CN111793722A

CN111793722A - 一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒

Info

Publication number: CN111793722A
Application number: CN202010787407.9A
Authority: CN
Inventors: 丁耀忠; 张�杰; 张中旺; 马维民; 何继军; 刘永生; 陈豪泰
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2020-08-07
Publication date: 2020-10-20

Abstract

本发明涉及一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒，属于病毒检测技术领域。本发明所述引物探针组，包括引物F1、引物F2、引物R和探针，所述引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针为在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的5'端修饰有荧光基团、3'端修饰有猝灭基团的物质。应用本发明所述引物探针组进行检测具有良好的特异性和敏感性，与1型猪繁殖与呼吸综合征没有任何反应，具有很好的临床应用价值。

Description

一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS)的病原，是一种RNA病毒，通常会引起母猪繁殖障碍、仔猪及育肥猪呼吸困难的高度传染性的一种猪病。根据抗原性和基因组特征，PRRSV可以分为两个基因型：欧洲型(European，Eu)，即1型PRRSV；北美型(North American，NA)，即2型PRRSV。在我国占流行优势的是2型PRRSV。

PRRS疫病一直是困扰我国养猪业健康发展的最主要疫病之一。由于缺乏区分PRRS感染与免疫的血清学方法，所以，建立一种能够区别2型的实时PCR用于临床诊断是非常必要的。

现有技术(刘永生等，ZL201310375408.2)报道了针对1型和2型PRRSV的常规PCR诊断方法，但该方法在实际检测很难实现大通量检测的要求，而且相对比较费时费力，同时在实践中会出现因操作人员水平而出现假阳性的情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒。本发明所述引物探针组能够实现2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的高速、大批量检测，操作简便，敏感性和特异性好，能够应用于猪繁殖与呼吸综合征的预防与检测诊断要求。

本发明提供了一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组，包括引物F1、引物F2、引物R和探针，所述引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针为在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的5'端修饰有荧光基团、3'端修饰有猝灭基团的物质。

优选的是，所述荧光基团包括HEX，所述猝灭基团包括BHQ2。

本发明还提供了一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的实时定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物探针组。

优选的是，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和含Enzyme Mix的反应液。

优选的是，所述试剂盒的反应条件为：50℃30min；95℃15min；95℃15sec，60℃15sec，40个循环。

本发明还提供了上述技术方案所述引物探针组在制备检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的应用。

本发明提供了一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组。本发明通过在多条引物和多套探针中挑出最佳组合，实现了与2型PRRSV等其他猪繁殖障碍疫病的区别，本发明所述引物探针组能够实现2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的大批量和大通量检测，可靠性强，检测效率和检测精度高，对工作人员技术操作水平要求低。试验结果表明，本发明所述引物探针组在实时定量PCR检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒时，能够快速诊断2型PRRSV，检测时间比传统多重PCR至少减低了1小时，特异性好，不与1型PRRSV、PCV2、PRV和CSF发生交叉反应，具有很强的敏感性，至少可以检出10拷贝/μL 2型PRRSV病毒，敏感性比常规RT-PCT方法至少提高10倍。通过对大量的临床样品检测以及与常规多重RT-PCR检测方法的比较，表明特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法不仅特异性强，而且临床灵敏度高。血清、肺脏和淋巴结都适于采用特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法，尤其是血清样品，收集便捷，利于普查。所以，本发明的特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法具有广阔的市场应用前景，可以开发成为大规模普检方法，有望开发为可以在广大猪场和基层防疫站使用的快速诊断试剂盒。

附图说明

图1为本发明提供的特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法建立图谱；

图2为现有技术(ZL201310375408.2)和本发明2型PRRSV特异性引物探针的一步法实时定量PCR检测方法敏感性比较；

图3为本发明提供的2型PRRSV特异性引物探针的一步法实时定量PCR检测方法特异性检测结果。

具体实施方式

一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组，包括引物F1、引物F2、引物R和探针，所述引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(5’-ATGATGRGCTGGCATTCT-3’)，所述引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(5’-ATRATGRGCTGGCATTCC-3’)，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(5’-ACACGGTCGCCCTAATTG-3’)，所述探针为在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的5'端修饰有荧光基团、3'端修饰有猝灭基团的物质(5’-HEX-TGTGGTGAATGGCACTGATTGACA-BHQ2-3’)。本发明的试剂盒的特异性引物和探针是经过反复比对不同的探针而确定的，很好的覆盖了2型猪繁殖与呼吸综合征保守区域。具体的，本发明所述探针所述探针为ORF7的特异性互补序列。

在本发明中，所述荧光基团包括FAM，所述猝灭基团包括BHQ2。

在本发明中，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和含Enzyme Mix的反应液。本发明所述含Enzyme Mix的反应液优选购自my lab公司。

在本发明中，所述试剂盒的反应条件为：50℃30min；95℃15min；95℃15sec，60℃15sec，40个循环。

在本发明中，每25μL所述试剂盒的反应体系优选包括：

本发明利用本发明设计的2型PRRSV的特异性引物和探针进行一步法实时定量PCR检测，大量样品的检测结果表明，本发明能够取得很强的敏感性，至少可以检出10拷贝/μL的RNA模板，其敏感性比常规RT-PCR方法提高了10倍；且不与1型PRRSV、PCV2、PRV和CSF发生交叉反应。进一步通过对大量的临床样品检测以及与常规多重RT-PCR检测方法的比较，表明特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法不仅特异性强，而且临床灵敏度高。血清、肺脏和淋巴结都适于采用特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法，尤其是血清样品，收集便捷，利于普查。本发明引物探针具有广阔的市场应用前景，可以开发为大规模普检方法，有望开发为可以在广大猪场现场和基层防疫站使用的快速诊断试剂盒。

下面结合具体实施例对本发明所述的一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒做进一步详细的介绍，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

1.毒株

2型PRRSV QH-08毒株为细胞毒(Ding et al.Yansuanmalingua inhibitsreplication of type 2porcine reproductive and respiratory syndrome virus viaactivating the caspase-8apoptosis pathway.J Basic Microb 2020,60,(5),400-406.2020)由实验室分离保存，2型PRRSV CH-1R和CH-1a、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(RRV)和猪瘟病毒(CSFV)商业化疫苗均购于甘肃省动物保健公司，使用时提取的相应疫苗的RNA。

1型PRRSV puc57-LV-6-7质粒(所述质粒是依据GenBank号:M96262的序列设计得到的，即所述质粒含有Lelystad virus的ORF6和ORF7(LV-6-7)片段，本发明对所述质粒的构建方法没有特殊限定，采用常规质粒构建方法将puc57质粒与Lelystad virus的ORF6和ORF7连接即可)和1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7质粒(包含GenBank号：GU047345.1的NMEU09-1的ORF6和ORF7片段，质粒制备方法同上)均由甘肃金科生物科技有限公司合成。

2.临床样品

用于临床检测的田间样品来自甘肃省不同地区猪场，共有100份样品，其中PRRSV阳性样品和阴性样品各50份包括肺、肝脏、肾脏组织、血液和淋巴结各10份，这些样品提取其核酸后，分别进行本发明建立的实时定量PCR和常规RT-PCR检测，用于评估本发明引物探针的临床特异性和敏感性。

3.核酸扩增和提取相关试剂盒

核酸提取采用Takara宝生物工程(大连)有限公司生产的TaKaRa MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0。用于建立实时定量PCR方法的扩增试剂盒和RT-PCR的试剂盒均购于Takara公司。

实施例1

一、样品核酸提取

采用Takara宝生物工程(大连)有限公司生产的MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit提取各种样品核酸。

二、常规RT-PCR反应实验测定PRRSV

1、多重RT-PCR反应所用引物

多重RT-PCR反应所用引物为专利ZL201310375408.2所述4条引物，第一对引物为：5’–CAC CACGTCGAAAGTGCCGC–3’(SEQ ID NO.5)和5’-GACGCCGGACGACAAATGCG-3’(SEQ IDNO.6)；第二对引物为：5’–GGGGCTGTTGCACATCCTAA–3’(SEQ ID NO.7)和5’-ACAAAAGGGCAACAACAGCC-3’(SEQ ID NO.8)，对1型和2型PRRSV的扩增大小分别约为120bp和70bp。

2、多重RT-PCR扩增反应体系和扩增反应流程

专利ZL201310375408.2所述扩增条件：50℃30min，94℃2min，然后是循环程序为94℃30s，58℃1min，72℃50s，35个循环。最后72℃延伸10min。

3、RT-PCR扩增产物电泳检测

RT-PCR扩增产物采用常规琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶浓度为1％，电泳缓冲液为1×TAE，电泳速度为5～6伏特/厘米。

三、基于本发明特异性引物和探针的一步法实时定量PCR建立

1、特异性引物和探针的一步法实时定量PCR扩增引物选择和序列

将1型PRRSV毒株和2型PRRSV毒株的全基因组序列的进行分析比较，围绕特异编码区设计特异性引物和特异性引物和探针，经反复对比，最终获得最佳3条引物和一条特异性引物和探针(见表1)。

表1特异性引物和探针的一步法实时定量PCR引物序列

2、特异性引物和探针的一步法实时定量PCR扩增反应体系(见表2)，为了检测方便，本发明在实际操作中，将引物，探针，各种酶按比例制成实时定量PCR扩增液。反应操作时一次性完成。

表2一步法实时定量PCR扩增反应体系

3、特异性引物和探针的一步法实时定量PCR扩增反应流程

经比对不同扩增程序获得最佳扩增程序为：50℃30min；95℃15min；95℃15sec，60℃15sec，40个循环。终止反应。

四、本发明的引物探针的性能试验

1、特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法敏感性实验

从2型PRRSV QH08的细胞毒中提取RNA，采用紫外分光光度计测定核酸浓度，然后根据基因组核酸分子量计算出提取RNA样品的每微升核酸拷贝数。将RNA样品用无菌和无核酸酶的ddH₂O系列稀释成1×10⁸～1×10⁰拷贝数/μL，然后按上述方法进行本发明定量PCR和ZL201310375408.2所述的多重PCR实验，每个反应管加入2μL上述系列稀释的RNA样品作为模板，比较两种方法的分析敏感性。

2.特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法特异性实验

在检测该方法的分析特异性时，2型PRRSV QH-08细胞毒RNA、2型猪繁殖与呼吸综合征CH-1R和CH-1a疫苗RNA做为特异性研究的阳性质控。然后分别与1型PRRSV puc57-LV-6-7和1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7质粒，猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)商业化疫苗提取的相应疫苗的RNA进行检测比较是否存在交叉反应性实验。

3.特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法临床实验

用于特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法临床灵敏度分析的阳性样品来自不同地区猪场猪的组织和血清样品共有100份样品，其中PRRSV阳性样品和阴性样品各50份包括肺、肝脏、肾脏组织、血液和淋巴结各10份，这些样品提取其核酸后，分别进行特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测和多重RT-PCR检测，评估新建立的特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方临床特异性和敏感性。

结果

1.特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法建立

以2型PRRSV QH-08毒株的细胞毒RNA为模板建立特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法，结果表明，在特异扩增条件都能够有效扩增出典型的S形图谱，CT值介于20～30之间，而阴性样品和其余质控样品都没有CT值和扩增曲线，如图1所示。

图1为特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法建立图谱；其中，1为特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测2型PRRSV QH-08的S曲线图，其余为阴性和质控的分别为阴性对照，1型PRRSV puc57-LV-6-7和1型PRRSV puc57-NMEU09-1-6-7质粒、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)商业化疫苗提取的相应疫苗的RNA。

2.特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法敏感性性检测结果

利用ZL201310375408.2提供的引物对，分别对以2型PRRSV QH-08细胞毒的RNA模板扩增，结果如图2所示。电泳图谱表明，ZL201310375408.2提供的引物对可以扩增出2型PRRSV QH-08片段，预计大小为70bp左右条带与预期结果一致，可以检出100拷贝/μL的RNA产物(图2中的A)；实时定量PCR对2型PRRSV毒株QH08的RNA模板可以扩增出标准的S型曲线，至少可以检出10个拷贝/μL的RNA模板(图2中的B)，这表明，特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法比常规多重RT-PCR灵敏高至少提高了10倍。

图2中的A为RT-PCR扩增PRRSV琼脂糖凝胶电泳图谱；其中，M:DL2000(2000，1000，750，500，250，100bp)；泳道1代表2型PRRSV QH-08细胞毒的RNA为1×10⁸拷贝/μL，泳道2代表2型PRRSV QH-08细胞毒的RNA为1×10⁷拷贝/μL，泳道3代表2型PRRSV QH08细胞毒的RNA为1×10⁶拷贝/μL，泳道4代表2型PRRSV QH-08细胞毒的RNA为1×10⁵拷贝/μL，泳道5代表2型PRRSV QH-08细胞毒的RNA为1×10⁴拷贝/μL，泳道6代表2型PRRSV QH-08细胞毒的RNA为1×10³拷贝/μL，泳道7代表2型PRRSV QH0-8细胞毒的RNA为1×10²拷贝/μL，泳道8代表2型PRRSVQH-08细胞毒的RNA为1×10⁰拷贝/μL；图2中的B特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法；S曲线1代表2型PRRSV QH-08细胞毒的RNA为1×10⁸拷贝/μL，S曲线2代表2型PRRSVQH08细胞毒的RNA为1×10⁷拷贝/μL，S曲线3代表2型PRRSV QH-08细胞毒的RNA为1×10⁶拷贝/μL，S曲线4代表2型PRRSV QH-08细胞毒的RNA为1×10⁵拷贝/μL，S曲线5代表2型PRRSVQH-08细胞毒的RNA为1×10⁴拷贝/μL，S曲线6代表2型PRRSV QH-08细胞毒的RNA为1×10³拷贝/μL，S曲线7代表2型PRRSV QH-08细胞毒的RNA为1×10²拷贝/μL，S曲线8代表2型PRRSVQH-08细胞毒的RNA为1×10⁰拷贝/μL。

3.特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法特异性结果

本发明建立特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方具有很好特异性，仅与2型PRRSV QH-08细胞毒RNA、2型猪繁殖与呼吸综合征CH-1R和CH-1a疫苗RNA发生反应，不与1型PRRSV puc57-LV-6-7和1型PRRSVpuc57-NMEU09-1-6-7质粒、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)商业化疫苗提取的相应疫苗的RNA(见图3)。

图3中的A为RT-PCR扩增PRRSV琼脂糖凝胶电泳图谱；其中，M:DL2000(2000，1000，750，500，250，100bp)；1泳道为1型PRRSV puc57-LV-6-7质粒(120bp)和PRRSV QH08(70bp)的RNA检测结果；2泳道为1型PRRSVpuc57-NMEU09-1-6-7(120bp)和CH-1R(70bp)的RNA检测结果；3泳道为CH-1a(70bp)的RNA检测结果；4泳道为猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗的RNA检测结果；5泳道为猪伪狂犬病毒(PRV)疫苗的RNA检测结果；6泳道为猪瘟病毒(CSFV)疫苗的RNA检测结果。

图3中的B为特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法，检测表明，不与其他病毒发生交叉反应。其中：“S”曲线1为PRRSV QH-08细胞毒的RNA检测结果，“S”曲线2为CH-1R疫苗的RNA检测结果，“S”曲线3为CH-1a疫苗的RNA检测结果。

4.特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法的临床检测

采用50份PRRSV阳性临床样品评估了特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法的临床敏感性，并与专利ZL201310375408.2的多重RT-PCR进行比较分析。表3结果显示，特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法的总阳性检出率为100％。ZL201310375408.2的多重RT-PCR总检出率为96％；对猪血清而言，特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法和RT-PCR方法的检出率为100％；对组织样品而言，分别为100％和90～100％。上述结果表明，本发明建立的2型PRRSV特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法的临床敏感性明显高于RT-PCR，对血清样品具有很高的检出率，比较适用于临床活体普检使用。

表2 50份阳性临床样品的检出敏感性比较

对50份阴性样品进行检测，特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法的总检出率为100％和常规RT-PCR方法总检出率为98％。特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法RT-PCR方法对猪血清的检出率均为100％。两种方法都具有很好的敏感性和特异性，但是特异性引物和探针的一步法实时定量PCR检测方法敏感性高于RT-PCR方法，而且适合大通量的检测，适于在临床推广使用。

表4 50份阴性临床样品的检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgrgct ggcattct 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atratgrgct ggcattcc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acacggtcgc cctaattg 18

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtggtgaat ggcactgatt gaca 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccacgtcg aaagtgccgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacgccggac gacaaatgcg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggctgttg cacatcctaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acaaaagggc aacaacagcc 20

Claims

1.一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组，包括引物F1、引物F2、引物R和探针，所述引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物F2的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针为在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的5'端修饰有荧光基团、3'端修饰有猝灭基团的物质。

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括HEX，所述猝灭基团包括BHQ2。

3.一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的实时定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述引物探针组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和含Enzyme Mix的反应液。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应条件为：50℃30min；95℃15min；95℃15sec，60℃15sec，40个循环。

6.权利要求1或2所述引物探针组在制备检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的应用。