CN113930547B - 猪流行性腹泻病毒n基因的rt-raa荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法 - Google Patents

猪流行性腹泻病毒n基因的rt-raa荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及猪流行性腹泻病毒N基因的RT‑RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法。本发明所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的引物对可以特异性扩增猪流行性腹泻病毒N基因，利用该引物对可以检测猪流行性腹泻病毒，且检测周期更短、特异性强。

Description

猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒 及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)是目前在全球范围内广泛流行的冠状病毒，PEDV为囊膜病毒，属于冠状病毒科(Coronaviridae)、α冠状病毒属(alphacoronavirus)成员，主要侵害各日龄猪，尤其可感染仔猪小肠，并迅速导致仔猪产生水样腹泻，伴随呕吐、脱水等临床症状，致死率高达100％。
最新研究数据表明，我国的PEDV流行株中的S1基因正在发生变异，变异株的感染导致猪流行性腹泻病的严重程度，随着PEDV变异株的流行，疫苗毒株也急需进行替换。由于检测是防控PEDV的另一种有效方式之一，因此，针对PEDV的优势检测方法势在必行。
目前，已建立PEDV诊断方法有病毒分离和RT-PCR等。PEDV比较难分离，必须添加适量胰酶才有可能分离到病毒，敏感度不高，且操作繁琐，周期较长；常规RT-PCR检测方法虽简单、方便、快速，但仍存在检测周期长、假阳性和PCR污染的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA(重组酶介导链替换核酸扩增法)荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法。本发明提供的引物对可以特异性扩增猪流行性腹泻病毒N基因，利用该引物对可以检测猪流行性腹泻病毒，且检测周期更短、特异性更强。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述引物对在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对。
优选的，所述试剂盒还包括针对猪流行性腹泻病毒N基因设计的探针。
优选的，所述探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；
所述阳性对照品包括含有猪流行性腹泻病毒AJ1102的核酸；所述阴性对照品包括ddH2O。
优选的，所述阳性对照品的扩增碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测猪流行性腹泻病毒的方法，包括如下步骤：
提取待测样本的RNA，以待测样本的RNA为模板，利用上述的试剂盒进行RT-RAA反应；
结果判定：若出峰时间≤19.5min或Ct值≤39，则待测样本为猪流行性腹泻病毒阳性；若出峰时间＞19.5min或Ct值＞39，则待测样本为猪流行性腹泻病毒阴性。
优选的，所述RT-RAA的反应温度为41℃，反应时间为20～30min。
优选的，所述试剂盒中的引物对的正向引物和反向引物的工作浓度均为10μmol/L；所述试剂盒中的探针的工作浓度为10μmol/L。
有益效果：
本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的引物对可以特异性扩增猪流行性腹泻病毒N基因，且与猪细小病毒、猪圆环病毒2型病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪日本乙型脑炎病毒的核酸均无交叉反应，特异性强，利用该引物对可以检测猪流行性腹泻病毒。由实施例可知，利用本发明所述引物对制备的试剂盒检测结果与购买的猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒一致，符合率100％；与实时荧光RT-PCR检测试剂盒在检测时间上相比，利用本发明所述引物对制备的试剂盒检测时间为20～30min，而实时荧光RT-PCR检测试剂盒的检测时间为90min，利用本发明所述引物对制备的试剂盒的检测时间显著优于实时荧光RT-PCR检测试剂盒的检测时间。
附图说明
图1为实施例1中初始设计的6组引物对和探针荧光RT-RAA检测结果图；
图2为实施例1中初始设计的F-2/R-2引物对和探针灵敏度检测结果图；
图3为二次设计的15组引物对和探针灵敏度检测结果图；
图4为本发明实施例2中猪流行性腹泻病毒N基因引物对PCR扩增产物的琼脂糖电泳结果图；
图5为本发明实施例4中猪流行性腹泻病毒N基因引物对和探针荧光RT-RAA检测结果图；
图6为本发明实施例5中本发明的试剂盒对实际样品检测结果图；
图7为本发明实施例5中购买的猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒对实际样品检测结果图；
图8为本发明实施例6中本发明的试剂盒灵敏度检测结果图；
图9为本发明实施例7中本发明的试剂盒特异性检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：AATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAG，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：CAAAGATTTAAGGGCATCCTTGACAGCAG。
本发明提供的引物对可以特异性扩增猪流行性腹泻病毒N基因，与猪细小病毒、猪圆环病毒2型病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪日本乙型脑炎病毒的核酸均无交叉反应，利用该引物对可以检测猪流行性腹泻病毒，且检测周期更短、特异性强。
本发明还提供了上述引物对在制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂或试剂盒中的应用。本发明通过上述引物对可以扩增猪流行性腹泻病毒N基因，且特异性强；利用上述引物对制备的试剂或试剂盒可用于检测猪流行性腹泻病毒。
本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括针对猪流行性腹泻病毒N基因设计的探针；所述探针优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：AACAGAGGAGGCAATAATAATAACAATAACAAGTCTCGTAACCAGTCCAAG的探针；所述探针更优选包括在核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针基础上经修饰的探针；所述修饰优选包括：在所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的5’端第34位T碱基标记FAM发光基团，第34位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第36位碱基标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰，修饰后的探针优选如下所示：5’-AACAGAGGAGGCAATAATAATAACAATAACAAG/i6FAMdT//THF//iBHQ1dT/CGTAACCAGTCCAAG[C3-spacer]-3’。本发明修饰后的探针在游离状态下核酸外切酶不识别，当探针和目的基因识别后开始结合，核酸外切酶在识别到缺口后，切除THF并解除C3-spacer生物阻断素，从而使FAM基因和BHQ1基因分离发出荧光被仪器检测到，进而检测出扩增产物。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品优选包括含有猪流行性腹泻病毒AJ1102的核酸；所述阳性对照品的扩增碱基序列优选如SEQ ID NO.4所示：AATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAGCTTCTCAGAACAGAGGAGGCAATAATAATAACAATAACAAGTCTCGTAACCAGTCCAAGAACAGAAACCAGTCAAATGACCGTGGTGGAATGACATCACGCGATGATCTGGTGGCTGCTGTCAAGGATGCCCTTAAATCTTTG；所述阴性对照品优选包括ddH2O。本发明为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有阳性对照品及阴性对照品，其中阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证所用试剂的有效性，避免假阴性的发生。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括RT-RAA荧光法通用试剂。本发明对所述RT-RAA荧光法通用试剂的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知市售商品即可。本发明及实施例优选采用南宁壮博生物科技有限公司的货号为ZBA22001的RT-RAA核酸扩增试剂。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测猪流行性腹泻病毒的方法，包括如下步骤：
提取待测样本的RNA，以待测样本的RNA为模板，利用上述试剂盒进行RT-RAA反应；
结果判定：若出峰时间≤19.5min或Ct值≤39，则待测样本为猪流行性腹泻病毒阳性；若出峰时间＞19.5min或Ct值＞39，则待测样本为猪流行性腹泻病毒阴性。
在本发明中，所述试剂盒中的阳性对照和阴性对照的判断标准优选为：
阳性对照：有典型的扩增曲线出现，或出峰时间≤19.5min或Ct值≤39，为有效结果；
阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间＞19.5min或Ct值＞39，为有效结果。
在本发明中，所述RT-RAA荧光法的基本原理优选包括：先利用MLV逆转录酶将RNA转录成DNA，再利用重组酶在常温下，与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长；利用荧光探针的标记和核酸外切酶酶切，实现定时定性的结果分析。
本发明对所述提取待测样本的RNA的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的提取方法即可。
在本发明中，所述RT-RAA的反应时间优选为20～30min；所述RT-RAA的反应程序优选包括：41℃40s；41℃30s，40个循环。
在本发明中，所述试剂盒中的引物对的正向引物和反向引物的工作浓度均优选为10μmol/L；所述试剂盒中的探针的工作浓度优选为10μmol/L。
本发明所述检测方法是以非诊断为目的，仅是为了获得待测样本是否含有猪流行性腹泻病毒的中间值。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
初始引物设计
以NCBI数据库中PEDV N基因序列(GenBank登录号：JX188454、KJ020932、KJ646613、KC243782、JF690780、JF700126、JQ743654、JX406135、MG373547、MK458324、MK458327、KT799997、KY619826、KY619826、KY619825)为参考，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，设计引物和探针(P1)如下：
P1:CTAGCGGACTCTTACGAGATTACATACAATTATAAAATGACTGTGCCAAAG(SEQ ID NO.5所示)；该探针经修饰后如下所示：CTAGCGGACTCTTACGAGATTACATACAA/i6FAMdT//THF//iBHQ1dT/AAAATGACTGTGCCAAAG[C3-spacer]；
F-1:CTCTTTGGTGGTAATGTGGCTGTTCGTGAG(SEQ ID NO.6所示)；
F-2:CCAGTTTAGCACCAAATGTTGCAGCATTG(SEQ ID NO.7所示)；
R-1:CAGTTTTAAATGCATCCACCTGTGAAACAAGAAG(SEQ ID NO.8所示)；
R-2:CATTCCCAGTTTTAAATGCATCCACCTGTG(SEQ ID NO.9所示)；
R-3:TTCCCAGTTTTAAATGCATCCACCTGTG(SEQ ID NO.10所示)；
分为6组：F-1/R-1、F-1/R-2、F-1/R-3、F-2/R-1、F-2/R-2和F-2/R-3。
引物筛选
6组引物对以猪流行性腹泻病毒AJ1102核酸(GenBank登录号JX188454：27345-27500)为模板，ddH2O为阴性对照，进行RT-RAA反应(RT-RAA的反应程序为：42℃40s；42℃30s，40个循环)，反应结果如图1所示。在引物和探针相同浓度情况下，选择Ct值小，扩增产物量多的一组引物：F-2/R-2。
灵敏度测试：由生工构建PEDV N基因质粒(GenBank登录号JX188454：26376-27701)，将模板按10倍倍比稀释，以105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL和101copies/μL，5个浓度梯度为模板并且以ddH2O为阴性对照，分别取2μL作为反应模板，结果如图2所示。
由图2可知，该引物探针的最低检测线为102copies/μL，需重新设计引物探针。
二次引物设计
以NCBI数据库中PEDV N基因序列(GenBank登录号：JX188454、KJ020932、KJ646613、KC243782、JF690780、JF700126、JQ743654、JX406135、MG373547、MK458324、MK458327、KT799997、KY619826、KY619826、KY619825)为参考，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，设计引物和探针(P2)如下：
P2:AACAGAGGAGGCAATAATAATAACAATAACAAGTCTCGTAACCAGTCCAAG(SEQ ID NO.3所示)；该探针经修饰后为P，所述探针P如下所示：AACAGAGGAGGCAATAATAATAACAATAACAAG/i6FAMdT//THF//iBHQ1dT/CGTAACCAGTCCAAG[C3-spacer](50bp)；
F1：AAATAACCAGGGTCGTGGAGCTTCTCAG(SEQ ID NO.11所示)；
F2:TTCACAGAATCGTGGAAATAACCAGGG(SEQ ID NO.12所示)；
F3:ACCAATCCCGCGGTAATTCACAGAATCG(SEQ ID NO.13所示)；
F4:CAGAATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGG(SEQ ID NO.14所示)；
F5:AATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAG(SEQ ID NO.1所示)；
R1:CCTTGACAGCAGCCACCAGATCATCGCG(SEQ ID NO.15所示)；
R2:CATCCTTGACAGCAGCCACCAGATCATCG(SEQ ID NO.16所示)；
R3:CAAAGATTTAAGGGCATCCTTGACAGCAG(SEQ ID NO.2所示)
分为15组：F1R1、F1R2、F1R3、F2R1、F2R2、F2R3、、F3R1、F3R2、F3R3、F4R1、F4R2、F4R3、F5R1、F5R2和F5R3。
引物筛选
由生工构建PEDVN基因质粒(GenBank登录号JX188454.1：26376-27701)，将质粒进行10倍倍比稀释，以103copies/μL稀释浓度的质粒为阳性对照，ddH2O为阴性对照，15组引物以101copies/μL为检测模板进行引物筛选(RT-RAA的反应程序为：41℃40s；41℃30s，40个循环)。结果如图3所示。
由图3可知，在相同条件下，F5R3引物对在101coupies/μL的条件下扩增效率最高，故选择F5R3为本专利的最优引物组。
实施例2
猪流行性腹泻病毒N基因RT-RAA检测引物对验证
对实施例1筛选的引物对F5R3扩增片段进行验证，模板为PEDVN基因质粒(GenBank登录号JX188454：26376-27701)，反应体系为：正向引物F5(10μM)1.0μL，反向引物R3(10μM)1.0μL，ddH2O 6.0μL，2x Es Taq MasterMix 10.0μL，模板2μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸2min。将得到的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。
结果如图4所示，筛选的引物对扩增片对与预期结果一致大小为171bp，泳道从左往右依次是Marker、PEDV N基因质粒、ddH2O阴性对照。
实施例3
一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，该试剂盒由以下组分组成：RT-RAA反应干粉、实施例1筛选的正向引物F5、实施例1筛选的反向引物R3、实施例1筛选后修饰的探针P、A液、B液、阳性对照品和阴性对照品；其中正向引物和反向引物及探针的摩尔配比为1:1:1；阳性对照品为含有猪流行性腹泻病毒AJ1102核酸(SEQ ID No.4所示)，阴性对照品为ddH2O。
RT-RAA反应干粉的组成成分为：MLV逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、ATP、dNTP Mix、氯化镁(MgCl2)；A液成分为：聚乙二醇(PEG)；B液成分为：醋酸镁(MgAc2)；所述RT-RAA反应干粉、A液和B液为购自南宁壮博生物科技有限公司的货号为ZBA22001的RT-RAA核酸扩增试剂中的组分。
实施例4
应用实施例3的试剂盒对样本中的猪流行性腹泻病毒进行检测，检测方法如下：
按照动物组织总RNA提取试剂盒(DP431)(广州斯佳生物科技有限公司)的说明书步骤提取待测样本基因组RNA。
RT-RAA反应体系的配制：每个检测样品对应一个RT-RAA反应干粉管，每个RT-RAA反应管中各反应组分和所加入的体积如表1所示。
表1RAA反应体系配制表
RT-RAA反应体系组分 使用量
RT-RAA反应干粉 1管
A液 25μL
B液 2.5μL
F5(浓度为10μmol/L) 2μL
R3(浓度为10μmol/L) 2μL
P(浓度为10μmol/L) 0.6μL
ddH<sub>2</sub>O 15.9μL
RNA模板 2μL
总体积 50μL
将配制好RT-RAA反应体系的反应管上下颠倒6～8次，充分混匀反应液，低速离心数秒使反应液全部离心至管底。将反应管放置于荧光定量仪中，41℃40s；41℃30s，40个循环，并收集荧光信号。
扩增结束后根据出峰时间或Ct值判定待检样本结果(如图5所示)，判断标准如下：
(1)阳性对照：有典型的扩增曲线出现，或出峰时间≤19.5min或Ct值≤39，为有效结果；
(2)阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间＞19.5min或Ct值＞39，为有效结果；
(3)检测样本：若出峰时间≤19.5min或Ct值＞39，可判断待测样本为猪流行性腹泻病毒阳性；若出峰时间＞19.5min或Ct值＞39，可判断待测样本为猪流行性腹泻病毒阴性。
由图5可知，本发明的阳性对照品和阴性对照品均为有效结果，其中阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证所用试剂的有效性，避免假阴性的发生。
实施例5
为验证本发明所述引物、试剂在实际情况下能正常使用，使用本发明的引物、试剂对实际样本进行检测。收集31份临床样品，按照动物组织总RNA提取试剂盒(DP431)(广州斯佳生物科技有限公司)的说明书步骤提取待测样本基因组RNA。用购买的猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒(哈尔滨国生生物科技股份有限公司)对提取的31份待测样品RNA进行检测，检测结果如图6所示；用本发明的试剂盒对提取的31份待测样品RNA进行检测，结果如图7所示。
由图6和图7可知，购买的猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒在实验成立的条件下，阳性样品共检测出15份，阴性样品16份。本发明试剂盒检测在实验成立的条件下，阳性样品共检测出15份，阴性样品16份。
通过与购买的猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒检测结果比较，本发明试剂盒检测结果与购买的猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒一致，符合率100％。与实时荧光RT-PCR检测试剂盒在检测时间上相比，本发明的试剂盒检测时间为30min，而实时荧光RT-PCR检测试剂盒的检测时间为90min，因此本发明的试剂盒优于实时荧光RT-PCR检测试剂盒的检测时间。
实施例6
本发明的试剂盒灵敏度试验
参照RNA提取试剂盒说明书提取猪流行性腹泻病毒RNA，采用体外转录的方法测定模板浓度，将模板按10倍倍比稀释，以105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL 5个浓度梯度为模板并且以ddH2O为阴性对照，分别取2μL作为反应模板，按照实施例4所述加样方法进行RT-RAA核酸扩增。
检测结果：如图8所示，本发明的试剂盒中引物对和探针能检测浓度为101copies/μL以上的模板，检测灵敏度高。
实施例7
本发明的试剂盒的特异性试验
以猪流行性腹泻病毒AJ1102核酸(SEQ ID NO.4所示)为阳性对照，ddH2O为阴性对照，分别取猪细小病毒、猪圆环病毒2型病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪日本乙型脑炎病毒的核酸2μL进行检测，按照实施例4所述加样方法进行RT-RAA核酸扩增。
检测结果：如图9所示，猪流行性腹泻病毒模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线，其他病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。
结果表明，本发明提供的试剂盒可以实现对猪流行性腹泻病毒的特异性检测，且不与猪细小病毒、猪圆环病毒2型病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪日本乙型脑炎病毒的核酸发生交叉反应。
综上所述，本发明所提供的引物对及试剂盒可以快速、方便、高效、特异地检测样本中是否含有猪流行性腹泻病毒及辅助诊断是否为猪流行性腹泻病毒感染，适宜于临床的鉴别检测、动物疫病检测和净化。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 猪流行性腹泻病毒N基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatcgtggaa ataaccaggg tcgtggag 28
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caaagattta agggcatcct tgacagcag 29
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacagaggag gcaataataa taacaataac aagtctcgta accagtccaa g 51
<210> 4
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatcgtggaa ataaccaggg tcgtggagct tctcagaaca gaggaggcaa taataataac 60
aataacaagt ctcgtaacca gtccaagaac agaaaccagt caaatgaccg tggtggaatg 120
acatcacgcg atgatctggt ggctgctgtc aaggatgccc ttaaatcttt g 171
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctagcggact cttacgagat tacatacaat tataaaatga ctgtgccaaa g 51
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctctttggtg gtaatgtggc tgttcgtgag 30
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccagtttagc accaaatgtt gcagcattg 29
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagttttaaa tgcatccacc tgtgaaacaa gaag 34
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cattcccagt tttaaatgca tccacctgtg 30
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttcccagttt taaatgcatc cacctgtg 28
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaataaccag ggtcgtggag cttctcag 28
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttcacagaat cgtggaaata accaggg 27
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accaatcccg cggtaattca cagaatcg 28
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagaatcgtg gaaataacca gggtcgtgg 29
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccttgacagc agccaccaga tcatcgcg 28
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
catccttgac agcagccacc agatcatcg 29

Claims (6)

1.一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对和针对猪流行性腹泻病毒N基因设计的探针；
所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品的扩增碱基序列如SEQID NO.4所示；所述阴性对照品包括ddH2O。
4.一种非诊断目的的检测猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取待测样本的RNA，以待测样本的RNA为模板，利用1~3任一项所述的试剂盒进行RT-RAA反应；
结果判定：若出峰时间≤19.5min或Ct值≤39，则待测样本为猪流行性腹泻病毒阳性；若出峰时间＞19.5min或Ct值＞39，则待测样本为猪流行性腹泻病毒阴性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA的反应温度为41℃，反应时间为20~30min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述试剂盒中的引物对的正向引物和反向引物的工作浓度均为10μmol/L；所述试剂盒中的探针的工作浓度为10μmol/L。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115323075B (zh) * 2022-06-30 2023-05-09 华南农业大学 一种检测鸡传染性支气管炎病毒及基因分型的rt-raa引物探针组、试剂盒及其应用
CN116064961A (zh) * 2022-11-14 2023-05-05 盐城师范学院 用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光rt-raa检测的产品和方法
CN116814848B (zh) * 2023-04-12 2024-03-19 中国医学科学院医学实验动物研究所 基于荧光raa检测小鼠微小病毒的引物和探针及方法
CN116790821B (zh) * 2023-08-07 2025-03-14 四川大学 一种针对于PEDV的RAA-PfAgo检测引物及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107299156A (zh) * 2017-08-22 2017-10-27 河北省检验检疫科学技术研究院 检测猪流行性腹泻病毒的核酸、实时荧光rt‑rpa试剂盒及方法
CN107475456A (zh) * 2017-09-27 2017-12-15 中国农业科学院兰州兽医研究所 基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的pedv快速检测方法及其试剂盒
CN107699635A (zh) * 2017-06-19 2018-02-16 中国检验检疫科学研究院 猪流行性腹泻病毒荧光rpa检测方法
CN109593889A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 广州动佰生物科技有限公司 基于实时荧光反转录重组酶介导链替换核酸扩增技术的猪德尔塔冠状病毒检测方法
CN110283938A (zh) * 2019-06-20 2019-09-27 华南农业大学 一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组、试剂盒及应用
CN110951916A (zh) * 2019-12-04 2020-04-03 华南农业大学 一种基于实时荧光逆转录重组酶聚合酶核酸扩增技术检测SADS-CoV的引物和试剂盒
CN112795704A (zh) * 2021-03-09 2021-05-14 中国农业大学 检测猪伪狂犬病病毒的raa引物对和探针、试剂盒及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107699635A (zh) * 2017-06-19 2018-02-16 中国检验检疫科学研究院 猪流行性腹泻病毒荧光rpa检测方法
CN107299156A (zh) * 2017-08-22 2017-10-27 河北省检验检疫科学技术研究院 检测猪流行性腹泻病毒的核酸、实时荧光rt‑rpa试剂盒及方法
CN107475456A (zh) * 2017-09-27 2017-12-15 中国农业科学院兰州兽医研究所 基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的pedv快速检测方法及其试剂盒
CN109593889A (zh) * 2018-12-29 2019-04-09 广州动佰生物科技有限公司 基于实时荧光反转录重组酶介导链替换核酸扩增技术的猪德尔塔冠状病毒检测方法
CN110283938A (zh) * 2019-06-20 2019-09-27 华南农业大学 一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组、试剂盒及应用
CN110951916A (zh) * 2019-12-04 2020-04-03 华南农业大学 一种基于实时荧光逆转录重组酶聚合酶核酸扩增技术检测SADS-CoV的引物和试剂盒
CN112795704A (zh) * 2021-03-09 2021-05-14 中国农业大学 检测猪伪狂犬病病毒的raa引物对和探针、试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rapid detection of porcine deltacoronavirus and porcine epidemic diarrhea virus using the duplex recombinase polymerase amplification method;Gen Li等;《Journal of Virological Methods》;20210215;第292卷;第1-8页 *
猪德尔塔冠状病毒荧光RT-RAA快速检测方法的建立及初步应用;赵平等;《中国动物检疫》;20210810;第38卷(第8期);第85-89页 *

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