CN103509882A - 猪流行性腹泻病毒的荧光定量pcr引物和探针 - Google Patents

猪流行性腹泻病毒的荧光定量pcr引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，其中上、下游引物如SEQIDNO:1~2所示，探针P1：SEQIDNO:3，探针P2：SEQIDNO:4，且探针1和探针2序列的3’端结合荧光淬灭基团，探针P1和探针P2序列的5’端结合不同的荧光报告基团。该引物特异性和灵敏度都较高，且能够检测出变异的PEDV，可以对各种临床样品进行检测、鉴别，从而可以快捷地对流行的PEDV毒株进行区分，操作简单、实用。

Description

猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种可以区分变异和经典猪流行性腹泻病毒的双重荧光定量PCR引物和探针。
背景技术
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）是由套式病毒目冠状病毒科、冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种猪肠道传染病，以水样腹泻、呕吐和脱水为特征（Takahashi K, Okada K, Ohshima K.An outbreak of swine diarrhea of a new type associated with coronavirus-like particles in Japan[J].Vet Sci, 1983,45:829-832; Murphy FA, Fauquet C M. smith Report of the ICTV[J], Archives virology suppl,1995,10: 407-409.；殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社，1997. 681-688.）。各种日龄的猪均可感染，哺乳仔猪、断奶仔猪的发病率可达100%，尤其哺乳仔猪受害最为严重，此病多发生于寒冷季节。20世纪70年代最初发现于英国（李连敏，裴爱民.秋冬季谨防猪流行性腹泻病[J].南方养猪，2006, 209: 44.；林初文，庄金秋，谢印乾.我国主要猪病毒性腹泻疾病的特点及其防治对策[J].中国畜牧兽医，2007, 34 (5): 121-122.）。随后，许多国家如比利时、德国、加拿大、法国、日本等国也都出现了PED流行的报道（蔡宝祥.介绍几种新近发现的猪传染病[J].畜牧与兽医，1982, 5: 218-221.；Pensaert M B, de Bouck P. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J]. Arch Viorl, 1978, 58:237-243.），我国从20世纪80年代初开始陆续有本病的流行报道，并且给我国的养猪业带来了巨大的损失（倪艳秀，林继煌，何孔旺等.猪流行性腹泻研究概况〔J].畜牧与兽医，2001, 33 (1): 38-40.）。
PEDV 属于冠状病毒属 I 群，是 RNA 病毒，基因组为单股正链，不分节段。基因组包含 6个开放读框(ORF)，从5’到3’顺序依次为ORF1（20346 nt）；S 基因（4152 nt）；ORF3 基因（675 nt）；E 基因（231 nt）；M 基因（681 nt）和 N 基因（1326 nt）（Kocherhans et al., Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genome sequence[J].Virus Genes. 2001, 23(2): 13-144.; Brian et al., Coronavirus genome structure and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 2005, 287: 1~30.）。
目前针对PEDV的实验室诊断方法有病原学方法、基于病毒抗原或抗体的免疫学方法和针对病毒RNA核酸检测技术（邓小红，吕立新，陶庆园等.猪病毒性腹泻病的实验室诊断[J].畜禽业，2004,165 (1): 49-50.）。传统的病原学方法主要通过细胞进行病毒的分离，耗时、耗力。用免疫学检测抗体可以了解病毒感染以及疾病发生、发展的过程，然而，由于抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，因此抗体检测在作为快速防控的方法时存在一定局限性。荧光定量PCR以特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快的诸多优点成为分子生物学研究中的重要工具。
目前，PEDV在中国大陆仍然存在大规模发生的情况，给中国的养猪业带来巨大损失。有学者对此次流行的PEDV毒株以及其基因变异情况进行了详细的分析（Pan Y et al., Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China[J]. Virol J. 2012,Sep 12;9:195.），发现变异毒株和经典PEDV毒株之间S基因有较大的不同，可以作为区分两种毒株的特征基因，但目前还未有针对此的荧光定量鉴别诊断方法出现。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述问题，通过对猪流行性腹泻病毒S基因的分析，设计引物和两个不同报告基团标记的探针（变异PEDV为FAM，经典PEDV为HEX），并建立了荧光定量PCR方法，可以对变异和经典猪流行性腹泻病毒进行快速的鉴别区分。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，序列如下：
上游引物F：GTTCTTTTCAAAATTTAATGTKCAGG（SEQ ID NO:1）；
下游引物R：CTTGCGAAATGCCAATCTCA（SEQ ID NO:2）；
探针P1：CTTGGTACTGTGCTGGCCAACATCC（SEQ ID NO:3）；
探针P2：TCTTCTAGCTGGTACTGTGGCACAGGC（SEQ ID NO:4）；
其中，探针1和探针2序列的3’端结合荧光淬灭基团，探针1和探针2序列的5’端结合不同的荧光报告基团。
根据NCBI登陆的猪流行性腹泻病毒基因组序列，登录号：变异毒株（JN825712，JX088695，JX188454，JX489155，JX261936，JX112709，JX524137，JQ282909）和经典毒株（AF353511，EF185992，Z25483，JQ023161，JN547228）提供的信息，经过比对分析，设计了以上定量PCR的引物和探针，使用上述引物进行荧光定量PCR扩增，可以通过扩增曲线鉴别经典和变异猪流行性腹泻病毒，省去测序的步骤，节省了时间和成本。
提取待检测样品中的RNA，经反转录后使用引物F、R和探针P1、P2进行荧光定量PCR扩增。如果探针P1的荧光报告基团有扩增曲线出现的即是变异PEDV，探针P2的荧光报告基团有扩增曲线出现的即是经典PEDV，若是均无扩增曲线产生，则说明样品中不含PEDV。其中扩增曲线CT值小于35的判断为阳性，CT值大于35而小于40的判断为可疑，需重复试验。第二次CT值仍在这个范围的判断为阳性。
作为优选方案，上述猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，所述荧光淬灭基团为TAMRA（6-羧基四甲基罗丹明）。
作为优选方案，上述猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，所述探针1序列5’端结合的荧光报告基团为FAM（6-羧基荧光素），探针2序列5’端结合的荧光报告基团为HEX（六氯-6-甲基荧光素）。
本发明还提供了上述猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针在制备检测经典猪流行性腹泻病毒和/或变异猪流行性腹泻病毒的试剂中的应用。
本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，包括以上所述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针。
一种猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，包括：
（1）反转录部分：
RT预混液1：随机引物和dNTP mix（dNTP混合物）；
RT预混液2：5倍反转录缓冲液，RNA酶抑制剂，反转录酶，不含RNA酶的双蒸水;
（2）荧光定量PCR部分：
预混酶体系，以上所述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，无菌双蒸水。所述的预混酶体系是指LifeTechnologies 公司的产品Universal Master Mix；所述的5倍反转录缓冲液是将本领域常用的反转录缓冲液稀释5倍得到的，更具体的可以为TaKaRa公司的产品PrimeScirpt Buffer经5倍稀释后得到。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一组双重荧光定量PCR的引物和探针，该引物特异性和灵敏度都较高，且能够检测出变异的PEDV，可以对各种临床样品进行检测、鉴别，从而可以快捷地对流行的PEDV毒株进行区分，操作简单、实用。
附图说明
图1为本发明对样品扩增的曲线，其中箭头1为变异株，箭头2为经典株；
图2为本发明特异性检验结果。其中箭头1为变异株，箭头2为经典株。3-8分别为猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒；
图3为检测变异株探针灵敏度结果，1、2、3、4、5代表的拷贝数分别为3.94×104、3.94×103、3.94×102、3.94×101、3.94；
图4为检测经典株探针灵敏度结果，1、2、3、4、5代表的拷贝数分别为2.99×104、2.99×103、2.99×102、2.99×101、2.99。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步对本发明进行解释，以使本领域技术人员能更好地理解本发明并能予以实施，但实施例并不作为对本发明的限定。
实施例1
（1）待检样品RNA提取：200μL细胞培养液（感染自主分离毒株CHGD-01，该毒株经鉴定为变异的PEDV，也可以使用其它变异毒株）、200μL细胞培养液（感染自主分离毒株ShQT，该毒株经鉴定为经典PEDV，也可以使用其它经典毒株）、100mg的肠道病料和100mg粪便（病料和粪便未知是否感染病毒）以及DMEM（细胞培养基，不含PEDV，为阴性对照）作为待检样品，分别进行以下操作：
加入1mL PBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，8000 rpm 离心10 min，取上清液200μL，加入0.2mL氯仿，震荡混匀15s后在室温下（15℃～30℃）放置2～3min后，12000g（2℃～8℃）离心15min；取上层水相置于新EP管中，加入0.5mL异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10min，12000g（2℃～8℃）离心10min；弃上清，加入1mL 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5min，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥后加入20μL RNase-Free H2O溶解，即为RNA模板。提取的RNA放于-80℃保存。
（2）提取的RNA加入到反转录预混反应液（RT预混液）中进行反转录，得到cDNA模板。
反转录体系及过程：8μL的RNA与2μL RT预混液1混匀，65℃ 反应5min，然后迅速置于冰上2min。此反应混合溶液再加入到RT预混液2中，混匀后置于PCR仪上，按如下条件反应：30℃ 10min；42℃ 60min；70℃ 15min（无循环）。
其中，RT预混液1：Ramdom 9 mer（50μM）和dNTP mix（10mM）各1μL；RT预混液2：5×PrimeScirpt Buffer 4μL，RNase Inhibitor(40U/μL) 0.5μL，PrimeScript Reverse Transcriptase（200U/μL）1μL，RNase free H2O 4.5μL，均购自大连TaKaRa公司。
（3）将2μL cDNA模板加入到定量PCR预混液中，配制20μL反应体系，并混合均匀。其中定量PCR预混液（即预混酶体系）：Universal Master Mix（AmpliTaq Gold?DNA Polymerase, UP (Ultra Pure)；Uracil-N glycosylase (UNG)；dNTPs with dUTP；ROX? Passive Reference；Optimized buffer components）10μL，购自Life Technologies公司；F和R（均为20pmol）各0.2 μL，探针P1（20pmol）0.1 μL，探针P2（20pmol）0.1 μL，由上海基康生物技术有限公司合成，P1的5’端和3’端分别标记FAM和TAMRA；P2的5’端和3’端分别标记HEX和TAMRA；无菌双蒸水7.4 μL，自制。
（4）将步骤（3）的PCR管置于ABI公司7500 Fast 定量PCR仪上进行扩增反应。扩增条件为：50℃，保持2min；95℃，保持10min；95℃，15s，60℃，1min，共40个循环。
（5）结果判定：报告基团FAM有扩增曲线出现的即是变异PEDV，报告基团HEX有扩增曲线出现的即是经典PEDV，若是均无扩增曲线产生，则说明样品中不含PEDV。其中扩增曲线CT值小于35的判断为阳性，CT值大于35而小于40的判断为可疑，需重复试验。第二次CT值仍在这个范围的判断为阳性。检测结果见表1。
表1 待检样品检测结果
待检样品 扩增曲线 扩增结果判定
细胞培养液（感染毒株CHGD-01） FAM报告基团有 变异株
细胞培养液（感染毒株ShQT） HEX报告基团有 经典株
肠道病料 FAM报告基团有 变异株
粪便 FAM报告基团有 变异株
DMEM细胞培养基 无扩增曲线 无
实施例2 特异性检验
以存在流行性腹泻病毒的经典株（毒株ShQT）、变异株（毒株CHGD-01）的病料作为阳性对照，猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的培养液进行特异性检测，使用实施例1的方法与引物和探针，结果除阳性对照外均没有扩增曲线，阳性病料经过PCR扩增分别在HEX（毒株ShQT）和FAM（毒株CHGD-01）基团有扩增曲线（见图2）。
实施例3 灵敏度检验
含有S基因的标准阳性质粒（pMD-S1和pMD-S2），由本专利所涉及PCR扩增出的191bp（以变异毒株ShQT 提取的cDNA为模板，SEQ ID NO:1~2为引物进行PCR，扩增产物序列如SEQ ID NO.5所示）和179bp（以经典毒株CHGD-01 提取的cDNA为模板，SEQ ID NO:1~2为引物进行PCR，扩增产物序列如SEQ ID NO.6所示）产物连接到克隆载体pMD18-T（大连宝生物工程有限公司）制备而成，经测定其浓度分别为 3.94×1010 copies/μL和2.99×1010 copies/μL。
将阳性质粒pMD-S1和pMD-S2用配置的灭菌双蒸水10倍递增稀释作为模板，每个稀释度各取2μL 作为模板，按实施例1方法进行检测，观察扩增曲线，以出现阳性预期曲线所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明最小检出量为 3.94 copies和2.99 copies。
 SEQUENCE LISTING
<110>  广东温氏食品集团股份有限公司
 
<120>  猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针
 
<130> 
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gttcttttca aaatttaatg tkcagg                                          26
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
cttgcgaaat gccaatctca                                                 20
 
 
<210>  3
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
cttggtactg tgctggccaa catcc                                           25
 
 
<210>  4
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
tcttctagct ggtactgtgg cacaggc                                         27
 
 
<210>  5
<211>  191
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
gttcttttca aaatttaatg ttcaggcgcc tgcagttgtt gtactgggcg gttatctacc     60
 
tattggtgaa aaccagggtg tcaattcaac ttggtactgt gctggccaac atccaactgc    120
 
tagtggcgtt catggtatct ttcttagcca tattagaggt ggtcatggct ttgagattgg    180
 
catttcgcaa g                                                         191
 
 
<210>  6
<211>  179
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
gttcttttca aaatttaatg ttcaggcacc tgccgtcgtc gttttgggtg gttacctacc     60
 
tagtatgaac tcttctagct ggtactgtgg cacaggcatt gaaactgcta gtggcgttca    120
 
tggtattttt ctcagctaca tcgattctgg tcagggcttt gagattggca tttcgcaag     179
 
 

Claims (6)

1.一种猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，序列如下：
上游引物F：SEQ ID NO:1；
下游引物R：SEQ ID NO:2；
探针P1：SEQ ID NO:3；
探针P2：SEQ ID NO:4；
其中，探针1和探针2序列的3’端结合荧光淬灭基团，探针P1和探针P2序列的5’端结合不同的荧光报告基团。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，所述荧光淬灭基团为TAMRA。
3.根据权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，所述探针P1序列5’端结合的荧光报告基团为FAM，探针P2序列5’端结合的荧光报告基团为HEX。
4.权利要求1~3任一所述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针在制备检测经典猪流行性腹泻病毒和/或变异猪流行性腹泻病毒的试剂中的应用。
5.一种猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一所述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针。
6.一种猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括：
反转录部分：
RT预混液1：随机引物和dNTP mix；
RT预混液2：5倍反转录缓冲液，RNA酶抑制剂，反转录酶，不含RNA酶的双蒸水;
（2）荧光定量PCR部分：
预混酶体系，权利要求1~3任一所述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量PCR引物和探针，无菌双蒸水。
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