CN114736989A

CN114736989A - 一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光rpa检测引物、方法及试剂盒

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Publication number: CN114736989A
Application number: CN202210339139.3A
Authority: CN
Inventors: 孙普; 卢曾军; 王方洲; 张婧; 马雪青; 李平花; 赵志荀; 袁红; 包慧芳; 李冬; 付元芳; 曹轶梅; 李坤; 王健; 白兴文; 刘在新
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2022-04-01
Filing date: 2022-04-01
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2042-04-01
Also published as: CN114736989B

Abstract

本发明公开了一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测引物、方法及试剂盒。本发明涉及了用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测引物和探针组合，包含引物和探针组合反应体系的检测试剂盒及方法；该方法快速省时，最低检测PRRSV载量为50copies/μL，且与常见感染猪的病毒无交叉反应，特异性好；该方法与实时荧光RT‑PCR检测结果符合率为100%。结果表明：本研究建立的PRRSV实时荧光RPA检测方法具有特异性强、敏感性高，满足美洲型PRRSV的快速诊断和流行病学调查。

Description

一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测引物、方法及试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测检测技术领域，涉及一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测引物、方法及试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和不同生长阶段猪的呼吸道疾病为主要特征的病毒性传染病，该疾病可造成持续性感染和免疫抑制，病原易发生变异和重组，混合感染现象严重，对养猪业造成了极其严重的危害。研发和更新快速的诊断方法是防控和净化该病的重要技术支撑。

PRRSV属于套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员，分为两个基因型，即欧洲型（基因1型）和美洲型（基因2型），我国主要流行美洲型毒株。中国于1996年首次分离到PRRSV，2006年爆发了由高致病性PRRSV（HP-PRRSV）引起的高致病性PRRS(HP-PRRS)，该毒株致病性极强，对养猪业造成了毁灭性的打击。2012 年，我国报道了与NADC30高度同源的新变异株，称为NADC30-like PRRSV，且于2016 年已超过HP-PRRSV 成为我国当前主要流行毒株。最新流行病学研究显示，目前我国PRRS以疫苗样毒株、HP-PRRSV、NADC30-like、NADC34-like、QYYZ毒株以及衍生的多种重组毒株混合感染，变异和重组现象极其严重和复杂。另外，国内大多数猪群存在PRRSV阳性，Guo等发现约80%以上的猪场存在PRRSV 血清阳性（Theprevalent status and genetic diversity of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus in China: a molecular epidemiologicalperspective）。因此，PRRSV的流行病学调查和防控面临着极大挑战，需求快速而敏感的病原学检测技术。

由于PRRSV基因组的高变异率及重组，导致其在国内的流行情况愈加复杂，多毒株混合感染，多基因亚型毒株重组变异在众多猪场中屡见不鲜，其中NADC30 Like毒株和HP-PRRSV毒株仍然作为目前国内主要流行的毒株^[11]，临床上带毒猪经常出现漏检，导致隐性带毒猪的调运加大了疫病的传播和病毒的变异。鉴于此，本实验根据目前国内主要流行的美洲型PRRSV毒株，选取HP-PRRSV的GSWW15毒株，NADC30-Like PRRSV的GSWW18毒株，经典PRRSV的VR-2332毒株，力求做到对当前流行毒株的代表毒株进行涵盖，从而减少漏检的可能。

近年来，PRRSV的实验室检测技术主要有血清学和分子生物学两种，包括聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、实时荧光聚合酶链式反应(QuantitativeReal-Time Polymerase Chain Reaction，qPCR)、环介导等温扩增技术(Loop-MediatedIsothermal Amplification，LAMP)、酶联免疫吸附测定（ELISA）等，但这些方法均需耗时1h以上，且操作繁琐。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一种新型的核酸扩增技术，与基于PCR的核酸扩增技术相比，具有特异性高、灵敏度强、操作简单、反应时间短、不需要特殊仪器且反应最佳温度适中( 37～42℃) 等优点。目前，RPA技术在食品安全监测、人畜病害防治、植物病害诊断等方面的应用范围非常广阔，在人畜病原检测方面，Zhang 等首次建立了登革热病毒( Dengue virus，DENV) 的 RPA 检测法（登革病毒逆转录重组酶聚合酶扩增-测流层析试纸条检测方法的建立与评价），Higgins等利用双重 RPA 能检测出肺炎链球菌( Streptococcus pneumonia) 、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis) 和流感嗜血杆菌( Hae-mophilus influenza) （Duplexrecombinase polymerase amplification assays incorporating competitiveinternal controls for bacterial meningitis detection），Cui 等利用 RPA 技术成功检测到犬类血液中的吉氏巴贝斯虫( Babesia gibsoni) （Detection of Babesiagibsoni in dogs by combining recombinase polymerase amplification (RPA) withlateral flow (LF) dipstick），灵敏度是常规 PCR的20倍等。此外，在猪常见病毒病中，非洲猪瘟病毒、塞内卡病毒等也成功的建立了RPA检测技术，仅Yang等在2016年报道了 PRRSV的RPA检测方法，靶标为NSP2基因（Rapid detection of highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome virus by a fluorescent probe-basedisothermal recombinase polymerase amplification assay）。Nsp2基因是PRRSV最易发生变异和重组的区域，是划分基因型的首选序列之一，所以随着流行毒株的复杂性，可能造成脱靶而漏检。

许多猪场均利用传统的RT-PCR方法检测PRRSV的感染情况，这种做法费时费力，需要的病毒载量高，敏感性差，经常发生漏检。实时荧光定量PCR技术因其高敏感性和高特异性而逐渐成为主要检测方法，吴海港等根据PRRSV的ORF7保守序列分别设计引物和TaqMan探针，建立了一种快速准确检测PRRSV的实时荧光定量PCR方法，其检测极限可达5copies/μL（快速实时荧光定量PCR检测猪繁殖与呼吸综合症病毒方法的建立）。Qiu等根据经典毒株、高致病性毒株和类NADC30 毒株等3个不同PRRSV，建立了可同时快速、准确检测和区分上述3种毒株的多重实时荧光PCR方法（Simultaneous Detection of Classical PRRSV,Highly Pathogenic PRRSV and NADC30-like PRRSV by TaqMan Probe Real-Time PCR）。然而，qPCR需要较长的反应时间，易污染出现假阳性结果，对实验人员的专业技能要求高，也不适应现场检测，不满足养殖户的疫病诊断需求。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一种快速、灵敏度高的分子检测技术，已在多个邻域研究使用。RPA技术自2006年问世以来，其优势非常明显，对设备要求低（便携式荧光检测仪即可），检测时间短（20min内即可判定结果），特别适合于现场及野外检测。同时，以RPA为基础的核酸快速检测方法在多个领域得到广泛应用，且与其他类型检测技术结合，包括侧向流、实时荧光、絮凝测定、电化学、化学发光、表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）等，从而衍生了多种RPA的检测方法。Wahed等建立了口蹄疫病毒的实时荧光定量RT-RPA检测技术，最低可检出100个拷贝的RNA分子（A Portable Reverse Transcription Recombinase PolymeraseAmplification Assay for Rapid Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus）。Yang等建立了检测小反刍兽疫病毒实时荧光定量RT-RPA方法，可在20min内出结果，灵敏度达100个拷贝（Development of real-time and lateral flow strip reversetranscription recombinase polymerase Amplification assays for rapid detectionof peste des petits ruminants virus）。Euler等（Development of a Panel ofRecombinase Polymerase Amplification Assays for Detection of BiothreatAgents）、Yang等（Development of a fluorescent probe-based recombinasepolymerase amplification assay for rapid detection of Orf virus）也建立了天花病毒、牛痘病毒、羊口疮病毒的实时荧光RPA方法，最低检测10～100个DNA拷贝。

基于此，本发明分析了国内流行的美洲型PRRSV全基因组序列，设计合成特异性引物和探针，利用RPA技术建立美洲型PRRSV检测方法，优化反应体系和条件，建立美洲型PRRSV实时荧光重组酶聚合酶检测方法，通过特异性、敏感性和重复性试验及田间样品的比对检测，评价其特异性、灵敏性、重复性以及检测能力，组装试剂盒，为PRRS的快速诊断更新技术和研制新产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测引物、方法及试剂盒。本发明建立的美洲型PRRSV实时荧光RPA方法快速省时，特异性强，敏感性高，适合PRRSV的临床检测、流行病学调查及防控需求。

一、实时荧光RPA方法的建立

1、引物和探针的设计与合成

整理NCBI GenBank中收录的我国PRRSV美洲型全基因组序列，利用Lasergene.V7.1生物学软件进行比对分析，选择相对保守的区域，按照RPA技术的要求设计引物和探针，qPCR的引物和探针按文献《两株PRRSV NSP2不同位置缺失基因工程病毒的生物学特性分析》合成（见表1），由北京擎科生物科技有限公司（西安）合成，引物和探针浓度均稀释至10 μmol/L使用。

2、病毒核酸的提取

根据病毒RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit操作说明提取PRRSV、CSFV、SVA、FMDV的RNA；根据病毒DNA提取试剂盒提取ASFV、PCV2和PRV的DNA。临床样品按照常规方法研磨后，反复冻融或者4℃条件下过夜浸毒，取上清提取病毒总RNA。

3、实时荧光RPA标准品的制备

以PRRSV GSWW15株病毒基因组RNA 为模板扩增目的基因片段，片段大小为135bp。RT-PCR的反应体系为25 μL，其中2×1 Step Buffer 12.5 μL，Prime Script 1 StepEnzyme Mix 1 μL，引物（10 μmol/ L）各1 μL（核苷酸序列见表1 RPA1-F1/R1），RNA 2 μL，ddH₂O 6.5 μL；反应条件：50℃ 30 min；94℃ 2 min；94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72℃ 60 s，35个循环；72℃10 min。将目的片段纯化后克隆至pGEM- T Easy 载体上，并转化DH5α细胞，次日挑取单个菌落培养，提取质粒，通过测序方法确认阳性质粒，命名为pGEM-T-PRRSV。使用限制性内切酶NdeI对阳性质粒进行线性化，纯化后使用RiboMAX Large Scale RNAProduction System - T7试剂盒进行体外转录，然后使用无RNase的RQ1 DNase 对体外转录的RNA 进行消化，转录产物总长度为174 bp，并通过琼脂糖凝胶电泳确定获得体外转录RNA 的大小及完整性。使用ND-2000c 核酸浓度测定仪测定体外转录RNA的浓度，并通过下列公式计算体外转录RNA的拷贝数：RNA 浓度（copies／μL）＝6.02×10²³×RNA 浓度（ng/ μL）×10^{- 9}/（体外转录RNA长度）×340。

对体外转录的RNA采用紫外分光光度计测定浓度为 623ng/μL，经公式计算得拷贝数为5×10¹⁰copies/μL，以其作为实时荧光RPA的标准品。

4、实时荧光RPA反应体系

按照RT-荧光型核酸扩增试剂盒（ERA法）的要求，反应总体系为50 μL。首先配制反应混合液48 μL，包含20 μL再水化缓冲液Rehydration Buffer、引物各2.1μL( 10 μmol /L) 、探针0.6 μL( 10 μmol /L) 、ddH₂O 21.2 μL、RNA 2 μL；然后将上述反应混合液与重组酶聚合酶冻干酶粉混匀；最后加入2 μL醋酸镁溶液。使用实时荧光定量PCR仪检测荧光强度，反应温度设为40℃，反应时间20min。重组酶聚合酶冻干酶粉为商品化RT-荧光型核酸扩增试剂盒（ERA法）成份，购自苏州先达基因科技有限公司。

5、引物和探针的筛选

用设计合成的2组引物和探针在上述反应体系下分别扩增美洲型PRRSV 的高致病性毒株GSWW15株、NADC30-like毒株GSWW18、经典毒株VR-2332株的细胞毒，从中筛选出特异性和敏感性较好的引物和探针组。

为了筛选最佳引物和探针组合，通过 NCBI数据库，使用 BLAST对表1种RAP1和RPA2设计合成的引物和探针进行序列比对分析，并与主要猪病毒（包括ASFV、O型FMDV、A型FMDV、CSFV、PRV、PCV2、PEDV和SVA）的序列比对，结果确定其特异性良好。使用2组引物和探针进行实时荧光 RPA 扩增，结果见图1，F1-R1-P1组合在RPA 反应第5个循环时，即可检测到荧光信号，且总荧光强度高于F2-R2-P2组合。因此，选用引物和探针组合F1-R1-P1建立美洲型PRRSV 实时荧光RPA检测方法。

6、实时荧光RPA方法的优化

为了确定最佳的反应温度，以RNA标准品为模板，使用引物和探针组合F1-R1-P1，在试剂盒推荐反应温度40℃基础上加减2℃，分别以38℃、40℃、42℃下反应20 min，根据测定的荧光强度确定最佳反应温度，结果见图2。由图2可知，温度越高，荧光强度随着反应时间的推移上升越快，温度为40℃时，RNA标准品在40个循环内即完成反应，约需20min； 42℃时获得的荧光总强度与40℃几乎相同，但达到相同荧光强度时所需循环数较小，在第16个循环时，约需8分钟，就可达到在40℃下反应40个循环所对应的荧光值；38℃的荧光强度相对低，而且与其他温度相比，达到相同荧光强度时所需循环数较大。因此，选择42℃为本方法的最佳反应温度。

综上，确定出用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的实时荧光RPA检测的引物和探针组合，为表1中F1（正向引物）-R1（反向引物）-P1（探针）组合。确定最佳反应温度为42℃，反应时间为20min。

本发明美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的RNA；

（2）以提取的RNA为模板，用上述F1（正向引物）-R1（反向引物）-P1（探针）进行扩增反应并实时检测荧光信号；扩增反应温度为42℃，反应时间为20min；扩增反应体系为50 μL，首先配制反应混合液48 μL，其中包含20 μL再水化缓冲液Rehydration Buffer、正向引物和反向引物各2.1μL、探针0.6 μL、ddH₂O 21.2 μL、模板RNA 2 μL；然后将上述反应混合液与重组酶聚合酶冻干酶粉混匀；最后加入2 μL醋酸镁溶液（280mM）混匀；所述正向引物、反向引物和探针的浓度均为10 μmol /L。重组酶聚合酶冻干酶粉均为商品化RT-荧光型核酸扩增试剂盒（ERA法）成份，购自苏州先达基因科技有限公司。

（3）结果判定：若出现荧光扩增曲线，且最终荧光信号强度高于25000即可判定为阳性，检测病毒为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒。

本发明的检测试剂盒，包含表1中F1（正向引物）-R1（反向引物）-P1（探针）组合，还含有ddH₂O、冻干酶粉、再水化缓冲液，激活醋酸镁溶液。

二、特异性实验

按照上述的检测方法，分别以GSWW15株、GSWW18株、VR2332株的RNA为阳性对照，ddH₂O为阴性对照，与临床上重大或者新发猪传染性病毒病的病原如ASFV、O型FMDV、A型FMDV、CSFV、PEDV、SVA、PRV、PCV2进行特异性评价。

根据特异性检测结果表明，与临床上重大或者新发猪传染性病毒病的病原ASFV、O型FMDV、A型FMDV、CSFV、PEDV、SVA、PRV、PCV2均未出现扩增曲线，而PRRSV的三株毒株出现相符的扩增曲线，结果如图3所示，表明该方法特异性良好。

三、敏感性实验

对体外转录RNA模板进行10倍系列稀释，使浓度5×10⁶～5×10⁰ copies/μL作为PRRSV 实时荧光RPA 敏感性检测的模板，按照上述的检测方法进行检测反应，确定该方法的最小检测量。

从对不同稀释度标准品的检测结果可知(见图4)，该方法在第22个循环(约11min) ，可检测到5×10¹ copies/μL的阳性RNA样本，在第28个循环(约14 min)观察到显著的结果，最低检测病毒基因的量为5×10¹ copies/μL。各稀释度模板间具有良好的倍性扩增关系。

四、重复性实验

为了检测建立的实时荧光RPA方法的重复性，以体外转录的RNA标准品为模板，并以ddH₂O作为阴性对照，用上述检测方法，在不同时间进行三次重复检测，确定检测方法的重复效果。

重复性试验结果表明，3次重复试验结果基本一致（见图5）。因此，建立的荧光型RPA方法具有较好的重复性。

本发明的有益效果：

1、本发明建立的美洲型PRRSV 的实时荧光 RPA方法快速省时，敏感性高，最低可检测50个拷贝的 RNA分子，时间比PRRSV实时荧光RT-PCR方法缩短2-3倍，仅需在42℃恒温下就可完成检测。

2、本研究建立美洲型PRRSV实时荧光RPA检测方法具有良好的特异性，与猪的其它常见病毒（包括ASFV、O型FMDV、A型FMDV、CSFV、SVA、PEDV、PRV、PCV2）均未出现反应荧光信号。不同时间段重复应用三次，检测结果一致，说明该方法具有良好的特异性和重复性。与常用的实时荧光qPCR检测方法比较了对临床样本的检测，表明本发明建立的实时荧光RPA方法的可靠性和稳定性，完全满足临床检测需求。

3、本发明选择了PRRSV较为保守的5′UTR设计特异性引物和探针，可降低漏检率，提高临床检测效果和速度需求。

4、本发明将RPA与实时荧光相结合，可实时监测扩增过程。

附图说明

图1为实时荧光RPA引物和探针筛选结果图，其中，1.GSWW15株；2.GSWW18株；3.VR-2332株；4-1.F1-R1-P1阴性对照；4-2.F2-R2-P2阴性对照；

图2为实时荧光RPA温度的优化结果图，其中，1.42℃；2.40℃；3.38℃；

图3为实时荧光RPA特异性实验，其中，1.GSWW15株；2.GSWW18株；3.VR-2332株；4.SVA；5.O型FMDV；6.A型FMDV；7.CSFV；8.PRV；9.PCV2；10.ASFV；11.PEDV；12.ddH₂O；

图4为实时荧光RPA敏感性实验结果图，其中，1~7分别为RNA标准品浓度5×10⁶copies/μL~5×10⁰copies/μL；8. ddH₂O；

图5为实时荧光RPA重复性实验结果图，其中，1.第一次；2.第二次；3.第三次。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术作进一步说明。

本发明所用的材料和设备如下：

细胞，病毒株及田间样品

1.细胞：Marc-145细胞，用于PRRSV的传代培养。

2.病毒株：美洲型PRRSV（GSWW15、GSWW18、VR-2332株）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪瘟病毒（CSFV）、O型和A型口蹄疫病毒（O type FMDV、Atype FMDV）、仔猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环2型病毒（PCV2）、塞内卡病毒（SVA）、均由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室保存提供。

3. 田间样品：采自甘肃、内蒙古、山东、陕西、宁夏、青海、四川等地区的猪肺脏、淋巴结等组织，共50份。

主要仪器与试剂

RT-荧光型核酸扩增试剂盒（ERA法）购自苏州先达基因科技有限公司；HiScript®II One Step RT-PCR Kit和病毒DNA提取试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit (Perfect Real Time)、DNA Marker、RNA酶抑制剂均购自宝生物工程（北京）有限公司；病毒RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit购自QIAGEN；DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司。

实施例

（1）对实验室收集的2018~2021年甘肃、内蒙古、山东、陕西、宁夏、青海、四川等地区的猪肺、脾、淋巴结、血清、精液组织，共50份。按常规方法研磨处理后，取400 μL上清提取总RNA；

（2）将重组酶聚合酶冻干酶粉于室温下平衡10min；

（3）配置预混液，组分如下表：

重复振荡混匀5s，3000rpm离心3~5s；

（4）将预混液转移至重组酶聚合酶冻干酶粉反应管中，振荡3s使重悬，3000rpm离心3~5s；

（5）再加入2μL醋酸镁溶液（280mM），短暂离心使激活剂进入预混液中；振荡3s，3000rpm离心3~5s；

（6）立即将反应管放入荧光检测仪中，42℃检测20min，每30s采集一次荧光信号；

（7）结果判定若出现荧光扩增曲线，且最终荧光信号强度高于25000即可判定为阳性，检测病毒为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，否则为阴性；通过判定检测结果如表2。

用本发明建立的实时荧光RPA方法和常规实时荧光RT-PCR方法同时进行检测，根据两种方法的检测结果，计算二者的符合率，评价本研究建立的检测能力。利用建立的实时荧光RPA方法与常规的荧光定量RT-PCR方法进行PRRSV比对检测，对50份临床组织样品进行检测。结果显示，两种方法均检出了20份阳性，30份阴性，阳性率为40%，符合率为100%，结果见表2。可见，本发明建立的美洲型PRRSV 实时荧光RPA方法与常规的荧光定量RT-PCR方法检测能力相当，但缩短检测时间2-3倍。

Claims

1.一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测的引物和探针组合，其特征在于：正向引物的核苷酸序列为：5'-CACCTTGCTTCCGGAGTTGCACTGCTTTACG-3'；反向引物的核苷酸序列为：5'ACATCGTGTGCAGTAGACYTGGCCCTCCGC-3'；探针的核苷酸序列为：5'-TTTAACCATGTCTGGGATACTTGATCGGTGCACG[FAM-dT]G[THF][BHQ-dT]ACCCCCAATGCCAGG/C3-spacer-3'。

2.一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的RNA；

（2）以提取的RNA为模板，用上述正向引物、反向引物和探针进行扩增反应并实时检测荧光信号；

3.根据权利要求2所述的一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述扩增反应体系为50 μL，首先配制反应混合液48 μL，其中包含20μL再水化缓冲液、正向引物和反向引物各2.1μL、探针0.6 μL、ddH₂O 21.2 μL、模板RNA 2 μL；然后将上述反应混合液与重组酶聚合酶冻干酶粉混匀；最后加入2 μL醋酸镁溶液混匀；所述正向引物、反向引物和探针的浓度均为10 μmol /L。

4.根据权利要求3所述的一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测方法，其特征在于：步骤（2）中，扩增反应温度为42℃，反应时间为20min。

5.一种基于权利要求1所述的用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测引物和探针组合的检测试剂盒。