0及普来模Primer5.0软件设计猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV基因引物；所述的 猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR反应体系： 建立如下二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR反应体系，总体积为25μL:
超纯水（ddH20） 7.87μl
缓冲液（10×PCR Buffer） 5.0μl
三磷酸碱基脱氧核苷酸[dNTP Mixture(2.5mmol/L)] 4.0μl
P3（10μmol/L） 0.5μl
P4（10μmol/L） 0.5μl
P5（10μmol/L） 0.5μl
P6（10μmol/L） 0.5μl
猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）互补脱氧核糖核酸(cDNA) 2.0μl
猪流行性腹泻病毒（PEDV）互补脱氧核糖核酸(cDNA) 2.0μl
氯化镁[MgCl2 (25mmol/L) ] 2.0μl
聚合酶[rTaq （5U/μl）] 0.13μl
将二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR产物及阴性对照产物同脱氧核糖核酸分子量标记物DL2000于1%琼脂糖凝胶电泳，经紫外检测仪检测并拍照;可以看出阴性对照无电泳带；PEDV和TGEV混合cDNA中在500bp上下有两条电泳带，大小分别约为584bp和426bp，分别为PEDV和TGEV的特异片段电泳带；TGEVcDNA中有一条大小约为426bp电泳带，为TGEV的特异片段电泳带；PEDVcDNA中有一条大小约为584bp电泳带，为PEDV的特异片段电泳带。
3.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，其特征是:所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物浓度优化；试验确定的猪传染性胃肠炎病毒TGEV模板稀释度，加入猪流行性腹泻病毒PEDV滴定的引物浓度最佳量及不同浓度的猪传染性胃肠炎病毒TGEV引物进行二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物优化; 引物浓度从8μmo1/L~10μmo1/L电泳带均较亮，相比之下引物浓度在8μmo1/L时，目的片段条带最为清晰，且完整性好，说明其扩增效好。
4.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，其特征是:所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR氯化镁MgCl2浓度优化;将氯化镁MgCl2反应终浓度分别定为0μmo1/L、2μmo1/L、4μmol/L、6μmo1/L、7μmo1/L、8μmo1/L和9μmo1/L，同时与猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV病毒cDNA模板进行滴定; 二联RT-PCR MgCl2最佳浓度为9μmol/L，其扩增的特异性电泳带最亮。
5.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，其特征是:所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP浓度优化;将三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP反应终浓度分别定为0μmo1/L、2μmo1/L、4μmo1/L、6μmo1/L、8μmo1/L、10μmo1/L、12μmo1/L、14μmo1/L、16μmo1/L和18μmo1/L，同时与猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV病毒cDNA模板进行滴定; 从8μmo1/L开始电泳条带都比较清晰而且较明亮，相比较，从14μmo1/L开始电泳条带的亮度无明显的变化，故dNTP最佳浓度为14μmo1/L。
6.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，其特征是:所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR最佳退火温度的确定;根据猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV单项PCR最佳退火温度，将二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR退火温度分别定为44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、和58℃; 二联RT-PCR引物随温度变化电泳条带变化不是很大，且在42~58℃范围内退火温度均出现电泳带。
7.根据权利要求6所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，其特征是:最佳退火温度为54℃。
8.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，其特征是:所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR敏感性试验;将猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV病毒cDNA模板分别做100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9稀释，加入两种引物进行二联反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）反应; 二联RT-PCR可检测出10-7稀释的TGEV和10-5稀释的PEDV cDNA模板，据此计算出可检出TGEV 7.3TCID50和PEDV 9.6TCID50。
9.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，其特征是:所述的二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR特异性试验;分别取猪传染性胃肠炎病毒TGEV cDNA模板、猪流行性腹泻病毒PEDV cDNA模板、猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV cDNA模板及对照病毒反转录产物进行二联反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）反应；只有猪传染性胃肠炎病毒TGEV ,cDNA模板和猪流行性腹泻病毒PEDV,cDNA模板在500bp上、下各有一条清晰的电泳条带，分别为PEDV和TGEV特异性扩增条带， TGEV和PEDV阳性对照有特异性条带，相应的HCV、PRV、PPV和PRRSV模板对照均无特异性条带，说明本试验建立的TGEV和PEDV PCR引物只能扩增自身核酸，而对HCV、PRV、PPV、和PRRSV核酸的扩增结果均为阴性。
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