CN116287477A - 一种通用型及分型检测人圆环病毒的荧光定量pcr检测引物探针组、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通用型及分型检测人圆环病毒的荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及应用。本发明的分型引物探针组序列如SEQ ID NO：1～3或SEQ ID NO：4～6所示，通用型引物探针组序列如SEQ ID NO：7～9所示。本发明提供的荧光定量PCR检测引物探针组和试剂盒，能实现对人圆环病毒HCirV1/2，HCirV‑1和HCirV‑2的特异性检测，其他DNA/RNA病原不会产生交叉反应，具有良好的特异性。本发明提供的引物探针组和试剂盒用于检测人圆环病毒可以在相对短时间内实现较高通量的样本检测，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种通用型及分型检测人圆环病毒的荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及应用。本发明利用TaqMan探针技术，建立一种通用型及分型检测人圆环病毒的实时荧光定量PCR技术，成功运用于人圆环病毒的快速检测诊断。
背景技术
圆环病毒(Circoviruses)属于圆环病毒科，圆环病毒属。它们是最小的自主复制、无包膜、单链DNA病毒，具有圆形对称性。到目前为止，已知有4种圆环病毒感染猪，包括猪圆环病毒PCV1、PCV2和新型的PCV3和PCV4。PCV1最早被发现在1974年，最初被认定是一种PK15猪肾细胞系污染物，但无致病性；PCV2、PCV3分别在1991年和2016年被分离鉴定，均对猪极为易感，临床上常引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)、猪皮炎肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy Syndrome，PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease com plex，PRDC)、猪增生性坏死性肺炎(Proliferative and necrotizing pneumonia，PNP)。这些疾病统称为猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease，PCVD)或猪圆环病毒相关疾病(Porcinecircovirus associated disease，PCVAD)；PCV4在我国于2019年在湖南省首次发现，其致病性尚不明确。圆环病毒最初被描述为禽类物种，但其中一些已在鱼类、昆虫和哺乳动物中被发现，也有越来愈多的新圆环病毒被发现。
2022年3月，法国一名接受心肺移植的61岁妇女寻求以肝酶升高为主要特征的慢性肝炎治疗。排除了常见病因后，研究人员用宏基因组测序分析肝活检样本，并确定了一种未知的环状病毒，命名为人类圆环病毒1(HCirV-1)。此外，也有研究人员在对静脉注射毒品使用者(IDUs)进行血源性病毒的复杂循环的研究时，在一个IDU样本中组装出一个完整的环状病毒基因组(GenBank:ON226770)，该基因组与PCV3的亲缘关系最密切，70％的同源性，这意味着它可能是一种针对人类的新型圆环病毒(HCirV-2)，引起了人们对这些新发现病毒在严重疾病的人群中传播风险的关注。此外，这些潜在新发病毒在高危人群中的存在，突出了筛查和调查其在注射吸毒者和其他高危人群中的流行程度，并进一步确定它们的起源和传播模式的重要性。
荧光PCR技术已经广泛应用在各种病原的诊断中，技术成熟，Taqman探针法荧光PCR技术与染料法荧光PCR相比多了一条探针，特异性更好，应用广泛，通过对不同探针标记不同的发光基团可实现病原多重检测，与传统PCR检测比，检测速度快，敏感性高，不需要开盖电泳检测PCR产物，减少实验室气溶胶污染风险。
目前，针对一型人圆环病毒已建立了相关的荧光染料PCR方法(Philippe Pérotet al，Emerging Infectious Diseases，2023)，但尚未发现基于TaqMan探针的通用型(HCirV1/2)及分型(HCirV-1，HCirV-2)检测人圆环病毒(HCirV)的荧光定量PCR检测方法。而普通PCR方法存在着灵敏度低、产物需要进行凝胶电泳实验进行鉴定等缺点。因此，需要开发一种针对人圆环病毒的高灵敏性和特异性高通量检测方法。
发明内容
本发明的目的是：针对现有技术中普通PCR方法存在着灵敏度低、产物需要进行凝胶电泳实验进行鉴定等缺点，本发明旨在通过对HCirV-1及HCirV-2进行序列比对，选取保守区域设计通用型检测引物探针组，能够实现最大限度识别HCirV的所有毒株；且同时设计了可鉴定一型及二型人圆环病毒的双重荧光定量PCR检测引物探针组和检测方法，可填补国内外相关领域的研究空白。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种用于检测人圆环病毒的荧光定量PCR检测引物探针组，包括如下引物探针组中的至少一种：
用于检测人圆环病毒HCirV-1的第一分型引物探针组，其包括如SEQ ID NO：1～2所示的引物对和如SEQ ID NO：3所示的TaqMan探针序列；
用于检测人圆环病毒HCirV-2的第二分型引物探针组，其包括如SEQ ID NO：4～5所示的引物对和如SEQ ID NO：6所示的TaqMan探针序列；
用于检测人圆环病毒HCirV-1和/或HCirV-2的通用型引物探针组，其包括如SEQID NO：7～8所示的引物对和如SEQ ID NO：9所示的TaqMan探针序列。
优选地，所述TaqMan探针的5’端连接有荧光标记；
和/或，3’端修饰有淬灭基团。
优选地，所述荧光标记为HEX、FAM、5-FAM、6-FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Texas Red、NED、Alexa Flour、TET、Quasar670或VIC；
和/或，所述淬灭基团为Dabcyl、MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3。
本发明的第二方面提供了上述用于检测人圆环病毒的荧光定量PCR检测引物探针组在制备用于检测人圆环病毒的试剂、试剂盒或微阵列芯片中的应用。
本发明的第三方面提供了一种用于检测人圆环病毒的试剂或试剂盒，其至少包括上述用于检测人圆环病毒的荧光定量PCR检测引物探针组。
优选地，还包括Premix Ex Taq qPCR mix预混液、阳性对照和阴性对照中的至少一种。
优选地，所述预混液中含有Mg2+离子、PCR缓冲液、dNTPs混合物和热启动Taq DNA聚合酶；
和/或，所述阳性对照包括标准质粒pcDNA3.1(+)HCirV-1和pcDNA3.1(+)HCirV-2；
和/或，所述阴性对照为无核酸酶水。
更优选地，所述标准质粒pcDNA3.1(+)HCirV-1、pcDNA3.1(+)HCirV-2的拷贝数均为1×108拷贝/μl。
所述试剂盒保存于20℃，并避免反复冻融。
本发明的第四方面提供了上述试剂或试剂盒在非诊断治疗目的的检测人圆环病毒中的应用。
本发明的第五方面提供了上述试剂或试剂盒的使用方法，或使用上述试剂或试剂盒非诊断治疗目的的检测人圆环病毒的方法，包括以下步骤：
步骤1：提取样品核酸；
步骤2：配制荧光定量PCR反应体系及进行荧光定量PCR反应；
步骤3：根据机器测算的荧光信号及Cq值判断样品中是否有HCirV-1、HCirV-2或判断样品中是否有HCirV-1和HCirV-2中的至少一种。
优选地，所述步骤2中的PCR反应体系包括：
Premix Ex Taq qPCR mix 10μl；
F 0.3μl×N，终浓度10μM，
R 0.3μl×N，终浓度10μM；
P 0.2μl×N，终浓度10μM；
模板DNA 5μl，加入无核酸酶水将体系补足至20μl；
其中，N为检测病原数；
和/或，所述荧光定量PCR反应条件的温控程序设置为：95℃预变性2min；95℃变性10s，59℃退火延伸30s，45个循环；同时以荧光定量PCR仪器收集荧光信号。
和/或，所述步骤3中Cq值＞35的结果判断为阴性。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)操作简便、快速：本发明基于通用型及分型荧光定量PCR检测引物探针组建立的HCirV-1和HCirV-2双重荧光定量PCR方法能够在HCirV1/2通用型检测大范围筛查过后确认是人圆环病毒后，可在一个PCR反应管中同时鉴别检测出HCirV-1及HCirV-2，并可通过计算机和分析软件实现PCR扩增、产物检测和定量分析一体化，避免人为因素的干扰；
(2)本发明的引物探针组及试剂盒为该类病的防控提供了可靠的技术支持，并且在很大程度上降低了单重检测方法的工作量，工作效率得到了大幅度地提升；
(3)安全、无污染：在全封闭状态下进行PCR扩增和产物分析，杜绝了传统PCR开放检测对环境的污染和由此导致的假阳性；
(4)高特异性和精确性：将DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精准性融合，应用荧光探针和光电传导，直接探测基因扩增过程中荧光信号的变化，以获得定量结果。
附图说明
图1：HCirV1/2单重，HCirV-1及HCirV-2双重实时荧光定量PCR的敏感性检测扩增曲线结果图，1～6分别为1×105～100拷贝/μL。
图2：HCirV1/2单重，HCirV-1及HCirV-2双重实时荧光定量PCR的标准曲线。
图3:HCirV1/2，HCirV-1及HCirV-2实时荧光定量PCR特异性结果。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规试剂产品。
实施例1引物设计
一种通用型及分型检测人圆环病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，包括Premix ExTaq qPCR mix荧光定量PCR反应预混液、无核酸酶水，以及用于通用型及分型检测HCirV的三对特异性引物和相应的TaqMan探针及对照品；其中，所述荧光定量PCR反应预混液含有Mg2+离子、PCR缓冲液、dNTPs混合物；所述对照品包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品为分别将HCirV-1和HCirV-2共有保守区域及特异检测区域基因片段，连入pcDNA3.1(+)载体，构建重组质粒作为标准品模板；所述阴性对照品为无核酸酶水。
根据NCBI上已报道的HCirV-1的基因序列(登录号GenBank:ON677309.1)以及HCirV-2的基因序列(登录号GenBank:ON226770.1)，利用探针引物设计软件PrimerExpress5.0设计出一对检测引物和一条探针，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物及探针均稀释至10μmol/L以备用，所述检测引物和探针序列如表1所示：
表1.HCirV检测引物组
实施例2通用型及分型TaqMan qPCR检测方法标准曲线的建立及敏感性测试
1)将HCirV-1的基因序列(登录号GenBank:ON677309.1)以及HCirV-2的基因序列发送给生工生物工程公司合成重组质粒，载体为pcDNA3.1(+)。得到重组质粒后对其浓度进行测定，并计算质粒拷贝数。最后通过倍比稀释将重组质粒的拷贝数浓度设置为从1×105copies/μL 1×100copies/μL。制备稀释倍数为10倍，浓度为1×105copies/μL 1×100copies/μL的HCirV-1和HCirV-2的重组质粒标准品。
2)将上述质粒标准品置入qPCR反应体系，使用实施例1所述试剂盒中的引物对与相应的TaqMan探针，进行PCR扩增，收集荧光信号。
3)通用型单重qPCR反应体系为：10μL Premix Ex Taq qPCR mix(含有Mg2+离子、dNTPs混合物、热启动Taq DNA聚合酶等)，HCirV1/2上下游引物F和R各0.3μL，HCirV1/2探针引物P 0.2μL，cDNA模板2μL，无核酸酶水加至体系总体积为20μL，如表2所示。
4)分型双重qPCR反应体系为：10μL Premix Ex Taq qPCR mix(含有Mg2+离子、dNTPs混合物、热启动Taq DNA聚合酶等)，HCirV-1和HCirV-2上下游引物F和R各0.3μL，HCirV-1和HCirV-2探针引物P 0.2μL，cDNA模板2μL，无核酸酶水加至体系总体积为20μL。
5)qPCR反应程序：荧光通道设置为：针对HCirV1/2的荧光通道为FAM，针对HCirV-1的荧光通道为VIC，针对HCirV-2的荧光通道为Cy5；温控程序设置为：95℃预变性2min；95℃变性10s，59℃退火延伸30s，45个循环；以荧光定量PCR仪器收集荧光信号。
6)得到HCirV-1和HCirV-2的质粒标准品由1×105copies/μL 1×100copies/μL6个浓度梯度的荧光扩增曲线和HCirV-1和HCirV-2的标准品稀释的标准曲线。
7)如图1所示，图1分别HCirV1/2，HCirV-1和HCirV-2的质粒标准品由1×105copies/μL 1×100copies/μL 6个浓度梯度的荧光扩增曲线，图2分别为HCirV1/2，HCirV-1和HCirV-2的标准品稀释的标准曲线。由图1及图2可知，用于测试本发明检测方法的质粒标准品已经成功建立，从而说明本发明检测方法数据的可靠性。
采用不同组合的引物、探针浓度进行试验，当采用如表2所示的反应体系，即探针加入量各0.2μL，引物加入量各0.3μL时，该多重qPCR反应的荧光强度最高，且Cq值也相对最低。
表2.qPCR检测方法反应体系
| 序号 | 组分 | 用量(μL) |
| 1 | 2×Premix Ex Taq qPCR mix | 10μL |
| 2 | 上游引物(10μM) | 0.3μL |
| 3 | 下游引物(10μM) | 0.3μL |
| 4 | 探针(10μM) | 0.2μL |
| 5 | 模板 | 2μL |
| 6 | 无核酸酶水 | 至20μL |
实施例3通用型及分型TaqMan qPCR检测方法特异性试验
1)将JCV，CMV，AdHu5，HIV，HBV，HCV，Pegivirus C等病毒阳性的临床样品根据柱法病毒总核酸(DNA/RNA)提取试剂盒(货号D3191 02C)说明书提取DNA/RNA，以及HCirV-1和HCirV-2重组质粒分别置于qPCR体系中，使用实施例1所述试剂盒中的引物对与相应的TaqMan探针，进行PCR扩增，收集荧光信号。
2)将上述质粒标准品置入qPCR反应体系，使用实施例1所述试剂盒中的引物对与相应的TaqMan探针，进行PCR扩增，收集荧光信号。
3)通用型单重qPCR反应体系为：10μL Premix Ex Taq qPCR mix(含有Mg2+离子、dNTPs混合物、热启动Taq DNA聚合酶等)，HCirV1/2上下游引物F和R各0.3μL，HCirV1/2探针引物P 0.2μL，cDNA模板2μL，无核酸酶水加至体系总体积为20μL，如表2所示。
4)分型双重qPCR反应体系为：10μL Premix Ex Taq qPCR mix(含有Mg2+离子、dNTPs混合物、热启动Taq DNA聚合酶等)，HCirV-1和HCirV-2上下游引物F和R各0.3μL，HCirV-1和HCirV-2探针引物P 0.2μL，cDNA模板2μL，无核酸酶水加至体系总体积为20μL。
5)qPCR反应程序：荧光通道设置为：针对HCirV1/2的荧光通道为FAM，针对HCirV-1的荧光通道为VIC，针对HCirV-2的荧光通道为Cy5；温控程序设置为：95℃预变性2min；95℃变性10s，59℃退火延伸30s，45个循环；以荧光定量PCR仪器收集荧光信号。
6)图3为使用通用型及分型TaqMan qPCR检测方法对JCV，CMV，AdHu5，HIV，HBV，HCV，Pegivirus C以及HCirV-1和HCirV-2重组质粒的检测荧光扩增曲线。
7)由图3可知，用本发明的通用型及分型TaqMan qPCR检测方法用于检测含有多种其它DNA/RNA病原的样品，结果只有HCirV1/2，HCirV-1和HCirV-2被正常检出，其他DNA/RNA病原均不能被检出，说明实施例1所述试剂盒中的引物对与相应的TaqMan探针与人类常见的其他重要DNA/RNA病原体不会产生交叉反应，本发明的检测方法具有良好的特异性。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于检测人圆环病毒的荧光定量PCR检测引物探针组，其特征在于，包括如下引物探针组中的至少一种：
用于检测人圆环病毒HCirV-1的第一分型引物探针组，其包括如SEQ ID NO：1～2所示的引物对和如SEQ ID NO：3所示的TaqMan探针序列；
用于检测人圆环病毒HCirV-2的第二分型引物探针组，其包括如SEQ ID NO：4～5所示的引物对和如SEQ ID NO：6所示的TaqMan探针序列；
用于检测人圆环病毒HCirV-1和/或HCirV-2的通用型引物探针组，其包括如SEQ IDNO：7～8所示的引物对和如SEQ ID NO：9所示的TaqMan探针序列。
2.如权利要求1所述的用于检测人圆环病毒的荧光定量PCR检测引物探针组，其特征在于，所述TaqMan探针的5’端连接有荧光标记；
和/或，3’端修饰有淬灭基团。
3.如权利要求2所述的用于检测人圆环病毒的荧光定量PCR检测引物探针组，其特征在于，所述荧光标记为HEX、FAM、5-FAM、6-FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Texas Red、NED、Alexa Flour、TET、Quasar670或VIC；
和/或，所述淬灭基团为Dabcyl、MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3。
4.权利要求1所述的用于检测人圆环病毒的荧光定量PCR检测引物探针组在制备用于检测人圆环病毒的试剂、试剂盒或微阵列芯片中的应用。
5.一种用于检测人圆环病毒的试剂或试剂盒，其特征在于，至少包括权利要求1所述的用于检测人圆环病毒的荧光定量PCR检测引物探针组。
6.如权利要求5所述的用于检测人圆环病毒的试剂或试剂盒，其特征在于，还包括Premix Ex Taq qPCR mix预混液、阳性对照和阴性对照中的至少一种。
7.如权利要求6所述的用于检测人圆环病毒的试剂或试剂盒，其特征在于，所述预混液中含有Mg2+离子、PCR缓冲液、dNTPs混合物和热启动Taq DNA聚合酶；
和/或，所述阳性对照包括标准质粒pcDNA3.1(+)HCirV-1和pcDNA3.1(+)HCirV-2；
和/或，所述阴性对照为无核酸酶水。
8.权利要求5～7中任意一项所述的试剂或试剂盒在非诊断治疗目的的检测人圆环病毒中的应用。
9.权利要求5～7中任意一项所述的试剂或试剂盒的使用方法，或使用权利要求5～7中任意一项所述的试剂或试剂盒非诊断治疗目的的检测人圆环病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取样品核酸；
步骤2：配制荧光定量PCR反应体系及进行荧光定量PCR反应；
步骤3：根据机器测算的荧光信号及Cq值判断样品中是否有HCirV-1、HCirV-2或判断样品中是否有HCirV-1和HCirV-2中的至少一种。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的PCR反应体系包括：
Premix Ex Taq qPCR mix 10μl；
F 0.3μl×N，终浓度10μM，
R 0.3μl×N，终浓度10μM；
P 0.2μl×N，终浓度10μM；
模板DNA 5μl，加入无核酸酶水将体系补足至20μl；
其中，N为检测病原数；
和/或，所述荧光定量PCR反应条件的温控程序设置为：95℃预变性2min；95℃变性10s，59℃退火延伸30s，45个循环；同时以荧光定量PCR仪器收集荧光信号。
和/或，所述步骤3中Cq值＞35的结果判断为阴性。
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