CN111826468A - 一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒 - Google Patents

一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111826468A
CN111826468A CN202010787402.6A CN202010787402A CN111826468A CN 111826468 A CN111826468 A CN 111826468A CN 202010787402 A CN202010787402 A CN 202010787402A CN 111826468 A CN111826468 A CN 111826468A
Authority
CN
China
Prior art keywords
type
primer
kit
prrsv
respiratory syndrome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010787402.6A
Other languages
English (en)
Inventor
丁耀忠
何继军
张�杰
陈豪泰
刘永生
马维民
孙跃峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN202010787402.6A priority Critical patent/CN111826468A/zh
Publication of CN111826468A publication Critical patent/CN111826468A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒，属于病毒检测技术领域。本发明所述引物探针组，包括正向引物、反向引物和探针，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的5'端修饰有荧光基团、3'端修饰有猝灭基团的物质。应用本发明所述引物探针组进行检测具有良好的特异性和敏感性，与2型猪繁殖与呼吸综合征没有任何反应，具有很好的临床应用价值。

Description

一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试 剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS)的病原，是一种RNA病毒，通常会引起母猪繁殖障碍、仔猪及育肥猪呼吸困难的高度传染性的一种猪病。根据抗原性和基因组特征，PRRSV可以分为两个基因型：欧洲型(European，Eu)，即1型PRRSV；北美型(North American，NA)，即2型PRRSV。
PRRS疫病一直是困扰我国养猪业健康发展的最主要疫病之一。由于缺乏区分PRRS感染与免疫的血清学方法，所以，建立一种能够区别1型和2型的实时PCR用于临床诊断是非常必要的。
现有技术(刘永生等，ZL201310375408.2)报道了针对1型和2型PRRSV的常规PCR诊断方法，但该方法在实际检测很难实现大通量检测的要求，而且相对比较费时费力。
发明内容
本发明的目的在于提供一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒。本发明所述引物探针组能够实现1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的高速、大批量检测，操作简便，敏感性和特异性好，能够应用于猪繁殖与呼吸综合征的预防与检测诊断要求。
本发明提供了一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组，包括正向引物、反向引物和探针，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的5'端修饰有荧光基团、3'端修饰有猝灭基团的物质。
优选的是，所述荧光基团包括FAM，所述猝灭基团包括BHQ1。
本发明还提供了一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的实时定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物探针组。
优选的是，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和含Enzyme Mix的反应液。
优选的是，所述试剂盒的反应条件为：50℃30min；95℃10min；94℃15sec，58℃15sec，40个循环。
本发明还提供了上述技术方案所述引物探针组在制备检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的应用。
本发明提供了一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组。本发明通过在多条引物和多套探针中挑出最佳组合，实现了与2型PRRSV等其他猪繁殖障碍疫病的区别，本发明所述引物探针组能够实现1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的大批量和大通量检测，可靠性强，检测效率和检测精度高，对工作人员技术操作水平要求低，试验结果表明，本发明所述引物探针组在实时定量PCR检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒时，能够快速诊断1型PRRSV，检测时间比传统多重PCR至少减低了1小时，敏感性和特异性好，比现有技术至少提高10倍。
附图说明
图1为本发明提供的1型PRRSV特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法建立；
图2为现有技术(ZL201310375408.2)和本发明1型PRRSV特异性引物探针的一步法实时定量PCR检测方法敏感性比较；
图3为本发明提供的1型PRRSV特异性引物探针的一步法实时定量PCR检测方法特异性检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组，包括正向引物、反向引物和探针，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(5'-GCACCACCTCACCCRRAC-3')，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(5'-CAGTTCCTGCRCCYTGAT-3')，所述探针为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的5'端修饰有荧光基团、3'端修饰有猝灭基团的物质(5-FAM-CCTCTGYYTGCAATCGATCCAGAC-BHQ1)。本发明的试剂盒的特异性引物和探针是经过反复比对不同的探针而确定的，很好的覆盖了1型猪繁殖与呼吸综合征保守区域。具体的，本发明所述探针为针对1型PRRSV的ORF7特异性序列。
在本发明中，所述荧光基团包括FAM，所述猝灭基团包括BHQ1。
本发明还提供了一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的实时定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物探针组。
在本发明中，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和含Enzyme Mix的反应液。本发明所述含Enzyme Mix的反应液优选购自my lab公司。
在本发明中，所述试剂盒的反应条件为：50℃30min；95℃10min；94℃15sec，58℃15sec，40个循环。
在本发明中，每25μL所述试剂盒的反应体系优选包括：
Figure BDA0002622502290000031
本发明还提供了上述技术方案所述引物探针组在制备检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的应用。
本发明利用本发明设计的1型PRRSV的特异性引物和探针进行一步法实时定量PCR检测，大量样品的检测结果表明，本发明能够取得很强的敏感性，至少可以检出10拷贝/μL的RNA模板，其敏感性比常规RT-PCR方法至少高出10倍；且不与2型PRRSV、PCV2、PRV和CSF发生交叉反应。进一步通过对大量的临床样品检测以及与常规多重RT-PCR检测方法的比较，表明特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法不仅特异性强，而且临床灵敏度高。血清、肺脏和淋巴结都适于采用特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法，尤其是血清样品，收集便捷，利于普查。本发明引物探针具有广阔的市场应用前景，可以开发为大规模普检方法，有望开发为可以在广大猪场现场和基层防疫站使用的快速诊断试剂盒。
下面结合具体实施例对本发明所述的一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒做进一步详细的介绍，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
1.毒株
2型PRRSV QH-08毒株的细胞毒(Ding et al.Yansuanmalingua inhibitsreplication of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus viaactivating the caspase-8 apoptosis pathway.J Basic Microb 2020,60,(5),400-406.2020)由兰州兽医研究所保存；2型PRRSV CH-1R、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)商业化疫苗均购于甘肃省动物保健公司，使用时提取的相应疫苗的RNA。
1型PRRSV puc57-LV-6-7质粒(所述质粒是依据GenBank号:M96262的序列设计得到的，即所述质粒含有Lelystadvirus的ORF6和ORF7(LV-6-7)片段，本发明对所述质粒的构建方法没有特殊限定，采用常规质粒构建方法将puc57质粒与Lelystad virus的ORF6和ORF7连接即可)和1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7质粒(包含GenBank号：GU047345.1的NMEU09-1的ORF6和ORF7片段，质粒制备方法同上)均由甘肃金科生物科技有限公司合成。
2.临床样品
用于临床检测的田间样品来自甘肃省不同地区猪场，共有阴性样品50份，包括肺、肝脏、肾脏组织、血液和淋巴结各10份，这些样品提取其核酸后，分别进行本发明建立的实时定量PCR和常规RT-PCR检测，用于评估本发明引物探针的临床特异性和敏感性。同时，将1型PRRSV puc57-HK3(GenBank号:KF287129.1)质粒，所述质粒为采用常规构建方法将HK3的ORF-ORF7构建于puc57载体上得到(甘肃金科生物科技有限公司合成)，由1×1010拷贝/μL按梯度稀释至1×101拷贝/μL作为临床检测阳性样品。
3.核酸扩增和提取相关试剂盒
用于建立实时定量PCR方法的扩增试剂盒购于北京美莱博医学科技有限公司。核酸提取采用Takara宝生物工程(大连)有限公司生产的TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.5.0。用于RT-PCR的试剂盒是Takara公司PrimeScriptTM One StepRT-PCR KitVer.2。
实施例1
一、样品核酸提取
采用Takara宝生物工程(大连)有限公司生产的MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit提取各种样品核酸。
二、常规RT-PCR反应实验测定1型PRRSV
1、多重RT-PCR反应所用引物
多重RT-PCR反应所用引物为专利ZL201310375408.2所述4条引物，第一对引物为：5’–CAC CACGTCGAAAGTGCCGC–3’(SEQ ID NO.4)和5’-GACGCCGGACGACAAATGCG-3’(SEQ IDNO.5)；第二对引物为：5’-GGGGCTGTTGCACATCCTAA-3’(SEQ ID NO.6)和5’-ACAAAAGGGCAACAACAGCC-3’(SEQ ID NO.7)，对1型和2型PRRSV的扩增大小分别约为120bp和70bp。
2、多重RT-PCR扩增反应体系和扩增反应流程
专利ZL201310375408.2所述扩增条件：50℃30min，94℃2min，然后是循环程序为94℃30s，58℃1min，72℃50s，35个循环。最后72℃延伸10min。
3、RT-PCR扩增产物电泳检测
RT-PCR扩增产物采用常规琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶浓度为1％，电泳缓冲液为1×TAE，电泳速度为5～6伏特/厘米。
三、基于本发明特异性引物和探针的一步法实时定量PCR建立
1、特异性引物和探针的一步法实时定量PCR扩增引物选择和序列
将2型PRRSV毒株和1型PRRSV毒株的全基因组序列的进行分析比较，围绕特异编码区设计特异性引物和特异性引物和探针，经反复对比，最终获得最佳2条引物和一条特异性探针(见表1)。
表1 特异性引物和探针的一步法实时定量PCR引物序列
Figure BDA0002622502290000051
Figure BDA0002622502290000061
2、特异性引物和探针的一步法实时定量PCR扩增反应体系(见表2)，为了检测方便，本发明在实际操作中，将引物，探针，各种酶按比例制成实时定量PCR扩增液。反应操作时一次性完成。
表2 一步法实时定量PCR扩增反应体系
Figure BDA0002622502290000062
3、特异性引物和探针的一步法实时定量PCR扩增反应流程
经比对不同扩增程序获得最佳扩增程序为50℃30min；95℃10min；然后94℃15sec，58℃15sec，40个循环。终止反应。
四、本发明的引物探针的性能试验
1、特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法敏感性实验
把1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7用紫外分光光度计测定核酸浓度，然后根据基因组核酸分子量计算出提取RNA样品的每微升核酸拷贝数。将RNA样品用无菌和无核酸酶的ddH2O系列稀释成1×1011～1×100(核酸拷贝数)/μL，然后按上述方法进行本发明定量PCR和ZL201310375408.2所述的多重PCR实验，每个反应管加入2μL上述系列稀释的RNA样品作为模板，比较两种方法的分析敏感性。
2.特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法特异性实验
在检测该方法的分析特异性时，分别与2型QH-08细胞毒的RNA、2型猪繁殖与呼吸综合征CH-1R、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)商业化疫苗提取的相应疫苗的RNA进行检测比较是否存在交叉反应性实验。
1型PRRSV puc57-LV-6-7和1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7作为特异性判断的质控样本。
3.特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法临床实验
用于特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法临床灵敏度分析的阳性样品为1型PRRSV puc57-HK3质粒由1×1010拷贝/μL按梯度稀释至1×101拷贝/μL稀释样品。阴性样品50份，包括肺、肝脏、肾脏组织、血液和淋巴结各10份，这些样品提取其核酸后，分别进行本发明实时定量PCR和常规RT-PCR检测，用于检测新建立方法的临床特异性和敏感性。
结果
1.特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法建立
以1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7质粒的RNA为模板建立特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法，结果表明，在特异扩增条件都能够有效扩增出典型的S形图谱，CT值介于20～30之间，阴性样品和其余质控样品都没有CT值和扩增曲线，如图1所示。
图1为本发明特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法建立图谱；其中，图中“S”曲线为特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7质粒图，而阴性和质控均没有特异扩增曲线。
2.特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法敏感性检测结果
利用ZL201310375408.2提供的引物对，分别对以1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7质粒模板扩增，结果如图2所示。电泳图谱表明，ZL201310375408.2提供的引物对扩增出1型PRRSV片段预计大小为120bp左右条带与预期结果一致，可以检出100拷贝/μL的RNA产物(图2中的A)；本发明实时定量PCR对1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7质粒模板可以扩增出标准的S型曲线，至少可以检出10个拷贝/μL的RNA模板(图2中的B)，这表明，本发明特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法比常规多重RT-PCR敏感性至少提高了10倍。
图2中的A为RT-PCR扩增PRRSV琼脂糖凝胶电泳图谱，检测表明特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法比常规多重RT-PCR敏感性高至少提高了10倍；其中，M:DL2000(2000，1000，750，500，250，100bp)；泳道1代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×1011拷贝/μL，泳道2代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×1010拷贝/μL，泳道3代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×109拷贝/μL，泳道4代表1型PRRSVpuc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×108拷贝/μL，泳道5代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×107拷贝/μL，泳道6代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×106拷贝/μL，泳道7代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×105拷贝/μL，泳道8代表1型PRRSVpuc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×104拷贝/μL，泳道9代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×103拷贝/μL，泳道10代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×102拷贝/μL，泳道11代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×101拷贝/μL；图2中的B本发明特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法；其中“S”曲线1代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×1011拷贝/μL，“S”曲线2代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×1010拷贝/μL，“S”曲线3代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×109拷贝/μL，“S”曲线4代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×108拷贝/μL，“S”曲线5代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×107拷贝/μL，“S”曲线6代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×106拷贝/μL，“S”曲线7代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×105拷贝/μL，“S”曲线8代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×104拷贝/μL，“S”曲线9代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×103拷贝/μL，“S”曲线10代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×102拷贝/μL，“S”曲线11代表1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7稀释度为1×101拷贝/μL。3.特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法特异性结果
本发明建立特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法具有很好特异性，仅与1型PRRSV的puc57-LV-6-7和puc57-NMEU09-1-6-7反应，而不与2型PRRSV QH-08细胞毒的RNA，2型猪繁殖与呼吸综合征CH-1R、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)相应疫苗的RNA反应。
图3实时定量PCR检测方法特异性检测。其中的A为RT-PCR扩增PRRSV琼脂糖凝胶电泳图谱；M:DL2000(2000，1000，750，500，250，100bp)；1泳道为1型PRRSV puc57-LV-6-7质粒(120bp)和PRRSV QH08(70bp)的RNA；2泳道为1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7(120bp)和CH-1R(70bp)的RNA；3泳道为为PCV2的RNA；4泳道为PRV的RNA；5泳道为CSF的RNA。图3中的B特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法，检测表明，建立1型PRRSV的实时定量检测方法特异性良好，与其他毒株没有交叉反应。其中：“S”曲线1为1型PRRSV puc57-LV-6-7质粒检测结果；“S”曲线2为1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7质粒检测结果。
4.特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法的临床检测
1型PRRSV puc57-HK3质粒由1×1010拷贝/μL按梯度稀释至1×101拷贝/μL稀释样品共10份，50份临床阴性样品评估了特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法的临床敏感性和特异性，并与专利ZL201310375408.2的多重RT-PCR进行比较分析。表3结果显示，特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法和多重RT-PCR的总阳性检出率均为100％。对50份阴性样品进行检测，特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法的总检出率为100％和常规RT-PCR方法总检出率为98％。特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法RT-PCR方法对猪血清的检出率均为100％。两种方法都具有很好的特异性，但是特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法特异性高于RT-PCR方法一些，而且适合大通量的检测，适于在临床推广使用。
表3 60份临床样品的检测结果
Figure BDA0002622502290000091
Figure BDA0002622502290000101
注：“+”代表阳性结果，“-”代表阴性结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaccacctc acccrrac 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagttcctgc rccytgat 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctctgyytg caatcgatcc agac 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccacgtcg aaagtgccgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacgccggac gacaaatgcg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggggctgttg cacatcctaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acaaaagggc aacaacagcc 20

Claims (6)

1.一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组，包括正向引物、反向引物和探针，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的5'端修饰有荧光基团、3'端修饰有猝灭基团的物质。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括FAM，所述猝灭基团包括BHQ1。
3.一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的实时定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述引物探针组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和含Enzyme Mix的反应液。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应条件为：50℃30min；95℃10min；94℃15sec，58℃15sec，40个循环。
6.权利要求1或2所述引物探针组在制备检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的应用。
CN202010787402.6A 2020-08-07 2020-08-07 一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒 Pending CN111826468A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010787402.6A CN111826468A (zh) 2020-08-07 2020-08-07 一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010787402.6A CN111826468A (zh) 2020-08-07 2020-08-07 一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111826468A true CN111826468A (zh) 2020-10-27

Family

ID=72920901

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010787402.6A Pending CN111826468A (zh) 2020-08-07 2020-08-07 一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111826468A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106435039A (zh) * 2016-12-26 2017-02-22 广东温氏食品集团股份有限公司 一种检测猪繁殖与呼吸综合征类nadc‑30毒株的引物、探针、试剂盒及方法
CN110072547A (zh) * 2016-12-14 2019-07-30 硕腾服务有限责任公司 断奶前对抗欧洲猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒株的有效疫苗接种
CN110616200A (zh) * 2018-06-19 2019-12-27 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110072547A (zh) * 2016-12-14 2019-07-30 硕腾服务有限责任公司 断奶前对抗欧洲猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒株的有效疫苗接种
CN106435039A (zh) * 2016-12-26 2017-02-22 广东温氏食品集团股份有限公司 一种检测猪繁殖与呼吸综合征类nadc‑30毒株的引物、探针、试剂盒及方法
CN110616200A (zh) * 2018-06-19 2019-12-27 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株核酸标准物质及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
林万明 主编: "《PCR技术操作和应用指南》", 30 September 1993 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110760620A (zh) 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法
CN110878377B (zh) 非洲猪瘟病毒强弱毒荧光定量pcr鉴别诊断试剂盒
CN111321248B (zh) 非洲猪瘟病毒mgf-505r基因荧光pcr检测试剂、试剂盒及其应用
CN113462820A (zh) 实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重rt-pcr引物探针组、试剂盒及其检测方法
CN105907890B (zh) 一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法
CN113249524A (zh) 一种用于检测多种猪圆环病毒的三重实时荧光定量pcr引物和探针组合物及其应用
CN105886667A (zh) 猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒及其检测方法
CN112877476A (zh) 非洲猪瘟病毒p72基因荧光探针pcr检测引物探针组、试剂盒及方法
CN113528708A (zh) 一种同时检测三种猫腹泻病毒的三重pcr检测方法及其用途
CN114350848B (zh) 一种鉴别非洲猪瘟ⅰ型毒株与ⅱ型毒株的双重荧光探针引物组合、试剂盒及其应用
CN108342510B (zh) Btv-11型、17型、20型、23型、24型基因型分型鉴别的多重rt-pcr试剂盒及其检测方法
CN112553372A (zh) 一种猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒3型双重荧光定量pcr检测引物和探针、试剂盒及方法
CN112280899A (zh) 猪星状病毒2型TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用
CN111793722A (zh) 一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒
CN111500767A (zh) 一种同时检测9种猪病原体的微流体芯片
CN115852054A (zh) 一种猪蓝耳类欧洲株的荧光探针引物、试剂盒及其应用
CN115725783A (zh) 鉴别NADC34 PRRSV的TaqMan实时荧光PCR检测试剂盒及其使用方法
CN111826468A (zh) 一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒
CN111500774A (zh) 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定rt-pcr试剂盒
CN111500777A (zh) 一种基于荧光rt-pcr方法检测新型冠状病毒核酸的试剂盒
Lyu et al. Detection and genetic evolution analysis of porcine parvovirus type 7 (PPV7) in Fujian Province
CN116144836B (zh) 一种prrsv的四重荧光定量rt-pcr检测引物组及检测方法
CN115976273B (zh) 用于非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型鉴别的双重荧光pcr检测试剂盒
CN114164300B (zh) 一种可快速鉴别ASFV基因I型与基因II型的iiPCR试剂盒及其使用方法
CN114736990B (zh) 一种基于双重微滴式数字pcr检测水貂阿留申病毒和水貂肠炎病毒的引物探针组及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201027

RJ01 Rejection of invention patent application after publication