CN113718064A

CN113718064A - 一种鉴别pcv2和pcv3的探针引物组合、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN113718064A
Application number: CN202111237166.1A
Authority: CN
Inventors: 张蓉; 毛旭明; 凌勇; 丁能水; 龙小敏; 龙毅; 吴有林
Original assignee: Taihe Aomu Breeding Co ltd; Guizhou Aonong Qihuan Animal Husbandry Co ltd; Fujian Aonong Biological Technology Group Co Ltd
Current assignee: Taihe Aomu Breeding Co ltd; Guizhou Aonong Qihuan Animal Husbandry Co ltd; Fujian Aonong Biological Technology Group Co Ltd
Priority date: 2021-10-22
Filing date: 2021-10-22
Publication date: 2021-11-30

Abstract

本发明公开了一种鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合、试剂盒及应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供的探针引物组合包括(a)SEQ ID NO.1‑3所示的第一组探针引物组合，(b)SEQ ID NO.4‑6所示的第二组探针引物组合。本发明提供的试剂盒可同时对PCV2感染、PCV3感染以及PCV2和PCV3感染实现一次性检出，减少常规方法耗时长、敏感性低且易出现假阳性问题，同时避免猪场共同感染样本因不同类型病毒浓度差异而影响病毒检出率，检测灵敏度高、特异性强，为猪圆环病毒的疫情监测和防控提供技术支持，具有良好的应用前景。

Description

一种鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种鉴别PCV2 和PCV3的探针引物组合、试剂盒及应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是一种小型单股负链、环状无囊膜的DNA病毒，根据其基因及抗原的差异性可将其分为3 种血清型：猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)以及新出现的猪圆环病毒3型(PCV3)。PCV1被认为对猪没有致病性；PCV2会导致断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征、繁殖障碍等疾病，给养猪业带来极大的威胁。PCV3为一种与猪皮炎和肾病综合征、生殖功能衰竭和多系统炎症相关的新型猪圆环病毒。 2016年Shen H等在中国广东省检测出了PCV3(PCV3-China/GD2016 株)，首次证实了PCV3在国内的存在，随后对国内许多省份进行了 PCV3的筛查，结果表明，PCV3在我国许多地区广泛流行。临床诊断中PCV3常与免疫抑制性病毒PCV2以双重感染的形式被检出，且感染PCV3的猪临床症状与PCV2非常相似，难以区分，为临床诊断和治疗带来极大的困难。

目前检测PCV的常用检测方法主要有病毒分离、血清学检测以及PCR检测等。但这些常规方法耗时长、敏感性低且容易出现假阳性。在PCR检测方法中，只有单一的检测PCV2或PCV3，不能在一个反应中同时对PCV2与PCV3进行实时荧光PCR检测，因此建立一种快速、灵敏、准确的PCV2和PCV3的鉴别方法意义重大。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合、试剂盒及应用以解决上述技术问题。

本发明提供了一种可以鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)以及猪圆环病毒3型(PCV3)的探针引物组合、试剂及试剂盒，该探针引物组合具有检测灵敏度高、特异性强、稳定性(或重复性)好的特点。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合，其包括第一探针引物组合和第二探针引物组合中的至少一种探针引物组合，第一探针引物组合包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO.3所示的第一探针，第二探针引物组合包括SEQ ID NO.4-5所示的第二引物对和SEQ ID NO.6所示的第二探针。

PCV2基因组全长1766bp-1768bp，目前已知有3个主要的开放阅读框ORF1、2、3，已经被证实，其中ORF1开放阅读框编码病毒的复制酶蛋白(Rep和Rep’)；ORF2开放阅读框主要编码病毒免疫原性蛋白即核衣壳蛋白(Cap)；ORF3开放阅读框位于ORF1内，虽然其编码的蛋白不是病毒复制过程中必需的，但是能够诱导宿主细胞凋亡。

PCV3的全基因序列长2000bp，目前已知有3个主要的开放阅读框ORF1、2、3，其中的ORF1和ORF2分别编码病毒的Rep蛋白和Cap蛋白。

通过同源性比对，结果表明：编码Cap蛋白的ORF2基因是PCV2 和PCV3之间差异性最高的基因，因此该基因是特异性地鉴别PCV2 和PCV3的最佳靶基因。本发明分别选取PCV2ORF2基因和PCV3 ORF2基因的保守区域设计荧光探针和引物序列。

双重荧光定量实验是在一个反应管中同时对2个靶标基因进行扩增定量实验，因此其中一个靶标基因的扩增势必会影响另一个靶标基因的扩增，所以要通过引物设计以及反应条件的优化来同步扩增效率，而不是在同一反应管中将所有引物和模板简单的混合。由于PCV2 和PCV3是两种不同的病毒，根据具体感染情况，共感染的样本中两种病毒浓度可能存在不同程度的差异。在同一反应管中扩增时，如果出现一种基因扩增效率高于另一种基因时，则其中一种基因的扩增可能受到抑制，最终影响两种病毒的检出率。

有鉴于此，本发明通过引物和探针的设计，在高度保守的序列中，找到合适的引物探针序列，且该引物对的扩增效率接近。筛选该引物对的过程较困难且结果不易控制，需要进行多次实验，同时通过调整引物与荧光探针的比例，优化反应条件，使样本中两种病毒基因的扩增效率一致，与每个单重反应的灵敏度保证一致。

第一引物对和第一探针用于扩增PCV2的ORF2基因，第二引物对和第二探针用于扩增PCV3的ORF2基因。

第一探针引物组合的序列如下：

上游引物SEQ ID NO.1：5’-ATGGCGGGAGGAGTAGTT-3’；

下游引物SEQ ID NO.2：5’-CGCTCTGTGCCCTTTGAA-3’；

第一探针SEQ ID NO.3：CATAGGGGTCATAGGTGAGGGC。

第一引物对扩增的目的序列如下(SEQ ID NO.7)：

ATGGCGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGGTCATAGGTGAGG GCTGTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCATCTAGAATAACAGCACT GGAGCCCACTCCCCTGTCACCCTGGGTGATCGGGGAGCAGGGC CAGAATTCAACCTTAACCTTTCTTATTCTGTAGTATTCAAAGGG CACAGAGCG。

第二探针引物组合的序列如下：

上游引物SEQ ID NO.5：5’-CATTGAACGGTGGGGTC-3’；

下游引物SEQ ID NO.4：5’-ATTCTGGCGGGAACTAC-3’；

第二探针SEQ ID NO.6：CGCTCACCCAGGACAAAG。

第二引物对扩增的目的序列如下(SEQ ID NO.8)：

CATTGAACGGTGGGGTCATATGTGTTGAGCCATGGGGTGG GTCTGGAGAAAAAGAAGAGGCTTTGTCCTGGGTGAGCGCTGG TAGTTCCCGCCAGAAT。

在其他实施方式中，针对上述引物或探针序列进行1-5个碱基的增减而带来扩增的特异性、灵敏度或稳定性相比与本发明有所提升或下降，也均在本发明的保护范围内。

上述探针引物组合的产品形态可以是粉剂、液体制剂或颗粒剂。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一探针和第二探针的5’端均标记有荧光报告基团，第一探针和第二探针的3’端均标记有荧光淬灭基团。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述荧光报告基团包括不限于 HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团包括不限于MGB、TAMRA、 BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一探针和第二探针的5’端分别标记有FAM和HEX，第一探针和第二探针的3’端分别标记有 BHQ1和BHQ2。

本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和PCR扩增反应液。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述阳性对照为PCV2的DNA 和PCV3的DNA；阴性对照为水。PCR扩增反应液可以选自市售的 PCR扩增液。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述阳性对照为含有PCV2基因片段的质粒1和含有PCV3基因片段的质粒2。

在一种实施方式中，上述试剂包括引物预混液和探针预混液，引物预混液包括PCV2上游引物、PCV2下游引物、PCV3上游引物和 PCV3下游引物的摩尔比为1:1:1:1的预混液。探针预混液包括第一探针、第二探针摩尔比为1:1的预混液。

在一种可选的实施方式中，设置反应时引物的摩尔终浓度与探针的终浓度为200-400nM:100-400nM。优选地，设置反应时引物的摩尔终浓度与探针的终浓度为400nM:200nM。当反应时引物的摩尔终浓度与探针的终浓度为400nM:200nM时，双重qPCR反应中PCV2和PCV3扩增效率最接近，且Ct值较低。

本发明还提供了一种PCV2和PCV3的探针引物组合或上述试剂盒在鉴别猪圆环病毒类型中的应用，该应用为非疾病的诊断目的，鉴别猪圆环病毒类型的步骤包括：对模板DNA进行双重荧光定量PCR，采集荧光信号，并对扩增结果进行分析；鉴别受试样品中感染PCV 病毒类型。

结果判断如下：

(1)若PCV2和PCV3的Ct值均不超过35，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双阳性；

(2)若PCV2的Ct值不超过35，而PVC3无Ct值，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型阳性，猪圆环病毒3型阴性；

(3)若PCV3的Ct值不超过35，而PVC2无Ct值，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型阴性，猪圆环病毒3型阳性；

(4)若PCV2和PCV3的Ct值均超过40或未出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双阴性；

(5)若PCV2和PCV3的Ct值均未超过40，且都大于35，则表明被检样本可疑，需重新取样提取DNA复检，从而判断样本是否被感染。

因此，本发明提供的检测试剂盒可以在一次操作后，即可鉴别样本中是猪圆环病毒2型感染，或猪圆环病毒3型感染，或两种病毒共同感染，具有灵敏性高、特异性强、重复性好的特点。

在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒中的阳性对照的Ct值均小于30，阴性对照无Ct值。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的探针引物组合可同时对PCV2感染、PCV3感染以及PCV2和PCV3感染实现一次性检出，减少常规方法耗时长、敏感性低且易出现假阳性问题，同时避免猪场共同感染样本因不同类型病毒浓度差异而影响病毒检出率，该探针引物组合检测灵敏度高、特异性强，为猪圆环病毒的疫情监测和防控提供技术支持。该探针引物组合可以用于制备检测试剂和试剂盒，具有良好的应用前景。

2、本发明建立了一个快速鉴别PCV2和PCV3的检测试剂盒，具有灵敏性高、特异性强、重复性和稳定性好的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为圆环病毒2型的荧光扩增曲线图；

图2为圆环病毒2型的标准曲线图；

图3为圆环病毒3型的荧光扩增曲线图；

图4为圆环病毒3型的标准曲线图；

图5为特异性实验得到的荧光扩增曲线图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种鉴别PCV2和PCV3的试剂盒，其包括PCV2 的第一探针引物组合、PCV3的第二探针引物组合、阳性对照、阴性对照和PCR扩增液。第一探针引物组合包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO.3所示的第一探针，第二探针引物组合包括SEQ ID NO.4-5所示的第二引物对和SEQ ID NO.6所示的第二探针。

第一探针引物组合的序列如下：

上游引物(PCV2-F)SEQ ID NO.1：

5’-ATGGCGGGAGGAGTAGTT-3’；

下游引物(PCV2-R)SEQ ID NO.2：

5’-CGCTCTGTGCCCTTTGAA-3’；

第一探针(PCV2-P)SEQ ID NO.3：

CATAGGGGTCATAGGTGAGGGC。

第一引物对扩增的目的序列如下(SEQ ID NO.7)：

第二探针引物组合的序列如下：

上游引物(PCV3-R)SEQ ID NO.5： 5’-CATTGAACGGTGGGGTC-3’；

下游引物(PCV3-F)SEQ ID NO.4：5’-ATTCTGGCGGGAACTAC -3’；

第二探针(PCV3-P)SEQ ID NO.6：CGCTCACCCAGGACAAAG。

第二引物对扩增的目的序列如下(SEQ ID NO.8)：

阳性对照：为含有PCV2和PCV3目的序列基因片段的重组质粒；

阴性对照：为双蒸水；

PCR扩增液包括：荧光定量2×Animal Detection Probe Master Mix (诺唯赞)。

为方便使用，本实施例将上述引物和探针分别配制为引物预混液和探针预混液。具体地，引物预混液：包括初始浓度为10μM的 PCV2-F、PCV2-R、PCV3-F、PCV3-R摩尔比为1:1:1:1的预混液。针预混液：初始浓度为10μM的PCV2-P、PCV3-P摩尔比为1:1的预混液。

本实施例还提供了阳性对照的制备方法：

PCV2和PCV3的阳性对照用已知PCV2和PCV3的阳性样品分别DNA，按照天根的DNA病毒提取试剂盒，进行总DNA的提取，采用25μL的体系，反应体系2×PCR Mix 12.5μL，上游引物(参照本实施例中第一探针引物组合和第二探针引物组合中的上下游引物序列)1μL，下游引物1μL，DNA 2μL，TRUEscript Enzyme Mix 0.8μL 以及RNase free H₂O(无核酸酶水)7.7μL。PCR扩增程序：94℃5min；循环94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；再在72℃下延伸10min。扩增完成后，所有产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用天根的胶回收试剂盒进行纯化回收，分别连接到pEASY-T1载体并转化到DH5ɑ感受态细胞，挑取阳性克隆，用 LB培养液摇菌扩增后，将菌液送到上海生工生物工程有限公司进行测序。用天根的质粒提取试剂盒分别提取菌液中的质粒，用NanoDrop 2000核酸浓度测定仪检测质粒模板浓度。由此，获得两个阳性对照质粒。

本实施例提供的试剂盒的使用方法如下：

(1)提取待测样品的总DNA备用。

(2)配制反应体系：

样品DNA 5μL，引物预混液2μL(400nM)，探针预混液1μL (200nM)，PCR扩增液12.5μL，ddH₂O 4.5μL

(3)扩增程序如下：

37℃2min，95℃30s，循环为95℃10s，58℃30s(采集荧光信号)，共计45个循环。共2个荧光通道，分别是报告基团“FAM”, 淬灭基团“BHQ1”，报告基团“HEX”,淬灭基团“BHQ2”。

(4)结果判定：

阳性对照2个通道Ct值＜30并出现特异的S型扩增曲线，阴性对照无Ct值且无特异的扩增曲线，二者均成立可判定实验结果成立。

结果判定标准表。

参照上述结果判定标准表可知，被检样品Ct值≤35并出现特异的S型扩增曲线，判为病毒核酸阳性，即待测样本存在猪圆环病毒2 型和猪圆环病毒3型的共感染；被检样品Ct值35＜Ct值≤40并出现特异的扩增曲线，判为病毒核酸可疑，可疑样品需重新取样提取DNA，进行复检；复检结果若Ct值≤40判为阳性，否则判为阴性。 Ct值＞40或无Ct值且无特异的扩增曲线，判为病毒核酸阴性。

若PCV2的Ct值不超过35，而PVC3无Ct值，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型阳性，猪圆环病毒3型阴性；

若PCV3的Ct值不超过35，而PVC2无Ct值，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型阴性，猪圆环病毒3型阳性。

实验例1

本实验例进行了双重荧光定量PCR的条件优化实验。

将实施例1中提取得到的两种质粒分别进行10倍梯度稀释后取浓度10⁴copise/μL，按照1:1的体积比进行混合，混合后的质粒液作为模板。设置总体系25μL，将上下游引物与相应探针分别以不同的引物终浓度和探针终浓度进行混合。引物(包括两对引物对的上、下游引物)与相应探针(包括两个探针)分别设置4个比例(参照表1 所示)：0.5μL：0.25μL(200nM:100nM)，0.5μL：0.5μL(200nM:200nM)，1μL：0.5μL(400nM:200nM)，1μL：1μL(400nM:400nM)。所有引物探针应用浓度均为10μM。按本发明实施例1提供的扩增程序37℃ 2min，95℃30s，循环为95℃10s，58℃30s(采集荧光信号)，共计45个循环，进行PCR扩增，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值时的引物探针浓度比例为最佳。

表1引物探针浓度比例结果表。

表1实验结果说明，发现当探针终浓度为200nM，引物终浓度为400nM时，该双重qPCR反应中PCV2和PCV3扩增效率最接近，且Ct值较低。因此，选择探针终浓度为200nM，引物终浓度为400nM 进行后续的实验。

实验例2

本实验例将实施例1的试剂盒进行圆环病毒2型的荧光扩增灵敏度实验。

将制备的圆环病毒2型标准质粒分别进行10倍梯度稀释后作为模板，取其中浓度为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copise/μL进行敏感度测定，采用单重qPCR反应体系：DNA模板5μL，上、下游引物1μL(400nM)，探针0.5μL(200nM)，PCR扩增液12.5μL， ddH₂O 6μL，所有的引物探针应用浓度均为10μM。扩增程序37℃ 2min，95℃30s，循环为95℃10s，58℃30s(采集荧光信号)，共计45个循环，进行PCR扩增，并分析其标准曲线。

结果参照图1和图2所示，图2显示在稀释的现行浓度范围内，模板量与对应的Ct值呈较好的线性关系，相关系数R²为0.999。图 1显示荧光定量PCR的最低检测量为10copise/μL，因此本发明提供的检测试剂盒具有较高的敏感性。

实验例3

本实验例将实施例1的试剂盒进行圆环病毒3型的荧光扩增灵敏度实验。

将制备的圆环病毒3型标准质粒分别进行10倍梯度稀释后作为模板，取其中浓度为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copise/μL进行敏感度测定，采用单重qPCR反应体系：DNA模板5μL，上、下游引物1μL(400nM)，探针0.5μL(200nM)，PCR扩增液12.5μL， ddH₂O 6μL，所有的引物探针应用浓度均为10μM。扩增程序37℃ 2min，95℃30s，循环为95℃10s，58℃30s(采集荧光信号)，共计45个循环，进行PCR扩增，并分析其标准曲线。

结果参照图3和图4所示，图4显示在稀释的现行浓度范围内，模板量与对应的Ct值呈较好的线性关系，相关系数R²为0.998。图3显示荧光定量PCR的最低检测量为10copise/μL，因此本发明提供的检测试剂盒具有较高的敏感性。

实验例4

本实验例进行重复性试验。

分别以实施例1制备的阳性对照为模板，分别按10倍梯度稀释。终浓度分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copise/μL，按实施例1提供荧光定量的反应体系及程序进行荧光定量PCR，每个梯度设定3个重复，验证该方法的重复性。

结果参照图1和图3所示，本发明的重复实验变异系数(CV值) 均在0.5％以下，表明本发明具有很好的重复性。

实验例5

本实验例进行特异性试验。

以发明人保存的由猪场采集分离的非洲猪瘟病毒，猪瘟病毒，猪伪狂犬病毒，猪蓝耳病毒，猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒阳性样品作为模板(模板浓度为10⁴copise/μL)，用本发明实施例1提供的引物及探针进行荧光定量PCR扩增。

结果参照图5所示，该体系中不同信号通道检测结果均为阴性，表明该方法特异性强，与其他主要传染病原无交叉反应。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州傲农七环畜牧养殖有限公司

泰和县傲牧育种有限公司

福建傲农生物科技集团股份有限公司

<120> 一种鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合、试剂盒及应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcgggag gagtagtt 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgctctgtgc cctttgaa 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cataggggtc ataggtgagg gc 22

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attctggcgg gaactac 17

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cattgaacgg tggggtc 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgctcaccca ggacaaag 18

<210> 7

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggcgggag gagtagttta cataggggtc ataggtgagg gctgtggcct ttgttacaaa 60

gttatcatct agaataacag cactggagcc cactcccctg tcaccctggg tgatcgggga 120

gcagggccag aattcaacct taacctttct tattctgtag tattcaaagg gcacagagcg 180

<210> 8

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cattgaacgg tggggtcata tgtgttgagc catggggtgg gtctggagaa aaagaagagg 60

ctttgtcctg ggtgagcgct ggtagttccc gccagaat 98

Claims

1.一种鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合，其特征在于，其包括第一探针引物组合和第二探针引物组合中的至少一种探针引物组合，所述第一探针引物组合包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO.3所示的第一探针，所述第二探针引物组合包括SEQ IDNO.4-5所示的第二引物对和SEQ ID NO.6所示的第二探针。

2.根据权利要求1所述的鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合，其特征在于，所述第一探针和第二探针的5’端均标记有荧光报告基团，所述第一探针和第二探针的3’端均标记有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合，其特征在于，所述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，所述淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。

4.根据权利要求3所述的鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合，其特征在于，所述第一探针和第二探针的5’端分别标记有FAM和HEX，所述第一探针和第二探针的3’端分别标记有BHQ1和BHQ2。

5.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的鉴别PCV2和PCV3的探针引物组合。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和PCR扩增反应液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为PCV2的DNA和PCV3的DNA；所述阴性对照为水。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有PCV2基因片段的质粒1和含有PCV3基因片段的质粒2。

9.一种如权利要求1-4任一项所述的PCV2和PCV3的探针引物组合或权利要求5-7任一项所述的试剂盒在鉴别猪圆环病毒类型中的应用，其特征在于，所述应用为非疾病的诊断目的，鉴别猪圆环病毒类型的步骤包括：对模板DNA进行双重荧光定量PCR，采集荧光信号，并对扩增结果进行分析，鉴别受试样品中感染PCV病毒类型。