CN104388592A - 一种猪流行性腹泻病毒s基因rt-lamp检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种猪流行性腹泻病毒s基因rt-lamp检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒及检测方法，其包含缓冲剂、Bst DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、MgSO4、AMV反转录酶、钙黄绿素、MnCl2、抑制剂和以下6条引物SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:6。本发明所述的猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒，大大简化了实验步骤，提高了准确率。本发明的猪流行性腹泻病毒S基因的非诊断性RT-LAMP检测方法，为野外及基层实验室检测PEDV提供一种无需特殊仪器、更为简便、快速、特异的检测猪流行性腹泻病毒的方法。

Description

一种猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测方法技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。
背景技术
近年来，仔猪腹泻呈多发性趋势，因其传播速度快、治愈率低、死亡率高等特点，严重制约生猪养殖业的健康发展。腹泻病毒感染是导致仔猪腹泻最重要的原因之一。许多病毒可致仔猪腹泻，如诺如病毒、博卡病毒、星状病毒等，但最常见、危害最深的是猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒，而又以后者为重。
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的急性、接触性、高度传染性的消化道疾病，不同品种、年龄的猪只都可感染发病，尤以7日龄内仔猪易感性最强，患猪主要症状为呕吐、水样腹泻和脱水等，该病感染率为100％，死亡率一般为80％-100％，波及范围广，呈世界范围内存在，给畜牧业生产带来巨大的经济损失。另外，病原基因型多，而且与传染性胃肠炎和轮状病毒病的临床症状、流行特点和病理变化都极其相似，但从临床症状方面很难进行有效地鉴别诊断，而现行的多数实验室诊断方法存在诸多弊端，故建立适合猪场和基层实验室使用的、快速准确的诊断方法对于发现、确诊、监测和防控该病意义重大。
目前，PEDV的常规监测方法主要有病原学检测，包括：病毒的分离鉴定和电镜检测；免疫学方法，包括：免疫荧光法、血清中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)，等；分子生物学技术，包括：核酸探针杂交，反转录-聚合酶链反(RT-PCR反应)，套式PCR，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)，多重PCR，等。作为传统的检测方法，PEDV的病原学检测存和血清学检测存在着许多不足。
PEDV的分离鉴定和电镜观察只能在高水平的实验室中由专业的技术人员操作，所需周期长，分离难度大；电镜观察病毒方法证明，在任何PEDV感染猪的肠内容物和粪便中可以发现有TGEV的存在，非特异性极低；PEDV抗体的血清学方法检测，最常用的是SN试验，技术复杂，操作繁琐，成本极高；酶联免疫吸附实验(ELISA)是当前应用最广泛的一种免疫学检测方法，但由于单克隆抗体是针对特定抗原位点，而不同PEDV株这些抗原位点有差异，导致某些样品的漏检。分子诊断技术的蓬勃发展给PEDV的检测提供了更多的方法，如RT-PCR、基因芯片技术、实时荧光RT-PCR等，但由于试验周期较长、操作繁琐、灵敏度不高等，因此，建立一种快速简便的、适用于临床和基层实验室的检测方法十分重要。
环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是Notomi等设计并应用的，针对靶基因的不同区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)，于恒温条件下快速完成核酸的扩增反应，最主要的特点是：四种引物在靶基因上的不同部位完全匹配才能进行扩增，具有很高特异性；等温扩增，省去了昂贵的热循环仪的费用；多引物且不用控制温度变化促使链置换反应使靶基因利用酶反应系统搞笑扩增，靶核酸序列呈指数扩增，扩增效率高。
逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)是在LAMP反应体系中加入一定量的逆转录酶从而实现RNA到DNA的一步扩增，不需要模板的热变性、退火和长时间温度循环等过程，只需要恒温几十分钟即可完成，且扩增效率极高，一般能检测到10拷贝以下的样品，故该方法具有高特异性和高敏感性的特点，对于低浓度的病毒或无症状的病毒携带者的检测敏感性也非常较高。RT-LAMP法的结果判定方法有肉眼观察沉淀法、荧光染料显色观察法、琼脂糖凝胶电泳法和浊度仪检测法四种。随着科学的发展，在反应体系中添加染料，通过产物与染料的作用而使体系颜色发生变化以确定反应发生的发生越来越被接受和使用，而SYBR Green I和Green Finder因假阳性和无特异性而备受诟病。
中国专利申请CN103276103A中公开了一种检测猪流行性腹泻病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用，其是在反应结束后，试纸条插入反应液中检测产物，这同添加SYBR Green I或Green Finder染料是一样的，需要开盖，特别容易形成挥发性气溶胶而污染环境，造成假阳性。中国专利申请CN102021249A中公开了反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的方法其采用N基因作为引物靶基因，设计了3对引物，通过两步法进行检测，即第一步是提取RNA后反转录成cDNA，第二步是将cDNA加入到LAMP反应体系中进行等温反应，最终通过染料变色法观察实验结果，由于N基因是保守序列，PEDV也是如此，针对N基因的引物对于单一病毒来讲特异性高，但是对于同类病毒来讲存在特异性不高的情况，即在实际应用中可能该引物出现错误扩增，如基于PEDV N基因的引物扩增出基于TGEV N基因的引物。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒，大大简化了实验步骤，提高了准确率。
本发明的另一目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒S基因的非诊断性RT-LAMP检测方法，为野外及基层实验室检测PEDV提供一种无需特殊仪器、更为简便、快速、特异的检测猪流行性腹泻病毒的方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒，其包含缓冲剂、BstDNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、MgSO4、AMV反转录酶、钙黄绿素、MnCl2、抑制剂和以下6条引物SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:6，
F3  GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA
B3  GTTACCCGAACCTGTAGGCT
F1C GCTATCGCATGGTGAAGG
F2  CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC
B1C CAAGTTGAAATTCGCCTGG
B2  ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG。
具体地，本发明所述的猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒包含10×Bst缓冲剂2.5μL、Bst DNA聚合酶8U、10mmol/L dNTPs 3.5μL、1mol/L甜菜碱3μL、100mmol/L MgSO40.5μL、5U/μL AMV反转录酶0.5μL、250μmol/L钙黄绿素3μL、25mmol/L MnCl20.5μL、40U/μL抑制剂1.5μL、40μmol/L F1C0.5μL、40μmol/L B1C 0.5μL、20μmol/L B30.25μL、20μmol/L F30.25μL、20μmol/L F20.85μL、20μmol/L B20.85μL。
在本发明中，在本发明中采用钙黄绿素/氯化锰替代SYBR Green或GreenFinder作为染色剂，其原理是：将钙黄绿素/氯化锰(Calcein/MnCl2)染色剂添加到反应体系中后，在未发生扩增反应时，钙黄绿素被氯化锰螯合，呈淬灭状态；反应开始后，靶基因DNA大量被合成，并产生同样大量的焦磷酸根离子，此时焦磷酸根离子竞争性与Mn2+结合，形成稳定的不溶性焦磷酸盐沉淀，钙黄绿素被释放而发出肉眼可见的绿色荧光；SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBRGreen I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。由两种染料的染色原理可知，SYBR Green I可以结合所有双链DNA，包括靶基因扩增后的DNA、引物聚合体、非特异性DNA等，所以，其染色属非特异性。而当反应在发生非特异性反应时，即非靶基因有效扩增时，反应产生的焦磷酸根离子是少量的，不足以与Mn2+结合而促使Calcein释放荧光，所以，Calcein/MnCl2染料只有在靶基因有效扩增产生大量DNA和焦磷酸根离子时才能发挥染色作用，故而特异性强，从而可以有效避免气溶胶污染环境，以及由此造成的假阳性现象。
一种猪流行性腹泻病毒S基因非诊断性RT-LAMP检测方法，其包括以下步骤：
1)PEDV的繁殖与收获步骤：传代培养Vero细胞PEDV，待其长成单层后，将PEDV冻干毒用DMEM稀释后接种于Vero细胞上，经过培养至出现明显病变后刮取细胞收获病毒液；
2)病毒RNA的提取步骤：采用TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒在上述病毒液中提取PEDV病毒RNA；
3)引物的设计与合成的步骤：根据GenBank中PEDV S基因的保守区域设计6条LAMP引物，6条引物序列为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:6，
F3  GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA
B3  GTTACCCGAACCTGTAGGCT
F1C GCTATCGCATGGTGAAGG
F2  CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC
B1C CAAGTTGAAATTCGCCTGG
B2  ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG；
4)配制RT-LAMP恒温反应体系的步骤：按照上述猪流行性腹泻病毒S基因非诊断性RT-LAMP检测试剂盒配制RT-LAMP恒温反应体系；
5)RT-LAMP反应：以步骤3)提取的RNA为模板，加入到在上述RT-LAMP恒温反应体系中进行反应；其中RNA模板量为2μL，并用去离子水补足至25μL；
6)可视化观察RT-LAMP反应记过，并对其结果进行验证。
具体地，步骤1)中接Vero细胞后于37℃5％CO2培养箱中吸附1h后，弃病毒液，加入DMEM维持液，重新置于培养箱中培养至至出现明显病变后刮取细胞收获病毒液。
具体地，在上述方法中，所述步骤2)病毒RNA的提取步骤如下：
a)用移液器将20μL蛋白酶K加入一个干净的1.5mL离心管中；
b)向离心管中加入200μL平衡至室温的血浆/血清/淋巴液；
c)加入200μL Carrier RNA工作液，盖上管盖，涡旋振荡15秒混匀，为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀；
d)在56℃孵育15分钟，简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；
e)加入250μL无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15秒，彻底混匀，在室温放置5分钟；
f)简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；
g)仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-free吸附柱CR2，盖上管盖，6000～8000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
h)打开吸附柱盖子，加入500μL溶液RW，盖上管盖，静置2分钟，8000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管；
i)重复步骤h)一次；
j)小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1分钟，弃废液；
k)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液；
l)将吸附柱放回2ml收集管中，打开吸附柱盖子，室温放置3分钟，使吸附膜完全变干；
m)将吸附柱放入一个RNase-free离心管中，打开吸附柱的盖子，向膜中央加入20-150ul RNase-free ddH20，盖上盖子，室温放置5分钟12000rpm离心1分钟。
具体地，步骤c)中Carrier RNA工作液按照以下公式配制：
n×0.22mL＝y mL ymL×28μL/mL＝zμL
n＝同时提取的样品个数
y＝需要加入缓冲液GB的体积
z＝需要加入Carrier RNA。
优选的方案，本发明中步骤5)RT-LAMP反应条件为63℃1h，80℃10min。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明中，由于PEDV病毒的S基因与其他冠状病毒FIPV、TGEV和CCV的同源性较低，针对靶序列不同区域设计的6条种特异性引物特异性高、假阳性率低，更适合用作靶基因而设计、能有效避免引物出现错误扩增；
2.在本发明中，RT-LAMP反应体系中加入Calcein+MnCl2，反应结束后不需要再加入SYBR Green I即可显色，用肉眼观察即可判断实验结果；
3.采用本发明的RT-LAMP检测试剂盒检测时，不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失，核酸扩增在lh内即可完成，同时观察实验结果，快速高效；
4.本发明的RT-LAMP检测试剂盒对于病毒扩增模板可达几个拷贝，敏感度比PCR高出几个数量级；本试验优化的RT-LAMP方法对PEDV RNA的最小检测限为10-5稀释度，即6.11×10-5μg/μL，而常规一步法RT-PCR试剂盒最小检测限为10-3稀释度，即6.11×10-3μg/μL；RT-LAMP敏感性为RT-PCR方法的100倍；且反应体系中加入的Calcein+MnCl2只在特异性扩增的情况下才显示呈绿色，且显色明显，灵敏度高，诸多条件大大增加了RT-LAMP反应的灵敏度。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为PEDV RT-LAMP温度梯度试验产物的电泳检测结果。M：DL2000分子标准量；1：56℃；2：58℃；3：60℃；4：62℃；5：64℃；6：66℃；
图2为PEDV RT-LAMP温度梯度试验产物的可视化结果。1：56℃；2:58℃；3:60℃；4:62℃；5：64℃；6:66℃；
图3为PEDV RT-LAMP 63℃温度梯度试验产物的电泳检测结果；
图4为PEDV RT-LAMP 63℃温度梯度试验产物的可视化结果。1：63℃；2：阴性对照；
图5为PEDV RT-LAMP特异性试验产物的电泳检测结果。M：DL2000分子标准量；1：PEDV；2：PRRSV；3：PCVⅡ；4：TGEV；5：CSFV；6：阴性对照；
图6为PEDV RT-LAMP特异性试验产物的可视化结果。1：PEDV；2：PRRSV；3：PCVⅡ；4：TGEV；5：CSFV；6：阴性对照；
图7为PEDV RT-LAMP敏感性试验产物的电泳检测结果。M：DL2000分子标准量；1-8：PEDV RNA 10-1～10-8稀释度稀释；
图8为PEDV RT-LAMP敏感性试验产物的可视化结果；1-8：分别是PEDVRNA 10-1～10-8稀释度稀释；
图9为一步法RT-PCR试剂盒检测结果，M.DL2000分子标准量；1-8：分别是PEDV RNA 10-1～10-8稀释度稀释。
具体实施方式
以下实施例中所涉及的实验材料分别如下：
1.病毒和质粒
病毒株PEDV CV777株、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪圆环2型病毒(PCVⅡ)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)等由本实验室保存。
2主要试剂
Bst DNA聚合酶(大片段)、甜菜碱(Betaine)、钙黄绿素Calcein购自NewEngland Biolabs公司；AMV反转录酶、dNTP及one step RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自北京天根生化生化科技有限公司，胶体金检测试剂盒(韩国，品牌：Anigen Rapid，品名：PEDAg Test Kit)；MgSO4、MnCl2等化学试剂购自广州康龙生物科技有限公司。
实施例1
一种猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒，其包含缓冲剂、BstDNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、MgSO4、AMV反转录酶、钙黄绿素、MnCl2、抑制剂和以下6条引物：
F3  GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA
B3  GTTACCCGAACCTGTAGGCT
F1C GCTATCGCATGGTGAAGG
F2  CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC
B1C CAAGTTGAAATTCGCCTGG
B2  ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG；
其中缓冲剂、Bst DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、MgSO4、AMV反转录酶、钙黄绿素、MnCl2、抑制剂及6条引物的量分别为：10×Bst缓冲剂2.5μL、Bst DNA聚合酶8U、10mmol/L dNTPs 3.5μL、1mol/L甜菜碱3μL、100mmol/LMgSO40.5μL、5U/μL AMV反转录酶0.5μL、250μmol/L钙黄绿素3μL、25mmol/LMnCl20.5μL、40U/μL抑制剂1.5μL、40μmol/L F1C 0.5μL、40μmol/L B1C 0.5μL、20μmol/L B30.25μL、20μmol/L F30.25μL、20μmol/L F20.85μL、20μmol/L B20.85μL。
实施例2
1)PEDV的繁殖与收获步骤：传代培养Vero细胞PEDV，待其长成单层后，将PEDV冻干毒用DMEM稀释后接种于Vero细胞上，经过培养至出现明显病变后刮取细胞收获病毒液；
2)病毒RNA的提取步骤：采用TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒在上述病毒液中提取PEDV病毒RNA，具体步骤如下：
a)用移液器将20μL蛋白酶K加入一个干净的1.5mL离心管中；
b)向离心管中加入200μL平衡至室温的血浆/血清/淋巴液；
c)加入200μL Carrier RNA工作液，盖上管盖，涡旋振荡15秒混匀，为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀；其中CarrierRNA工作液按照以下公式配制：
n×0.22mL＝y mL ymL×28μL/mL＝zμL
n＝同时提取的样品个数
y＝需要加入缓冲液GB的体积
z＝需要加入Carrier RNA；
d)在56℃孵育15分钟，简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；
e)加入250μL无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀。盖上管盖并涡旋振荡15秒，彻底混匀，在室温放置5分钟；
f)简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；
g)仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-free吸附柱CR2，盖上管盖，6000～8000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
h)打开吸附柱盖子，加入500μL溶液RW，盖上管盖，静置2分钟，8000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管；
i)重复步骤h)一次；
j)小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1分钟，弃废液；
k)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液；
l)将吸附柱放回2ml收集管中，打开吸附柱盖子，室温放置3分钟，使吸附膜完全变干；
m)将吸附柱放入一个RNase-free离心管中，打开吸附柱的盖子，向膜中央加入20-150ul RNase-free ddH20，盖上盖子，室温放置5分钟12000rpm离心1分钟；
3)引物的设计与合成的步骤：根据GenBank中PEDV S基因的保守区域设计6条LAMP引物，6条引物序列为：
F3  GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA
B3  GTTACCCGAACCTGTAGGCT
F1C GCTATCGCATGGTGAAGG
F2  CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC
B1C CAAGTTGAAATTCGCCTGG
B2  ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG；
4)配制RT-LAMP恒温反应体系的步骤：按照实施例1的猪流行性腹泻病毒S基因非诊断性RT-LAMP检测试剂盒配制RT-LAMP恒温反应体系；
5)RT-LAMP反应：以步骤3)提取的RNA为模板，加入到在上述RT-LAMP恒温反应体系中进行反应；其中RNA模板量为2μL，并用去离子水补足至25μL；
6)可视化观察RT-LAMP反应记过，并对其结果进行验证。
实施例3
在实施例2的基础上还包括了对RT-LAMP反应条件的优化；具体步骤为：将温度按56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃依次递增，多次重复后确定最佳反应温度；配置1mol/L Betaine，250umol/L Calcein,，5mmol/L MnCl2，100mmol/L MgSO4，连同AMV和Bst DNA聚合酶对RT-LAMP反应条件进行优选；配置6条引物的工作浓度(10mmol/mL)后对引物浓度配比进行优化；对反应时间在30min，45min，60min和75min依次增加确定最佳反应时间。优化结果参见图1-4。
由图1、2可知，PEDV RT-LAMP温度梯度试验产物的电泳和可视化检测结果表明，本反应在62℃-64℃时，表现为阳性；由图3、4可知，PEDV RT-LAMP温度梯度试验产物的电泳和可视化检测结果表明，本反应在63℃时，阳性结果最明显，适用于试验检测。
效果检测
1.RT-LAMP试剂盒的特异性检测
用上述实施例1的猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒对PEDV、PRRSV、PCVⅡ、TGEV、CSFV等样品进行检测，验证LAMP方法的特异性，扩增结束后观察颜色的变化，可视化观察结果见图6。由图6可知，本实验所建立的RT-LAMP试验只能特异性的表达PEDV RNA，不能表达PRRSV、PCVⅡ、TGEV和CSFV；再取5μL反应产物上样1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电泳结果见图5，由该图可知，本实验所建立的RT-LAMP试验只能特异性的表达PEDV RNA，不能表达PRRSV、PCVⅡ、TGEV和CSFV；由结果可知，仅以PEDV为模板可扩增出条带并见到绿色荧光，其它为阴性，表明该优化的RT-LAMP方法对PEDV具有良好的特异性。
2.RT-LAMP方法的重复性检测
提取等量8份不同代的PEDV Purdue株细胞培养物的RNA，上述实施例1的猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒按照实施例2的方法进行检测，确定批内重复性；4d后再提取同样8代培养物，提取病毒RNA同一反应条件下进行实验，确定批间重复性。
8份不同代的PEDV株细胞培养物RNA，检测结果均无差异，批内重复性好；4d后再提取的同样8代培养物，检测结果均无差异，批间重复性好。
3.LAMP方法的敏感性检测
将提取的PEDV RNA经核酸测定仪测定后，做10-1～10-8系列的倍比稀释，各取2μL模板，用上述实施例1的猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒，按照实施例2的方法进行检测；同时以2.1的方法进行RT-PCR反应，根据该反应的引物和所提供的反应条件用TaKaRa one step RT-PCR试剂盒进行扩增，以1.2％琼脂糖凝胶电泳观察。通过实验结果对比优化的RT-LAMP方法和RT-PCR方法的敏感性。可视化观察结果见图8，电泳结果见图7和图9。
由图8可知，10-1-10-5稀释后的RNA经RT-LAMP反应后可视化检测表现为阳性，10-6-10-8稀释后的RNA经RT-LAMP反应后可视化检测表现为阴性；再取5μL反应产物上样1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电泳结果见图7，由该图可知，10-1-10-5稀释后的RNA经RT-LAMP反应后琼脂糖电泳检测表现为阳性，10-6-10-8稀释后的RNA经RT-LAMP反应后琼脂糖电泳检测表现为阴性；同时，按照梯度稀释后的PEDV RNA模板进行RT-PCR反应；RT-PCR引物为：
F1  5c-TAAGGAAGGGTAAGTTGCTCAT-3c
F2  5c-ACAGGATTAAACCACCAAAGG-3c
RT-PCR反应体系及反应条件为：
反应结束后将产物进行电泳检测，检测结果见图9，由图9可知，10-1-10-3稀释后的RNA经RT-PCR反应后琼脂糖电泳检测表现为阳性，10-4-10-8稀释后的RNA经RT-PCR反应后琼脂糖电泳检测表现为阴性。由结果可知，显示本发明所建立的RT-LAMP对PEDV RNA的最小检测限为10-5稀释度，即6.11×10-5μg/μL，而常规一步法RT-PCR试剂盒最小检测限为10-3稀释度，即6.11×10-3μg/μL。RT-LAMP敏感性为RT-PCR方法的100倍。
4.RT-LAMP方法的临床检测
应用上述实施例1的猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒按照实施例2的方法对实验室送检的37份疑似猪传染性胃肠炎样品进行检测，同时使用常规RT-PCR方法和胶体金试剂盒进行检测并比较实验结果。
结果显示：RT-LAMP方法检出28份阳性病料，阳性检出率为75.68％，RT-PCR方法检出15份阳性病料，阳性检出率为40.54％，胶体金试剂盒检出12份阳性病料，阳性检出率为32.44％，说明本试验建立的RT-LAMP方法更为敏感，特异性更高。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，其包含缓冲剂、Bst DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、MgSO4、AMV反转录酶、钙黄绿素、MnCl2、抑制剂和以下6条引物：
F3  GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA
B3  GTTACCCGAACCTGTAGGCT
F1C GCTATCGCATGGTGAAGG
F2  CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC
B1C CAAGTTGAAATTCGCCTGG
B2  ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG。
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S基因RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，其包含10×Bst缓冲剂2.5μL、Bst DNA聚合酶8U、10mmol/LdNTPs 3.5μL、1mol/L甜菜碱3μL、100mmol/L MgSO40.5μL、5U/μL AMV反转录酶0.5μL、250μmol/L钙黄绿素3μL、25mmol/L MnCl20.5μL、40U/μL抑制剂1.5μL、40μmol/L F1C 0.5μL、40μmol/L B1C 0.5μL、20μmol/L B30.25μL、20μmol/L F30.25μL、20μmol/L F20.85μL、20μmol/L B20.85μL。
3.一种猪流行性腹泻病毒S基因非诊断性RT-LAMP检测方法，其包括以下步骤：
1)PEDV的繁殖与收获步骤：传代培养Vero细胞PEDV，待其长成单层后，将PEDV冻干毒用DMEM稀释后接种于Vero细胞上，经过培养至出现明显病变后刮取细胞收获病毒液；
2)病毒RNA的提取步骤：采用TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒在上述病毒液中提取PEDV病毒RNA；
3)引物的设计与合成的步骤：根据GenBank中PEDV S基因的保守区域设计6条LAMP引物，6条引物序列为：
F3  GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA
B3  GTTACCCGAACCTGTAGGCT
F1C GCTATCGCATGGTGAAGG
F2  CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC
B1C CAAGTTGAAATTCGCCTGG
B2  ACCAACTACTCTTGGTAGTCGTG；
4)配制RT-LAMP恒温反应体系的步骤：按照权利要求2配制RT-LAMP恒温反应体系；
5)RT-LAMP反应：以步骤3)提取的RNA为模板，加入到在上述RT-LAMP恒温反应体系中进行反应；其中RNA模板量为2μL，并用去离子水补足至25μL；
6)可视化观察RT-LAMP反应记过，并对其结果进行验证。
4.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒S基因非诊断性RT-LAMP检测方法，其特征在于：步骤1)中接Vero细胞后于37℃5％CO2培养箱中吸附1h后，弃病毒液，加入DMEM维持液，重新置于培养箱中培养至出现明显病变后刮取细胞收获病毒液。
5.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒S基因非诊断性RT-LAMP检测方法，其特征在于，所述步骤2)病毒RNA的提取步骤如下：
a)用移液器将20μL蛋白酶K加入一个干净的1.5mL离心管中；
b)向离心管中加入200μL平衡至室温的血浆/血清/淋巴液；
c)加入200μL Carrier RNA工作液，盖上管盖，涡旋振荡15秒混匀，为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀；
d)在56℃孵育15分钟，简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；
e)加入250μL无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15秒，彻底混匀，在室温放置5分钟；
f)简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；
g)仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-free吸附柱CR2，盖上管盖，6000～8000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
h)打开吸附柱盖子，加入500μL溶液RW，盖上管盖，静置2分钟，8000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管；
i)重复步骤h)一次；
j)小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1分钟，弃废液；
k)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液；
l)将吸附柱放回2ml收集管中，打开吸附柱盖子，室温放置3分钟，使吸附膜完全变干；
m)将吸附柱放入一个RNase-free离心管中，打开吸附柱的盖子，向膜中央加入20-150ul RNase-free ddH20，盖上盖子，室温放置5分钟12000rpm离心1分钟。
6.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒S基因非诊断性RT-LAMP检测方法，其特征在于，步骤c)中Carrier RNA工作液按照以下公式配制：
n×0.22mL＝y mL    ymL×28μL/mL＝zμL
n＝同时提取的样品个数
y＝需要加入缓冲液GB的体积
z＝需要加入Carrier RNA。
7.根据权利要求4所述的猪流行性腹泻病毒S基因非诊断性RT-LAMP检测方法，其特征在于，步骤5)RT-LAMP反应条件为63℃1h，80℃10min。
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