CN115852054A - 一种猪蓝耳类欧洲株的荧光探针引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物学分子技术领域，尤其是涉及一种猪蓝耳类欧洲株的荧光探针引物、试剂盒及其应用。本发明选择蓝耳美洲株和欧洲株基因组进行比对，根据基因序列分析，本发明选取LV株ORF1a基因设计荧光探针引物组，本发明试剂盒可以同时进行大批量的样本分析，一次检测即可鉴别样本中是否有蓝耳类欧洲株，且本发明提供一种动物源性内参，能够满足检测动物源性样品时内控核酸检测的要求，避免假阴性结果，具有简便快捷、稳定性好、灵敏度高、特异性强的特点。

Description

一种猪蓝耳类欧洲株的荧光探针引物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物学分子技术领域，尤其是涉及一种猪蓝耳类欧洲株的荧光探针引物、试剂盒及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)感染引起的一种以怀孕母猪流产、早产和死胎等繁殖障碍和仔猪、育肥猪呼吸系统紊乱和生长迟缓为主要症状的高度接触性传染病，是严重危害养猪业的传染病之一。根据毒株间的基因组特性，PRRSV可以分为两个基因型，即以VR2332株为代表的美洲型和以LV株为代表的欧洲型，2种类型的毒株虽然在核酸水平上存在着40％以上的差异性，但是它们在基因组结构，流行病学特点以及引起猪的临床症状等方面都十分相似，对全球生猪产业造成了难以估量的经济损失。

PRRSV是一种单链RNA病毒，其基因组总长度约为15Kb，基因组的5’端有一个类似于帽子的引导序列，3’端有一个Poly(A)尾序列。病毒基因组中从5’端至3’端有10个互相重叠的开放阅读框架构成。它们分别是ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF2a、ORF3～ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7等，ORFs1a和1b编码非结构蛋白(NSPs)；ORFs 2a、2b、3、4和5编码囊膜蛋白；ORFs 6和7分别编码基质蛋白和核蛋白。

ORF1a基因长度约为2.9kb，在所有的非结构蛋白中最大，编码该蛋白的基因常常发生碱基缺失、突变和插入的变异现象，因此，不同病毒株的长度之间存在差异。抗原表位多，在表位集中区域容易发生基因缺失或突变，因此保守性最差，美洲株和欧洲株中氨基酸序列的同源性仅为32％。

欧洲毒株在致病性上比经典毒株弱，但是同样持续感染，且主要造成母猪流产，流产率较高，对猪场的经济效应影响较大，同时仔猪感染后，免疫力受到抑制，导致条件性致病菌发病，造成较严重呼吸症状和继发感染，临床症状较严重且存在较高的死亡率，此外，多毒株共存的情况下，PRRSV通过其毒株的高突变率和频繁的重组在全球大部分猪群中持续存在，有时变异产生的强毒株突破了现有的疫苗保护，因此需要防止蓝耳欧洲株的流行，一旦流行重组，又会造成猪群的大批死亡。目前公开的检测手段如冻干微芯片，制作工艺较为复杂，成本较高。现在生猪养殖处于非洲猪瘟防疫阶段和复产关键阶段，因此急需一种成本低且快速便捷的检测方法对蓝耳欧洲株进行监测。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种猪蓝耳类欧洲株的荧光探针引物、试剂盒及其应用，本发明选择蓝耳美洲株和欧洲株基因组进行比对，并筛选特异性片段设计探针引物，本发明试剂盒可以同时进行大批量的样本分析，一次检测即可鉴别样本中是否有蓝耳欧洲株，且本发明提供一种动物源性内参，能够满足检测动物源性样品时内控核酸检测的要求，避免假阴性结果，具有简便快捷、稳定性好、灵敏度高、特异性强的特点。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一个目的是提供一种猪蓝耳类欧洲株的引物探针组，所述引物探针组包括：

上游引物LV-F:5’-TCCCCGAACTGAAGGGCTGA-3’(序列如SEQ ID NO.1所示)；

下游引物LV-R:5’-CTGGCTGGGTCCACGGTAGG-3’(序列如SEQ ID NO.2所示)；

荧光探针引物LV-P:5’-ATCGCCATCAGAGAAAGCATT-3’(序列如SEQ ID NO.3所示)，其中5’端添加报告基团FAM，3’端添加淬灭基团MGB；

上述引物探针组的目的序列为

CTGGCTGGGTCCACGGTAGGCGCGAGCCTGTCTTTGTAAAGCCTCGAAATGC TTTCTCTGATGGCGATTCAGCCCTTCAGTTCGGGGA(序列如SEQ ID NO.4所示)。

在本发明的一个实施方式中，还包括动物源性内参的引物探针组，所述引物探针组包括：

上游引物L13a-F:5’-GTGGCCAAGCAGGTACTTC-3’(序列如SEQ ID NO.5所示)；

下游引物L13a-R:5’-CCAGGTACTTCAGTTTGTTT-3’(序列如SEQ ID NO.6所示)；

荧光探针引物L13a-P:5’-CTGGGCCGGAAGGTGGTGGTTGTGC-3’(序列如SEQ ID NO.7所示)，其中5’端添加报告基团HEX，3’端添加淬灭基团BHQ1；

上述引物探针组的目的序列为

GTGGCCAAGCAGGTACTTCTGGGCCGGAAGGTGGTGGTTGTGCGCTGTGAG GGCATCAACATTTCTGGCAATTTTTACAGAAACAAACTGAAGTACCTGG(序列如SEQ ID NO.8所示)。

本发明的第二个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒包括阴性对照、阳性对照、引物预混液、探针预混液、PCR扩增液，酶预混液；

所述引物预混液包括LV-F、LV-R、L13a-F和L13a-R，

LV-F:5’-TCCCCGAACTGAAGGGCTGA-3’(序列如SEQ ID NO.1所示)，

LV-R:5’-CTGGCTGGGTCCACGGTAGG-3’(序列如SEQ ID NO.2所示)，

L13a-F:5’-GTGGCCAAGCAGGTACTTC-3’(序列如SEQ ID NO.5所示)，

L13a-R:5’-CCAGGTACTTCAGTTTGTTT-3’(序列如SEQ ID NO.6所示)；

所述探针预混液包括LV-P和L13a-P，

LV-P:5’-ATCGCCATCAGAGAAAGCATT-3’(序列如SEQ ID NO.3所示)，其中5’端添加报告基团FAM，3’端添加淬灭基团MGB，

L13a-P:5’-CTGGGCCGGAAGGTGGTGGTTGTGC-3’(序列如SEQ ID NO.7所示)，其中5’端添加报告基团HEX，3’端添加淬灭基团BHQ1。

在本发明的一个实施方式中，所述阳性对照为含有蓝耳欧洲株和动物源内参基因L13a基因片段的重组质粒；

所述阴性对照为双蒸水；

所述PCR扩增液为南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的2×One Step U⁺；

所述酶预混液为南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的One Step U⁺EnzymeMix。

本发明的第三个目的是提供一种上述试剂盒的应用，所述应用具体包括以下步骤：

(1)提取待测样品的总RNA备用；

(2)以步骤(1)中得到的总RNA为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为实验组；以阴性对照为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为阴性对照组；以阳性对照为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为阳性对照组；

(3)根据步骤(2)的荧光扩增反应结果判定待测样品为蓝耳欧洲株和/或动物源性内参核酸阳性或阴性。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，以荧光反应体系总体积为30μL计，实验组包括样品总RNA6μL，引物预混液2.4μL(400nM)，探针预混液0.6μL(100nM)，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH₂O 4.5μL；

阴性对照组包括引物预混液2.4μL，探针预混液0.6μL，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH2O 10.5μL；

阳性对照组包括含有蓝耳欧洲株和动物源内参基因L13a基因片段的重组质粒6μL，引物预混液2.4μL，探针预混液0.6μL，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH2O 4.5μL。

在本发明的一个实施方式中，所述引物预混液包括初始浓度为10μM的LV-F、LV-R、L13a-F、L13a-R摩尔比为1:1:1:1的预混液。

在本发明的一个实施方式中，所述探针预混液包括初始浓度为10μM的LV-P、L13a-P摩尔比为1:1的预混液。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述荧光扩增的反应程序具体为：55℃15min，95℃30s，循环为95℃10s，60℃30s，共计45个循环。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，结果判定：阳性对照组LV-FAM和L13a-HEX的Ct值＜30并出现特异的S型扩增曲线，阴性对照组LV-FAM和L13a-HEX无Ct值且无特异的扩增曲线，二者均成立可判定实验结果成立；

①被检样品FAM通道Ct值≤35并出现特异的S型扩增曲线，判为蓝耳类欧洲病毒核酸阳性；②无Ct值且无特异的扩增曲线，判为蓝耳类欧洲株病毒阴性；③35＜Ct值＜45并出现特异的扩增曲线，判为蓝耳类欧洲株病毒核酸可疑，可疑样品需重新取样提取RNA，进行复检，复检的Ct值＜45判为阳性，否则判为阴性；④被检样品HEX通道Ct值≤35并出现特异的S型扩增曲线，判为动物源性内参核酸阳性；⑤无Ct值且无特异的扩增曲线，判为动物源性内参核酸阴性；⑥35＜Ct值＜45并出现特异的扩增曲线，判为动物源性内参核酸可疑，可疑样品需重新取样提取RNA，进行复检，复检的Ct值＜45判为阳性，否则判为阴性。

本发明中，Ct值为从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数；荧光扩增过程中共四个荧光通道，分别是报告基团FAM，淬灭基团MGB，报告基团HEX，淬灭基团BHQ1。

在本发明的一个实施方式中，阳性对照为浓度为10⁴copise/μL的阳性标准品。

在本发明的一个实施方式中，上述试剂盒还应用于环境样本检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)选择蓝耳美洲株和欧洲株基因组进行比对，根据基因序列分析，本发明选取LV株ORF1a基因设计荧光探针引物组；

2)双重荧光定量实验是在一个反应管中同时扩增2个靶标基因进行定量实验，因此其中一个靶标基因的扩增势必会影响另一个靶标基因的扩增，所以要通过引物设计以及反应条件的优化来同步扩增效率，而不是在同一反应管中将所有引物和模板简单的混合。样本中两种病毒浓度可能存在不同程度的差异，在同一反应管中扩增时，如果出现一种基因扩增效率高于另一种基因时，其中一种基因的扩增可能受到抑制，最终影响两种病毒的检出率。本发明通过引物和探针的设计，在高度保守的序列中，找到合适的引物探针序列且扩增效率接近，过程较困难且结果不易控制，需要进行多次实验，同时通过调整引物与荧光探针的比例，优化反应条件，使样本中两种基因的扩增效率一致，与每个单重反应的灵敏度是一致；

3)本发明的特异性较强，对于猪瘟病毒，猪伪狂犬病毒，猪蓝耳病毒其他毒株，猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒，均无非特异性扩增曲线，保证检测的准确性；

4)本发明对猪、人、狗、猫、马的保守基因进行比对，经过比对，发现核糖体基因L13a基因，在多种哺乳动物中都具有极高的保守性，且核酸含量高，因此筛选L13a作为动物内源性基因扩增。不仅可以用于猪的检测，也可以用于其他动物的内参检测；

5)本发明只需一次检测即可鉴别样本中是否有蓝耳欧洲毒株，且本发明提供一种动物源型内参，能够满足检测动物源样品时内控核酸检测的要求，避免假阴性结果，具有灵敏性高、特异性强、重复性好的特点。

附图说明

图1为本发明实施例1中LV株的荧光扩增曲线图；

图2为本发明实施例1中LV株的标准曲线图；

图3为本发明实施例1中L13a的荧光扩增曲线图；

图4为本发明实施例1中L13a的标准曲线图；

图5为本发明实施例1中特异性实验得到的荧光扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明提供一种猪蓝耳类欧洲株的引物探针组，所述引物探针组包括：

上游引物LV-F:5’-TCCCCGAACTGAAGGGCTGA-3’(序列如SEQ ID NO.1所示)；

下游引物LV-R:5’-CTGGCTGGGTCCACGGTAGG-3’(序列如SEQ ID NO.2所示)；

荧光探针引物LV-P:5’-ATCGCCATCAGAGAAAGCATT-3’(序列如SEQ ID NO.3所示)，其中5’端添加报告基团FAM，3’端添加淬灭基团MGB；

上述LV株的引物探针组的目的序列为

CTGGCTGGGTCCACGGTAGGCGCGAGCCTGTCTTTGTAAAGCCTCGAAATGC TTTCTCTGATGGCGATTCAGCCCTTCAGTTCGGGGA(序列如SEQ ID NO.4所示)。

在本发明的一个实施方式中，还包括动物源性内参的引物探针组，所述引物探针组包括：

上游引物L13a-F:5’-GTGGCCAAGCAGGTACTTC-3’(序列如SEQ ID NO.5所示)；

下游引物L13a-R:5’-CCAGGTACTTCAGTTTGTTT-3’(序列如SEQ ID NO.6所示)；

荧光探针引物L13a-P:5’-CTGGGCCGGAAGGTGGTGGTTGTGC-3’(序列如SEQ ID NO.7所示)，其中5’端添加报告基团HEX，3’端添加淬灭基团BHQ1；

上述L13a的引物探针组的目的序列为

GTGGCCAAGCAGGTACTTCTGGGCCGGAAGGTGGTGGTTGTGCGCTGTGAG GGCATCAACATTTCTGGCAATTTTTACAGAAACAAACTGAAGTACCTGG(序列如SEQ ID NO.8所示)。

本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括阴性对照、阳性对照、引物预混液、探针预混液、PCR扩增液，酶预混液；

所述引物预混液包括LV-F、LV-R、L13a-F和L13a-R，

LV-F:5’-TCCCCGAACTGAAGGGCTGA-3’(序列如SEQ ID NO.1所示)，

LV-R:5’-CTGGCTGGGTCCACGGTAGG-3’(序列如SEQ ID NO.2所示)，

L13a-F:5’-GTGGCCAAGCAGGTACTTC-3’(序列如SEQ ID NO.5所示)，

L13a-R:5’-CCAGGTACTTCAGTTTGTTT-3’(序列如SEQ ID NO.6所示)；

所述探针预混液包括LV-P和L13a-P，

LV-P:5’-ATCGCCATCAGAGAAAGCATT-3’(序列如SEQ ID NO.3所示)，其中5’端添加报告基团FAM，3’端添加淬灭基团MGB，

L13a-P:5’-CTGGGCCGGAAGGTGGTGGTTGTGC-3’(序列如SEQ ID NO.7所示)，其中5’端添加报告基团HEX，3’端添加淬灭基团BHQ1。

在本发明的一个实施方式中，所述阳性对照为含有蓝耳欧洲株和动物源内参基因L13a基因片段的重组质粒；

所述阴性对照为双蒸水；

所述PCR扩增液为南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的2×One Step U⁺；

所述酶预混液为南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的One Step U⁺EnzymeMix。

本发明的第三个目的是提供一种上述试剂盒的应用，所述应用具体包括以下步骤：

(1)提取待测样品的总RNA备用；

(2)以步骤(1)中得到的总RNA为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为实验组；以阴性对照为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为阴性对照组；以阳性对照为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为阳性对照组；

(3)根据步骤(2)的荧光扩增反应结果判定待测样品为蓝耳欧洲株和/或动物源性内参核酸阳性或阴性。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，以荧光反应体系总体积为30μL计，实验组包括样品总RNA6μL，引物预混液2.4μL(400nM)，探针预混液0.6μL(100nM)，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH₂O 4.5μL；

阴性对照组包括引物预混液2.4μL，探针预混液0.6μL，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH2O 10.5μL；

阳性对照组包括含有蓝耳欧洲株和动物源内参基因L13a基因片段的重组质粒6μL，引物预混液2.4μL，探针预混液0.6μL，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH2O 4.5μL。

在本发明的一个实施方式中，所述引物预混液包括初始浓度为10μM的LV-F、LV-R、L13a-F、L13a-R摩尔比为1:1:1:1的预混液。

在本发明的一个实施方式中，所述探针预混液包括初始浓度为10μM的LV-P、L13a-P摩尔比为1:1的预混液。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述荧光扩增的反应程序具体为：55℃15min，95℃30s，循环为95℃10s，60℃30s，共计45个循环。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，结果判定如表1所示：阳性对照组LV-FAM和L13a-HEX的Ct值＜30并出现特异的S型扩增曲线，阴性对照组LV-FAM和L13a-HEX无Ct值且无特异的扩增曲线，二者均成立可判定实验结果成立；

①被检样品FAM通道Ct值≤35并出现特异的S型扩增曲线，判为蓝耳类欧洲病毒核酸阳性；②无Ct值且无特异的扩增曲线，判为蓝耳类欧洲株病毒阴性；③35＜Ct值＜45并出现特异的扩增曲线，判为蓝耳类欧洲株病毒核酸可疑，可疑样品需重新取样提取RNA，进行复检，复检的Ct值＜45判为阳性，否则判为阴性；④被检样品HEX通道Ct值≤35并出现特异的S型扩增曲线，判为动物源性内参核酸阳性；⑤无Ct值且无特异的扩增曲线，判为动物源性内参核酸阴性；⑥35＜Ct值＜45并出现特异的扩增曲线，判为动物源性内参核酸可疑，可疑样品需重新取样提取RNA，进行复检，复检的Ct值＜45判为阳性，否则判为阴性。

本发明中，Ct值为从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数；荧光扩增过程中共四个荧光通道，分别是报告基团FAM，淬灭基团MGB，报告基团HEX，淬灭基团BHQ1。

在本发明的一个实施方式中，阳性对照为浓度为10⁴copise/μL的阳性标准品。

在本发明的一个实施方式中，上述试剂盒还应用于环境样本检测。

表1判定标准

以下实施例中，核苷酸序列如下所示：

LV株ORF1a基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.9所示：

atgtctgggacgttctcccggtgcatgtgcaccccggctgcccgggtattttggaacgccggccaagtcttttgcacacggtgtctcagtgcgcggtctcttctctctccagagcttcaggacactgacctcggtgcagttggcttgttttacaagcctagggacaagcttcactggaaagtccctatcggcatccctcaggtggaatgtactccatccgggtgctgttggctctcagctgttttccctttggcgcgtatgacctccggcaatcacaacttcctccaacgacttgtgaaggttgctgatgttttgtaccgtgacggttgcttggcacctcgacaccttcgtgaactccaagtttacgagcgcggctgcaactggtacccgatcacggggcccgtgcccgggatgggtttgtttgcgaactccatgcacgtatccgaccagccgttccctggtgccacccatgtgttgactaactcgcctttgcctcaacaggcttgtcggcagccgttctgtccatttgaggaggctcattctagcgtgtacaggtggaagaaatttgtggttttcacggactcctccctcaacggtcgatctcgcatgatgtggacgccggaatccgatgattcagccgccctggaggtactaccgcctgagttagaacgtcaggtcgaaatcctcattcggagttttcctgctcatcaccctgtcgacctggccgactgggagctcactgagtcccctgagaacggtttttccttcaacacgtctcattcttgcggtcaccttgtccagaaccccgacgtgtttgatggcaagtgctggctctcctgctttttgggccagtcggtcgaagtgcgctgccatgaggaacatctagctgacgccttcggttaccaaaccaagtggggcgtgcatggtaagtacctccagcgcaggcttcaagttcgcggcattcgtgctgtagtcgatcctgatggtcccattcacgttgaagcgctgtcttgcccccagtcttggatcaggcacctgactctggatgatgatgtcaccccaggattcgttcgcctgacatcccttcgcattgtgccgaacacagagcctaccacttcccggatctttcggtttggagcgcataagtggtatggcgctgccggcaaacgggctcgtgctaagcgtgccgctaaaagtgagaaggattcggctcccacccccaaggttgccctgccggtccccacctgtggaattaccacctactctccaccgacagacgggtcttgtggttggcatgtccttgccgccataatgaaccggatgataaatggtgacttcacgtcccctctgactcagtacaacagaccagaggatgattgggcttctgattatgatcttgttcaggcgattcaatgtctacgactgcctgctaccgtggttc ggaatcgcgcctgtcctaacgccaagtaccttataaaacttaacggagttcactgggaggtagaggtgaggtctggaatggctcctcgctccctttctcgtgaatgtgtggttggcgtttgctctgaaggctgtgtcgcaccgccttatccagcagacgggctacctaaacgtgcactcgaggccttggcgtctgcttacagactaccctccgattgtgttagctctggtattgctgactttcttgctaatccacctcctcaggaattctggaccctcgacaaaatgttgacctccccgtcaccagagcggtccggcttctctagtttgtataaattactattagaggttgttccgcaaaaatgcggtgccacggaaggggctttcatctatgctgttgagaggatgttgaaggattgtccgagctccaaacaggccatggcccttctggcaaaaattaaagttccatcctcaaaggccccgtctgtgtccctggacgagtgtttccctacggatgttttagccgacttcgagccagcatctcaggaaaggccccaaagttccggcgctgctgttgtcctgtgttcaccggatgcaaaagagttcgaggaagcagccccggaagaagttcaagagagtggccacaaggccgtccactctgcactccttgccgagggtcctaacaatgagcaggtacaggtggttgccggtgagcaactgaagctcggcggttgtggtttggcagtcgggaatgctcatgaaggtgctctggtctcagctggtctaattaacctggtaggcgggaatttgtccccctcagaccccatgaaagaaaacatgctcaatagccgggaagacgaaccactggatttgtcccaaccagcaccagcttccacaacgacccttgtgagagagcaaacacccgacaacccaggttctgatgccggtgccctccccgtcaccgttcgagaatttgtcccgacggggcctatactctgtcatgttgagcactgcggcacggagtcgggcgacagcagttcgcctttggatctatctgatgcgcaaaccctggaccagcctttaaatctatccctggccgcttggccagtgagggccaccgcgtctgaccctggctgggtccacggtaggcgcgagcctgtctttgtaaagcctcgaaatgctttctctgatggcgattcagcccttcagttcggggagctttctgaatccagctctgtcatcgagtttgaccggacaaaagatgctccggtggttgacgcccctgtcgacttgacgacttcgaacgaggccctctctgtagtcgatcctttcgaatttgccgaactcaagcgcccgcgtttctccgcacaagccttaattgaccgaggcggtccacttgccgatgtccatgcaaaaataaagaaccgggtatatgaacagtgcctccaagcttgtgagcccggtagtcgtgcaaccccagccaccagggagtggctcgacaaaatgtgggatagggtggacatgaaaacttggcgctgcacctcgcagttccaagctggtcgcattcttgcgtccctcaaattcctccctgacatgattcaagacacaccgcctcctgttcccaggaagaaccgagctagtgacaatgccggcctgaagcaactggtggcacagtgggataggaaattgagtgtgaccccccccccaaaaccggttgggccagtgcttgaccagatcgtccctccgcctacggatatccagcaagaagatgtcaccccctccgatgggccaccccatgcgccggattttcctagtcgagtgagcacgggcgggagttggaaaggccttatgctttccggcacccgtctcgcggggtctatcagccagcgccttatgacatgggtttttgaagttttctcccacctcccagcttttatgctcacacttttctcgccgcggggctctatggctccaggtgattggttgtttgcaggtgtcgttttacttgctctcttgctctgtcgttcttacccgatactcggatgccttcccttattgggtgtcttttctggttctttgcggcgtgttcgtctgggtgtttttggttcttggatggcttttgctgtatttttattctcgactccatccaacccagtcggttcttcttgtgaccacgattcgccggagtgtcatgctgagcttttggctcttgagcagcgccaactttgggaacctgtgcgcggccttgtggtcggcccctcaggcctcttatgtgtcattcttggcaagttactcggtgggtcacgttatctctggcatgttctcctacgtttatgcatgcttgcagatttggccctttctcttgtttatgtggtgtcccaggggcgttgtcacaagtgttggggaaagtgtataaggacagctcctgcggaggtggctcttaatgtatttcctttctcgcgcgccacccgtgtctctcttgtatccttgtgtgatcgattccaaacgccaaaaggggttgatcctgtgcacttggcaacgggttggcgcgggtgctg gcgtggtgagagccccatccatcaaccacaccaaaagcccatagcttatgccaatttggatgaaaagaaaatgtctgcccaaacggtggttgctgtcccatacgatcccagtcaggctatcaaatgcctgaaagttctgcaggcgggaggggccatcgtggaccagcctacacctgaggtcgttcgtgtgtccgagatccccttctcagccccatttttcccaaaagttccagtcaacccagattgcagggttgtggtagattcggacacttttgtggctgcggttcgctgcggttactcgacagcacaactggttctgggccggggcaactttgccaagttaaatcagaccccccccaggaactctatctccaccaaaacgactggtggggcctcttacacccttgctgtggctcaagtgtctgcgtggactcttgttcatttcatcctcggtctttggttcacatcacctcaagtgtgtggccgaggaaccgctgacccatggtgttcaaatcctttttcatatcctacctatggccccggagttgtgtgctcctctcgactttgtgtgtctgccgacggggtcaccctgccattgttctcagccgtggcacaactctccggtagagaggtggggatttttattttggtgctcgtctccttgactgctttggcccaccgcatggctcttaaggcagacatgttagtggtcttttcggctttttgtgcttacgcctggcccatgagctcctggttaatctgcttctttcctatactcttgaagtgggttacccttcaccctcttactatgctttgggtgcactcattcttggtgttttgtctgccagcagccggcatcctctcactagggataactggccttctttgggcaattggccgctttacccaggttgccggaattattacaccttatgacatccaccagtacacctctgggccacgtggtgcagctgctgtggccacagccccagaaggcacttatatggccgccgtccggagagctgctttaactgggcgaactttaatcttcaccccgtctgcagttggatcccttctcgaaggtgctttcaggactcataaaccctgccttaacaccgtgaatgttgtaggctcttcccttggttccggaggggttttcaccattgatggcagaagaactgtcgtcactgctgcccatgtgttgaacggcgacacagctagagtcaccggcgactcctacaaccgcatgcacactttcaagaccaatggtgattatgcctggtcccatgctgatgactggcagggcgttgcccctgtggtcaaggttgcgaaggggtaccgcggtcgtgcctactggcaaacatcaactggtgtcgaacccggtatcattggggaagggttcgccttctgttttactaactgcggcgattcggggtcacccgtcatctcagaatctggtgatcttattggaatccacaccggttcaaacaaacttggttctggtcttgtgacaacccctgaaggggagacctgcaccatcaaagaaaccaagctctctgacctttccagacattttgcaggcccaagcgttcctcttggggacattaaattgagtccggccatcatccctgatgtaacatccattccgagtgacttggcatcgctcctagcctccgtccctgtagtggaaggcggcctctcgaccgttcaacttttgtgtgtctttttccttctctggcgcatgatgggccatgcctggacacccattgttgccgtgggcttctttttgctgaatgaaattcttccagcagttttggtccgagccgtgttttcttttgcactctttgtgcttgcatgggccaccccctggtctgcacaggtgttgatgattagactcctcacggcatctctcaaccgcaacaagctttctctggcgttctacgcactcgggggtgtcgtcggtttggcagctgaaatcgggacttttgctggcagattgtctgaattgtctcaagctctttcgacatactgcttcttacctagggtccttgctatgaccagttgtgttcccaccatcatcattggtggactccataccctcggtgtgattctgtggttattcaaataccggtgcctccacaacatgctggttggtgatgggagtttttcaagcgccttcttcctacggtattttgcagagggtaatctcagaaaaggtgtttcacagtcctgtggcatgaataacgagtccctaacggctgctttagcttgcaagttgtcacaggctgaccttgattttttgtccagcttaacgaacttcaagtgctttgtatctgcttcaaacatgaaaaatgctgccggccagtacattgaagcagcgtatgccaaggccctgcgccaagagttggcctctctagttcagattgacaaaatgaaaggagttttgtccaagctcgaggcctttgctgaaacagccaccccgtcccttgacataggtgacgtgattgttctgcttgggcaacatcctcacggatccatcctcgatattaatgtggggactgaaaggaaaactgtgtccgtgca agagacccggagcctaggcggctccaaattcagtgtttgtactgtcgtgtccaacacacccgtggacgccttgaccggcatcccactccagacaccaacccctctttttgagaatggtccgcgtcatcgcagcgaggaagacgatcttaaagtcgagaggatgaagaaacactgtgtatccctcggcttccacaacatcaatggcaaagtttactgcaaaatttgggacaagtctaccggtgacaccttttacacggatgattcccggtacacccaagaccatgcttttcaggacaggtcagccgactacagagacagggactatgagggtgtgcaaaccaccccccaacagggatttgatccaaagtctgaaacccctgttggcactgttgtgatcggcggtattacgtataacaggtatctgatcaaaggtaaggaggttctggtccccaagcctgacaactgccttgaagctgccaagctgtcccttgagcaagctctcgctgggatgggccaaacttgcgaccttacagctgccgaggtggaaaagctaaagcgcatcattagtcaactccaaggtttgaccactgaacaggctttaaactgttag；

核糖体基因L13a基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.10所示：

cccacgcgtccgcccacgcgtccggccgaagatggcggaggggcagcaggtgctggtgctcgatggccgaggccatctcctgggccgcctggcggccattgtggccaagcaggtacttctgggccggaaggtggtggttgtgcgctgtgagggcatcaacatttctggcaatttttacagaaacaaactgaagtacctggccttcctccgcaagcgcatgaataccaacccgtcccgaggcccctaccacttccgagcccccagccgcatcttctggcggacggtgcgaggcatgctgccccataagaccaagcgagggcaggccgccctggaccgtctcaaggtgttcgatgggatcccgccaccctatgacaagaaaaagcgcatggtggtgcctgccgccctcaaggtggtgcgtctgaagcctacgcggaagttcgcctacctgggacgcctggctcatgaggttggctggaagtaccaggcagttacagccaccctggaggagaagaggaaggagaaggccaagatccattaccgcaagaagaagcagctcatgaggctgcggaagc。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

下述各实施例中，所用材料如无特殊说明，均为市售；所用检测手段如无特殊说明，均为本领域常规技术手段。

实施例1

本实施例提供一种猪蓝耳类欧洲株试剂盒的应用。

(1)阳性标准品的制备

LV和L13a的阳性标准品用从养殖场收集的阳性样品，提取RNA作为模板，按照天根的RNA病毒提取试剂盒，进行总RNA的提取，采用50μL的体系，反应体系包括：2×One StepMix(Dye Plus)25μL、One Step Enzyme Mix(诺唯赞)2.5μL，上游引物2μL、下游引物2μL、RNA 6μL以及RNase free H₂O(无核酸酶水)12.5μL。PCR扩增程序：50℃反转录30min；94℃3min；循环94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；再72℃延伸7min。扩增完成后，所有产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用天根的胶回收试剂盒进行纯化回收，连接到pEASY-T1载体并转化到DH5ɑ感受态细胞，挑取阳性克隆，用LB培养液摇菌扩增后，将菌液送到上海生工生物工程有限公司进行测序。

(2)双重荧光定量PCR条件优化

用天根的质粒提取试剂盒提取标准质粒，用NanoDrop 2000核酸浓度测定仪检测质粒模板浓度，将四种标准质粒分别进行10倍梯度稀释后取浓度10⁴copise/μL(作为阳性对照)，1:1进行混合作为模板，总体系30μL，将上下游引物与相应探针分别以不同的探针终浓度和引物终浓度进行混合，引物(上游引物、下游引物)与相应探针(LV-P和L13a-P)分别加1.2μL、1.2μL(400nM:400nM)，1.2μL、0.6μL(400nM:200nM)，1.2μL、0.3μL(400nM:100nM)，0.6μL、0.3μL(200nM:100nM)，所有引物探针应用浓度均为10μM，按本发明提供的扩增程序55℃15min，95℃30s，循环为95℃10s，60℃30s(采集荧光信号)，共计45个循环，进行PCR扩增，以获得最低的CT值和较高的荧光强度增加值时的引物探针浓度比例为最佳。

表2引物探针浓度比例结果表

实验结果(表2)说明，用不同组合探针和引物浓度进行最佳反应体系摸索实验，发现当探针终浓度为100nM，上下游引物终浓度为400nM时该双重qPCR反应中LV和L13a扩增效率最接近，且Ct值较低。

将两种标准质粒分别进行10倍梯度稀释后作为模板，取其中浓度为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copise/μL进行敏感度测定，采用单重RT-qPCR反应体系：DNA模板6μL，上、下游引物1.2μL(400nM)，探针0.3μL(100nM)，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，Rnase-free ddH₂O 6μL，所有引物探针应用浓度均为10μM。扩增程序55℃15min，95℃30s，循环为95℃10s，60℃30s(采集荧光信号)，共计45个循环，进行PCR扩增(荧光扩增曲线如图1和图3所示)，并分析其标准曲线(标准曲线如图2和图4所示)。

如图2和图4所示，在稀释的现行浓度范围内，模板量与对应的Ct值呈较好的线性关系，相关系数R²分别为0.999、0.998，本发明的荧光定量方法对于不同毒力基因有较高的扩增效率(99.13％-101.25％)，荧光定量PCR的最低检测量为10¹copise/μL，因此本发明建立的荧光定量PCR具有较高的敏感性。

(3)重复性试验

分别以7个浓度的10倍梯度稀释的阳性标准品为模板，终浓度分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copise/μL，按提供荧光定量的反应体系及程序进行荧光定量PCR，每个梯度设定3个重复，验证该方法的重复性。结果表明，本发明的重复实验变异系数(CV值)均在0.5％以下，表明本发明具有很好的重复性。

(4)特异性试验

以福建傲农生物科技集团股份有限公司保存的非洲猪瘟病毒，猪瘟病毒，猪伪狂犬病毒，猪蓝耳病毒其他毒株，猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒阳性样品作为模板，用本发明中的引物及探针进行荧光定量PCR扩增，结果如图5显示，该体系中不同信号通道检测结果均为阴性，表明该方法特异性强，与其他主要传染病原无交叉反应。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猪蓝耳类欧洲株的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括：

上游引物LV-F:5’-TCCCCGAACTGAAGGGCTGA-3’；

下游引物LV-R:5’-CTGGCTGGGTCCACGGTAGG-3’；

荧光探针引物LV-P:5’-ATCGCCATCAGAGAAAGCATT-3’，其中5’端添加报告基团FAM，3’端添加淬灭基团MGB。

2.根据权利要求1所述的一种猪蓝耳类欧洲株的引物探针组，其特征在于，还包括动物源性内参的引物探针组，所述引物探针组包括：

上游引物L13a-F:5’-GTGGCCAAGCAGGTACTTC-3’；

下游引物L13a-R:5’-CCAGGTACTTCAGTTTGTTT-3’；

荧光探针引物L13a-P:5’-CTGGGCCGGAAGGTGGTGGTTGTGC-3’，其中5’端添加报告基团HEX，3’端添加淬灭基团BHQ1。

3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阴性对照、阳性对照、引物预混液、探针预混液、PCR扩增液，酶预混液；

所述引物预混液包括LV-F、LV-R、L13a-F和L13a-R，

LV-F:5’-TCCCCGAACTGAAGGGCTGA-3’，

LV-R:5’-CTGGCTGGGTCCACGGTAGG-3’，

L13a-F:5’-GTGGCCAAGCAGGTACTTC-3’，

L13a-R:5’-CCAGGTACTTCAGTTTGTTT-3’；

所述探针预混液包括LV-P和L13a-P，

LV-P:5’-ATCGCCATCAGAGAAAGCATT-3’，其中5’端添加报告基团FAM，3’端添加淬灭基团MGB，

L13a-P:5’-CTGGGCCGGAAGGTGGTGGTTGTGC-3’，其中5’端添加报告基团HEX，3’端添加淬灭基团BHQ1。

4.根据权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有蓝耳欧洲株和动物源内参基因L13a基因片段的重组质粒；

所述阴性对照为双蒸水；

所述PCR扩增液为南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的2×One Step U⁺；

所述酶预混液为南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的One Step U⁺Enzyme Mix。

5.一种如权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用具体包括以下步骤：

(1)提取待测样品的总RNA备用；

(2)以步骤(1)中得到的总RNA为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为实验组；以阴性对照为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为阴性对照组；以阳性对照为模板，利用试剂盒配置荧光反应体系进行荧光扩增作为阳性对照组；

(3)根据步骤(2)的荧光扩增反应结果判定待测样品为蓝耳欧洲株和/或动物源性内参核酸阳性或阴性。

6.根据权利要求5所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，步骤(2)中，以荧光反应体系总体积为30μL计，实验组包括样品总RNA6μL，引物预混液2.4μL(400nM)，探针预混液0.6μL(100nM)，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH₂O 4.5μL；

阴性对照组包括引物预混液2.4μL，探针预混液0.6μL，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH2O 10.5μL；

阳性对照组包括含有蓝耳欧洲株和动物源内参基因L13a基因片段的重组质粒6μL，引物预混液2.4μL，探针预混液0.6μL，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH2O 4.5μL。

7.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，所述引物预混液包括初始浓度为10μM的LV-F、LV-R、L13a-F、L13a-R摩尔比为1:1:1:1的预混液。

8.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，所述探针预混液包括初始浓度为10μM的LV-P、L13a-P摩尔比为1:1的预混液。

9.根据权利要求5所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述荧光扩增的反应程序具体为：55℃15min，95℃30s，循环为95℃10s，60℃30s，共计45个循环。

10.根据权利要求5所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，步骤(3)中，结果判定：取待测样本与权利要求1所述的一种猪蓝耳类欧洲株的引物探针组混合进行反应，根据荧光信号进行待测样本的结果判定。

Images