CN107475456A

CN107475456A - 基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的pedv快速检测方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN107475456A
Application number: CN201710886522.XA
Authority: CN
Inventors: 兰喜; 王志林; 李学瑞; 周建华; 马丽娜; 刘永生
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2017-12-15

Abstract

本发明公开了一种基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，该试剂盒包含引物和探针，引物序列为：上游引物F1020：5′–TCGTGAGCTAGCGGACTCTTACGAGATTAC‑3′；下游引物R1160：5′‑GCTGCAGCGTGGTTTCACGCTTGTTCTTCT‑3′；探针序列为：P1082：5′‑ATCCAAATGTTGAGCTTCTTGTTTCACAGG(FAM‑dT)G(THF)A(BHQ1‑dT)GCATTTAAAACTGGG‑C3space‑3′；建立了PEDV等温逆转录重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法，最低可检测到30Cospies的PEDV RNA，并且该方法最早可在反应开始后4min时检出PEDV，30min内即可完成检测。利用本发明检测50份PEDV阳性乳猪腹泻粪样、100份PEDV阴性乳猪腹泻粪样，检测结果表明与RT‑PCR检测结果的符合率为100％。本发明对PEDV特异性强、灵敏度高、耗时短、操作简单、安全可靠。

Description

基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的PEDV快速检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于猪流行性腹泻病毒检测技术领域，尤其涉及一种基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的PEDV快速检测方法及其试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病，各年龄段的猪均易被感染，尤其对1～2周龄哺乳仔猪的危害最为严重，主要临床表现为腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率，发病死亡率可高达90％～100％，呈世界范围性流行，给世界养猪业带来了很大的经济损失。而PEDV与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(RV)、猪嵴病毒(PKV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后所引起的临床症状相似，临床难以鉴别诊断，给疾病的确诊、治疗和防控带来了很大困难，因此需要开发更加简便快捷，安全可靠的检测方法。

为提高猪流行性腹泻的临床疫情监控效率，亟待发明一种安全可靠、灵敏度高、特异性强的方便临床快速检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，用于快速可靠的检测猪流行性腹泻病毒。

本发明的另一目的在于提供一种基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的PEDV快速检测方法，旨在解决猪感染猪流行性腹泻病毒(PEDV)后，由于其产生的临床症状与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(RV)、猪嵴病毒(PKV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后所引起的临床症状相似，临床难以鉴别诊断，给疾病的确诊、治疗和防控带来很大困难的问题，该方法安全可靠、灵敏度高、特异性强。

本发明是这样实现的：

一种基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，所述试剂盒包含引物和探针，所述引物序列为：

上游引物F1020：5′–TCGTGAGCTAGCGGACTCTTACGAGATTAC-3′；

下游引物R1160：5′-GCTGCAGCGTGGTTTCACGCTTGTTCTTCT-3′；

所述探针序列为：

P1082：5′-ATCCAAATGTTGAGCTTCTTGTTTCACAGG(FAM-dT)G(THF)A(BHQ1-dT)GCATTTAAAACTGGG-C3space-3′；

进一步地，所述引物的浓度为10μM，探针的浓度为10μM。

进一步地，所述引物扩增猪流行性腹泻病毒预期目的片段的大小为170bp。

一种基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的PEDV快速检测方法，该方法包括提取待测样品的RNA，利用所述的引物和探针进行快速扩增以及实时荧光检测，如果得到170bpDNA片段或获得明显的扩增曲线，则证明所测样品中含有猪流行性腹泻病毒。

进一步地，等温逆转录重组酶聚合酶RT-RPA反应体系为：上、下游引物(10μM)各2.4μL，Rehydration Buffer 29.5μL，RNase Inhibitor1μL,RNA 2μL、和ddH₂O 10.2μL；将所述RT-RPA反应体系混匀后加入RT-RPA酶管中，再加入2.5μL的乙酸镁混匀；置于加热器上40℃反应，30min后，进行凝胶电泳观测扩增片段大小并进行测序鉴定。

进一步地，等温逆转录重组酶聚合酶QRT-RPA反应体系为：上、下游引物(10μM)各2.1μL，探针(10μM)0.6μL，Rehydration Buffer 29.5μL，RNase Inhibitor1μL,RNA 2μL、和ddH₂O 10.2μL；将所述QRT-RPA反应体系混匀后加入QRT-RPA酶管中，再加入2.5μL的乙酸镁混匀；放入荧光定量PCR仪上，39℃反应30min，在扩增过程实时收集检测荧光信号。

本发明的有益效果为：本发明基于PEDV的N基因保守序列，设计引物与探针，建立了PEDV等温逆转录重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测技术,RT-RPA和QRT-RPA最低可检测到30Cospies的PEDV RNA，并且该方法最早可在反应开始后4min时检出PEDV，30min内可完成检测。本发明初步用于临床样品检测，选取了经过RT-PCR扩增及测序结果为阳性的乳猪腹泻粪样50份，PEDV阴性粪样100份进行检测，结果表明与RT-PCR检测结果的符合率为100％。本发明对PEDV特异性强、灵敏度高、耗时短、操作简单、安全可靠。

附图说明

图1是本发明实施例提供的RT-RPA扩增特异性实验结果图。

图2是本发明实施例提供的QRT-RPA扩增特异性实验结果图。

图3是本发明实施例提供的PEDV RT-RPA扩增敏感性实验结果图。

图4是本发明实施例提供的PEDV QRT-RPA扩增敏感性实验结果图。

图1、图2中：1-猪流行性腹泻病毒(PEDV)；2-猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)；3-轮状病毒(RV)；4-猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)；5-猪嵴病毒(PKV)；6-猪瘟病毒(CSFV)；7-阴性对照。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面通过具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

实施例1：

1、引物设计

选取的PEDV为经典株CV777；根据PEDV的N基因的保守序列设计引物与探针如下表1：

表1引物和探针序列信息

2、提取PEDV的RNA

提取方法按照现有的技术进行。

制备标准RNA：

PEDV病毒RNA经RT-PCR在引物PndmF：TAACCAGGGTCGTGGAGCT和PndmR：CTCTGGGATGTCTTTGAGG扩增出片段长301bp，胶回收后，连接到pGEM-TEasy载体后，将其转化至大肠杆菌DH5感受态细胞，经复苏、挑斑、摇菌后，提取重组质粒，测序并分析鉴定，阳性重组质粒DNA由NdeI线性化，并用T7转录试剂盒转录大小片段为301bp的RNA，通过凝胶电泳验证RNA的完整性与大小，用RQ1无RNA酶的DNA酶消化体外转录的DNA并纯化RNA。使用ND-2000c分光光度计检测浓度并计算拷贝数，RNA拷贝数计算公式如下:(6.02×10²³拷贝数/摩尔数)×(RNA浓度)/(330×碱基数)。

3、反转录RPA(RT-RPA)、实时荧光定量RT-RPA(QRT-RPA)反应体系及条件

RT-RPA反应体系：上、下游引物(10μM)各2.4μL，Rehydration Buffer29.5μL，RNase Inhibitor 1μL，RNA 2μL和dH₂O 10.2μL。将上述反应体系混合后加入RT-RPA酶管中混匀，再加入2.5μL的乙酸镁混匀。置于加热器上40-42℃反应30min后，进行凝胶电泳观测扩增片段大小并测序鉴定。

QRT-RPA反应体系：上、下游引物(10μM)各2.1μL，探针(10μM)0.6μL，RehydrationBuffer29.5μL，RNase Inhibitor 1μL，RNA 2μL和dH₂O 10.2μL。将上述反应体系混合后加入QRT-RPA酶管中混匀，再加入2.5μL的乙酸镁混匀。放入荧光定量PCR仪上，39-42℃反应30min。

4、特异性实验

取PEDV、PRRSV、RV、TGEV、PKV、CSFV，用前述方法提取RNA，加入前述两种反应体系，并通过RT-RPA(如图1)与荧光定量RT-RPA(QRT-RPA)(如图2)验证引物与探针的特异性，同时以无RNA水为模板做阴性对照。

5、敏感性实验

制作PEDV的标准RNA作为QRPA的标准品，计算拷贝数，并以10倍的梯度稀释标准RNA，通过RT-RPA(如图3)与实时荧光定量RT-RPA(QRT-RPA)(如图4)来验证引物与探针的敏感性。原始标准RNA稀释到3x10⁹cospie/μL后并以10倍梯度稀释。

6、临床验证

选取经过RT-PCR扩增及测序结果为PEDV阳性的乳猪腹泻粪样50份，PEDV阴性粪样100份，采用本发明的PEDV等温逆转录重组酶聚合酶扩增快速检测技术进行检测，验证其与RT-PCR检测结果的符合率。

二、结果

1、反转录RPA(RT-RPA)与实时荧光定量RT-RPA(QRT-RPA)反应条件的优化：

RT-RPA；最佳反应时间：30min；最佳反应温度：40℃。

QRT-RPA:最佳反应时间：30min；最佳反应温度：39℃。

2、特异性实验：

实验结果表明：RT-RPA：只有PEDV可以扩增出相应的条带(170bp)，测序结果证实为PEDV目的基因序列。而猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪瘟和猪蓝耳病均扩增不出任何目的片段，表明该引物具有良好的特异性(如图1)。QRT-RPA：只有PEDV有相应的荧光曲线，其它病毒均没有，表明该引物与探针有良好的特异性(如图2)。

3、敏感性实验

实验结果表明：标准RNA稀释到10^-8(约30cospies)后，RT-RPA仍可扩增出170bp的目的条带(如图3)，测序结果证实为PEDV目的基因序列；将标准RNA稀释到10^-8后，仍能检测到荧光信号(如图4)，表明该RT-RPA和QRT-RPA最低可检测到30cospies的PEDVRNA，并且该方法最早可在反应开始后4min时检出PEDV，30min内可完成检测。

4、临床样品检测结果：选取经过RT-PCR扩增及测序结果为PEDV阳性的乳猪腹泻粪样50份，PEDV阴性粪样100份，采用本发明的等温逆转录重组酶聚合酶扩增快速检测技术进行检测，结果发现与RT-PCR检测结果的符合率为100％。

通过特异性试验、敏感性试验以及最后的检测结果可知本发明基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的PEDV快速检测方法能够简便、快速的鉴定PEDV，具有良好的特异性和敏感性，便于临床使用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含引物和探针，所述引物序列为：

上游引物F1020：5′–TCGTGAGCTAGCGGACTCTTACGAGATTAC-3′；

下游引物R1160：5′-GCTGCAGCGTGGTTTCACGCTTGTTCTTCT-3′；

所述探针序列为：

P1082：5′-ATCCAAATGTTGAGCTTCTTGTTTCACAGG(FAM-dT)G(THF)A(BHQ1-dT)GCATTTAAAACTGGG-C3space-3′。

2.根据权利要求1所述基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为10μM，探针的浓度为10μM。

3.根据权利要求1所述基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述引物扩增猪流行性腹泻病毒预期目的片段的大小为170bp。

4.一种基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的PEDV快速检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的引物和探针进行快速扩增以及实时荧光检测，如果得到170bp DNA片段或获得明显的扩增曲线，则证明所测样品中含有猪流行性腹泻病毒；

反转录RPA(RT-RPA)反应体系：上、下游引物(10μM)各2.4μL，Rehydration Buffer29.5μL，RNase Inhibitor 1μL，RNA 2μL和dH₂O 10.2μL；

反转录RPA(RT-RPA)反应条件：40-42℃反应30min；

实时荧光定量RT-RPA(QRT-RPA)反应体系：上、下游引物(10μM)各2.1μL，探针(10μM)0.6μL，Rehydration Buffer 29.5μL，RNase Inhibitor 1μL，RNA 2μL、和dH₂O 10.2μL；

实时荧光定量RT-RPA(QRT-RPA)反应条件：39-42℃反应30min。

5.根据权利要求4所述基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的PEDV快速检测方法，其特征在于，所述RT-RPA反应条件为：40℃反应30min。

6.根据权利要求4所述基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的PEDV快速检测方法，其特征在于，所述QRT-RPA反应条件为：39℃反应30min。